Genová terapie a jiné terapeutické molekulárně genetické přístupy

• Rekombinantní proteiny a „genetically engineered“ vakcíny

• Expresním klonováním produktů normálního genu (klonované geny jsou exprimovány v mikroorganismech nebo transgenních livestock), které slouží k tvorbě velkých množství medicínsky cenných produktů

• Produkcí geneticky „engineering“ protilátek (geny pro protilátky jsou manipulovány k tvorbě nových částečně nebo plně humanizovaných protilátek) pro terapeutické použití

• Produkcí „genetically engineered“ vakcín-především proti tumorům a infekčním agens.

Genová terapie: typy nemocí

• Infekční nemoci

• Rakoviny

• Vrozené nemoci

• Nemoci imunitního systému

Genová terapie

• Zahrnuje jakoukoliv proceduru, určenou k léčení nemoci genetickou modifikací buněk pacienta.

• Do buněk se transferují: geny nebo jejich části nebo oligonukleotidy.

• Genová terapie in vivo: transfer přímo do buněk pacienta

• Genová terapie in vitro: genové modifikace probíhají mimo organismus

• Genová terapie ex vivo: modifikované buňky se vracejí do organismu

Genová terapie

• Klasická genetická terapie (dopravit geny do vhodných cílových buněk, aby bylo dosaženo optimální exprese vnesených genů) s cílem:

• 1. zajistit produkci látky, která chybí

• 2. aktivovat buňky imunitního systému ve snaze pomoci odstranit nemocné buňky

Neklasická genová terapie

• Inhibice exprese genů asociovaných s patogenezou

• Korekce genetického defektu a obnovení normální genové exprese

• Současná genová terapie se omezuje na terapii somatických mutací. Etické problémy s potenciální terapií zárodečných mutací.

Rekombinantní léky je možno produkovat expresním klonováním v mikroorganismech nebo v transgenních zvířatech

• V mikroorganismech:• Výhody: dostatečná množství produkovaných látek• Nevýhoda: Pozměněné produkty v důsledku odlišných

posttranslačních úprav bílkovin se stejnou primární strukturou (glykosylace)

problémy s purifikací• V transgenních zvířatech: možnost navodit podobné

posttranslační systémy jako u člověka

„Genetically engineered“ protilátky a vakcíny

• Uměle produkované terapeutické protilátky jsou navrženy jako monospecifické (poznají jen jeden typ antigenního místa) a poznají specifické antigeny asociované s nemocí, což vede k zabití nemocných buněk

• Typy nemocí:• Lymfomy, leukemie, infekční nemoci, autoimunitní

nemoci.• Hybridomy = heterogenní směs hybridních buněk

(vzniklých fúzí), které jsou schopny produkovat specifické protilátky (B lymfocyty imunizovaného zvířete) a přitom se v kultuře neomezeně dělit (nesmrtelný myší B-lymfocytární tumor).

Chimerické a humanizované protilátky

• Rekombinantní protilátky humánní-hlodavčí• Humanizace hlodavčích mAb umožňuje získat

velké množství protilátek a zároveň zabránit imunitní odpovědi lidského příjemce:

• chimerické V/C protilátky)• CDR (complementarity determining regions)

graft protilátky• Infekční patogeny a antigeny nádorových buněk

Plně lidské protilátky

• Technologie fágového displaye: protilátky jsou tvořeny in vitro napodobováním selekční strategie imunitního systému

• Transgenní myši: Transfer kvysinkových umělých chromozomů s velkými segmenty lidských těžkých a lehkých Ig řetězců do myších embryonálních buněk. Narozené myši obsahují velmi pozoruhodnou porci lidských V genetických segmentů a jsou schopny tvořit lidské protilátky

„Geneticky enginnered“ vakcíny

• Pomocí rekombinantní technologie:

• Vakcíny nukleových kyselin:

• bakteriální plasmidy s geny pro patogeny nebo tumorové antigeny, podávané i.m. v solném roztoku. Obsahují silný virový promotor.

• „gene gun“ - zlaté perly, do nichž byla precipitována DNA

„Geneticky enginnered“ vakcíny• Genetická modifikace antigenu – např.

fúze cytokinu s antigenem ke zvýšení antigenicity

• Genetická modifikace virů- virové vektory

• Genetické modifikace mikroorganismů, které způsobí:

• odstranění genů nutných pro patogenezu

• expresi exogenního genu v bakteriích nebo parazitech po jeho inzerci do těchto organismů

Technologie klasické genetické terapie

• Jedná se o zacílení buněk nemocné tkáně

• Geny mohou inzertovány do buněk pacienta přímo a nepřímo

• Inzertované geny se mohou

• Integrovat do chromozomů

• Zůstat extrachromozomálně (epizomy)

Technologie klasické genetické terapie

• Metody k zacílení nepostižených buněk:

• Buněčné zabíjení, způsobené imunitním systémem- jde o podporu imunitní odpovědi namířené proti nádorovým buňkám nebo infekčním agens

• Uvolnění genetických produktů z buněk na vzdáleném místě (myoblasty sekretují do krve)

Genetický transfer

• Ex vivo

• Transfer klonovaných genů do buněk v kultuře (transplantace autologních geneticky modifikovaných buněk)

• In vivo

• Transfer se děje přímo do tkáně pacienta. Pomocí liposomů nebo virových vektorů.

Principy genetického transferu

• cDNA s kompletní DNA kódující sekvencí je modifikována k zajištění vysoké hladiny exprese, např. pomocí silného virového vektoru. Následná inzerce genu se děje

• A) do chromozomu• gen se bude rozšiřovat do dalších buněk • zajištěna vysoká úroveň exprese (kmenové buňky)• náhodná inzerce-různá lokalizace –různá úroveň

exprese-smrt jednotlivé buňky-rakovina (aaktivace onkogenu, deaktivace supresorového nebo apoptotického genu-výhoda transferu ex vivo.

• B) extrachromozomálně – nevýhoda nejistého dlouhodobého účinku

Haplotypes I and II within the genes encoding (a) interferon (IFNG) and (b) interleukin 4 (IL4)

Relationship between IFNG genotype and IFN- expression levela

Potential scenario for the implementation of cytokine genetics infuture strategies for the treatment of multifactorial diseases

Schematic diagram of Ad5 virion. The double-stranded DNA genome is packaged within an icosahedral protein capsid. The major structural protein of the capsid is the hexon. Penton capsomers, formed by association of the penton base and fiber, are localized at each of the 12 vertices of the Ad capsid.

The pathway of adenoviral infection

Retargeting of adenoviral vectors by bispecific conjugates. (A) Ad attachment to cells is accomplished by the high affinity binding of the knob(B) domain of the fiber to the primary cellular receptor, CAR. (C)(B) The bispecific conjugate is designed to simultaneously ablate (D)native tropism, by preventing the Ad vector from binding to CAR, and introduce(E) novel tropism, by directing the vector to a novel target receptor on the cell surface.

Schematic diagram of fiber-pseudotyped vector. The fiber-pseudotyped vector is constructed by substituting the fibers from an Ad2 or Ad5 vector backbone with the fiber proteins from an alternative serotype.

Scheme of HLA-restricted immune response against cancer. Peptide-loaded mature dendritic cells can prime naïve T cells, which becomeactivated effector cells able to recognize and kill tumor cells expressing the peptide/MHC complex. Tumor cells and regulatory T cells (the latter characterized by the co-expression of CD25 and CD4) can produce immunosuppressive factors that may inhibit both the maturation of dendritic cells, and the activation of T cells

Interaction between innate immunity cells (NK cells, macrophages) and HLA-restricted immunity against tumor. NK cells can facilitate adaptive immune response by increasing the availability of TAA and danger signal mediators in the tumor microenvironment, thus favoring dendritic cell maturation. This would lead to enhanced priming of T cells, which ultimately sustains an effective HLA-restricted immune attack against cancer cells. NK cell activity can be impaired by ROS, which are produced by macrophages present in the tumor microenvironment. Some substances (e.g. histamine and IL-10) inhibit ROS production by macrophages, thus stimulating NK cell function.

Specific pathophysiology of a gene therapy side effect

Factors that regulate acute secretion of insulin from cells

Antisense therapeutics in cancer trials

Figure 1. Schematic representation of transcriptionally targeted gene expression. Tissue- or cancer-specific promoter-driven reporter or therapeutic gene is incorporated into a gene delivery vector (depicted as recombinant adenovirus here). Gene transfer can occur in both targeted cancer cells and non-targeted normal cells. However, transgene expression can only occur in cancer cells due to the presence of transcription factors competent to mediate expression of the specific promoter. Red squares denote the endogenous gene product expressed from the specific promoter. The swirls denote the reporter/therapeutic gene product.

Figure 2. Binary approaches to amplify activity of weak promoter. (a) Two-step transcriptional amplification. The specific promoter drives expression of a synthetic transcriptional activator, GAL4-VP16, which in turn binds to and activates the GAL4 responsive promoter of the reporter or therapeutic gene. Multiple GAL4-VP16 activators work in concert to synergistically activate transcription of the downstream gene (denoted by upward sweeping arrow). (b) Cre-mediated activation of gene expression. Cre recombinase expression is regulated by a tissue- or cancer-specific promoter. Activation of transgene expression is induced by removal of the translational inhibition sequence via a Cre-specific recombination between the two loxP sites.

Figure 3. Estimation of the sensitivity of optical imaging. Prostate cancer cells, LNCaP, were infected by recombinant adenovirus expressing FL driven by CMV promoter (AdCMV-FL) at MOI 10. Two days after infection, cells were harvested and resuspended in 50  l sterile phosphate-buffered saline+50  l Matrigel (BD Biosciences), and injected intra-peritoneally. On the same day of cell implantation, mice were imaged in Xenogen IVIS charged coupled device camera after administration of 200  l D-luciferin substrate (15 mg/ml). Optical signal intensity (listed below images in relative luminescent units per min of acquisition, RLU/min) is roughly proportional to the number of AdCMV-FL-infected cells (listed above the images). The negative control cells were infected with AdCMV-TK.

Figure 4. Verification of positive optical signals. Animals bearing prostate tumor received 3.6 or 7.2×107 infectious units of prostate-targeted adenovirus, AdPSE-BC-FL, administered via the tail vein. (a) Histological analysis to assess positive signal. Twelve days after administration, an optical signal was observed in the lung (left panel) of an animal that received 3.6×107 infectious units of virus. The positive optical signal in this animal was correlated with the presence of metastatic human cancer cells in the lung (right panel). Cancer cells in the lung sections were visualized by confocal microscopy using CY-3 conjugated (red) human-specific pan-cytokeratin antibody (BioGenex Laboratories). Lung blood vessels were visualized by FITC-lectin (green).

Figure 5. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) to detect the presence of tumor cells in the lung. Semiquantitative RT–PCR was used to detect the presence of prostate-specific antigen (PSA)-expressing human cancer cells. The animals in the left and right panel received 3.6×107 and 7.2×107 infectious units of AdPSE-BC-FL, respectively. At 21 days after viral injection, the animal in the left and right panel displayed positive and negative lung signals, respectively, after organ isolation. Thirty-five cycles of PCR amplifications performed on the lung extract revealed a low-intensity positive band detected by PSA-specific primers (the animal in the left panel). No PSA transcripts were detected in the lung of the optically silent animal (right panel). Androgen receptor RNA was detected in the lung of non-tumor bearing (naïve) animals (negative control). Tumor tissue extract served as positive control.

Figure 6. Dynamic imaging of androgen receptor (AR) function in tumors. LAPC-9 tumors grafted in SCID mice were injected with 107 infectious units of AdTSTA-FL. Optical signals were monitored by charged coupled device imaging repetitively at the specified days following injection. Animals castrated at 5 days following viral administration displayed a more rapid decay of intratumoral signal, compared with the non-castration animal. AR immunohistochemical staining of the respective tumors showed that depletion of testicular androgen correlated with the diffusion of AR into cytoplasm, compared with a predominant nuclear localization in the intact animals. Heterogeneity in AR staining was observed in tumors, both in intact or castrated animals.

Cationic polymers most frequently used for nucleic acid delivery.

Example of a polyplex modification with triggered intracellular DNA release. RPC, reductively cleavable linear polycations