TRNG I HC M TP. H CH MINH KHOA CNG NGH SINH HC ---oOo--- Gio trnh thc tp CNG NGH T BO NG VT (p dng cho sinh vin nm 3, cng ngh sinh hc)

Ph trch PGS.TS Trnh Hu Phc CN. Lao c Thun TP. HCM, nm 2011 Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt 2 NI QUY THC HNH ---oOo--- 1-Sinh vin khi i hc thc hnh phi i ng theo gi quy nh, nu i hc tr 15 pht so vi quy nh th xem nh vng bui hc ngy hm .2-Sinh vin khi i thc hnh phi c k cc bi thc hnh trc khi n lp. Sinh vin cn phi c k v nm c cc thao tc trong phn hng dn th nghim, ghi nhn li kt qu thu c trong sut qu trnh thc tp 3-Khi n phng thnghim,sinh vin phimc o Blouse vtunthttc ccquytc caphngthnghim,tunththeoshngdncathychngdn.Sinhvin khng mc o Blouse s khng c tham gia bui hc. 4-Sau mi bi thc hnh, sinh vin cn phi nm r cc thao tc c bn, ngha ca cc th nghim cng nh kt qu th nghim t c. 5-Trong qutrnhthc hnh,sinh vin khngc tiuchnhcc thitb my mc nh cn in t, my ly tm, bp n nhit v chuyn di v tr ca chng. Khi s dng, cn phi hi kin ca thy c ph trch. Cc dng c ha cht khng c s dng mt cch ln ln, phi c k trc khi s dng, khng c t di di ra ch khc. Cc l ha cht sau khi s dng phi ng np y kn cn thn. 6-Sau khi lm thc hnh, phi dn dp v sinh ch ngi, ra ton b dng c th nghim7-Bi tng trnh mi nhm vit v np vo ngy cui cng ca chng trnh hc thc tp. Trong bi tng trnh cn ghi r kt qu thu nhn v gii thch bin lun kt qu thu c. 8-iu kin thi kim tra cui kha, sinh vin phi tham gia y cc bui thc hnh v np y cc bi tng trnh. i vi trng hp vng, phi c giy php xin ngh v hcbvomtbuikhc.Vngmtbuihcthctpkhngphp,khnghcbs khng c tham gia thi kt thc mn hc. 9- Tt cmi thcmclin quan n mn hclinhvithy c phtrch cgii p. PTN SINH L NG VT Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt 3 NI DUNG THC HNH ---oOo--- Bi 1. Thu nhn t bo gan t m gan. Bi 2. nh gi cht lng tinh dch. Bi 3. p sut thm thu, nh sc bn hng cu. Bi 4. Kho st tc dng dc ca thuc Furosemid. Bi 5. M phng s vn chuyn ion qua mng. Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt 4 BI 1. THU NHN T BO GAN T M GAN ---oOo--- I. I CNG Tch t bo l giai on u tin ca qu trnh nui cy s cp t bo ng vt c tch ra tmhaycquan. Vic tch tbo ltchchngthnhcc tbo ringr t nhng mnh m v cho chng bm vo gi th ph hp. Vic tch t bo c th thc hin bng phng php c hc hay enzyme to thnh mt dch huyn ph t bo. Hu ht cc t bo bnh thng (tr t bo mu) u cn gi th bm, sng v pht trin vi hiu qu cao nht. Tuy nhin, nhng t bo ung th c th pht trin trng thi l lng trong mi trng. Cnhiuloienzymesdngtchtbonh:collagenase,elastase, hyaluronidase, pronase nhng trypsin c s dng hiu qu nht v ph bin nht v hiu qu tch t bo cao, v gi thnh r. Trypsin l mt enzyme c bn tnh l protease, c kh nng tch hon ton t bo t m bng cch thy phn cc protein lin kt cc t bo vi nhau, cc ni peptide gia cc amino acid vi nhau. Cng do c tnh ny nn trypsin cng c th lm tn thng mng t botrong qutrnhtch,lmgim slngt bo nthunhn c, do t c hiu qu cao trong qu trnh tch th cn phi xc nh nng enzyme v thi gian tch ti u. Hnh 1. V tr tc ng ca Trypsin Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt 5 II. MC CH TH NGHIM Ti u ha iu kin tch t bo gan bng trypsin trn hai ch tiu kho st: nng trypsin v thi gian . -Nng trypsin: 0.10%; 0.25%; 0.40%. -Thi gian : 30 pht; 60 pht; 90 pht. III. I TNG, HA CHT, DNG C TH NGHIM 1-i tng: mu m gan heo. 2-Ha cht: dung dch PBS (Phosphate Buffer Saline), dung dch Trypsin 1%. Dung dch PBS 20X (1 lt) -KCl4 g -KH2PO44 g -NaCl160 g -Na2HPO4.12H2O57.7 g -nh mc nc ct 1 lt. 3-Dngcthnghim:knhhinvi,mylc,bungm,lammelle,pipetman, erlen, bercher (50 mL, 100 mL), ko, pippette (1 mL, 2 mL, 5mL), qu bp cao su, giy bc, ko, kpIV. THC HNH -Tin hnh cn ba mu m gan c trng lng 5 gram. -Cho 3mugan vo2 becher,tin hnhravi dungdch PBS(2 n 3 ln) cho sch mu. -Tinhnhdngkoctthtnhuynmgan,sautinhnhravidung dch PBS nhiu ln cho n mu chuyn sang mu trng nhm loi ht ton b t bo mu trong mu. -Chuyn 3 mu ct vo 3 erlen c nh s t 1 n 3, tng ng vi nng 0.10%; 0.25%; 0.40%. c c nng kho st, tin hnh pha dung dch PBS v Trypsin theo t l di y: oErlen 1: 18 mL dung dch PBS + 2 mL dung dch Trypsin 1% oErlen 2: 15 mL dung dch PBS + 5 mL dung dch Trypsin 1% Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt 6 oErlen 3: 12 mL dung dch PBS + 8 mL dung dch Trypsin 1% -y np cc erlen bng giy bc v t trn my lc. -Sau 30, 60, 90 pht, ly mu mi erlen v xc nh mt t bo trong dung dch bng bung m hng cu. Lu : cn phn bit t bo gan v t bo mu. -Tin hnh xc nh mt t bo bng bung m hng cu Neubeuer (Tin hnh m mt t bo trong 5 vng ln A, B, C, D, E ca bung m). -Cng thc tnh mt t bo/ mL D = A/5 x 104 D: mt t bo trn 1 mL (T bo/ mL). A: Tng s t bo m c trong 5 vng. -Tin hnh xy dng th tng quan gia nng v thi gian tch v xc nh iu kin ti u. Hnh 2. T bo gan quan st di knh hin vi. V. YU CU -Xc nh c mt t bo n sau khi tch cc ch tiu tch khc nhau. -Sosnh, nhgimitng quangiamt tbothucvinng Trypsin v thi gian khc nhau. -Xc nh c iu kin tch ti u. Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt 7 BI 2. NH GI CHT LNG TINH DCH ---oOo--- I. I CNG ng vt hu nh, vic th tinh l s kt hp gia giao t c (tinh trng) v giao t ci (trng) ti v tr 1/3 ngoi vi t cung to thnh hp t, hp t pht trin thnh phi, phi pht trin thnh c th mi. Ngy nay, mt trong nhng cng ngh mi, hin i trong lnh vc h tr sinh sn c quan tm n l Th tinh trong ng nghim (In vitro fertilization IVF).IVF lqu trnh ht hp gia tinh trng v trng to thnh hp t c thc hin bn ngoi c th m, ti phng th nghim. Tuy xy ra ngoi c thnhngcciukinchoqutrnhIVFnhmitrng,nhit,m, nhtcng cc ch s sinh hc khc phi ging nh trong c th m.Vic thu nhn s lng ln cc t bo sinh dc gm t bo trng v tinh trng l mt yu t thit yu v l giao on u tin tronglnh vc th tinh nhn to trn ngi v ng vt. Cc t bo sinh dc thu nhn phi m bo cc yu cu thit yu v cht lng nhm t kt qu tt cho th tinh in vitro. Trong bi thc hnh ny, sinh vin tin hnh nh gi mt s ch tiu c bn ca tinh dch. 1-S lc v sinh l cu to tinh trng Cu to tinh trng gm 3 phn: u, thn v ui. -Phn u: cha th nh acrosome, y l ni gii phng cc enzyme gip cho tinh trng c th xm nhp vo trng. -Phnthn:chatyth,clinquanncchotngchuynhachtv nng lng. -Phn ui: gip tinh trng vn ng. S lng tinh trng: chim 5% th tch tinh dch (95% dch tit: Cht dch l mt hn hp baogmdcht ng dntinh (60%),dchtti tinh (30%), dcht tuyn tinlit (10%)v mt phn rt nh do mo tinhhon, tuyn hnh niu o sn xut). ngi, Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt 8 trung bnh c 3 mL cho mt ln xut tinh, s lng tinh trng t t 60 120 triu t bo/ mL, t l sng phi trn 80%...S sinh tinh xy ra gn nh sut i sng c th c. Hnh 3. Cu to tinh trng 2-Thu nhn v nh gi cht lng tinh dch Phng php ly mu tinh dch phi tun theo hng dn c th. Tinh dch phi c ly sau khi giao hp t nht 48 ting v khng qu 7 ngy, gim thiu nhng thay i trn kt qu phn tch. Ttnhtlmu tinh dch ctin hnhlytrong phngring nm cnh phng xt nghim, nu khng th c th c ly ti nh (nhng phi m bo iu kin v trng), sau em n phng xt nghim trong vng 60 pht. Nhit thch hp cho vic gi mu mang t nh n phng xt nghim khong t 20 40oC. Tinh dch phi c ly y cho n khi xut tinh hon tt.Mu tinh dch c tin hnh thu nhn bng cch th dm v cho xut thng vo mt l thy tinh hay l nha c ming rng v c gi m trong khong nhit trn. Trong mt s trng hp yu cu v xt nghim vi trng trong mu, ngi n ng phi i tiu trc sau ra tay v dng vt sch mi c th cho xut tinh vo l.Trong mt s trng hp c th dng bao cao su c bit chuyn dng cho vic ly tinh thay th cho l thy tinh, lu rng khng c s dng bao cao su thng thng ly tinh v s lm cht mt lng ln tinh trng. Vic nh gi tinh trng cn tin hnh nhanh chng, chnh xc v cn thn. Cc ni dung ch yu nh gi cht lng tinh dch: Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt 9 -Ly tinh: ngy thng nm ly tinh, phng php ly tinh, nhit khng kh, qu trnh vn chuyn, bo qun -nh gi i th: lng xut tinh, mu sc, mi, keo dnh, pH, tl d dng-nh gi vith:mt tinhtrng,tinhtrng khnh, sc khng ca tinh trng, t l tinh trng sng cht, sc hot ng ca tinh trng (thng tinh dch c kim tra ngay di knh hin vi). -Nhngnhgikhcdngtrongnghincu:tnhtrngacrosome,psut thm thu, nht t trng -Ging di truyn, th trng con vt. - II. MC CH Tin hnh kho st mt s cc ch tiu sinh l ca mu tinh dch. -Ch tiu nh gi i th: pH, keo dnh. -Ch tiu nh gi vi th: mt tinh trng, t l tinh trng sng cht, t l tinh trng k hnh. Tin hnh ng lnh tinh trng, gii ng, kho st t l tinh trng sng/ cht sau khi gii ng. III. I TNG, DNG C, HA CHT 1-i tng: Mu tinh dch heo. 2-Hacht:dungdchNaCl3%,dungdchphalongtinhtrng,thucnhum Eosin 1%, Nigrosin 10% Dung dch m tinh trng 1X (1 lt) -NaHCO350 g -Formol10 mL -Xanh methylenert t -nh mc nc ct 1 lt. 3-Dngcthnghim:bercher, erlen, eppendorf,micropipette,utip, cryotube, bung m neubeuer, lamelle, lame, knh hin vi Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt 10 IV. THC HNH 1-nhgi pH pHc tin hnh nhgi ngay saukhixuttinhmt ting. Lymt git tinh dch c pht u trn giy pH. Sau 30 giy, ni b thm s him mu u. Tin hnh so snh mu ny vi bng mu pH, t xc nh c pH ca mu tinh dch.-Ch tiu pH i vi tinh trng ngi: 7.2 8.0 (Theo WHO) -Ch tiu pH i vi tinh trng heo: 6.8 8.1 (Theo Greenfeel VN) 2-nh gi keo dnh ( nhy, qunh) keo dnh ca mu s c c lng bng cch ht nh tinh dch vo pippet 5 mL, sau nh 1 git t do v ghi nhn di ca si. Mt tinh dch bnh thng keo dnh khng c qu 2 cm ngha l di si khng c ko di qu 2 cm. Mt phng php khc cng c p dng l dng a thy tinh quy nh trong tinh dch, sau ko nh que ln, quan st di ca si, di cng khng c ko di trn 2 cm. 3-Xc nh mt tinh trng (C) Mt tinh trng (C) c nh ngha l s lng tinh trng trong 1 mL tinh dch.-Ch tiu mt tinh trng ngi: > 20 x 106 TB/ mL. -Ch tiu mt tinh trng heo: 100 300 triu TB/ mL. Tin hnh th nghim -Thc hin vic m tinh trng heo bng phng php m hng cu. Ngi ta tin hnh pha long tinh dch 20 ln. -Tinhnhphalongbngngtrnbchcu:tinhnhhttinhdchlnti vch 0.5, sau ht tip dung dch pha long tinh trng ti vch s 11. -Sau tin hnh lc u. -t lamelle ln bung m. -Nh mt git tinh dch pha long trn vo bung m (Lu : nh b 2 3 git u). -Tin hnh quan st v m s lng tinh trng hin din trong 400 nh ca 25 ln (vng E ca bung m hng cu). -Mt tinh trng c tnh theo cng thc sau: Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt 11 C = N x 104 x pha long C: mt tinh trng trong 1 mL tinh dch (t bo/ mL) N: s t bo tinh trng c trong 400 nh ca 25 ln (t bo) Hnh 4. Hnh nh tinh trng quan st di knh hin vi 4-Xc nh t l sng cht, k hnh Tinhnhnhgitltinhtrngsngchtthngquaphngphpnhumtinh trng bng thuc nhum Eosin, Nigrosin. Khi nhum, tinh trng sng th u tinh trng khng bt mu. Ngc li, nu tinh trng cht th u tinh trng bt mu hng ca thuc nhum. -Ch tiu t l tinh trng sng/ cht: o ngi: > 75% o heo: > 70% -Ch tiu t l k hnh: o ngi: > 1(mngchn lc cation)thinth mng c quyt nh bi cation: + E = 58 .2 loguc+ui+ (4) Trong : ao v ai l lc ion bn trong v bn ngoi mng. -Trongtrnghpt sP+/P-