giza haziko peptidasak eta gizonezkoen ugalkortasunaren
TRANSCRIPT
Giza haziko peptidasak eta gizonezkoen ugalkortasunaren asaldurak
Jakintza-arloa: Medikuntza
Egilea: ASIER VALDIVIA PALACIN
Urtea: 2005
Zuzendaria: JON IRAZUSTA ASTIAZARAN
Unibertsitatea: UPV/EHU
ISBN: 978-84-8438-622-3
Hitzaurrea
Lehenengo eta behin, UEUri eskertu nahi nioke, ikerkuntza lan honen argitaratzea
aurrera eraman nahi izanagatik. Alde batetik, lan hau euskarazko publikoarentzat
interesgarria suertatu daitekeela pentsatzeagatik eta liburu modura ematen dioten
hedapenagatik. Gainera, aspaldian irakurtzen ez nuen nire tesi oroitidazkiarekin
berriz harremanean jartzera bultzatu naute, eta garai gazte haietako oroitzapenek
berriz ekartzeko beta eman didate.
Ikerkuntza lan hau euskaraz egitera eraman gaituzten arrazoiak anitzak dira. Alde
batetik, nire motibazio pertsonalak, euskaraz haur-eskolatik ikasi izateak, horretara
bultzatu ninduen. Gurasoek, erdaldunak, euskaraz ikastea ziurtasun gutxiko apustua
zenean, eta euskarazko hezkuntza arautua oraindik jaiotzen zegoenean egin zuten
aukerari balioa eman nahi izan nion. Unibertsitate malako ikasketak ere euskaraz
egin nituela, eta euskararen aldeko jarrera proaktiboa zuen laborategi batean
(EHUko Fisiologia Saileko Jon Irazusta eta Javier Gil irakasleen zuzendaritzapean,
Fisiologia Zelularreko laborategia) sartu nintzela ere oso baldintza aproposak izan
ziren, doktore-tesia ere euskaraz egiteko.
EHUko ikertzaileen formaziorako diru-laguntza bati esker, lan honi hasiera eman
zitzaion Jon Irazusta (besteak beste, Euskara eta Eleaniztasun Errektoreorde
izandakoa) eta Javier Gilen proposamenez. Tesia euskaraz idaztea ia hasieratik,
modu naturalean, hartutako erabakia izan zen beraz. Gure laborategiko ikerketa
lerroa neuropeptidoen metabolismoaren ingurukoa zen nagusiki garai hartan.
Neuropeptidoak, izenean doakien bezala, neuronen arteko komunikazioan
inplikatutako seinale molekula peptidikoak dira, baina tesi lan honen izenburutik
ulertu daitekeenez, lan honetako ikerketa giza ugalkortasunaren inguruan dihardu.
Ikergai hain ezberdinen arteko saltoa, neuropeptidoak nerbio sistemako seinaleak
izateaz gain, beste ehun eta sistema ezberdinetan, oso funtzio heterogeneoen
modulazioan harremanak topatu zirela kontutan izanik, modu errazagoan ulertu
daiteke. Gainera, peptido hauek puskatzen dituzten entzimak, peptidasak, nahiko
hedapen zabala dute giza ehunen artean, hauek benetan, peptidoak baino gehiago,
ikerlan honen helburua direla. Beraz, entzima hauen ikerketa hasi genuen, horietako
bat giza hazian deskribatua izan zela, ernalkuntzaren erregulazioarekin harremana
zegoela bibliografian behartu genuenean.
Horrela gauzak, eta esperimentazio epea bukatuta, tesiaren oroitidazkiaren idazketa
prozesua hasi zen. Terminologia teknikoa eta zientifikoa euskaratzeak sarritan, nahi
baino gehiagotan, hitz berriak asmatzera behartzen gintuen (hitz eratorriak, hitz
elkartuak, hitz konposatuak… uff). Askotan ere maileguen erabilera inposatzen zen;
hitz berriak sortzea euskararen aberastasunaren aldetik interesgarria bazen,
ikuspuntu tekniko batetik oso artifiziala edota testuinguru kanpokoa gerta liteke, tesi
oroitidazki batek izaten ohi dituen arau zorrotzekin, eta ikerkuntza medikoak dituen
kutsu kontserbadoreak kontutan izanik. Beste kontu bat, ikertutako entzimen izenen
grafia izan zen. Nik, izen berezi bezala hartu eta hitz larriz idatzi beharko genituela
lehendabiziko hizkian; zuzendariek, minuskulaz idazteko, irakurketa ez
korapilatzeko….
Idazteko prozesua aurrera zihoala EHUko ikerlarien prestakuntzarako beka bukatu
zitzaidan. Garai horretan, zuela gutxi, EHUk Euskaraz Tesia Idazteko diru-laguntzen
deialdiak sortu zituen, Euskara Errektoreordetzaren eskutik. Ni baino lehen, Gorka
Larrinaga doktoreak gure laborategian eskatu zuen laguntza hau bere lehendabiziko
deialdian, eta bere atzetik nik. Zerbitzu horretako pertsonala benetan lagungarria eta
adiskidetsua iruditu zitzaidan.
Azkenean, alea bukatuta zegoela, Doktore tesiaren defentsarako epaimahaia
bilatzeko prozesua hasi zen. Doktore euskaldunak, ikerketaren gaian adituak edo
behintzat lotura zutenak, EHUkoak zein kanpokoak, emakumeak zein gizonak… Ez
zen erreza izan. Hemendik ere, euren burua epaimahaian parte-hartzeko eskaini
zutenei, bihotzez mila esker.
Ez nuke hitzaurre hau bukatu nahi, nire aldamenekoei eskerronak berriztu barik.
Garai horietatik honetara, ikerketarako motibazioa eta nire lorpenetan oinarri izan
diren lankide, adiskide, senitarteko eta bereziki Beronika, nire bikoteari, nire
alferkeriarako joera naturalaren aurkako botikarik onena delako.
Asier Valdivia, 2017ko urria.
Eman ta zabal zazu
Universidad Euskal Hernko del País vasco Unibertsitatea
MEDIKUNTZA ETA ODONTOLOGIA FAKULTATEA FISIOLOGIA SAILA
GIZA HAZIKO PEPTIDASAKETA
GIZONEZKOEN UGALKORTASUNARENASALDURAK
Asier Valdivia Palacín (2005)
UNIVERSIDAD EUSKAL HERRIKODEL PAIS VASCO UNIBERTSITATEA
Eman ta zabal zazu
GIZA HAZIKO PEPTIDASAK
ETA
GIZONEZKOEN UGALKORTASUNAREN
ASALDURAK
DOKTORE-TESIA:
Asier Valdivia Paladn
Fisiología SailaMedikuntza eta Odontología Fakultatea
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín
David Artola Blancori
Oraindif^eta Setira^o
gure 6iíiotzean ,
Doktoie-Tesia Asier Valdivia Palacín
,(Ez, ez zaitez satatu. (Egin aCa ez egin,
6aina ez zaitez saiatu"
(V
Ondorio 6eza(a, oso gutjçi dafyguth, eta ñata ere, Harrigarria da zenBat ezagutzen cfugun.
fita harrigarnagoa, fiain ezagutza tyj^ia^fiorrenôeste Botere ematea('Bertrand usseH)
Doktoie-Tesia Asier Valdivia Palacín
(Pertsom Baten Bizitza ez da prozesu (errozuzena, Bizipen ugariren gainjarpena eta
■proiefytu anitzen garapena Baizi^ Jfoizean Behin, atzera Begiratzefcg Beta azaCtzen zaigu, asfcgtan
proieptu fiorictakp 6at Bupaize^p Bidean dagoenean. 'Momentu haietan, niri Behintzat, Beti
etortzen zaizhit arin Burura Bizitzaren ataChorretan (agundu nautenpertsom^
jlsf{otan gaCdetu izan diot neure Buruari, Beste tofciren datera fan egitera, ikertzera erori
izan Banintz, nere Bizitza orain noCakoa izango ote zen, ÇaCdera ñau ez da 6a tere zientifiÑoa ezta
arrazionafa ere. Stephen J. Çouûf eBoCuzionista ameriharrah defendatzen duen Ñpntingentziaren
kimtzeptmf^ ziurasÇtnire Bizitza guztia atdaraziho 6aiCu$e: 5Vz ez nintefce ni, edo horreCakp
zerBait. J&CaBaina, gaCdera horren jatorria, Beste ÇezÇa xehego, sentipenezho Bat da: nire inguruan
izan denjendeguztiaren ordez Beste pertsona Batzuh^Badra, egin dudanaren antzekp zeozer Burutu
ahaCizango nuhe? erantzun BezaCa, arrazoia ,"SaCiteke” eta BihotzaPJ'ezelz" esaten didate.
Luzatzen fasiii naiz eta horrenBeste pertsonari es^erraf^emate^o eta gogorapena^egite^o
tofci txifci, txiÇiegi, hau agortu^p dut. <Beraz, fiasi gaitezen CehcnBaikfieiv
LehenBizi, EJTV-Çp Jdedikuntza eta OdontoCogia ‘FaÑiiftate^p ‘FisioCogia SaiCari, Bertan
egin didan harrera eta ifcertzeÇo eman didan auÑeragatif esherrai eman nahi izan nizftiofcg. Tesi
honen garapem eta ehoizpena iraundu duen Bitartean izandahp firu zitzendariei, Juan ManueC
Çandarias y (Bajón, Temando JQinz eta (Begoña Ochoa Irafccisk (Do torei. JfawÇin Batera, saiCei{o
ira asCe, Be^adun eta JlZ<Pf(p guztiei (Berezifci, Luis Casis-% taCde honen sortzaiCea izateagatii^eta
<David eta Monica, orain Vtah-n Bizi direna^ Çazteiz^o ‘Enrique eta Bere taCdeari eta Juan
íMúgica-ri, i%erfceta~iCdo ñau zaBaftzeho aukera eman ziguiafco.
Ej ferra Bihotzez (haie^ jaftin Behar o Cuhete zein madaraino...), nire tesi honen
zuzendariaf^diren, Jon Irazusta eta Javier Çif Irafcask (Dohtorei
EsÑer anitz (Donostia^o (Erizaintza ‘Eshptari, Bere irakaste eta JLZ<P oei eta Berezipi
Çorosti taCdefco partaideei, egin didaten harreragatiki eta Behar izan dudan edozerrerahp eman
dizhjdaten errazLasunengati^
Esfer mita, (BifBoftp Euscalduna %finif¡ari eta zefiazpi ñango seminoCogia iaBorategia eta
Lagundurihp Vgalfteta unitateari eman didaten CaguntzagatiEsher Bereziaf Carmen Ochoari,
ESKER ONAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín
<Vertsona Gaten Bizitza ez da prozesu úrrozuzena, 6izipen ugariren gainjarpena eta
praicÇtu anitzen garapena ñaizií íNoizean Behin, atzera Begiratze^o Beta azaCtzen zaigu, askotan
proiefctu ñorietaf{p Bat Bufiatzefto Bidean dagoenean. Momentu ñaietan, niri éeñintzat, Beti
etortzen zaizkil arin burura Bizitzaren ataChorretan fagundu nauten pertsonaf^
jisfiotan gaCdetu izan diot neure Buruari, Beste toftiren Satera Can egitera, ikertzera erori
izan Banintz, nere Bizitza orain noCaíipa izango ote zen. ÇaùCera ñau ez da Bátete zientififcpa ezta
arraziom(a ere. Stephen J. ÇouCd eBoCuzionista amerifcarra defendatzen duen ftontingentziaren
£pntzeptua$¿ ziurasfci, ñire Bizitza guztia afdarazi/îo BaiCuÇe: ffî ez ninte^e ni, eda horrefkkg
zerSait. JltaBaina, gaCdera horren jatorria, Beste f{ezf{a xehego, sentipenezfco Bat da: ñire inguruan
izan denjende guztiaren ordez Beste pertsona 6atzuf{ 6aRra, egin dudanaren antzekg zeozerBurutu
aíiaCizango nu eP erantzun BezaCa, arrazoia^‘'6aCite e" eta Bihotza^ “ezetz" esaten didate.
Luzatzen fiasia naiz eta íorrenBeste pertsonari esÇerra ematefco eta gogorapenaf egitefco
tof{i txtkl, txikjegi, hau agortuko dut. (Beraz, fiasi gaitezen íehenBaiCeñeiv
LehenBizij TJíV-ko íMedi^untza eta OdontoCogia ‘FaÇuCtatefco TisioCogia SaiCari, Bertan
egin didan fiarrera eta iÇertzeÇp eman didan aukeragatif es fierra^ eman nafii izan nizkiof e. tfesi
ñoiien garapem eta eÇoizpena iraundu duen Bitartean izandafio fiiru zuzendariei, Juan ManueC
Çandarias y (Bajón, Femando Jlinz eta (Begoña Ochoa IrakasCe (DoÇtorei Haueftin Batera, saiCe o
irafcasCe, Be^adun eta JïZ<Pfcp guztiei (BereziÇi, Luis Casis-i, tatde honen sortzaiCea izateagatif^eta
(David eta Mónita, orain Zltafi-n Bizi d ir e n a ÇazteizÇo Enrique eta Bere taCdeari eta Juan
Múgica-ri, iÇerÇeta-iCdo hau za6aítze(¡o aufcera eman ziguCafco.
c£s^errakj, Bifiotzez (haief jakin Beharfco Cuñete zein maiCaraino...), ñire tesi honen
zuzendariaí^diren, Jon Irazusta eta Javier Ç'iCIra asCe <Dof{torei
%sker anitz (Donostia^o ‘Erizaintza ‘EsÇolhri, Bere impaste eta JlZ<P%pei eta Berezifti
Çorosti taCdef{0 partaideei, egin didaten harreragati£ eta Behar izan dudan edozerrerafco eman
dizfÿdaten erraztasunengatif^
‘Es^er miCa, <BiCBofcg ‘EusÇaCduna %Cini%ari eta zehazfti hango seminoCogia CaBorategia eta
Lagundurikp VgaCÇeta unitateari eman didaten [aguntzagatü(Es^er Berezia£ Carmen Ochoari,
ESKER ONAK
Asier Valdivia Doktore-Tesia
Bere adeitasunagati^ eta Bere motiBazioagali^ lEsí¡erra j ere (Euscara Errektoreordetza^o
perlsonaCan, 6ere laguntza eta arduragati
Orain 6ai, ez ditut afiazluko ñire eguneroka (anfcideaf (Berriz ere, Jon, taíde^o Bi piéote
antofatzai(eetaf{p 6at, egiten ari nintzenaren konfidantza gaCtzear nengoeCa gora egiteagatif^ eia
datua£ i$ustef¡p eta ideia£ gauzaizebp duen aBi(eziagati^¡, Javi, Beste piBotea, taídekp Burn
pragmatista, BeragaBe oraindi£ Cunaren hasieran egongo nintzateke. ¡Defentsa Canetan, Çorüa
(txjstufariafi ñamaéitan) eta JldoCfo (may the force Be with you), zentraCe moduan, antagoni^o-
osagartiafc Bata musitan armeniozalka, Bestea %ariBe Migaren aûdeÇp porroÇatua, Bie^ dute
soCasera o eta azaCpenetarafip aBiiezia. !HegaCetan, ‘Fatima (giro t%arra ivçatu egiten dueCakg) eta
fíaiara (ñire Confidente gogo faena) ipiniftp nituzÇe. (Ri fiauen dizipCina eta seriotasun efiunekp
BatareÇin poztufcp nintzateÇe. <Defentsaren aCBoetan, JLmaia, edozeingaiari Buruz^o eztaBaidarako
Beti prest, eta Itziar, (nperíangiíe eta ^afectarako Beste fitiqije on Bat. yï tezain moduan, Jaime, tofc
guztitan egotefip eta gauza guztitaz arduratzefio duen gaitasunagati4. Jlurrefari moduan Eíiaitz
Bfotting-aren “sheriff'-a, izotz-^utxa esítuetan duela, Broma gutoq; Leire eta Nerea, haief^Bait dita
etorfazuna. <Ez ditut añaztu nafii. ziBer-lítcna eta Susana, Beti [aguntzefco eta entzutekg prest...
(Bu^atzera noaCa, adisfcideei ñire tesiari Buruz Baziíada^egin arren, Benetan arduratu izan
direCako. <Esf(erraf¡¿ Eran, (paBCo, Igor, íMifieC eta Nerea, Zigor, If¡er, (Ramón, Juíen, Josu, Jlr^atu,
Imaz, Eder, Santi, Jo%e, Itiçaz, Sergio, 'Jfaritz, Enefip, (pifcutaraftp nes%a$¿ “Çaizfiiaren ardatza"...,
IñaÑi, Mvaro, Jain(af(¡, Ene^o,... JímaLur, ÇoitiBera eta EECñkpei... ez nufte inoiz Bu^atukp.
Nirefiin uniBertsitatean iBiCitafto lagutiei Jíemen ere, aipamen Berezi Bat gazteegijoan zaizfÿgun
(David Jírtoía, (agun minarentzat, tesi hau Berea Bait da, maiCa dandi Batean, eta Beragati£
taBorategian sartu nintzeüÇo (egin dut!)etaXaBi Cotorentzat, dueCa egun guú(i utzi Baitgaitu.
Jlzkenil^ etxefipei. Jlma, JLita, Çorfia, eta Conchi ere, ema(te)n didazuen guztiagati
Bada izue. (Beronifcari, ni aguantatzeagatii^ eta den-denagatifa, eta Bere famiíiari !Nire famiCiafio
Beste guztiei, rtosf(i, eta gogoramen Bereziaz amona IsaBeCeta Laurirentzat.
Çuztiet\
M i í a e s k e r
ESKER ONAK
Doktore-Tesia Asict Valdivia Palacín
AURKIBIDEA
AURKIBIDEA
Doktore-Tesia Asiet Valdivia Palacín
AURKIBIDEA
1. S A R R E R A 1
1.1. GIZA UGALKORTASUNAREN GAIA
GAUREGUNGO GIZARTEAN 3
1.1.1. Giza haziaren analisia: Normaltasuna eta Patología 6
1.2. GIZONEZKOEN UGAL APARATUA 10
1.2.1. Garapen enbrionarioa 10
1.2.2. Ugal aparatu arraren egiturak 11
1.2.2.1.Barrabilak 11
1.2.2.2.Epididimoa 12
1.2.2.3.Hodi Deferenteak 12
1.2.2.4.Guruin osagarriak 13
1.2.3. Esperraatogenesia 16
1.3. ESPERMATOZOIDEAREN EGITURA ETA
PROZESU FISIOLOGIKOAK 19
1.3.1. Espermatozoidearen egitura 19
1.3.2. Espermatozoidearen heltzea 23
1.3.3. Espermatozoidearen motilitatea 26
1.3.4. Kapazitazioa 28
1.3.5. Erreakzio Akrosomikoa 30
1.4. HAZIAREN BESTELAKO OSAGAIAK 31
1.4.1. Likido Seminala 31
1.4.2. Prostasomak 32
AURKIBIDEA
Asier Valdivia Doktore-Tesia
1.5. PEPTIDO ERjREGULATZAILEEN GARRANTZI
FISIOLOGIKOA 34
1.5.1. Peptido erregulatzaileak 34
1.5.2. Peptido erregulatzaileen sintesia, metaketa eta
Jariapena 37
1.5.2.1. Biosintesia 37
1.5.2.2. Metatzea 37
1.5.2.3. Askapena 38
1.5.2.4. Hartzaileak 38
1.5.2.5. Inaktibazioa 39
1.5.3. Barne Peptido Opioideak (BPO) eta euren
eragin fisiologikoak 40
1.5.3.1. Orokortasunak eta deskribapen historikoa 40
1.5.3.2. BPOen sailkapena, ezaugarri molekularrak eta
Kokapena 41
1.5.4. TRH hormona eta bere analogoak 44
1.5.4.1. Orokortasunak eta deskribapen historikoa 44
1.5.4.2. TRHaren peptido analogoak 45
1.5.4.3. TRHaren banaketa gorputzean 4 6
1.5.4.4. TRHaren ezaugarri molekularrak,
Doktote-T esia Asier Valdivia Palacin
1.6.2. Entzefalinen entzima anderatzaileak. Aminopeptidasak
eta Endopeptidasa Neatroa 58
1.6.2.1. Endopeptidasaneutroa (EC 3.4.24.11) 59
1.6.2.2.Puromizinarekiko sentikora den
Alanina aminopeptidasa (PSA edo EC 3.4. í 1.14) 60
1.6.2.3. Alanina aminopeptidasa N edo M
(puromizinarekiko ez -sentikorra)
(APNedo EC 3.4.11.2) 62
1.6.3. TRH eta honen peptido analogoak anderatzen
dituzten peptidasak 63
1.6.3.1. Prolil Endopeptidasa (EC 3.4.21.26) 64
1.6.3.2. Piroglutamil peptidasa I (EC 3.4.19.3) 66
1.6.4. Peptidasen garrantzia ugalkortasunean 70
2. HELBURUAK 74
3. MATERIALA ETA METODOAK 81
3.1. ERABILITAKO EHUN BIOLOGIKOEN LORPENA 83
3.2. MATERIALA 84
3.2.1. Produktu kimikoak 84
3.2.2. Tresneria eta ekipamendua 86
3.3. SOLUZIOAK ETA BUFFERRAK 87
3.3.1. Soluzio indargetzaileak 87
3.3.2. Bestelako soluzioak 89
3.3.3. Saio Entzimatikoetarako sustrato-soluzioak 91
3.3.4. Zatiki azpizelularren purutasun-saioetarako
Soluzioak 92
3.4. METODOAK 93
3.4.1. Ehunen isolamendua eta giza haziaren
iaginen lorpeua 93
AURKIBIDEA
Asier Valdivia Doktore-Tesia
3.4.2. HazMaginen espermio-kopuruaren,
mugikortasunaren, morfologiaren eta
bideragarritasunaren azterketa 94
3.4.3. Lagin entzimatikoen lorpenerako prozedurak 97
3.4.4. Aktibitate entzimatikoa neurtzeko teknika 103
3.4.4.1. Aminopeptidasen eta Prolil
Endopeptidasaren aktibitatearen behaketa 104
3.4.4.2. Entzefalinasaren aktibitatearen behaketa 105
3.4.5. Proteinen kontzentrazioaren kuantifikazioa 107
3.4.6. Sustrato-kontzentrazio egokiaren doipena 108
3.4.7. Inhibitzaileen eta substantzia gehigarrien bidezko
aktibitate entzimatikoen bereizketa 110
3.4.7.1. Aktibatzaile tipikoak: EDTA eta DTT 110
3.4.7.2. Inhibitzaile espezidikoen erabilpena 113
3.4.8. Ehunen arteko aktibitate peptidasikoen konparaketa 115
3.4.9. Método estatistikoak 116
4. EMAITZAK 117
4.1. TEKNIKAREN DOIKETA 119
4.1.1. Sustrato kontzentrazio optimoa 119
4.1.2. Aktibitate entzimatikoen bereizketa 129
4.1.2.1. Inhibitzaile espezifikoen erabilpena 129
4.1.2.2. Substantzia gehigarriak EDTA eta DTT 140
4.2. AKTIBITATE ENTZIMATIKOAK:
EHUNEN ARTEKO KONPARAKETA K 150
4.3. AKTIBITATE PEPTIDASIKOAK ETA
HAZIPATOLOGIAK 161
4.4. AKTIBITATE PEPTIDASIKOAK ETA
HAZIAREN PARAMETRO EZBERDINAK 179
4.5. ZATIK3ENISOLAMENDUAREN DOITASUNA.
LAKTATO DESHIDROGENASA 187
AURKIBIDEA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín
4.6. IKERTUTAKO PEPTIDASEN BANAKETA
HAZI-ZATIKIEZBERDINETAN 191
5. EZTABAIDA 193
5.1. GIZA HAZIKO PEPTIDASAK 195
5.1.1. Entzefalinen peptidasa anderatzaileen bereizketa 196
5.1.2. TRH hormona eta analogoak anderatzen
dituzten peptidasen bereizketa 199
5.1.3. Peptidasak. ehunen arteko konparaketa 201
5.2. GIZA HAZIAREN PATOLOGIAK ETA
PEPTIDASEN AKTIBITATEAK 203
5.2.1. Entzefalinen entzima anderatzaileak eta
hazi patologiak 203
5.2.2. TRH hormona eta analogoen entzima
anderatzaileak eta hazi patologiak 206
5.2.3. Giza haziko peptidasak eta peptidoak.
Lanerako hipotesiak 208
6 . ONDORIOAK 213
7. BIBLIOGRAFIA ETA ERREFERENTZIAK 217
AURK3BIDEA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacio: 1
SARRERA
SARRERA 1
2 Asier Valdivia Doktore-Tesia
SARRERA
Doktoïe-Tesia Asier Valdivia Palacín 3
1. SARRERA
1.1. GIZA UGALKORTASUNAREN GAIA
GAUREGUNGO GIZARTEAN
Aintzinetik datorkio gizarteari bere ugalkuntzaren osasuna mantentzearen
ardura. Gaur egun ere, handia da giza ugalkortasunak duen interesa, gai honen
inguruan dauden ikerketen ugaritasunak isladatzen duen bezala. Adibidez, Estatu
Batuetan, adin ugalkorrean dauden bikoteen %15ak jaso izan du inoiz
ugalezintasunarekin erlazionatutako laguntza (Templeton, 1995). Proportzio hau
%13tik, %24ra aldatu daiteke ikerketa epidemiologikoak egin diren herrialdeetan, eta
Espainar Estatúan, prebalentzia %19’2a déla estimatu da (NOGF/FIGO, 1995). Honen
barruan, gizonezkoen ugalkortasuna etengabeko eztabaida zientifikoen iturria izaten
da. Badirudi, ugalezintasun kasu guztien %25a gizonezkoei lotutako faktoreei zor
zaiela (Templeton, 1995). Hau dela eta, gizonezkoen ugalkortasunari eta
ugalezintasunari buruz, ikuspegi ezberdinez, aritzen diren lan zientifikoak ugari dira.
Giza haziaren kalitateraren jeitsierari buruz ohartarazten diguten ikerketak
(Carlsen eta lank., 1992) honen adibide dira. Giza haziaren kalitatearen jeitsiera hau
ukatzen duten ikerketak ere badaude (Andolz eta lank., 1999; Acacio eta lank., 2000).
Giza haziaren kalitateari buruzko lan hauek arazo metodologiko ugari azaltzen dituzte.
Hala nola, gehienetan, aztertutako populazioak ugalkortasun arazoak dituzten
gizonezkoekin egiteak, lagin-bilketa prozedura ezberdinak erabiltzen dituzten lan
askoren metaanalisiak izateak, haziaren azterketan erabilitako teknikak ezberdinak
izateak edota meta-analisirako erabilitako eredu estatistiko ezberdinek ondorio
SARRERA 3
4 Asier Valdivia Doktore-Tesia
kontraesankorrak emateak, lan hauen baliogarritasuna erlatiboa egiten dute. Honen
inguruan egin diren ikerkuntza gehienak atzeranzkoak izan dira gainera, eta honelako
gaiak ebasteko interesgarriagoak omen dira aurrerazko ikerketak (Multigner eta Oliva,
2002). Dena den, gai honen inguruan argi dagoen zerbait, kalitatearen balizko jeitsiera
hori onartuta ere, jeitsiera hori ez delà unibertsala ez eta homogeneoa ere, ikuspegi
geografiko batetik begiratuz (Multigner eta Oliva, 2002; OME, 1999).
Hala ere, gizonezkoei lotutako ugalezintasunaren zergatiak anitzak dira (Wong
eta lank., 2000). Aide batetik, faktore genetikoak, endokrinoak eta jaiotzetikoak daude.
Hauen adibide dira Klinefelter sindromea pairatzen duten banakoen ugalezintasuna,
edota sexu-hormonen ekoizpena murriztua duten pertsonak. Bestalde, gaisotasunen
batek sortutako ugalezintasuna dago. Honen barruan, barrabiletako minbizia izan duten
gizonezkoak, barikozelea (barrabiletako odol-zirkulazioari lotutako kaltea) dutenak,
edota gemu eta ugal aparatuetan izandako infekzioek sortarazitako ugalezintasunak.
Hirugarren talde batean, haziaren garraio egokia galerazten duten faktoreak leudeke;
hala nola, autoinmunitateak sortutako ugalezintasuna (esperaiatozoideen aurkako
antigorputzak), edota sexu-disfuntzioei lotutakoa. Beste talde batean, elikadurari
lotutako gizonezkoen ugalezintasun faktoreak ditugu. Hauen artean, ekintza
antioxidatzailea duten elementu eta konposatuen gabeziak (E bitamina, C bitamina,
selenioa, karotenoideak,...) egongo lirateke, izan ere estrés oxidatiboa giza haziaren
zenbait parametro garrantzitsuetan eragina duela ikusi da (Agarwal eta lank., 2003;
Scott eta lank., 1998), eta hauekin batera, bestelako zereginak betetzen dituzten
sustantzien (zink eta folatoa) gabeziek sortutako ugalkuntzarako kalteak. Esate
baterako, zinka, barrabilen garapenarekin, espermatogenesiarekin eta
espermatozoideen mugikortasunarekin harremana duela behatu da (Favier, 1992; Wong
eta lank., 2002) (aipatuko dugu ere, geroago, Zinkaren garrantzia zenbait entzimen
aktibitatean). Azkeneko talde batean, inguruneko faktoreak aipatuko genituzke,
gizonezkoei lotutako ugalurritasunean. Hauen artean, adina eta eragile kimikoak
dauzkagu, bereziki. Badirudi, zenbait giza haziaren parametro garrantzitsu, hala nola,
haziaren bolumena eta espermatozoideen mugikortasuna, adinarekin batera behera
egiten dutela (Kidd eta lank., 2001). Oso interesgarria da, gizonezkoei lotutako
ugalezintasunari buruz Sullivan-ek ematen duen ugalezintasunaren zergatien sailkapen
4 SARRERA
Doktote-Tesia As iet Valdivia Palacín 5
orokorra, zeinean gizonezkoei lotutako ugalezintasun hiru talde nagusi ezberdintzen
dituen: Jatorri pretestikularreko ugalezintasuna (homionala, genetikoa, koitoarekin
lotutako arazoak); jatorri testikularrekoa ( Sertoli-Cell-Only sindromea,
espermatogenesiaren gelditzea, kriptorkidismoa,...) eta jatorri postestikularreko
ugalezintasuna (obstrukziozkoa, inmunologikoa, infekzioak direla eta,..) (Sullivan,
2004)
Bestalde, eta sustantzia kimikoen eraginen adibide bezala, gero eta argiago
egoten da ugalkortasunaren murrizpenaren eta gaur egungo gizarteak dakartzan zenbait
ohituraren arteko harremana. Ikerketa askok giza haziaren zenbait parametro, ohitura
kaltegarrien ondorioz, eta eragingarri ezberdinak direla eta, nola aldatzen diren behatu
dute. Honen inguruan aipagarriak dira tabako eta marihuanaren erretzea eta alkohol
kontsumoa. Wong eta lankideek, gizonezko ugalurrituekin eta ugalkorrekin egindako
ikerketa batean, ugalurrituen artean zigarro-erretze maiztasun altuagoa behatu egin
zuten (Wong eta lank., 2000). Erretzeak giza hazian estres oxidatzailearen adierazleak
(oxigenoaren espezie erreaktiboak, ahalmen antioxidatzaile totalaren jeitsiera eta
leukozitosia) gora egiten dutela ikusi dute, bestelako hazi-parametroetan aldaketa
nabamienik topatu ez duten arren (Saleh eta lank., 2002). Badira, dena den, erretzearen
eta espermatozoideen mugikortasuna, dentsitatea eta bestelako parametro en
beherakadaren erlazioa deskribatzen dutenak (Kiinzle eta lank., 2003). Alkoholaren
kasuan ere, antzerako parametroen maila baxuak topatu dira alkoholarekiko
menpekotasun sindromea izan dutenenengan (Kucheria eta lank., 1985) eta gauza bera,
marihuanaren erretzaile kronikoengan (Pardo eta lank., 1985).
Gizonezkoei lotutako ugalezintasuna edota ugalurritasunaren inguruan
egindako ikerketak ugariak badira ere, handia da oraindik gai honen inguruan dagoen
ezjakintasuna, batez ere maila metabolikoan ari diren elementu eta prozesuen inguruan.
SARRERA 5
6 Asier Valdivia Doktore-T esia
1.1.1. GIZA HAZIAREN ANALISIA: NORMALTASUNA
ETA PATOLOGIA
Aurrera jarraitu baino lehen, hizkeraren inguruko zenbait zehazpen egin behar
dira, erabiliko ditugun kontzeptu batzuk argituz. Ingurune klinikoan eta zientifikoan,
antzutasuna eta ugalezintasuna ez dira gauza bera, bietan azkeneko emaitza berdina
den arren: seme-alabak lortzeko ezintasuna. Antzutasuna, haurdunaldirik lortzen ez
duen bikoteen kasuan gertatuko litzateke, eta ugalezintasuna, zehazki, haurdunaldia
lortuta, erditzera iristen ez den emakume edo bikoteen kasuan izango litzateke.
Hertsiki, kasu bietan, medikuen laguntzarik gabe haurdunaldi edo ematzerik lortu ezin
duten bikoteei aplikatu dakieke. Lan honetan, bereizigabe erabiliko dira, antzutasuna
nahiz ugalezintasuna. Hala ere, badago beste hirugarren hitz bat defmitzeko:
ugalurritasuna edo ugal eskasia. Ugalurritasuna, ematzea lortzeko probabilitatea
ohizkoa baino txikiagoa den kasutan erabiliko dugu. Hauxe da, gainera, gehienetan
gertatzen den kasua. Bestalde, esan behar dugu ere, frogatutako ugalkortasun bezala,
inoiz seme-alabarik sortzeko gai izan den pertsonen kasuetan onartzen déla
(ugalkortasuna, behinbetirako egoera ez den heinean, kontzeptu honek balio erlatiboa
dauka).
Giza haziaren urtez-urteko kalitatearen eboluzioa aztertu dituzten metaanalisiei
buruz hitzegiten genuenean, lan horien fidagarritasuna zalantzan jar lezaken
arrazoietako bat kontuan hartzen ziren erizpideak azterketa guztietan antzekoak ez
izatea zen. Honela, beharrezkoa egiten da, bai ikerkuntzan bai praktika klinikoan,
zeintzu erizpide erabiltzen ditugu aztertzen diren giza laginak sailkatzeko, eta ikerlari
eta klinikoen arteko informazio elkartrukea egoki eman dadin. Hau da, hazian aztertzen
diren parametroak erreferentzia aniankomunen bidez erabili behar dira.
Aipatzen ari garen haziaren parametro hauek, haziaren azterketa klinikoetan
erabiltzen direnak dira. Hauen artean, espermatozoideen mugikortasuna, denstitsatea,
6 SARRERA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 7
kopuru osoa, espermatozoide bizien portzentaia, morfología, haziaren bolumen
osoa,...daude. Parametro bakoitzaren nonnaltasuna fmkatzen duten balioak, erizpide
ezberdinetan oinarritzen dira (Tygerberg, OME/WHO,...), baina erabilienak
Osasunerako Munduko Erakundeak proposatzen dituenak dira (OME/WHO, 1999).
SARRERA 7
8 Asier Valdivia Doktore-T esia
ALDAGAIA ERREFERENTZIA BALIOA
Haziaren bohimena >2.0 ml
pH >7.2
Espermatozoide-kontzentrazioa >20 x 106 espermatozoide/ml
Espermatozoide-kopurua >40 x 10b espermat./eiakula.
Mugikortasuna
>%50 mugikor (A + B motak)
edota
>%25 mugikortasun progresiboz (A mota)
(isuriaren hurrengo 60 min.etan zehar)
Morfología >%15 forma normalak
Bizitasuna >%50 espermatozoide bizi
Odol-zehila zuriak <1 x 106 zelula/ml
Immunobikorren testa<%50 (esperm. mugikor) atxekitutako
bikorrekin
MAR testa<%50 (esperm. mugikor) partikula
atxekikorrekin
1.1. Taula. Giza haziaren normaltasunerako erreferentzia balioak (OME/WHO, 1999)
Honela, baldintza hauek betetzen ez dituzten giza haziak, patologiko bezala har
daitezke, Hala ere, honelako baldintzak ez betetzeak ez du, halabeharrez,
ugalezintasuna adierazten; gizonezko batek, aipatutako normaltasun balioak baino
murritzagoak izan ditzake bere hazian, eta, hala eta guztiz ere emalketa edota egokiro
bukatzen den haurdunaldia lor dezake. OME-ren normaltasun erizpideak betetzen ez
8 SARRERA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 9
duten hazi-laginak, haziaren patologien terminologiaren bidez sailkatzen dira. Izen
erabilienak:
• Normozoospermia: eiakulatu nórmala, aipatutako erizpidetan oinarrituta.
• Oligozoopermia: Espermatozoideen kontzentrazioa erreferentzia-balioa baino
txikiagoa denean.
• Astenozoospermia: Espermatozoideen mugikortasuna erreferentzia-balioak
baino txikiagoak direnean. Aurrerago azalduko da, zehaztasunez,
espermatozoideen mugikortasunaren sailkapena.
• Teratozoospermia: Espermatozoide normalen (morfologikoki) kopurua,
erreferentzia-balioa baino urriagoa denean.
• Nekrozoospermia: Espematozoide bizien kopurua erreferentzia-balioa baino
baxuagoa denean.
• Azoospermia: Espermatozoiderik ez eiakulatuan.
• Aspermia: Eiakulaturik ez.
(OME/WHO, 1999)
Kasu ezberdinen arteko konbinaketak ere eman daitezke. Honela, hazi
OligoAstenoNekrozoospermiko batek, espermatozoide gutxi, motel eta %50 baino
gehiago hilak izango ditu. Gehienetan, ez dago patología bakar bat soilik azaltzen duen
hazi-laginik. Aipatutakoak ohizkoak badira ere, bestelako kasu edo talde batzuk ere
aipatu genitzake. Esate baterako, kriptozoospermia (oligozoospermiaren muturreko
kasua), hipospermia (2 mi baino gutxiagoko eiakulatuen kasuan),... Esan beharra dago,
gizonezko batek, bi eiakulatu ezberdinetan, balio ezberdinak azal ditzakela.
Horrexegatik, azterketa seminologiko bat baino gehiago egin behar da, diagnostiko
argia lortzeko.
SARRERA 9
10 Asier Valdivia Doktore-Tesia
1.2. GIZONEZKOEN UGAL APARATUA
1.2.1. GARAPEN ENBRIONARIOA
Enbrioiaren garapenaren lehenengo 6 astetan zehar, bai ar bai emeen kasuan, ugal
egituren garapena ia berdina izaten da. Aldi honetan, zenbait prozesu ematen dira:
- Hirugarren astetik aurrera, Jatorrizko zelula germinalek, saku bitelinotik
migratzen dute, atzekaldeko gorputz-paretaren mesenkimara 6. astean heltzen
direlarik. Bertan, toraxaren 10. segmentuaren mailan gandor genitalen sorrera
eragiten dute. Bertan ere, jatorri mesonefritikoa eta zelomikoa duten Sertoli
zelulen aitzindariak bateratuko dira.
Wolff-en hodiak laugarren astean garatzen dira. Gizonezkoengan geroago
epididimoa eta hodi deferenteak sortaraziko dituzte. Emakumeengan
endakatuko dira. Emakumeengan Müller-en hodiak garatu egingo dira, 6.
astean zehar.
Seigarren astea bukatzean, gizonezkoengan Testikuluen Faktore Mugatzailea
izeneko proteina espresatuko da. Honen ondorio bezala, testikuluen eta ugal hodien
formazioa eta ezberdintzapena gertatuko da oinarrizko ezaugarri sexual primarioekin
batera. Kanpo-genitalak, egitura aitzindari berdinetatik hasten dira sexu bietan.
Zazpigarren astean antzeko itxura azaltzen dute sexu bietan, haurdunaldiaren 12.
astearen bukaera arte. Pubertaroa iritsi arte ez da aldaketa garrantzitsurik gertatuko
ugal-aparatuan. Pubertaroan, jariapen eta ekintza hormonal sakonarekin batera, eta
gorputzeko beste zenbait ezaugarrirekin batera, ugal aparatuaren garapenaren fase berri
batean sartuko gara. Garai honetan, bigarren mailako ezaugarri sexualekin batera (ugal
egituren tamainaren handipena, biloaren agerpena, ahotsaren loditzea,...)
espermatogenesiari hasiera emango zaio.
10 SARRERA
Doktote-Tesia Asier Valdivia Palacín 11
1.2.2. UGAL-APARATU ARRAREN EGITURAK
1.2.2.1. Testikuluak
Testikuluak androgenoen jariapenerako eta espermatozoideen sorrera eta
metaketarako organo espezializatuak dira. Itxura obalatua duten organo pareak dira.
Jaiotzaren aurrean abdomenaren barrunbetik eskrotorantz jeitsi egiten dira. Eskrotoan
kokatzearen zergatia barrabilen tenperatura, gorputzaren ohizkoa baino baxuagoa (2-
3°C) mantentzeko da. Izan ere, barrabilen tenperatura altuagoa denean
espermatogenesia kaltetua gertatzen omen da (Munkelwitz and Gilbert, 1998;
Zorgniotti, 1980). Barrabilak zenbait atalez osatuta daude,
Tubulu seminiferoak
Barrabilaren bamean dauden ehundaka hodiska bihurri eta era oso trinkoan
paketatuak dauden egiturak dira. Tubuluak lobulu ezberdinetan banatzen dira eta
guztiak Testis Sarean bukatzen dute. Tubuluetan espermatogenesia gertatzen da.
Tubulu hauen aide basalean Sertoli-ren zelulak kokatzen dira. Sertoli zelulak oso zelula
handiak dira. Euren fimtzioa espermatogenesia erregulatzea da. Zelula hauek osatzen
dute odola eta tubuluaren arteko barrera edo muga euren artean eta eurak sortutako
inbaginazioetan espermatogenesian gertatzen diren kordoi germinalak bab esten dira.
Zirrituarteko gunea
Zirrituarteko gunea (intesticium), tubuluen aide basalaren inguruan dago.
Bertan, besteak beste, Leydig zeulak kokatzen dira. Zelula hauek testosterona jariatzen
dute.
Bestelako egiturak
Barrabilaren inguruan, tubuluak biltzen, Tunika Albuginea izeneko geruza lodi
eta fibrotsua dago. Hauen luzapenak diren Pareta Testikularrrak, barrabilaren lobuluak
(non tubulu seminiferoak dauden) banatzen dituzte. Guztia inguratzen eskroto izeneko
SARRERA 11
12 Asier Valdivia Doktote-T esia
zaku-egitura dago. Egitura hau larruazalez eta zenbait rauskuluz (cremaster, dartos)
osatuta dago eta bere funtzioen artean, oso garrantzitsua izaten da testikuhietako
tenperatura konstante mantentzearena. Tubuluak, Rete Testis (testis sarea) izeneko
gune biltzailera igortzen dute euren edukina. Hemendik, hodi eferentetatik, testikulutik
kanpo, epididimora, eramaten dute esperma.
1.2.2.2. Epididimoa
Testikulutik kanpo, Rete Testis-etik, hodi eferenteen bidez epididimo izeneko
duktua dago. Epididimo bi dauzkate gizonek; bana, testikulu bakoitzarentzako.
Geroxeago ikusiko dugun bezala, organo hau oso garrantzitsua da espermatozoideen
heltze-prozesuan eta motilitatean (Cosentino eta Cockett, 1986). Hemen, espermari
haziaren zenbait osagai gehitzen zaizkio. Honela, gametoek ugalketa-prozesurako
ezinbestekoak diren zenbait propietate bereganatzen dituzte. Epididimoa, omodun
guztietan dagoen duktua da, arrain kartilaginotsuetan izan ezik, eta batez ere bame-
emakultzaz ugaltzen diren animalietan dago garatuta (Jones, 1998). Epididimoa,
klasikoki, hiru zatitan banatu izan da: hasierako zatia edo proximala, tarteko
epididimoa eta epididimo kaudala edo bukaerakoa. Epididimoaren luzera espezieen
arabera aldatzen da (Robaire eta Hinton, 2002) baina gizakian 4-5 metrokoa da,
Espermatozoideek bide hori egiteko 3 egunetik gora ematen dute, espezieraren arabera
(Wen eta Yang, 2000). Espermatozoideen heltzean ez ezik, epididimoak espermaren
biltegi bezala egiten du. Bertan, espermatozoideak egun askorako bideragarri mantendu
daitezke.
1.2.2.3. Hodi Deferenteak
Hodi deferentea edo vas deferens, epididimoaren edukina jaso eta uretrara
eramaten duen hodia da. Bere funtzio nagusia espermatozoideak uretrara kanporatzeaz
(prozesu honi emisioa esaten zaio) gain, biltegiarena da. Hauxe da basektomietan
mozten den hodia.
12 SARRERA
Doktore-Tesia Asiei Valdivia Palacín 13
1.2.2.4. Guruin Osagarriak
Badaude, ugal-funtzioaren parte diren zenbait guruin. Hauek uretrarekin
konektatuta daude eta berauen jariakinak oso garrantzitsuak dira ugalkortasunerako.
Hazi-besikulak
Hazi-likidoaren %60a izaten da guruin hauen jariakina. Jariatzen dituzten gaien
artean fruktosa (espermatozoideen elikagai energetiko nagusia), azido askorbikoa eta
prostagladinak daude, besteak beste.
Hazi-besikulan edota bere jariakinean ere aktibitate peptidasiko ezberdinak
topatu izan dira, hala ñola, Dipeptidil Peptidasa II eta IV, A Aminopeptidasa (Vanha-
Perttula eta lank., 1990), Dipeptidil Peptidasa III eta Alanil Aminopetidasa (Agrawal
and Vanha-Perttula, 1987). Beraien funtzioa ezezaguna da oraindik.
Prostata
Gemu-maskuriaren azpikaldean, uretrarekin konektatuta, kokatzen den guruina
da. Osagai asko jariatzen ditu hazi-likidora Hauen artean, poliamidak, azido zitrikoa,
fibrinolisna, fosfatasa azidoa eta kalikreina edo PSA (Prostate-Specific Antigen). Ehun
tubulualbeoarrez eta estroma fibromuskular bâtez osatuta dago. Prostata, adinarekin
handitzen den organo edo guruina da eta kasu askotan gemuaren oztopaketa eragin
dezake. Bestalde, bertan minbiziak sortzeko gune garrantzitsua daukagu
gizonezkoengan; badirudi, minbizi hauen garapenean androgenoak zerikusi handia
dutela, prostatan dagoen AR (androgenoen hartzailea) aktibatzen dituen zenbait bide
zelularren eraginez (Mobbs eta lank, 1980; Kim eta Coetzee, 2004; Porkka eta
Visaporki, 2004; Heinlein eta Chang, 2004).
Bestalde, prostataren jariakina pH azidoa duela esango dugu ere. Gainera,
jariakinen artean prostasoma izeneko besikula mintzakarak daude (aurrerago egingo
dugu hauei buruz), ugalkortasunaren zenbait prozesu garrantzitsu erregulatzen omen
dituztenak.
SARRERA 13
14 Asier Valdivia Doktore-T esia
Prostatarekin ere zenbait peptidasa erlazionatu izan dira. PSA edo kalikreinaz
gain, dipeptidil peptidasa IV (DPP IV / CD26) (Vanhoof eta lank., 1992) , APN
entzima (tumoreekin erlazionatuta), APA (Bogenrieder eta lank., 1997), NEP edo
endopeptidasa neutroa (hau ere minbiziekin erlazionatu izan da) (Usmani eta lank.,
2000; Pan eta lank,, 2003; Shen eta lank. 2003) eta P aminopeptidasa (E.C. 3.4.11.9)
(Vanhoof eta lank., 1992) topatu dira (1.1. irudia).
14 SARRERA
Doktore-Tesia Asiet Valdivia Paíacín IS
mûîiulo dorios
tornea vaginal
túnicoCfixxjineo
ve$fcukiSHTHOO!
ompoflo
corxJixio deferente
«vyfvclülos dere ies de lo cobeza rfeJ opicfidimo
epidk>irra>
condiKio fjf epkJkJímaíio
reie lesiis
«fiducie deferente o lo solido de (acoJcicfeJ «ptdídiino
1.1. Irudia. Gizakiaren ugal aparatu arra (Debuse, 1998)
SARRERA 15
16 Asier Valdivia Doktore-Tesia
1.2.3. ESPERMATOGENESIA
Espermatogenesia, ugal ama-zeluletatik espermatozoideetara doan
ezberdintzapen-prozesuari deitzen diogu. Gameto arren sorrera, edo gameto genesi
maskulinoa ere deitzen zaio. Prozesu hau testikuluetan gertatzen da, tubulu
seminiferoetan, zehazki. Gametogenesiaren prozesua, bi sexuengan, gameto bakoitzak
ugalkuntzan izango duen betebeharrari oso lotua dago. Adibidez, gameto arrak txikiak
eta mugikorrak dira. Euren helburua gameto emea topatzea, berarekin kontaktua egitea
eta fusionatzea izaten da. Gameto emea, aldiz, normalean, espermatozoidea baino
mugikortasun gutxiagokoa eta handiagoa izaten ohi da eta bere betebeharra, emaídua
izateko “gai izatea” da.
Gametogenesia, garapen enbrionariotik hasten den prozesua da. Izan ere, ia
lehenengo zatiketa enbrionarioetatik ezberdintzen da zelula germinalen Ierro zelularra.
Espermatogenesia, berez, pubertaroan gertatzen bada ere, zelula germinalak ez daude
lo umekiaren garapen fasean; haurdunaldiaren 24-25. egunetan jatorrizko zelula
germinalak bizkarraldeko zaku bitelinoan identifikatu daitezke, garapenean dauden
testikuluetara migratzen dute eta euren muinean txertatzen dira (Starz-Gaiano eta
Lehman, 2001; Sutton, 2000; Raz, 2004). Haurdunaldiaren zehar, oinarrizko zelula
germinal hauek, zenbait apoptosi eta ugalketa prozesu bortitz pairatzen dituzte (Tres
eta lank., 2004). Behin oinarrizko zelula germinal hauek testikuluetan txertatu eta
ugaldu, ugal ama-zelula betzala ezagutuko ditugu eta euren artean eta testikuluetako
zelula somatikoekin (Sertoli,...) harreman estuak sortuko dira.
Testikuluetako tubulu seminiferoetan gametoen sorrera atsedenenean
mantentzen da hautzaroaren zehar, pubertaroan, gonadotropinen (FSH eta LH)
mailaren igoerarekin batera, testikuluetako Leydig zelulek testosterona hormona
jariatuko dute eta honekin batera espermatogenesia hasten da. Prozesu hau bizitza
osoan zehar mantendu egingo da, zaharízaroan gutxipen txiki bat nabaria den arren.
16 SARRERA
Doktore-Tesia Asief Valdivia Palacín 17
Testikuluetako tubuluetan txertatutako ama-zelula germinal hauei,
espermatogonia izena emango diegu. Hauen funtzioa mitosiren bidez zatitzea da,
honela, hasiera emango diote espermatozoideak sotzeko zatiketa eta ezberdintzapen
prozesuari. Espermatogoniaren zatiketa mitotikoaren ondorioz, espermatozito
primario ak izango ditugu, eta hauengan gertatuko da lehenengo zatiketa meiotikoa,
honetatik bi espermatozito sekundario agertuz. Hauengan ematen da bigarren zatiketa
meiotikoa, eta horren ondorioz, lau espermatida (haploideak) izango ditugu. Beraz,
laburbilduz, espermatogonia batetik, espermatozito primario bat izango dugu; bertatik
bi espermatozito sekundario sortuko dira eta azkenik, lau espermatida. Espermatida
hauek ez dute zatiketa gehiagorik pairatuko, ezberdintzapenez espermatozoidetan
bilakatuko direlarik. Espertogonietatik espermatozoideetarako prozesua dugu, hain
zuzen ere, espermatogenesia.
Ondoz ondoko zatiketa hauek nahiko konplexuak dira, besteak beste, bestelako
prozesu molekular eta morfologiko askorekin batera gertatzen direlako. Gainera,
zatiketa bakoitzaren ondoko produktuak ez dira guztiz banatzen (ez dira zelula
índependienteak bilakatzen) espermatozoide bihurtu arte. Honela, zatiketa ez-oso
hauek, elkarkonektatutako zelula-klon luzeak sortarazten dituzte. Badirudi,
komunikazio interzelular hau oso baliogarria izaten omen déla zelula hauen garapena
sinkronizatzeko. Porzesu guztia, Sertoli zelulen bidez ere, eraenduta dago.
Espermatogenesiaren barruan, espermiogenesi izeneko prozesua dugu. Hemen,
espermatida bakoitzetik espermatozoide bideragarri bat lortzeko ezberdintzapen
prozesuari esaten zaio. Prozesu honek zelularen aldaketa morfologiko eta molekular
sakonak sortaraziko di tu. Aldaketa aipagarrienak nukleoaren birkokapen exzentrikoa
eta kromatinaren paketamendu trinkoa, akrosomaren garapena, axonema eta
flageloaren garapena eta espermatozoidearen mintz plasmatikoan gertatzen diren
zenbait aldaketa, izango dira.
Gizakiarengan, ziklo espermatogeniko bakoitza 65-70 egun irauten du. Hala
ere, ziklo bakoitza bukatu baino lehen beste ziklo berri batzuk hasten dira, 2-3 asteko
erregulartasunez. Honela, tubulu bakoitzean garapen egoera ezberdinetan dauden
SARRERA 17
18 As i er Valdivia Doktore-Tesia
zelulak izango ditugu, “uhin espermatogeniko” bat osatzen (Bustos-Obregon eta lank.,
1975; Schulze, 1982). Egun bakoitzeko, 200 milioi espermatozoide sortarazten ditu
gizon osasuntsu batek (Aniann eta Howards, 1980).
Badirudi, metabolismo biopeptidikoan parte hartzen duten peptidasek,
espermatogenesiari lotutako funtzioa badituztela. Hala nola, Puromizinarekiko
sentikorra den Aminopeptidasaren (PSA) eza duten arratoiengan antzutasuna,
kopularako iharduera falta eta espermatogenesi desparekatua behatu izan da, ziuraski
Sertoli zeluletan PSA-k duen espresio maila altuarekin erlazionatuta (Osada eta lank.
2001). Bestalde, Sertoli zeluletan entzefalinen, P substantziaren eta bradikininaren
apurketa gertatzen dela ikusi ondoren, apurketa honen arduradunak
metaloendopeptidasa neutroak, angiotensinaren entzima bihurtzailea eta
aminopeptidasak zirela behatu zen. Izan ere, entzima hauek apurten dituzten hormona
peptidikoak, testikuluetako zelulen erregulazio endokrino, autokrino eta parakrinoan
garrantzia dutela topatu izan da (Monsees eta lank., 1998). B aminopeptidasa ere
deskribatua izan da testikuluetan, espermatogenesiaren fase berantiarretan (Foiulon eta
lank. 1997; Cadel eta lank., 1995).
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 19
1.3. ESPERMATOZOIDEAREN EGITURA
ETA PROZESU FISIOLOGIKOAK
XVÏÏ. mendean Antoni van Leeuwenhoek-ek, asraatu berna zuen bere
mikroskopioaz, espermatozoideak behatu zituenetik, asko ikertu egin da hauen
inguruan. Artile-merkatari honek ahariaren hazian behatutako “animalkulu” horiek,
emalkuntzarekin harremandu zituen, hasiera batean ausartu ez bazen ere, orduko
komunitate zientifikoak bere aurkikuntza onartuko ez zuelakoan.
Gaur egun, haziaren azterketa oso faktore garrantzitsua izaten da
ugalkortasunaren biologiaren ikasketarako eta ugaleztintasunaren zergatien
“screening”-a egiteko.
1.3.1. ESPERMATOZOIDEAREN EGITURA
Espermatozoideak oso zelula espezializatuak dira. Beren funtzioa ugal zelula
emearaino iristea eta hau emaltzea izaten da eta helburu hauetarako oso morfología
zehatzekoak dira. Hala ere, espermatozoideen itxura, espeziez espezie aldatzen déla
esan beharra dago, bakoitza espeziearen ugal-baldintzei egokitua. Honela ere,
espermatozoideen morfología erizpide taxonomiko bezala erabili izan da, hurbil
dauden espezieen arteko bereizketa egiteko (Phillips, 1983).
Badaude zenbait ezaugarri amankomuneko, espermatozoide gehienetan.
Nukleoa, akrosoma eta flageloa hauen adibide dira. Nukleoaren baitan oso
kondentsazio maila handiko kromatina bat izaten da. Akrosomaren kasuan, arraultza
edo gameto emearen inguruan dauden geruzak zeharkatzen laguntzen du. Flageloa,
zelularen higidurarako organulua dugu, baina ez da ezaugarri unibertsala. Beraz, ezin
da kontsideratu morfología “tipiko” bat dagoenik.
SARRERA 19
20 Asier Valdivia Doktore-T esia
Ugaztunen espermatozoidea bi zati nagusitan ezberdindu dezakegu: burua eta
isatsa. Buruaren barruan nukleoa eta akrosoma izango dira egitura aipagarrienak.
Akrosoma, buruaren aide apikalean kokatzen da eta, nukleoaren zati handi bat
inguratzen kokatzen da. Akrosomaren atzetik geratzen den buruaren zatia, eskualde
post-akrosomala deitzen da. Isatsa, morfologikoki, lau zatitan banatu daiteke: lepoa,
tarteko zatikia, zatiki nagusia eta bukaerako zatikia. Lepoa, burua eta isatsaren arteko
giltzadura izaten da. Tarteko zatikiaren ezaugarri nagusia, isatsaren egitura
funtzionalen inguruan dagoen, mitokondriez osatutako, geruza da.
Espermatozoidearen burua ez du mikroskopioz ezberdintzeko azpiegitura
nabaririk. Barnekaldea nukleoaz beteta dago, bere kromatina konpaktatuak xehetasun
bereizgarri handirik ematen ez duelarik. Nukleoaren inguruan eta mintz plasmatikoaren
aide apikalaz inguratua, akrosoma izeneko egitura besikularra dago. Egitura honen
barruan emalkuntzarako beharrezkoak izango diren entzimak daude. Hauen artean
akrosina, proakrosina, hialuronidasa, beta-glukuronidasa, beta-glukosidasa, fosfatasa
azidoa, N-azetil-glukosaminidasa, beta-galaktosidasa,... (Mack eta lank., 1983).
Akrosomaren atzekaldean kokatzen da akrosomaren zatiki ekuatoriala. Honen
garrantzia, hemendik gertatzen déla espermatozoidea eta arraultzaren arteko hasierako
kontaktua emalkuntzaren prozesuan.
Espermatozoidearen isatsa, gametoaren mugimendua ahalbidetzeko egitura
konplexua eta espezializatua osatzen du. Mugimendua sortzen duen egitura
ultraestrukturala axonema deitzen da. Axonema, 2 mikortubulu zentralez eta hauek
inguratzen kokatzen diren 9 mikortubulu-bikotez osatutako egitura da. Mikrotubulu-
bikote bakoitzeko mikrotubuluak ezberdinak dira (bata osoa, bestea C itxurakoa). Bai
erdialdeko bi mikrotubulu osoak, bai inguruko bikote bakoitzeko mikrotubulu osoek 13
protofiruz osatuta daude. C itxurako, bikoteetako mikrotubuluak 10 protofiruz osatuta
dago. Protofiru hauek tubulinaz eratuta daude. Inguruko bikoteen C moduko
mikrotubuluetan ere dineina 1 dago. Proteina honek ATPasa aktibitatea dauka eta
energia kimikoa, mugimendurako energía mekaniko bihurtzeko prozesua berak
burutzen du (Ogawa eta lank., 1977). Axonemaren egitura flageloaren zatiki guztietan
20 SARRERA
Doktore-T esia Asicf Valdivia Palacin 21
mantenduko da (9 + 2 mikrotubuluen egitura). Flageloaren beste zatiki aipagarri bat
zatiki ertaina dugu. Hemen, axonema inguratzen, mitokondriaz osatutako geruza bat
dago. Dimdienez, zatiki honetan sortzen da gametoaren mugimendurako beharrezkoa
den ATPa.
SARRERA 21
22 Asier Valdivia Doktore-Tesia
A crosom a
M em b fan a superficial Vacuola
Cubierta ontorior de la cabeza Cutáorla posterior de ta cabeza
Cuello
C uerp o
M itocottctôas
Pieza principal de la cola
Pieza torminal do ia cola
1.2. Irudia. Giza espermatozoidearen eskema. (Guyton eta Hall, 1997)
22 SARRERA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 23
1.3.2. ESPERMATOZOIDEAREN HELTZEA
Tubulu seminiferoetan espermatogenesia eta espermiogenesia direlako
prozesuak burutu direnean, espermiazioa, edo espermatozoidearen, ugal-zelula
aintzindariekin osatutako sintzitiotik gertatuko da askapena. Prozesu honetan,
zitoplasmaren soberakinak erauzi behar dira. Honetarako, zitoplasma
espermatozoidearen lepoan metatzen da, hondar-gorputza deituriko lobulua osatuz.
Hondar-gorputza hau Sertoli zelulek fagozitatzen dute eta honez gero, espermatozoidea
aske gelditzen da. Baina erauzketa prozesuaren ondorioz, espermatozoidearen lepoan
tanta-zitoplasmatikoa izeneko hondarra geldituko da. Tanta hau erauztea izango da,
adibidez, espermatozoidearen heltzearekin harremanduriko aldaketa morfologiko bat.
Honela, espermatozoide askeak epididimora iragango dira. Epididimoan
aldaketa ugari jasango dituzte oraindik ere, sortu-berriko espermatozoideak. Izan ere,
barrabiletatik irtetzen diren espermatozoideak ez dira oraindik oozitoa emaltzeko gai
ugaztun askotan. Abilezia hau lortzeko aipatutako aldaketa morfologiko, fisiologiko eta
biokimiko sakonak eman behar izango dira. Aldaketa hauei guztiei,
espermatozoidearen heltze prozesua esaten zaie.
Heltze prozesuaxen helburu nagusiak edota espermatozoideak bereganatzen
dituen gaitasun espezifiko garrantzitsuenak bi dira: mugikortasunaren lorpena eta
oozitoa ezagutu eta berarekin fusionatzeko gaitasuna (Gatti eta lank., 2004). Heltze
prozesuaren aide garrantzitsuena epididimoan ematen bada ere, emakumearen ugal-
aparatuan bukatu egiten da, kapazitazioa eta erreakzio akrosomikoa bezalako
prozesuekin. Egia esan, espermatozoidea oozitoarekin fusionatzen den arte, etengabe
aldaketak jasaten dituen zelula izaten da.
Mugikortasunaren kasuan, espermatozoideak gradualki bereganatu egiten dute,
epididimoaren hasierako zatian zelula gehienak mugikortasunik gabekoak izatetik,
epididimoaren zati kaudalean kopuru maximora iritsi arte. Prozesu hau AMP ziklikoa
eta ATP-aren maila intrazelularren igoerari lotuta dago. Dirudienez, AMP ziklikoaren
SARRERA 23
24 Asier Valdivia Doktore-Tesia
igoerak (Dacheux eta Paquignon, 1980), besteak beste, bultzatzen ditu
mugikortasunaren mekanismo intrazeluarrak epididimoan. Izan ere, kalmodulinaren
maila zelularraren erorketa eta AMP ziklikoaren menpeko proteina kinasa
aktibitatearen igoera nabaria, korrelazioa dute flageloaren mugikortasunaren
hasierarekin (Pariset eta lank., 1985). Motilitatearen bereganatzean duten bestelako
faktore garrantzitsuak inguruneko ioien presentzia (kaltzioa, pH, bikarbonatoa) (Gatti
eta lank., 1993; Wade eta lank., 2003) eta sustrato energetikoen egote ala ez egotea,
ATP maila baxuak nahiz altuak mantendu ahal izateko.
Epididimoak proteina ugari jariatzen ditu. Izan ere, barrabiletatik datorren
jariakina desagertu egiten da epididimoaren hasierako zatikiaren aide proximalean eta
jariakin berriak topatuko ditugu. Jariapen epididimalaren ikuspegitik, zatiki
garrantzitsuenak epididimoaren hasiera edo aide apikala eta tartekoa edo corpus-a dira
(Gatti eta lank., 2004).
Bestalde, epididimoan, heltze-prozesuan, aldaketa garrantzitsuak gertatzen dira
espermatozoidearen mintzean. Honen adibidea dugu, espermatozoidearen mintzean,
espermatogenesiaren ondoren, dagoen AEB-aren (Angiotentsinaren Entzima
Bihurtzailea) isoforma germ in alar en (gAEB) desagerpena edo erauzketa (Gatti eta
lank., 1999; Metayer eta lank., 2002). Proteina ugari, izaten dira mintzetik erauziak
edota eraldatuak, heltze prozesuan zehar. Prozesua ez da ezaguna baina serin proteasak
prozesuan zerikusia dutela uste da (Frayne eta lank., 1998).
Epididimotik igarotzen direla, espermatozoideek ere proteina berriak
bereganatzen dituzte, beren mintzean txertatzen direnak. Prozesu hauek bideretzen
dituzten mekanismoak oraindik nahiko ezezagunak dira, baina hiru txertatzeko modu
orokor proposatzen dira: indar gutxiko mintza-proteina elkarteak, prozesamendu
proteolitikoaren ondoko txertaketa eta ezaugarri hidrofobikoak dituzten proteinak
izatea (Gatti eta lank., 2004). Bestelako txertaketak, epididimoko epitelioak askatutako
besikulen bidezkoak (Saez eta lank., 2003), ere eman daitezkela proposatu da.
24 SARRERA
Heltze prozesua, peptidasei lotutako prozesua da ere. Adibidez, Endopeptidasa
Neutroa, traktu genitalean heltzearekin erlazionatu izan da (Erdos eta lank., 1985).
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 25
SARRERA 25
26 Asier Valdivia Doktore-T esia
1.3.3. ESPERMATOZOIDEAREN MOTILITATEA
Espermatozoideak, oozitoak ez bezala, zelula mugikorrak dira. Mugikortasun
hau espermatozoideen zereginerako ezinbesteko ezaugarria da. Honela, ugal-aparatu
arretik irten eta gameto emeraino iritsi behar dira, beren material genetikoa baldintza
estruktural egokian mantentzen dutela eta, oozitoa inguratzen dituzten geruzak
zeharkatzeko gaitasuna mantenduz, emalketa eman dadin. Honetarako, flageloaren
mugimenduez baliatzen da. Mugimendu honen oinaman, erreakzio kimiko ugari
daude. Espermatozoideen mugimendu flagelarra oso konplexua da eta ez da lan honen
helburua hemen aztertzea.
Gizakien espermatozoideen batazbesteko, Ierro zuzeneko abiadura 30 ¡j.m
segundukoa da 37°C tan, eta hau tenperaturaren arabera aldatuko da (Kraemer eta
lank., 1998). Espermatozoidearen flageloaren mugimenduaren oinarri fisikoa edo
mekanikoa, axonemaren fíruen (mikrotubuluen) elkarren arteko mugimendu erlatiboan
datza. Axoneman, 250 bat proteina parte hartzen dute; hauen artean proteina
zitoeskeletikoak (tubulina), proteina motoreak, proteina txaperonak, Ca++ lotzen duten
proteinak eta proteina kinasak nahiz fosfatasak, besteak beste (Inaba, 2003). Dineinak,
axonemaren tubuluei atxekitutako “besoak” osatzen dituzte. ATPasa aktibitatea
daukaten, kate peptidiko anitzeko proteinak dira. Proteina-proteina elkarrekintzen
bidez, ondoz ondoko tubuluen arteko irristaduraren arduradunak dira. Euren
ñintzionamendurako ATPa, erdiko zatikiaren, axonemaren inguruko, mitokondrioek
ekoizten dute.
Mugikortasunaren erregulazioa eta aktibazioa AMP ziklikoaren menpeko
prozesua da. AMP ziklikoak , AMP ziklikoaren menpeko proteina kinasa aktibatuko
du. proteina kinasa honek eta berak aktibatutako tirosina kinasak flageloaren proteina
egituralak (dineinak,...) fosforilatuko dituzte, fíruen arteko mugimendua sortaraziz.
Zelularen AMP ziklikoaren maila igotzeko, Ca++ ioiaren zelula kanpotiko bameraketa
eta espermatozoidearen Ca** bame-biltegien hustuketa gertatu behar da. Ca++-k,
m SARRERA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 27
kalmodulinaren bidez, adenilato ziklasa aktibaizen duela honek AMP ziklikoa
ekoitziko du.
Espermatozoideen motilitatea eta kapazitazioa elkarri lotutako prozesualc dira.
Esan daiteke pareko prozesuak direla, izan ere, kapazitazioaren ondorioetako bat
mugikortasun espermatikoaren aktibazioa edota hiperaktibazioa da. Beraz,
kapazitazioarengan eragiten dute zenbait faktore, mugikortasunean ere eragina daukate.
Hala nola, zelula bameko pH-aren alkalinizazioa (dineinen aktibaziorako
ezinbestekoa), ioien elkartrukeak (sodio bameratzea,...), mintzeko kolesterol
edukinaren aldaketa,...
Espermatozoidearen motilitatearen piztean sustantzia askok zerikusia dute. “/«
vitro" egindako mugikortasunaren estimulazioan, xantinak, nukleotidoak, kalikreina,
kamitina,... erabili izan dira (Amelar eta lank., 1980). Aurrerago ikusiko dugu ere,
hainbat sustantziek (peptidoak) duten eragina, besteak beste, mugikortasunean.
SARRERA 27
28 Asier Valdivia Doktore-Tesia
1.3.4. KAPAZITAZIOA
Kapazitazioa espermatozoidearen heltzearen prozesu bat da, ugaztunetan
bakarrik gertatzen dena (Ramalho-Santos eta lank., 2002). Prozesu honen lehenengo
berriak 1951. urtean jaso ziren, ugaztunen espermatozoideek zenbait ordu emearen
ugal traktuan eman behar zituztela, obulua emaltzeko gaitasuna garatzeko (Austin,
1951; Chang, 1951). Kapazitazioa, beraz, espermatozoideek obulua emaltzeko
gaitasuna lortzeko jasan behar dituen aldaketen bilduma bezala definitu daiteke.
Bilduma honen barman, prozesu ezberdinak kontuan hartzen dira. Hauen
artean, arnasketa zelularraren igoera eta mugikortasun espermatikoaren patroiaren
aldaketa (hiperaktibazioa) (Yanagimachi, 1994), espermatozoidearen mintzetik
kolesterolaren erauzketa (Cross, 1998), mintz espermatikoen desegonkortzea
(Hammerstedt eta Parks, 1987), zelularen bameko pHa (bikarbonatoaren sarreragatik)
eta kaltzio mailen igoera (Vrenenburgh eta Parrish, 1995), bigarren mezularien zenbait
sistemen aktibazioa (Duncan eta Fraser, 1993), etab. Aldaketa garrantzitsuena
espermatozoidearengan, erreakzio akrosomikoa jasateko abileziaren bereganatzea da.
Kapazitazioaren prozesua oso lotuta dago, espermatozoidearen mintzarengan gertatzen
diren fluidotasunaren aldaketekin, ioien zelula bameko mailen aldaketekin eta
zelularen metabolismoaren aldaketarekin (Yanagimachi, 1994). Bestalde, badirudi,
duela denbora gutxi proposatutako espermatozoideen teoría kimiotaktikoarekin lotuta,
kapazitazioarekin hatera garatzen dira espermatozoidearen jokabide kimiotaktikoa.
Honekin harremanean ere, kapazitazioa prozesu itzulezina (espermatozoide bakoitza
bakarrik kapazitatu daiteke behin bere bizitza osoan) eta iragankorra (isuritutako
espermatozoide-populazio osoan ez dira espermatozoide guztiak batera kapazitatzen;
populazioa egoera kapazitatu-deskapazitatu ezberdinetatik igaro daiteke) déla esan
behar da (Cohen-Dayag eta lank., 1995).
Kapazitazioaren oinarrian prozesu biokimiko eta molekular konplexuak daude.
Prozesu honetan, mintzeko kolesterolaren proteina hartzaile solugarrietarantz
(albúmina) transferentzia gertatzen da (Cross, 1998). Honek, besteak beste, mintzaren
28 SARRERA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 29
isurkortasuna aldatuko du, erreakzio akrosomikorako baldintzak erraztuz. Bestalde,
dirudienez, espennatozoidearen prozesu honetan inplikatutako zelulabameko
seinalizazio bideen artean, kaltzioaren menpekoak, AMP ziklikoaren menpekoak,
kinasen menpekoak eta REDOX baldintzen menpeko seinalizazio bideak ditugu. Bide
hauen arteko elkargurutzamenduak ere badaude (Baldi eta lank., 2002).
Kapazitazioan, epididimoko heltze prozesuari buruz komentatzen genuen
bezala, espermatozoidearen mintzaren aldaketak ez dira gertatzen espermatozoidearen
bameko espresio genikoagatik (edo ez, behintzat, maila adierazgarrian). Aldaketa
hauek inguruneko (plasma seminaleko, emearen ugal-hodiaren epitelioko,...)
substantziak eta molekulak bereganatzen lortzen dira. Kapazitazioaren prozesua 5-6
orduz luzatu daiteke gizakiaren kasuan (Browder eta lank., 1991).
Aurrerago aipatuko dugun bezala, jatorri prostatikoa duten eta plasma
seminalean dauden prostasoma izeneko besikulak, espermatozoidearen kapazitatzeko
gaitasuna murrizten dute. Besikula hauek kolesterolean joriak izaten dira, eta hau dela
eta, espermatozoidearekin baginan fusionatzean, espermatozoide-mintzaren
kolesterol/fosfolipido ratio-a aldatzen da, kapazitazioa zailduz. Gertakari honen
azalpen bezala, proposatu izan da, hauen fiintzioa espermatozoideen kaltzio-mailak
igotzea izatea, baina behar baino goizago erreakzio akrosomikorik eman gabe (Arienti
eta lank., 2004).
Peptido erregulatzaileak eta bere sistemen elementu erregulatzaileak
(hartzaileak, peptidasak,...) partehartzen omen dute kapazitazioaren prozesuan. Hala
nola, angiotentsina II-aren hartzaileak eta angiotensinaren entzima bihurtzailea (AEB),
(angiotentsinaz gain, entzefalinak degradatzen dituena, besteak beste) behatu izan dira
espermatozoidearen mintzean, Inteleukina 6 bitartekaria ere, kapazitazioa eta erreakzio
akrosomikoa estimulatzen duela deskribatu da. TRH-a eta honen antzeko peptidoak
(FPP, Gln-FPP,...) kapazitazio prozesuan parte hartzen dutela ikusi da (Fraser eta
Adeoya-Osiwa, 2001). Hala ere, FPP-ren kasuan behintzat, kapazitazioa bultzatu egiten
da kapazitatu gabeko zeluletan, baina erreakzio akrosomikoa, aldiz, inhibitu egiten da,
AMPc-ren ekoizpena erregulatuz.
SARRERA 29
30 Asier Valdivia Doktote-T esia
1.3.5. ERREAKZIO AKROSOMIKOA
Espermatozoidearen erreakzio akrosomikoa akrosomaren kanpo aldeko mintza
eta espermatozoidearen mintz plasmatikoaren arteko fusio anitzak bame hartzen duen
prozesu exozitikoa da. Erreakzio akrosomikoa kapazitazioaren ondoren gertatzen da,
eta espermatozoidea kumulu-zelulen geruza (Corona Radiata) zeharkatzean hasten da.
Prozesu honen bidez akrosomaren edukina zelulatik kanporatua izaten da.
Akrosomaren edukinaren funtzio nagusia obuluaren inguruan dagoen geruzaren (Zona
Pellucida) zenbait osagai degradatzea da eta, ondorioz, emaltzea posible egitea,
Honela, erreakzio akrosomikoa momentu egokian ematea oso garrantzitsua da, bestela
emaltze prozesu osoak porrot egin dezake.
Akrosomaren bamean enztima litiko ugari daude. Euren artean, proteasak,
glukosidasak (Zona Pellucida-ren glukoproteinen geruzeko karbohidratoengan eragiten
dutenak) eta fosfatasa daude. Entzima akrosomiko ugarienen artean akrosina,
proakrosina, fosfatasa azidoa, beta-glukuronidasa, hialuronidasa, beta-glukosidasa,
beta-N-azetilglukosaminidasa, beta-galaktosidasa eta beta-N-azetilgalaktosaminidasa
ditugu, besteak beste (Mack eta lank., 1983).
Prozesu hau aktibatzeko progesteronaren estimulazioa eta ZP3-aren (Zona
Pellucida Protein 3) espermatozoidearen mintzarekin lotzea behar da (Baldi eta lank.,
2002). Orain déla gutxi, espermatozoidearen mintzeko aide apikalean progesteronaren
hartzaile ez-genomikoak deskribatu izan dira (Tesarik eta lank., 1992; Baldi eta lank,
1998). Badirudi, hauen efektuak eta ZP3-ren loturarenak, kaltzio maila intrazelularrak
nabariki igotzearen (300-500 nM) (Breitbart, 2002), ondorioa dakartela (Baldi, 2002),
eta honekin batera, erreakzio akrosomikoaren piztea.
30 SARRERA
Doktore-T esia Asiet Valdivia Palacin 31
1.4. HAZIAREN BESTELAKO OSAGAIAK
Espermatozoideez gain, ejakulatuan bestelako gaiak topatzen ditugu. Gai hauek,
ugal-aparatuaren bestelako guruin eta egiturek jariatzen dituzte. Gai guztien baturak
(osagai zelularra eta osagai jariatua) hazia osatzen du.
1.4.1. LIKIDO SEMINAL A
Osagai zelularra inguratzen duen gai likidoa. Honen parterik gehiena besikula
edo guruin seminaletatik (haziaren % 60a), prostatatik (%30a) eta Cowper-en
guruinetatik (guruin bulbouretaletatik) dator, eta Cowper-en jariakinak eta epididimotik
datorren espermak haziaren gainontzeko % 10a osatzen dute.
Prostataren sekrezioa, azidoa izaten da eta honen osagai nagusiak fosfatasa
azidoa, zink-a, fibrinolisina eta azido zitrikoa dira, besteak beste. Besikula seminalen
jariakina, ordea, basikoa izaten da eta bere osagaien artean espermatozoidearen iturri
energetiko oinarrizkoa osatzen duten fruktosa eta glukosa daude, prostaglandina,
fibrinogenoa eta bikarbonatoarekin batera. Cowper guruinen jariapena alkalinoa da.
Azido askorbikoa eta neuropeptido eta hormona ezberdinak ere topatu izan dira likido
seminalean. Haziaren eta, beraz, likido seminalaren pHa 7’2 eta 7’8-ren artean egon
ohi da, gizonezko osasuntsuengan.
Likido seminalaren osagaien funtzioak anitzak dira. Euren artean ATP-aren
ekoizpenerako sustrato energetikoak gehitu (fruktosa), motilitatea eragin eta
bideragarritasuna mantendu, espermatozoideen oxidazioa ekidin (azido askorbikoa,...),
eiakulatutako haziaren koagulazioa lehenbizi (fibrinogeno, semenogelina...) eta
likuefakzio edo urtzea ondoren (fibrinolisina).
SARRERA 31
32 Asier Valdivia Doktore-T esia
1.4.2. PROSTASOMAR
Prostasomak, jatorri prostatikoa duten besikula txikiak dira (150-200 nm-ko
batazbesteko diametroa). Ronquist eta lankideek deskribatu zituzten lehenengoz
(Ronquist eta Brody, 1985). Hauen antzeko besikulak deskribatu izan dira beste
animalien plasma seminalean, baina askotan, hauen osagaiak eta funtzioak ez dira
gizakiarengan ematen diren berberak (Arienti eta lank., 2004).
Prostasomen osagai lipidiko nagusiak kolesterol eta esfingomielina dira
gehienbat, aldiz fosfatidilkolina ez da horren ugaria (Arvidson eta Iank., 1989; Arienti
eta lank., 1998). Hau garrantzitsua da espermatozoideen mintzaren osagai lipidikoa
kontrako antolaketa azaltzen duelako, fosfolipidoen edukina, kolesterola eta
esfmgomielinarena baino ugariagoa da. Hau, garrantzitsua da lehenago aipatutako,
kapazitazio prozesuan, kolesterolaren parte handiena mintz espermatikotik erauzia
izaten delako (Cross, 1998).
Osagai lipidikoaz gain, prostasomek ioi eta molekula txiki ugari (C a^’ Zn'1-1',
GDP, ADP, ATP) eta entzima anitz, hala nola, A fosfolipasa, ATPasa eta peptidasak
(Arienti eta lank., 2004). Prostasometako proteina ugari (139) izan dira identifikatuak
(Utleg eta lank., 2003). Horien artean, %33’8a entzimak ziren, proteina garraiotzaileak
%19a, proteina txaperonak %5’8a, GTP proteinak %14’4a eta seinaleen transdukzio
proteinak %17’3.
Bukatzeko, prostasometan markatzaile neuroendokrino ezberdinak deskribatu
dira. Hauen artean kromogranina B, Y neuropeptidoa eta hesteko peptido basoaktiboa,
adibidez (Stridsberger eta lank., 1996).
Prostasomen funtzio fisiologikoen artean espermatozoideen mugikortasuna
estimulatzea (Stegmayr eta Ronquist, 1982), haziaren urtzea (Lilja eta Laurel, 1984),
immunosupresioa (Kelly, 1995), bakterioen aurkako ekintza (Carlsson eta lank., 2000)
eta ekintza antioxidantea (Saez eta lank., 1998).
32 SARRERA
Doktore-Tesia Asiet Valdivia Palacín 33
Prostasomak espermatozoidearekin fusionatzen direla ikusi da (Arienti eta
lank., 1997). Fusio prozesu hau pH eta proteinen menpekoa déla behatu da. Fusio-
portzentaia, pH-a jeisten den heinean handitzen doa eta gutxitzen da, prostasoma eta
espermatozo ideen proteinen aldibereko deuseztearekin. Prostasoma eta
espermatozoideen arteko fusioa pH 5-ean ikertua izaten ohi da, baina 6 eta 7-ko pHtan
ere antzeman daiteke, pH 8-an desagertuz. pH aren aldaketa txikiek fusio prozesua
piztu dezakete. Isuriketa zatikatuaren (split ejaculation) lehenengo zatikiak, prostataren
jariakinarekin, hazi osoa baino azidoagoa dena, elkartu egiten dira, fusio hau erraztuz.
Bestalde, ugal hodi emearen pH azidoak fusio prozesua erraztu dezake.
Espermatozoide eta prostasomen arteko fusioa ez da oso handia, oso absolutua
(%10-20), baldintzarik onenetan ere, baina bada nahiko prozesu azkarra (10 bat
minututan bukatu egiten dena) (Arienti eta lank., 1997). Badirudi azkartasun hori oso
garrantzitsua dela funtzio fisiologikoaren aldetik.
Prostasomekin lotutako beste gertakari bat, espermatozoideetan kaltzioaren
maila intrazelularren igoera da. Prostasomak espermátozoideekin fusionatzean kaltzio
pultso bat sortzen da. Kaltzio ioiaren maila zelularrak kapazitazioa eta erreakzio
akrosomikoa pizteko garrantzi handia du. Aldiz, prostasomengan joria den kolesterolak
kapazitazioa inhibitzen du (Cross, 1998; Travis eta Kopf, 2002). Bi estimulu
kontrajarri hauen emaitza edo ondorio fisiologikoa espermatozoideen aktibazioa da,
mugikortasuna handituz, baina denboraz kanpoko erreakzio akrosomiko goiztiarra
galeraziz.
SARRERA 33
34 Asier Valdivia Doktore-Tesia
1.5. PEPTIDO ERREGULATZAILEEN
GARRANTZIFISIOLOGIKOA
l.S.1. PEPTIDO ERREGULATZAILEAK
Gure gorputzeko organo eta ehunen integrazio funtzionalean, ezinbestekoa
izaten da zelulen arteko komunikazio-sistema egokia existitzea. Zenbait zelulek (zelula
miokardikoek, esate baterako) komunikazio elektriko zuzenaz komunikatzen dira euren
artean. Hala ere, zelulen arteko komunikazio biderik hedatuenak oinarri kimikoa dute
(nerbio sistemaren sinapsietako neurotransmisoreak, sistema endokrinoko hormonak,
Sistema Immunearean bitartekari kimikoak...). Komunikazio kimikoan parte hartzen
duten sustantziak izaera kimiko oso anitzekoak izan daitezke (lipidikoak, aminoazido
eraldatuak,...). Sustantzia horien artean aktibitate biologikoa duten peptidoak daude.
Biopeptido, peptido erregulatzaile, neuropeptido, peptido bioaktibo edo hormona
peptidiko izenez ere ezagutzen diren sustantzia hauek.
Peptidoen partehartzea zelulen arteko komunikazio sisteman, eta bereziki
neuronen artean, honako aurkikuntzei esker ezarri zen:
1.- Ordurarte hipotalamikotzat hartutako hormonak, hipotalamo kanpoko
NSZeko guneetan topatzea (Leppaluoto eta lank., 1978)
2.- Hartzaile opioideekin selektiboki lortzeko gai diren peptidoen aurkikuntza
NSZ-ean (Simon, 1973); (Terenius, 1973)
3.- Horma gastrointestinalean edo erlazionaturiko guruinetan deskribatutako
peptidoen aurkikuntza garunean (Von Euler eta Pemow, 1977)
M SARRERA
Doktoie-Tesia Asiet Valdivia Palacín 35
4.- Oxitozina eta basopresina (Kelly eta Renaud, 1978) eta hipofisi-hormonen
jariapena kontrolatzen duten hipotalarao-hormonen jatorri neuronalaren aurkikuntza.
Horrek, ugaztunetan neurona peptidergikoaren kontzeptua ezarri zuen (Scharrer, 1978).
36 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Hurrengo taulan, gorputzean isolaíutako peptido bioaktibo garrantzitsuenak
aurkezten dira:
Peptido opioideak Hipofîsi-peptidoak
Proopiomelanokortina (POMC) ACTH (POMC-tik erat.)
Beta-endorfma p-MSH (POMC-tik erat.)
N- azetil-b eta-endorfina
A Proentzefalina Peptido eastrointestinalak
Met-entzefalina Protakikininak
Leu-entzefalina P Substantzia (SP)
Amidorfina K Substantzia (SK)
Metorfamida Hesteetako polipept. basoaktiboa
Oktapeptidoa Kolezistokinina (CCK-8)
Heptapeptidoa Gastrina
B Proentzefalina (Dinorfinak) Neurotensina
p-Neoendorfina Neuropeptido
P-Neoendorfina Y Neuropeptidoa (NPY)
A Dinorfina (1-8), (1-17) Areko polipeptidoak
B Dinorfina (Rimorfma) Bonbesina
Leumorfina (B Dinorfina, 1-29) Intsulina
Peptido hipotaiamikoak Glukagona
TRH Sekretina
LHRH (GnRH) Bestelako peptidoak
Soraatostatina Angiotentsinak
Kortikoliberina (CRH) Bradikinina
Somatokrinina Kamosina
Basopresina Loaren peptidoak
Oxitozina Galanina
Neurofisina
1.2. Taula. Gorputzeko peptido bioaktibo garrantzitsuenak
36 SARRERA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 37
1.5.2. PEPTIDO ERREGULATZAILEEN SINTESIA,
METAKETA ETA JARIAPENA
1.5.2.1. Biosintesia
Peptido bioaktiboen sintesi mekanismo nagusiak ezagutzen dira: (a)
oligopeptidoen sintesia mekanismo entzimatikoen bidez eta (b) ohizko mekanismo
erribosomikoen bidez sintetizatzeko, proteinen hidrolisi entzimatikoaren peptido
espezifikoak emanez.
Peptidoen sintesia erribosometan mRNA baten itzulepenaz sintetizatutako
peptido aintzindari baten ekoizpenaz hasten da (preprohormona, prepropeptidoa).
Aintzindari proteiko hau erretikulo endoplasmikoaren zistemetara pasatzen da, non
PRE aurresekuentzia degradatua izaten den. Honela pro-proteina edo propeptido bat
sortaraziko da eta Golgi-ren apar atura garraituko da. Hemen, porpeptidoaren
zatiakapena gertatuko da, peptido txikiagoak ekoitziz. Peptido hauek jariatze-
granuluetan bilduko dira.
1.5.2.2. Metatzea
Peptido bioaktiboak jariapen besikuletan metatzen dira eta garraio
zitoplasmikoz bukaera mintz plasmatikorantz eroaten dira, zuntz zitoeskeletikoen
bidez. Hor mantendu egingo dira, atsedenean, jariapen-kinada jaso arte.
SARRERA 37
38 Asier Valdivia Doktore-T esia
1.5.2.3. Askapena
Peptido erregulatzaileen jariapen-mekanismoak eta neuro transmisora
klasikoenak antzekoak dira (Burgus eta lank., 1970; Douglas, 1973). Kinada
despolarizatzaile baten ondoren, kaltzioaren menpeko prozesuan (Thom eta lank.,
1978) jariatuak izaten dira. Jariapenaren eredu klasikoa, nerbio-sinapsietan ematen
dena izaten da. Hemen, axoiaren zehar garraiatua izaten den ekintza potentziala,
axoiaren bukaeran despolarizazioa ematen da, C a^ ioiaren zaharrera bideratuz eta,
ondorioz, jariapen-besikula eta mintz plasmatikoaren fusioa ematen da, peptidoak gune
sinaptikora kanporatuz. Irudi hau, orokorrean, baliogarria izaten da beste ehunetako
peptidoen jariapenean. Kasu hauetan kinada seinale kimiko bat izan daiteke, baina
prozesua oso antzekoa da.
1.5.2.4. Hartzaileak
Peptido bioaktiboak odolean, sinapsira, edo bestelako fluidotara (hazia)
jariatuak izan daitezke, itu-zelula batera iritsiko direlarik Itu-zelula hauekin lotuz,
eragingo dute biopeptidoek euren efektu fisiologikoak Honetarako, itu-zelulek euren
mintz plasmatikoan, peptido bakoitzekin lotura espezifikoak egiteko gaitasuna duten
proteinak espresatuko dituzte. Proteina hauei mintzeko hartzaile deitzen zaie. Bame
peptido aren eta hartzailearen arteko elkarrekintzak kanal ioniko jakinetan
iragazkortasun aldaketak edo zelula bameko bigarren mezularien agerpena eragin
dezake.
Peptido erregulatzaileen hartzaileek oso dentsitate baxuak dituzte (100 fmol/mg
proteina inguru), baina oso afinitate altua; gutxi gorabehera, neurotransmisore
klasikoek bere hartzaileekiko dutena baino ehun aldiz altuagoa.
Hartzaile peptidikoak G proteinetara lotutako hartzaile metabotropikoak dira.
Mintzaren zeharreko zazpi domeinu hidrofobiko, zenbait glikosilazio gune N-
mutuirean eta kinasa erregulatzaileentzako fosforilazio guneak dituzte. Gainera,
38 SARRERA
Doktote-Tesia Asier Valdivia Palacíh 39
hartzaile peptidikoen azpimaila asko deskribatu dira; heterogeneotasun handi honek,
parte hartzen duten prozesuen aniztasuna isladatzen du.
1.5.2.5. Inaktibazioa
Peptido batek sortzen duen eraginaren iraupena eta intentsitatea, hartzailearen
inguruan dauden peptido horren kontzentrazioaren gutxitzean parte hartzen duten
mekanismoen menpe dago. Prozesu hau bí modutara gertatu ahal da: bukaera
sinaptikoetatik eta ondoko glia-zeluletatik gune sinaptikora askatu diren peptidoen
bereganatzeaz, edo anderakuntza entzimatikoz.
Peptido bioaktiboen inaktibaziorako bide nagusia, hauen hidrolisi entzimatikoa
da, bai exopeptidasa zein endopeptidasen bidez. Exopeptidasak peptidoak amino
(aminopeptidasa) zein karboxilo (karboxipeptidasa) muturretatik hidrolizatzen dituzte,
aminoazido bakarra askatuz. Endopeptidasak proteina eta peptido bameko loturetan
eragiten dute. Peptido erregulatzaile gehienak, mintzari loturiko zelula kanpoko
peptidasek inaktibatzen dituzte. Hala ere, kontuan izan behar dugu peptidasa
solugarrien eginkizuna.
Azkenik, peptidoaren ezabapenerako mekanismoa, peptido-hartzaile
konplexuaren barneratzea da, hormona peptidikoekin gertatzen den modura
(Willingham eta lank., 1980; King eta Cuatrecasas, 1981; Edwardson eta McDermott,
1982; Beaudet eta lank., 1998; Lin eta lank., 2000).
SARRERA 39
40 Asier Valdivia Doktote-Tesia
1.5.3. BARNE PEPTIDO OPIOIDEAK (BPO) ETA EUREN
ERAGIN FISIOLOGIKOAK
1.5.3.1. Orokortasunak eta deskribapen historikoa
Lehen azaldu bezela, 1973an lehenengoz hartzaile opioideak aurkitu ondoren
bameko sustantzi opioideak egon behar zutenaren susmopean jarri zituen ikertzaileak.
Izan ere, urte bat lehenago, Akil eta lankideek (1972, 1976) garuneko gune batzuetan
elektrikoki kitzikatuz lorturiko analgesia naloxonaren bitartez Iehengoratu zitekeela
ikusi zuten. Terenius eta Whalstrôm (1974) eta Kosterlitz eta Waterfield-ek (1975) ere
garun-estraktuez osatutako prestakin batzuk opiazeoen antzeko aktibitatea zutela
egiaztatu zuten. 1975an Hughes eta lankideek txerriaren burmuinean opiazeoek bezela
jokatzen zuten neuropeptido bi isolatu zituzten, entzefalina izenaz bataiatuak:
Metionina entzefalina (met-entzefalinaj eta leuzina entzefalina (leu-entzefalina).
Hurrengo urteetan endorfmak (Li eta lank., 1976) eta dinorfinak (Goldstein eta
lank., 1979;1981) aurkitu zituzten.
Bame peptido hauen arteko erlazio molekularra beren prekurtsore molekularrak
klonatu zirenean argitu zen. Lehenengoz karakterizatu zena, proopiomelanokortina
(POMC), P-endorfina eta ACTH aren prekurtsorea, izan zen (Nakanishi eta lank.,
1979). Gero entzefalinen prekurtsorea, proentzefalina, eta dinorfinena (prodinorfina)
klonatu ziren (Comb eta lank., 1982; Kakidani eta lank., 1982).
Beraz, hamar urte barman opiazeo-antzeko bame sistema egon zitekeela
susmatzetik hartzaile opioideak, beren bameko ligandoak eta hauen prekurtsoreak
direnen hiru geneak identifikatzera pasa zen.
1997an, endomorfina bezala ezagutzen diren peptido berri bi aurkitu ziren
(Zadina eta lank., 1997).
40 SARRERA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 41
I.5.3.2. BPOen sailkapena, ezaugarri molekularrak, eta
kokapena
Gaur egun 20 peptido opioide ezagutzen dira. Guztien, nozizeptina eta
endomorfina izan ezik, ezaugarria amino-muturretik karboxi-muturrera errepikatutako
aminoazido sekuentzia da:
Tyr-Gly-Gly-Phe-Meí
edo
Tyr-Gly-Gly-Pbe-Letí (met/leu entzefalinen egitura)
Era honetara, BPO-en familia 5-tik 32 aminoazidorainoko (P-endorfina) luzera
izan dezaketen peptidoz osatzen da, guztiek dutelarik gutxienez met edo leu-entzefalina
sekuentzi bat euren bamean. Peptido hauek lehen aipatutako hiru prekurtsoreen
apurketaren bidez sintetizatzen dira, opioide aktibitateko molekula bihurtuz.
Met-en tzefaliña: T yr- Gly-Gly-Phe-MetLeu-entzefalina: Tyr-Gly- Gly-Phe-Leu
P-endorfina: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Gly-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-
Val-Thr-Leu—Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile~Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-
Lys-Gly-Glu
Dinorfina A (1-17): Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-
Asp-Asn-Gln
Dinorfina B(l-13): Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Gln-Phe-Lys-Val-Val-Thr
a-Neoendorfina: T yr-Gly- Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-T yr-Pro-Lys
Nozizeptina: Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-
Ala-Asn-Gln
Endomorfinak: T yr-Pro-Trp-Phe-NH2
1.3. Taula. Ugaztunen peptido opioide naturalak. (Florez, 1998)
SARRERA 41
42 Asier Valdivia Doktoie-Tesia
Proentzefaliña (PE) NSZ-ean eta mu in adrenalean sintetisatzen da. Tripsina,
endopeptidasa eta N-karboxipeptidasa motako entzimen eraginez 243 aminoazidoko
proteina honetatik 7 peptido opioide ezberdin sor daitezke. Garrantzitsuenak
entzefalinak (met edo leu entzefalina) dira. Burmuinean isolatutako entzefalina
konbertasa izeneko karboxipeptidasa bat da pentapeptido hauen sintesiaren arduraduna
(Hughes, 1983). PE-ak met-E-ren lau kopia ditu (Akil eta lank., 1998).
Prodinorfinak (PD) dinorfma A (1-8) (1-17), B (1-13), p-nco-cndorfina, e.a.
peptido gordetzen ditu.
Proopiomelanokortina (POMC) opioide aitzindarien artean bame opioideak ez
diren peptidoak gordetzen dituen bakarra da. Izan ere, P-endorfina peptido opioideaz
gain, hormona adenokortikotropoa (ACTII), a eta fi lipotropina (LPH), a eta [V
melanotropina (MSH), eta beste zenbait peptidoren prekurtsorea da. Kasu honetan ere
molekula hauek sisntetisatzen dituen entzima ezagutzen da, POMC entzima
bihurtzailea hain zuzen (Turner eta lank., 1987).
Entzefalinak, dinorfinak eta endorñnak nahiko espezifízitate baxuz lotzen
zaizkie hiru hartzaile opioideei. Entzefalinak 6-hartzailearen lotugai naturalak bezela
ezagutzen dira, baina ^-hartzaileei ere lotzen zaizkie. Dinorfinak K-hartzaileari lotzen
zaizkio eta P-endorfinak |u-hartzailea eta baita ó-hartzailea ia afínitate berez ezagutu
ditzake (Roques, 1999).
Gaur egun, bost aminoazidoko egitura amankomun gabeko eta opioide
aktibitatea duten peptido berriak ere ezagutzen dira (endomorfina, nozizeptina).
Nozizeptina edo orfanina FQ (OFQ), ORL-1 hartzaile opioidearen lotugai
naturala, 17 aminoazidoz osatutako peptidoa da. Bere amino muturreko lehen eta
bostgarren aminoazidoak tirosina eta leu/met izan beharrean, fenilalanina eta threonina
dira (P/je-Gly-Gly-Phc-r/zr) (Meunier eta lank., 1995; Reinscheid eta lank., 1995).
OFQ-aren prekurtsorea pronozizeptina edo proorfanina FQ da. Gizakien eta
42 SARRERA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 43
karraskarien NSZ estraktuetan (Reinscheid eta lank., 2000) eta baita gaizkatan ere
klonatu izan da. Arrain espezie honetan klonatu izanak opioide klase honen eta besteen
arteko erlazio ebolutiboa ulertzeko aurrerapausua izan liteke (Danielson eta lank.,
2001).
Prekurtsore honen mRNA maila altuak sistema linbikoan deskribatu dira,
nozizeptinak duen estres-aurkako aktibitatea azpimarratuz; gero knock-out arratoietan
ikusi den bezela (Reinscheid eta lank., 2000).
Pronozizeptinak OFQ-z gain peptido biologikoki aktibo bi gorde ditzake.
OFQ2-a adibidez ahalmen analgesiko handia duela deskribatu da (Amodeo eta lank.,
2000).
OFQ edo nozizeptina, azkenengo urteetan ikertzaile ezberdinek deskribatutako
opioideen aitrkako familia harnean kokatzen dute (Harrison eta lank., 1998).
Endomorfma 1 eta 2 (EM 1 edo 2) jj.-hartzaileari afinitate handiz lotzen
zaizkion arren, tetrapeptido hauen aminoazido sekuentziak Tyr-Pro-Trp-Phc edo Tyr-
Pro-Phe-Phe dira (Zadina eta lank., 1997). Oraindik ez da bere aitzindaria klonatu.
Lehen azaldu den bezala, bai bame peptido opioideak eta beste biopeptido
motak peptidasen bitartez inaktibatzen dira. Hurrengo atal batean, entzima hauen
deskribapen sakona egingo da tesiaren gaiarekin bat doalako.
SARRERA 43
44 Asier Valdivia Doktore-T esia
1.5.4. TRH HORMONA ETA BERE ANALOGOAK
I.5.4.I. Orokortasunak eta deskribapen historikoa
Tirotropinaren hormona askatzailea (TRH edo tiroliberina) hormona askatzaile
hipotalamikoen taldearen osagaia da. Hormona talde honetatik lehenengo isolatu eta
karakterizatu zena izan zen, aurrcko hipofisitik zenbait hormona trofiko askatzeko duen
gaitasuna zela eta (Boler eta lank., 1969). Hormona hauek, neurona hipotalamikoetan,
nagusiki, sintetizatzen dira eta odol-zirkulazio lokalera askatzen dira, hipotalamo-
hipofisi-porta sistemaren bidez.
THR-ak, aurreko hipo lisian, tirotropina (tiroidearen hormona estimulatzailea,
TSH), hazkuntzaren hormona (GH) eta prolaktinaren sintesi eta jariatzearen
arduraduna da (Morley, 1981).
Hipotalamoak hipofisi-tiroide ardatzaren aktibitatea kontrolatzen duela,
berrogeitamargarren hamarkadatik ezaguna zen, baina hogei urte pasatu ziren, TRH-a
ardi- eta txerri-ehun hipotalamikotik kimikoki isolatu zen arte. p-Glu-His-Pro-NH2
sekuentzia peptidikoa duen tripeptidoa zela ikusi zen eta 1969.ean sintetizatzea lortu
zen (Boler eta lank., 1969; Burgus eta lank., 1969). Tiroliberinaren egitura primarioa
ardi- eta txerri-ehun hipotalamikoan berdina zela frogatu zen (Burgus eta lank., 1970)
eta behi eta gizakiaren TRH-ak mugikortasun kromatografiko bera zutela ere behatu
zen (Bowers eta lank., 1965).
TRH-a konformazio eskakizun zorrotzak ditu bere aktibitate biologikorako.
Honela bada, tiroliberinaren egitura naturalatik urruntzen den edozein formak,
aktibitate aldaketa handia du (Guillemin eta Burgus, 1972).
44 SARRERA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Patacín 45
TRH-ari buruzko lehenengo ikasketak TSH, GH eta prolaktinaren jariapena
eragiteko, aurreko hipofisiaren gain dituen ekintza neuroendokrinoctan oinarritzen
baziren ere, TRH-ak NSZ-ean ere eragin garrantzitsuak zituela, berehala argitu zén.
TRH-ak parte hartzen du : (1) kitzikapen neuronala aldatuz, (2) transmisoreen
askapena eta turaover-ra handituz, (3) NSZ-ean alerta areagotuz, (4) odol-presioa,
gorputz-tenperatura eta amas-zatiketa handituz, (5) elikagai eta likidoen hartzea
aldatuz, (6) aktibitate motorea handituz eta (7) analgesia sortuz (Jackson, 1982;
Griffiths eta Bennett, 1983; Griffiths, 1985; Sharif, 1988; Burt eta Sharif, 1989).
Binding esperimentuez (Hawkins eta lank., 1987; Sharif, 1988) eta teknika
autoradiografikoez (Manaker eta lank., 1986; Palacios eta Dietl, 1987), ugaztunen
NSZ-aren hainbat aldetan, TRH-aren hartzaileen maila altuak, heterogeneoki banatuta
aurkitzen zirela frogatu zuten. Honek, TRH-a neurotransmisorea zelaren hipotesia
indartu zuen.
TRH-ak, bere askapen bidearen arabera, modu desberdinetan jokatu ahal du:
1. Odolera askatzean neurohormona moduan j okatzen du.
2. Hipotalamo hipofisi porta sistemara askatzean askatutako-hormona moduan
lan egiten du.
3. NSZ eta Nerbio Sistema Periferiko (NSP) mailako sinapsietara askatzean,
neurotransmisore eta neuromoduladore moduan aritzen da.
4. Zelula ez neuronaletara askatzean, alboko zeluletan bitartekari parakrino eta
autokrino moduan jokatzen du.
1.5.4.2. TRH-aren peptido analogoak
1989-an TRH hormonaren antzeko egitura zuen tripeptidoa isolatu zuten
untziaren prostata eta guruinetan (Cockle eta lank., 1989a), TRH-arekiko zuen
SARRERA 45
46 Asier Valdivia Doktore-T esia
ezaugarri bereizgarria, TRH tripeptidoaren erdiko histidina hondarraren ordez,
glutamiko hondar bat azaltzen zuela zen. Handik gutxira, peptido bera giza hazian
deskribatu zuten (Cockle eta lank., 1989b) eta beste Ian batzuetan peptido hura, beste
espezie batzuen hipofisian deskribatu zen (Ashworth eta lank., 1991). Geroxeago, beste
TRH-aren antzeko tripeptido bi isolatu ziren, erdiko aminoazidoa Phe edo Gin
aminoazidoaz zutenak (Khan eta lank., 1992). pGlu-Glu-Pro tripeptidoak
espermatozoideen kapazitazioan eta emaltzeko abilezian eragina zuela ezarri zen
(Green eta lank., 1994) eta berehala peptido honi FPP (Fertilization Promoting Peptide)
izena eman zitzaion (Cockle eta lank., 1994). Ondoren, FPP-aren hartzaile espezifikoa
topatu izan zen, TCP-11 espermatozoideen azaleko proteina hain zuzen ( Fraser eta
lank., 1997).
1.5.4.3. TRH-aren banaketa gorputzean.
TRH-aren banaketa Nerbios Sisteman oso anitza da. Dirudienez, peptido honen
% 70a hipotalamotik (bere jatorri lekutik) kanpo omen dago (Leppaluoto eta lank.,
1978). Hipotalamotik kanpo, garun-kortexean eta enborrean behatu izan da TRHa
(Jackso etaReichlin, 1974; Morley, 1979).
TRHa arratoien organo periferikoetan (gibelean, giltzurrunean, arean,
bihotzean, barrabiletan, obulutegian) eta gorputzeko likidoetan (odolean, giza-hazian)
kokatu da (Safran eta lank,, 1982; Pekary eta lank., 1983; Lamberton eta lank., 1984;
del Rio-Garcia eta Smyth, 1990). TRH-aren hartzaileen banaketa ere ehun
periferikoetan ikertu da (Fukusumi eta lank., 1995).
Oilaskoetan TRH-a topatu da garunean, hipofisian, tiroide guruinean eta
gonadetan, hazkuntzan, ugalketan eta digestioan zerikusirik izan ahal duela pentsatzen
da (Geris eta lank., 2000).
46 SARRERA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 47
1.5.4.4. TRH-aren ezaugarri molekularrak, anderatze
metabolikoa eta bere produktuak
TRH-ak, bere egitura déla eta, entzima proteolitiko askoren aurrean
erresistentzia du, baita pepsina, papaina edo termolisinaren antzeko aktibitate
entzimatiko inespezifikoen aurrean (Burgus eta Guillemin, 1970). Aide batetik,
tripeptidoaren amino muturraren ziklazioa eta karboxilo muturrean duen amida taldea
déla eta, exopeptidasen aurrean erresistentzia du. Bestaldetik, bameko prolina déla eta
endopeptidasa gehienek ezin dute hidrolizatu.
Dena den, TRH-aren anderakuntza kataliza dezaketen, gutxienez, hiru entzima
identifikatu dira: prolil endopeptidasa, piroglutamil peptidasa I eta piroglutamil
peptidasa n.
TRH-a peptidasen bidez inaktibatzen da, gorputzaren atal desberdinetan:
garuna, hipofisia, bizkar-muina, gibela, giltzurrunak, area, guruin adrenalak eta odola
(Griffiths eta McDermott, 1983).
Entzima anderatzaileen presentziak leku hauetan guztietan, TRH-a
inaktibatzeko gaitasunaz gain, ehunetan bere edukia, bere ekintzaren iraupena eta bere
eraldaketa, biologikoki aktiboak diren zati txikiagotara, kontrolatzeko ahalmena ere
isladatu ahal du (Griffiths eta McDermott, 1983).
Anderatzearen produktuak
TRH-aren prozesamendu entzimatiko primarioaren ondoren nagusiki bi
metabolito eratzen dira:
SARRERA 47
48 Asier Valdivia Doktore-Tesia
1 - TRH azidoa:
Prolil endopeptidasa entzimaren aktibitatearen ondorioz sortzen den metabolito
primarioa da. Erradioinmunosaiakeraz, detektatu zen lehenengo aldiz, arratoiaren
burmuinean (Emerson eta lank., 1980) eta gizaki-gemuan (Bhandrau eta Emerson,
1980). Molekula honen garun-bentrikulu bameko injekzioak, “wet dog shaking”
izenarekin ezagutzen den konportamendua eragiten du (Boschi eta lank., 1980).
2- His-Pro diketopiperazina edo ziklo (His-Pro):
TRH-a piroglutamil peptidasa entzimen bidez hidrolizatzean His-ProNH2
sortzen da eta hau, espontaneoki ziklatzen da His-Pro diketopiperazina emateko
(Peterkofsky eta lank., 1982; Prasad eta lank., 1982).
Bere aitzindaria (TRH-a) baino kontzentrazio handiagotan aurkitzen da
burmuinean. Bertan eragin ugari ditu. Aktibitate endokrinoa du (Brabant eta lank.,
1981) eta NSZ-ean zenbait ekintza burutzen ditu, adibidez, kortexeko neuronak
kitzikatzea (Stone, 1983). Odolean (Mori eta lank., 1982; Duntas eta lank., 1993), hodi
gastrointestinalean (Mori eta lank., 1982) eta gemuan (Perry eta lank., 1965) ere topatu
da.
1.5.5.5. TRH-aren hartzaileak
1990.ean TRH-aren hartzailea identifikatu zen lehenengo aldiz genea klonatuz
bere espresioa lortu zuenean (Straub eta lank., 1990). Hartzaile hau ugaria zen aurreko
hipofisian eta burmuinaren atal neuroendokrinoetan, baina ez beste askotan.
Bestalde, NSZ-ean TRH-aren lotura guneak autoradiografiaz aztertu zirenean,
lortutako datuek, tripeptidoak banaketa zabalagoa erakusten zuela frogatu zuten. Honek
guztiak beste hartzaile baten presentzia iradokitzen zuen. Honela, 1998.ean, TRH-aren
hartzaileen azpitalde berri baterako kodifikatzen zuen cDNA klonatu zen (Cao eta
lank., 1998). TRH hartzaile honi TRH-R2 deitu zioten, lehenago aurkitutakoaz
desberdintzeko (TRH-R1).
48 SARRERA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 49
TRH-aren hartzaileak bizkar-muinean, giltzurrunetan, biriketan, bihotzean,
guruin adrenalean, arren ugalketa sisteman eta sistema gastrointestinalean topatu dira,
ikasketa hauetan zein motatako hartzaileak diren zehaztu ez bada ere (Bhargava eta
Gulati, 1988; Shi eta lank., 1996; Horita, 1998; Bilek, 2000). Badirudi hartzaile
bakoitzaren erregulazioa zelula motarekiko espezifikoa déla (Gershengom eta Thaw,
1991). Orain ere TRH-aren peptido analogoa den FPP trip epti do aren hartzailea
(TCP11) deskribatu izan da giza espermatozoidetan (Ma eta lank., 2002).
SARRERA 49
50 Asier Valdivia Doktore-Tesia
1.5.5. PEPTIDO ERREGULATZAILEAK ETA
UG ALKORT ASUN A
Ekintza biologikoa duten peptidoak, giza eta ugaztunen hazian topatu izan dira.
Kasu gehienetan euren funtzioa gizonezkoen ugalkortasunarcn fisiologian ez da
ezaguna, baina peptido hauen eragin zehatz batzuk badira ezagunak.
Peptido bioaktiboek ugalkortasunaren oso prozesu ezberdinetan partehartzen
dute. Y Neuropeptidoa, adibidez, hodi seminiferoetan eta barrabiletan deskribatu izan
da eta bere ekintza espermatogenesiaren erregulazio autokrino eta parakrinoaren
bamean proposatu da (Wengçr eta lank., 1990). Bestalde, Y Neuropeptidoak haziaren
isuritzean zerikusia du (Steers, 1994).
Leptinak ere ugal-aparatu arran eta gizakien hazian deskribatuak izan dira
(Glander eta lank., 2002; Camina eta lank., 2002) eta bere funtzioa oraindik ezagutzen
ez bada ere, sustantzia honentzako hartzaileak behatu izan dira isuritutako haziaren
espermatozoideen mintzean eta espermatozoidearen mintzaren osotasunarekin
erlazionatu izan da (Jope eta lank., 2003).
Aipamen bat besterik ez dugu egingo gonadotropinen (FSH eta LH) garrantziari
buruz, luzeegia eta konplexuegia izan baitaiteke hormona hauek ugalkortasunaren
fisiologian adierazten dituzten xehetasun guztiak direla eta. Gainera, hau ez da lan
honen helburua. Beste egituretan sartu gabe, haziaren plasman deskribatu dituzten
lanak (Shirai eta lank., 1975). Esan behar da gonadotropinen hartzaileak
espermatozoidetan behatu izan direla ere (Eblen eta larik., 2001).
Oxitozina ere behatu izan da giza hazian, eta hazi parametroekin, batez ere
mugikostasunarekin harremanean jarri nahi izan den arren, emaitzak kontraesankorrak
dira eta ez da harreman estatistikorik behatu (Goverde eta lank., 1998).
50 SARRERA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 51
Gastrina eta Kolezistokinina (CCK), barrabiletan eta zelula
espermatogenikoetan (ugaztunen espezie ezberdinetan CCK-ren kasuan) behatu izan
dira hurrenez hraren. Gastrina espermatozoidearen akrosomaren inguruan behatu izan
da. Hau delà eta, gastrina (gizakian) eta CCK (bestelako ugaztunetan) erreakzio
akrosomikoa ematean askatuak izaten direla proposatu da (Schalling eta lank., 1990).
Honi lotuta, bonbesinaren analogoa den GRP-ren (Gastrin releasing peptide) efektua
hazian, aztertua izan da. Motilitate, kapazitazioa eta bestelako parametroak eraginik
pairatzen ez dituzten arren, erreakzio akrosomikoa pairatzen duten zelula kopurua
aldatu egiten dela ikusi da, peptido honekin tratatzean (Levy eta lank., 1996).
ADH edo basopresinaren kasuan, hormona peptidiko hau espermatozoideen
mugikortasun murritzarekin eta oligozoospermiarekin harremandu izan da (Puri eta
Puri, 1985). Orohar, FSH, inhibina, arginina-basopresina (AVP), kalzitonina,
serotonina, oxitozina, adrenokortikotropina (ACTH), gastrina, sekretina, eta
somatostatina behatu izan dira gizakiaren barrabiletako ehunean, guztien funztioak oso
finkatuak ez egon arren (Mehta eta lank., 1995).
Beste hormona hipotalamiko garrantzitsua ugalkortasunean GnRH edo
gonadoliberina da. Peptido bioaktibo hau, hipotalamo-hipofisi-ugal aparatua osatzen
duten ardatz fisiologikoaren lehenengo urratsa izateaz gain, espermatozoideek Zona
Pellucida-rekm lotzeko duten gaitasuna areagotzen dute (Morales, 1998). GnRH-ren
jariapena, besteak beste, bame peptido opioideek (BPO) inhibitu egiten dute (Fabbri
eta lank., 1989).
1.5.5.1. Barne Peptido Opioideak ugalkortasunean
Bame peptido opioideak (BPO) ugal funtzioaren prozesu askorekin erlazionatu
izan dira. Esan egingo dugu opioideak duela denbora nahiko deskribatu izan direla giza
hazian. Honela, p-endorfina kantitate altuetan behatu izan da plasma seminalean
(Davidson eta lank., 1989). Entzefalinak, adibidez, oso hedatuak daude ugal-organo
ezberdinetan (Fujisawa eta lank., 1996). Peptido opioideak duela 20 bat urte deskribatu
omen ziren giza hazian (Sastry eta lank., 1982; Fraioli eta lank., 1984) eta hasiera-
SARRERA 51
52 Asier Valdivia Doktore-Tesia
hasieratik lotu izan dira espermatozoideen mugikortasun murriztuarekin (Fraioli eta
lank., 1984; Foresta eta lank., 1985; Sastry eta lank. 1991). Ez hori bakarrik; sustantzia
opioide exogenoen (Heroina, metadona,...) eragina ugal-fisiologian aztertua izan zen
(Cicero eta lank., 1975) sustantzia hauek ere hazi-parametroetan eta bereziki
espermatozoideen mugikortasunean, kalteak sortarazten zituztela proposatu zen (Ragni
eta lank., 1985).
Opioideak ugal funtzioaren puntu askotan erregulazioa eragiteko gai diren
peptido bezala deskribatu izan dira. Funtzio hauen guztien arteko ezaugarri
amankonuna, egiten duten eraenketaren mezua bereziki “inhibitzailea” izaten déla Hala
ñola, espermatozoideen motilitatearen jeitsiera, hodi deferentearen muskuluaren
uzkurdura inhibitu, bikotearen erantzun immunea motelduz,... (Fabbri eta lank., 1989).
Ez dago opioideak eta espermatozoideen kapazitazioa harremanean argi jartzen
duen lanik, baina besikula edo guruin seminalen jariakina, endorfinak eta bestelako
peptidoak dituena, espermatozoidearen kapazitazioarekin erlazionatu da (Aumuller eta
Riva, 1992). Proentzefalinaren kasuan, espermatogenesiaren, zelula germinalek
ekoitzitako, faktore parakrinoa izateaz gain, propeptido hau akrosoman mantendu eta
erreakzio akrosmikoan ingurunera askatu egiten déla behatu izan da, emaltze
prozesuan nolabaiteko garrantzia izan dezakeela proposatuz (Kew eta lank., 1990).
Honi lotuta, badaude Met-entzefalinaren analogoez, erreakzio akrosomikoaren
inhibizioa, dosi-menpeko moduan, deskribatzen dituzten lanak (Foresta eta lank.,
1986).
Entzefalinak, eta opiazeoak orohar, espermatozoideen mugikortasunarekin
erlazionatu izan direla esan dugu. Hala ere, opiazeo exogenoen efektua motilitatearen
aurkakoa déla behatu den bitartean (Cicero eta lank., 1975; Fraioli eta lank., 1984 ;
Ragni eta lank.,1985; Foresta eta lank., 1985), beste batzuk entzefalinak, eta zehazki
met-entzefalinak, in vitro, espermatozoidearen mugikortasuna ordutan luzatu
ditzakeela ikusi dute (Fujisawa eta lank., 1996), eta astenozoospermikoen hazian
topatutako met-entzefalinaren kantitatea, normozoospermikoenean topatutakoaren
aldean, askoz txikiagoa déla ere behatu dute.
52 SARRERA
Doktore-T esia Asier Valdivia Palacín 53
Peptido opioideak giza haziaren eta ugalkortasunaren prozesuetan duten
garrantzia indartzeko, duela gutxi opioideen |i hartzailea zaldien espermatozoideen
mintzean deskribatu da (Albrizio eta lank., 2005). Lan berean, espermatozoideen
kapazitazioan eta mugikortasunean eragina izan dezakeela proposatzen dute, hartzaile
horrekiko antagonista bat erabiliz (naloxona). Antagonista honekin inkubatzean,
espermatozoideen kapazitazioa estimulatu egiten zen, ziuraski kaltzio mai la
intrazelularrak igoz.
1.5.5.2. TRH Hormona eta bere peptido analogoak
ugalkortasunean
TRH (tiroliberina) eta honen antzeko peptidoen presentzia giza hazian
aspalditik ezaguna da (Pekary eta lank., 1983). Peptido honen jatorria hazi-isurian,
prostatikoa déla proposatu da ere. Handik urte batzutara, TRH-aren egitura osoa
antzekoa zuten tripeptidoak isolatu ziren giza hazian; hala ñola, pGlu-Glu-ProNH2 eta
pGlu-Phe-ProNH2 (Cockle eta lank., 1989) (Gkonos eta lank., 1994). Berehala
proposatu zen sustantzia hauek espermatozoidearen funtzioan eta fisiología
prozesuetan izan zezaketen garrantzia. Pglu-Glu-Pro-NH2, TRH-aren peptido
analogoak, arratoi-espermatozoideen kapazitazioa in vitro bultzaten zuela eta emaltze-
gaitasuna (errakzio akrosomikoaren berebiziko handipenik gabe) handitzen zuela
behatu zen (Green eta lank., 1994). Peptido honi FPP (Fertilization Promoting Peptide)
izena ezarri zitzaion (Cockle eta lank., 1994). Hortik gutxira, TRH-a bera eta FPP-a,
hazi-likidoan degradatzen zituen prolil endopeptidasa entzimaren aktibitate antzekoa
topatu zen (Siviter an Cockle, 1995). Hala ere, deskribatutako peptido horien artean
bakarrik FPP-ak bakarrik eragiten zuela, adierazgarriki, gizakien espermatozoideen
kapazitazioa ikusi zen (Green eta lank., 1996a).
Gizakiaren hazian azaltzen duen batazbesteko kontzentrazioan (50 nM), eta
TRH eta pGlu-Phe-ProNH2 peptidoen aldean, soilik FPP-ak azaltzen du kapazitazio
eragiteko gaitasuna. Hortaz, eragina hartzaile baten bidez egitekotan, FPP-arekiko
SARRERA 53
54 Asier Valdivia Doktore-Tesia
hartzaile espezifiko batez, eta ez TRH-aren hartzailearen bid.cz, lortu behar zela
ondorioztatu zuten (Green eta lank., 1996). Bestalde, prozesu honetan zelulaz kanpoko
Ca++ kontzentrazio mínimo bat (90 p.M) beharrezkoa zela behatu zuten. Gainera,
kapazitazioaren fase berantiarretan gehituta, FPP-ak akrosomaren galera espontaneoa
inhibitzen zuela ikusi zen, baina erreakzio akrosomikoa pairatzeko gaitasuna ez zen
galtzen; progesteronaren (erreakzio akrosomikoaren eragile físiologikoa) bidez,
erreakzio hau jasotzeko gai ziren FPP-z tratatutako espermatozoideak (Green eta lank.,
1996). Honela, FPP-aren efektua Adenosinaren parekoa zela ikusi zen, eta adenilato
ziklasaren zelula bameko seinale-bidearen bidez kapazitazioa eragiten zuela proposatu
zuten.
FPP-arentzako hartzaile espezifikoaren genea Fraser eta lankideek topatu zuten,
arratoien espermatozoidetan (Fraser eta lank., 1997).
Kaltzitoninaren eta Angiotensina II-aren eragina giza hazian antzekoa déla
ikusirik, sustantzia hauen guztien gabezia hazian edota hartzaile espezifíkoen kalteak
edo mutazioak, ugalkortasun eskasaren zergati garratzitsuak izan daitezke (Fraser eta
Adeoya-Osiguwa, 2001)
54 SARRERA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 55
1.6. PEPTIDASEN GARRANTZI
FISIOLOGIKOA
1.6.1. SARRERA
1.6.1.1. Entzima proteolitikoak
Sistema biologikoetan ematen diren ia erreakzio guztiak entzimak deritzen
makromolekula espezifikoen bitartez katalizatzen dira. Entzimen ezaugarri
garrantzitsuenak bere ahalmen katalitikoa (gizakiak sorturiko katzalizatzaileak baino
askoz boteretsuagoa) eta espeziñzitatea dira.
Entzima proteolitikoak, lotura peptidikoen apurketa hidrolitikoaren
katalizatzen dutenak dira. Hauek sailkatzerakoan bi talde bereiz daitezke:
Protein as ak, bere ekintza proteinen gain egiten duten entzimak dira (ehun
baino aminoazido gehiagoz osatutako egituren gain). Hauek exoproteinasak edo
endoproteinasak (ugarienak) izango dira proteina katearen kanpo aldean edo erdialdean
egiten badute bere ekintza katalitikoa. Zelula kanpoan (tripsina, errenina, e.a.) edo
bamean (katepsinak, kalpaina,...) kokatuta egon daitezke.
Peptidasak, peptidoen (ehun unitate baino gutxiagoko katea) apurketa
hidrolitikoaren katalizatzaileak dira eta hauek ere exo eta endopeptidasetan sailkatzen
dira. Exopeptidasen barruan aminopeptidasak eta karboxipeptidasak aurkitzen dira.
Lehenengoek amino muturrean (karga positiboduna) eta besteek karboxilo muturrean
(karga negatiboduna) egiten dituzte bere ekintzak. Endopeptidasek peptido erdian
ekiten dute, adibidez; angiotensinaren entzima bihurtzailea (AEB), kalpainak eta
endopeptidasa neutroa 24.11.
SARRERA 55
56 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Entzima proteolitikoak biopeptido ezberdinen sintesi eta anderakuntzarako
proposatuak izan dira. Sintesiari dagokionez, peptido erregulatzaileen deskribapena
egiterakoan azaldu den bezela, prekurtsore proteiko baten apurketaren ondorioz
peptido aktiboak sortzen dira. Peptido aktibo hauen inaktibazioa berriz, peptidasen
ekintzaren ondorioz ematen da, zati inaktibo txikiagoak edo aminoazidoak askatuz
(endo edo exopeptidasak diren arauera).
1.6.1.2. Peptidasak
70. hamarkadaren bukaeran, Ondetti eta lankideek AEB-ren inhibizioak
hipertentsio-kontrako efektua eragiten zuela ikusi zutenean (Ondetti eta lank., 1977)
peptidasekiko interesa asko suspertu zen. Hiru urte beranduago zink metalopeptidasa
zehatz baten inhibizioak analgesia sor zezakeela ikusi zuten. Entzima hori
endopeptidasa 24.11 edo entzefalinasa izenaz bataiatu zuten (Roques eta lank., 1980).
Peptidoen anderatzaileak diren entzimei buruzko ikerketak aurrera joan ahala,
biomolekula hauek (baita beren sustratuak ere) gorputz o so an oso hedatuak daudela
argi gelditu zen. Gainera kontzeptu hau, “peptidasa bat, sustratu bat”, aide batera utzi
zen (Schwartz, 1983; Kenny, 1986). Gaur egun onartuta dago peptidoak
sustratuarekiko espezifizitate nahiko zabala duten entzima kopuru mugatu batek
hidrolizatzen dituztela.
Peptidasa hauen artean batzuk mintz zelularrean integratzen dira, bere gune
aktiboa aide extrazelularrean kokatuta dute (ektoentzimak), eta talde prostetikoan zinka
daukaten metaloproteinak dira (Turner eta lank., 1987; Maroux, 1987). Hala ere,
badaude zitosolikoak diren peptidasak (Wagner eta lank., 1981; Hersh, 1982) eta baita
gune aktiboa zelula bamera begira duten peptidasa integralak ere (Dyer eta lank.,
1991).
56 SARRERA
Doktote-Tesia Asier Valdivia Palacín 57
80. hamarkadan eginiko ikerketa askotan bai neuroncn eta bai zelula glialen
mintzetan peptidasa ugari aurkitu dira, neuropeptidoen inaktibazioaren arduradun
nagusiak direla proposatuz (Turner eta lag., 1985; McKelvy eta Blumberg, 1986;
Lynch eta Snyder, 1986; Turner, 1986).
Aminopeptidasak peptido ezberdinen N-muturreko aminoazidoen lotura
peptidikoa hidrolisatzen dute. Egitura kimikoa argi egon ez arren gehienak talde
prostetiko bezala Zn2+-a daramaten metaloproteinak (Vallee eta Galdes, 1984) edo tiol
proteinak (O’Cuinn eta lank., 1990) direla dakigu. Peptidasa hauen tamaina oso
aldakorra da, 25-300 kDa tartekoa (Taylor, 1993),
Orain arte eginiko ikerketa ezberdinek biopeptido bakoitzarekiko espezifikoak
diren peptidasarik ez dagoela diote. Dirudienez, espektru zabaleko peptidasa gutxi
batzuk neuropeptido askoren anderakuntzaren arduradunak dira. Hala ere, oraindik
beharrezkoak dira ikerketa gehiago ikuspuntu hau ziurtatzeko.
Sustratuekiko espezifizitate gutxi dutenez eta orokorrean ikertutako izaki
bizidun eta ehun mota gehienetan aminopeptidasa aktibitatea ikus daitekenez, entzima
hauen sailkapen zehatza egitea ez da erraza (Taylor, 1993).
SARRERA 57
58 Asier Valdivia Doktote-Tesia
1.6.2. ENTZEFALINEN ENTZIMA ANDERATZAILEAK.
AMINOPEPTIDASAK ETA ENDOPEPTIDASA
NEUTROA
Entzefalinen anderakuntzan parte hartzen duten entzimak aminopeptidasak,
endopeptidasa neutroa 24.11, karboxipeptidasak, katepsina C eta angiotentsinaren
entzima bihurtzailea (AEB) dira, 1.3. irudian ikus daitekeen bezala.
1.3. Irudia. Entzefalinen entzima anderatzaileak.
Hala ere azkeneko 30 urteetan egindako lan askok entzefalinen anderakuntzaren
arduradun nagusiak aminopeptidasak eta endopeptidasa neutroa 24.Ü (entzefalinasa)
direla azpimarratzen dute.
70. hamarkadan eginiko lan batzuk entzefalinen erdibizitza nahiko laburra zela
bai “in vivo” zein “in vitro” egoeran adierazi zuten, animaliei pentapeptido hauen dosi
altuekin tratatu eta analgesia ahula eta laburra azaltzen zela ikusi ondoren (Belluzi eta
lank., 1976 ). Gainera tyr-gly edo gly-phe lotura peptidikoak hidrolisiarengandik
babestuta zuten entzefalina sintetikoak eman ondoren analogo hauen botere
analgesikoa handiagoa zela frogatu zen (Pert eta Iank., 1976; Foumié-Zaluski eta Iank.,
1979). Beraz zelulen mintzan peptidasa aktibitatea zuten ektoentzimak egon behar
{Katepsina C[ AEB
58 SARRERA
Doktore-Tesia Asiei Valdivia Palacín 59
zirenaren susmoa egiaztatzen hasi zen. Honela, arratoiaren NSZ-ko estriatuko
mintzetan tyr gly gly tripeptidoa askatzen zuen entzima aurkitu zen (Malfroy eta lank,
1978). Entzefalinasa izena hartutako entzima honen ekintza fisiologikoa frogatuta
gelditu zen bere lehenengo inhibitzaile sintetikoa (tiorfana) erabili zenan, honek
naloxonarekin itzulgarria zen propietate nozizeptiboa baitzuen (Roques eta lank.,
1980). 1983-an Zn2+-metalopeptidasa hau endopeptidasa neutroa 24.11 bezala
deskribatu zen (.NEP edo EC 3.4.24.11) (Relton eta lank., 1983).
Bestalde, entzefalinen tyr-gly lotura peptidikoaren apurketa fisiologikoaren
arduraduna aminopeptidasa N zela frogatu zen bere inhibitzailea den kelatorfanak
sortutako analgesiaren ondorioz (Waksman eta lank., 1985). Era berean, Hui eta
lankideek (1983) puromizina antibiotikoarekiko sentikorra zen beste aminopeptidasa
bat (puromycin-sensitive aminopeptidase edo PSA) deskribatu zuten, zeinek
entzefalinak hidrolisatu eta tirosina aminoazidoa askatzen zuen.
Gaur egun aminopeptidasa N eta entzefalinasaren inhibitzaile sintetiko berriak
(RB 101) eta kelatorfana bera, animalietan lortutako nozizepzioaren aurkako efektuak
direla eta, etorkizunean opiazeoen altematiba edo laguntzaile moduan erabil zitezkeen
analgesiko berri bezala proposatu dira (Ortega-Alvaro eta lank., 1998; Noble eta lank.,
1999). Izan ere, inhibitzaile hauen eragin analgesikoa amas-depresio arrisku gabeko
efektua dela frogatu da, opiazeoekin gertatzen ez den bezala (Boudinot eta lank.,
2001).
Tesi honetan entzefalinak anderatzen dituzten peptidasen deskribapen zabala
egin denez, hauen adierazpen berezia egingo dugu:
I.6.2.I. Endopeptidasa neutroa (Nep, EC 3.4.24.11)
Endopeptidasa neutroa glikosilatutako zink metalopeptidasa bat da. Peptidasa
honek aminoazido hidrofobikoekiko espezifikotasun handia azaltzen du (Kerr eta
Kenny, 1974). Ektoentzima hau 90 bat KDa-eko kate polipeptidiko bakar batez osatuta
dago (Relton eta lank., 1983). Pisu hau, entzimaren glikosilazio-mailaren arabera alda
SARRERA 59
60 Asier Valdivia Doktore-Tesia
daiteke. Entzima hau, mintz plasmatikoko proteina intégrala bezala hartzen den arren,
badira forma solugarriak deskribatzen dituzten ikerketak (Spillantini eta lank., 1990).
Dirudienez, entzima hau ia ugaztun oroetan azaltzen da (Gee eta lank., 1983)
eta ehun anitzetan deskribatu izan da, hala ñola, giltzurruna, birika, nerbio sistetema
zentrala, gizonezkoen ugal aparatuan, odolean, gemuan, neutrofiloetan,
fibroblastoetan,... (Erdos eta Skidgel, 1989). Giltzurrunetan maila aítuenetakoak
azaltzen di tu (Kerr eta Kenny, 1974). Garunetan eta nerbio sistema zentralean
deskribatu zenetik (Sullivan eta lank., 1978), garrantzi fisiologiko altuko zereginekin
lotu izan da, hala ñola, minaren fisiologian (Roques eta lank. 1980).
Entzima honek, entzefalinaz gain, kininak, P substantzia, Peptido Natriutetiko
Aurikularra, etab, anderatzen ditu. Endopeptidasa neutroa Zn++ eta bestelako katioi
dibalenteen bidez (maila txikiagoan) aktibatu egiten da, EDTA bezalako kelatzaile
metalikoak inhibitu egiten duten bitartean. Inhibitzaile espezifikoen artean tiol-
inhibitzaileak dira garrantzitsuenak, Tiorfanaren (Roques eta lank. 1980) familiakoak
(azetofan, sinorfan,...). Beste talde bat, fosforilatutako inhibitzaileena,
fosmaridonarena, alegia, izango litzateke.
1.6.2.2. Puromizinarekiko sentikorra den alanina
aminopeptidasa (PSA edo EC 3.4.11.14)
Puromizina hazkuntza bakterianoetan isolaturiko antibiotikoa da (Porter eta
lank., 1952). Espektru antibakteriano zabaleko molekula hau entzefalinen
anderakuntzaren inhibitzailea zela ikusi zen orain déla 20 urte, nahiz eta lortutako
eragina beste inhibitzaile batzuena (bestatina adibidez) baino askoz eskasagoa izan
(Chaillet, 1983). Urte gutxi beranduago definituta gelditu ziren garun mintzetan
entzefalinak anderatzen dituzten aminopeptidasa mota bi. Bata, puromizinarekiko
sentikorra zena (PSA) (Hui eta lank., 1983; Hersh eta lank., 1985), eta bestea, ez zena
antibiotiko honekin inhibitzen (alanina aminopeptidasa N edo M, APN) (Gros eta lank.,
1985; Matsas eta lank., 1985). Hori déla eta bestatinak, entzima bien inhibitzailea,
puromizinak baino nozizepzio aurkako aktibitate hobea aurkezten zuen.
60 SARRERA
Doktore-T esia Asier Valdivia Palacio. 61
Entzefalinak anderatzen dituen PSA-k isoforma bi ditu; hau da, egitura berbera
aurketzten duten entzima solugarri bat (alanil aminopeptidasa solugarria) eta mintzari
lotutako beste bat (alanil aminopeptidasa Mû edo AP Mil). Azken hau ez da mintzan
kokatutako proteina integral bat ez baitu aurkezten mintzari lotzeko domeinu berezirik.
Horregatik, proteina anfitropikoen taldean sartu dute zenbait ikertzailek. Dirudienez,
AP MII-ak mintzean kokatzeko beste proteina integralekin elkarrekiten du (Dyer eta
lank., 1990).
Giza PSA klonatu eta neuronetan (ezta glian, ezta garun basoetako endotelioan)
azaltzen zela agertu zuten (Tobler eta lank., 1997). Izan ere, AP Mil-a garunean
espezifíkoki agertzen déla deskribatu den bitartean, forma solugarria oso hedatua dago
ehun ezberdinetan, (bihotza, gihar eskeletikoa, giltzurruna, gíbela, e.a.) (McLellan eta
lank., 1988).
PSA-k eta APN-ak oligopeptido eta proteina askoren N-muturreko alanina,
tirosina, fenilalanina eta metionina aminoazidoak hidrolisatzen dituzte. Fisiologikoki,
entzefalinez gain, beste oligopeptido batzuen anderakuntzan parte hartzen dutela
deskribatu da (Tayíor A, 1993). Adibidez, bame peptido opioideen artean
prodinorfinaren eratorriak diren dinorfina antzeko peptidoak hidrolisatzen dituzte; beti,
13 aminoazido baino gutxiago dituzten peptidoak direnean. Izan ere, 1989-an Gibson
eta lankideak, dinorfina A (1-17) -k Leu-entzefalinaren hidrolisia inhibitzen zuela
ikustean, tamaina honetako peptidoak eta handiagoak zitosoleko alanina
aminopeptidasa aktibitatearen erregulatzaileak izan zitezkeela proposatu zuten.
Beharbada ordura arte animali ereduekin egindako garunbideko BPO tratamenduen
efektuak zuzenak eta ez-zuzenak izan litezke. Hau da, efektu ez-zuzena BPO-en
anderatzaileak diren aminopeptidasen inhibizioaren ondorioz gerta liteke.
SARRERA 61
62 Asier Valdivia Doktore-Tesia
1.6.2.3. Alanina aminopeptidasa N edo M (puromizinarekiko
ez-sentikorra) (APN edo EC 3.4.11.2)
Entzima hau 1985-an arratoi garun mintzetan isolatu eta entzefalinak
anderatzen dituen entzima delà frogatu zenetik (Gros eta lank., 1985; Waksman eta
lank., 1985) gorputzeko beste organo edo ehunetan ere deskribatu da (giltzumma,
gibela, hesteak, e.a) (Hersh eta lank., 1987). Azkeneko urteetan, linfozitoen CD13
markatzailea del a ikusi ondoren, immunitatearekin lotutako ikerketa asko egiten ari
dira entzima honi buruz (Shimizu eta lank,, 2002). APNa II motako mintzeko proteina
da (Giros eta lank., 1985).
APN-aren inhibitzaile naturalei dagokionez, PSA eta dinorfina “luzeekin”
gertatzen den bezala, P substantziak eta bradikininak entzima hori inhibitzen duela
deskribatu da (Xu eta lank., 1995).
Giros-en taldeak (1985) APN-ak entzefalinen anderakuntzan PSA-k baino
eragin gehiago duela proposatu zuen eta, ideia honi jarraituz, gaur egun prestatzen ari
diren katabolismo honen inhibitzaile berriak APN-a eta entzefalinasaren inhibitzaileak
dira (Roques BP, 1999). Hala ere, NSZ-an APN-ak bere ekintza nola eta non egiten
duen ez dago argiegi. Egia esan, duela gutxi arte entzima honek bere ekintzaren zati
handiena garuneko endotelio baskularrean egiten duela usté izan da (Solhonne eta
lank., 1987). Baina entzima honen inhibitzaile markatuak erabiliz, APN-a NSZ-ko
gune ezberdinetan azaltzen dela ikusi da (Noble eta lank., 2001).
Beste peptido ezagunen artean APN-ak angiotensina 111-a inaktibatu dezakeela
ikusi da (Reaux eta lank., 1999).
62 SARRERA
Doktote-Tesia Asier Valdivia Palaein 63
1.6.3. TRH ETA HONEN PEPTIDO ANALOGOAK
ANDERATZEN DITUZTEN PEPTIDASAK
Hiru dira TRH-ren anderakuntza aurrera ermaten duten peptidasa ezagunenak:
Piroglutamil Peptidasa I (pGlu-X lotura hidrolisatzen du), Piroglutamil Peptidasa II
(pGlu-His loturarekiko espezifikotasuna du) eta Prolil Endopeptidasa (Karboxilo
muturreko prolinaren deamidazioa egiten du TRH eta peptido analogoetan).
1.4. Irudia. TRH eta honen peptido analogoa den FPP-ren (Fertilization
Promoting Peptide) entzima anderatzaileak.
SARRERA 63
64 Asier Valdivia Doktore-T esia
1.6.3.1. Prolil endopeptidasa (EC 3.4.21.26)
Prolina biologikoki aktiboak diren peptido askoren aminoazido sekuentzian
kokatzen da, hauen egitura molekularrean eta peptidasa ezberdinekiko erresistentzian
garrantzitsua delarik (Turner, 1986). Lehenengoz 1971 an deskribatutako prolil
endopeptidasak (PEP), prolil oligopeptidasa ere deitua, peptido hauek prolina
aminoazidoaren karboxilo muturretik hidrolisatzen ditu (Walter eta lank., 1971).
Prolil endopeptidasaren aktibitatea, giza umetokien homogenizatuak,
oxitozinatik (Cys-T yr-Il e-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2) leuzilglizinamida
peptidoaren askapena gauzatzeko gai zirela behatu zenean aurkitu zen (Walter eta
lank., 1971). Geroago, aktibitate hau, garai hartan "post-proline cleaving enzyme"
deitua, arkume giltzurrunatik purifikatua izan zen eta peptido askoren prolina
aminoazidoaren karboxilo aldetik hidrolisia eragiten zuela ikusi zen (Koida eta Walter,
1976), bi prolinen arteko lotura izan ezik. Garunean antzeko aktibitate entzimatikoa
ediren zen, prolil endopeptidasa izenarekin izendatu zena (Orlowski eta lank., 1979).
Entzima hau prolil oligopeptidasa izenarekin ere ezagutzen da.
Prolil endopeptidasa serin-proteasen taldearen barruan koka dezakegu. Entzima
metal astunei sentikorra da EDTA erabiliz prolil endopeptidasaren egonkortasun
handiagoa lortzen baita. Zn2+, Co2+, Fe2+ -ek erabateko inhibizioa sortzen dute eta
Mn2+, Ca2+ eta Mg2+ -ek inhibizio partziala (Orlowski eta lank., 1979).
Entzima hau gizaki edo arratoiaren garunean zabalki deskribatu da (Kato eta
lank., 1980; Wilk S, 1983; Kalwant eta lank., 1991). Hortik kanpo bestelako ehun
periferiko ezberdinetan ere behatu izan da. Hala ñola giltzurruna, testikuluak, gihar
eskeletikoa, biriketan, linfozitoak, fíbroblastoak, e.a. (Kato eta lank., 1980; Yoshimoto
eta lank., 1979; Goossens eta lank., 1996; Orlowski eta lank., 1979).
64 SARRERA
Doktore-Tesia Asiet Valdivia Palacín 65
Gainera, serumean (Maes eta lank., 1994b) agertzeak, entzimaren forma jariatua
ere dagoela pentsarazten digu. Giza-hazian, espermatozoideetan (Yoshida eta lank.,
1999) dago. Obulutegian, folikuluen granulu zeluletan eta fluxuan ere detektatu da
(Kimura eta lank., 1998).
Hasiera batean bakarrik zitosolean aurkitzen den entzima delà pentsatu izan
bada ere (Dresdner eta lank., 1982), gaur egun mintzari lotutako isoforma bat dagoela
dakigu, neuronen kasuan sinaptosometan mailan aurkitu daitekeena hain zuzen
(O’Leary eta lank., 1995 eta 1996).
Prolil endopeptidasak aminoazidoaren karboxilo muturretik prolina duten
peptidoak, azil-Yaa-Pro-Xaa modukoak, anderatzen ditu. Entzimak ezin du proteina
luzeagoak hidrolizatu, eta deskribatu da 3000 Da baino gehiagoko peptidoak ezin
dituela anderatu. Peptidoek, amino terminalean N-amina askea dutenean, ez ditu
anderatzen. Bi prolinen arteko lotura peptidikoaren hidrolisia ere, ezin du aurrera
eraman (Cunningham eta O'Connor, 1997) eta bakarrik trans konformazioan dauden
prolinak ezagutzen ditu (Lin eta Brandts, 1983). Zenbaitetan, prolinaren ordez, alanina
duten substratuak ere hidroliza ditzake, baina aktibitatearen galera handia du. Prolil
endopeptidasak, besteak beste, hurrengo peptidoetan eragiten du: TRH, GnRH,
angiotensina I, bradikinina, p-endorfina, neurotensina, oxitozina, P sustantzia eta
basopresina (Walter eta lank., 1971; Koida eta Walter, 1976; Tate, 1981; Emson eta
lank., 1982; Greene eta lank., 1982; Camargo eta lank., 1984; Moriyama eta lank.,
1988; Mendez eta lank., 1990; Stanziola eta lank., 1999). Prolil endopeptidasak,
hauetako zenbait peptidoen aktibitatea, erregulatzen du; bestetan, peptido aktiboak
eratzen ditu bere aitzindarietatik.
Adibidez Angiotensina I (Asp-Arg-Val-Tyr-Ue-His-Pro-Phe-His-Leu) eta
Angiotensina II (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)-aren prolinen karboxilo muturrean
eragiten du Angiotensina (1-7) (Angiotentsina III) emateko, biologikoki aktiboa den
heptapeptidoa. Beste adibide bat aipatze arren, P substantzia (Arg-Pro-Lys-Pro-Glu-
SARRERA 65
66 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Glu-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2) bere bigarren prolina aminoazidoaren karboxilo
muturra hidrolizatzen du
Prolil endopeptidasaren banaketa zabalak eta biologikoki aktiboak diren peptido
askorengan duen eraginak, entzima honek funtzio biologiko garrantzitsu edo/eta
espezifikoak izan ditzakela iradokitzen digu
Azkeneko hamarkadan prolil endopeptidasari buruzko ikerketa ugari argitaratu
dira, gaixotasun ezberdinen ñsiopatologiarekin erlazionatuta baitago. NSZ-ren kasuan,
Alzheimer, Parkinsona, Huntington, e.a. endekapenezko gaixotasun neurologikoetan
entzima honen aktibitatearen aldaketak ikusi dira (Mantle eta lank., 1996). Izan ere,
entzima honek oroimenarekin zerikusia duela eta, gaur egun PEP-ren inhibitzaileekin
azterketa preklinikoak egiten hasi dira karraskari, tximino eta gizakian (Schneider eta
lank., 2002; Morain eta lank., 2002) emaitza onak agertuz. Prolil endopeptidasaren
aktibitate-mailaren aldaketak, buru-gaisotasunekin (depresioa, eskizofrenia, asaldura
bipolarrak,...) erlazionatzen dituzten ikerketa-lanak ere badaude (Maes eta lank., 1995;
Williams eta lank., 1999)
Maila periferikoan entzima hau espermatozoideen mugikortasunarekin (Kimura
eta lank., 2002), glomerulonefritisarekin (Naghetinni eta lank., 2001), sprue edo
gaixotasun zeliakoarekin (Shan eta lank., 2002), e.a erlazionatu da.
1.6.3.2. Piroglutamil peptidasa I (EC 3.4.19.3)
Piroglutamil peptidasa I-ak (PAP; EC 3.4.19.3), peptidoetatik amino muturreko
piroglutamil aminoazidoak hidrolizatzen ditu oso modu selektiboan (McDonald eta
Barret, 1986).
Amino muturreko L-azido glutamikoa ziklatzen denean, L-pGlu emateko,
zenbait ezaugarri berezi hartzen dute peptidoek. Aide batetik peptidoaren batazbesteko
bizitza, tamaina bereko beste peptidoena baino luzeagoa izaten da, peptidasa gehienak
66 SARRERA
Doktote-Tesia Asie* Valdivia Palacín 67
ez baitira gai L-pGlu-X lotura hidrolizatzeko. Dena den, egitura hau duten peptidoen
erregulazioa aurrera eramateko gai diren entzimak beharrezkoak dira. Honela bada,
lotura hau apurtuko duten zenbait peptidasa deskribatu dira: piroglutamil peptidasa I
eta piroglutamil aminopeptidasa H
Aktibitate hau duten peptidasei omega peptidasak deitzen zaie aminopeptidasak
deitu beharrean, hauen substratuek ez dutelako N-muturrean amino-talde askerik.
Piroglutamil peptidasa II (EC 3.4.19.6) hobekien ezagutzen dena da, ikerlan
ugari kaleratu baitira entzima honi buruz (O’Connor eta O'Cuinn, 1985; Zagon eta
McLaughlin, 1989). Mintzari loturiko metalopeptidasa bat da. Muskuluan eta nerbio
sisteman, batez ere sinaptosometan, agertzen da (Wilk eta Wilk, 1989; Czekay eta
Bauer, 1993; Awade eta lank., 1994). Oso espezifitate handia du TRHarekiko, beste
substraturík ez baitu hidrolizatzen.
Piroglutamil peptidasa I entzimak, piroglutamil peptidasa II-a bezala L-pGlu-X
lotura hidrolizatzen duen arren, zenbait desberdinatasun ditu aurrekoaren aldean. Hau,
zistein peptidasa zitosolikoa déla deskribatu da (Cummins eta O'Connor, 1996).
Piroglutamil peptidasa I Bacillus amyloliquefaciens-eúk isolatu zen lehenengo
aldiz, bere ezaugarri entzimatikoak karakterizatuz (Tsuru eta lank., 1978). Aurrerago
bere genea klonatu eta sekuentziatzea lortu zen (Yoshimoto eta lank., 1993).
Mutagenesi zuzendutako analisiaren bidez, katalisian zisteina batek zeregina zuela
aurkitu zen, Cys-144 hain zuzen ere (Yoshimoto eta lank., 1993). Entzima Escherichia
coli-n espresatzea lortu zen eta x-izpiak erabiliz kristalizatu zen, bere hiru
dimentsiotako egitura argituz (Odagaki eta lank., 1999).
Ugaztunen piroglutamil peptidasa I-a 23700 Da-etako monomero moduan
deskribatu da. Bakterioen eta ugaztunen entzimaren azpiunitatea SDS-PAGE bidez, 22-
25 KDa-etakoa zela neurtu zen.
SARRERA 67
68 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Ikerlan gehienek soilik zitosolean aurki daitekeela dioten bitartean (Cummins
eta lank., 1998) badira mintzean entzima hau neurtu izan dutenak eta, beraz, isoforma
biko entzima dela (Alba eta lank., 1995).
Piroglutamil peptidasa 7-ek, espektru zabaleko aminopeptidasa, piroglutamiko
hondarra duten peptido gehienak anderatu ditzake (Browne eta lank., 1983). Entzima
hau, gizakiaren eta arratoiaren garun kortexean eta beste organo batzuetan isolatu da;
baita ugaztunak ez diren beste animalietan eta bakterioetan ere (Cummins eta lank.,
1998). Duela gutxi, ikerlan batean gizakiaren PG I klonatu da (Dando eta lank., 2003),
Entzima giltzurrunetan (Mantle eta lank., 1990) eta muskulu eskeletikoan (Lauffart eta
Mantle, 1988) deskribatzen duten artikuluak argitaratu dira.
Piroglutamil peptidasa I-ak hidrolizatzen dituen peptido aktiboen artean
hurrengoak topa genezake: TRH, LHRH, neurotensina, bonbesina eta gastrinak
(Fujiwara eta lank., 1979; Browne eta O'Cuinn, 1983; Awade eta lank., 1994). Beste
konposatu xenobiotikoak ere hidrolizatzen ditu (Abe eta lank., 2003). Ikus
dezakegunez, piroglutamil peptidasa II baino substratu gehiago hidrolizatzeko
gaitasuna du.
Bere funtzio fisiologikoa peptidoen metabolismoan ez dago oso argi, entzima
solugarri gehienekin gertatzen den bezala. Posible da minduta edo zahartuta dauden
bixikuletatik zelula b amera askatutako edo gehiegi ekoiztutako neuropeptidoen
katabolismoan parte hartzea (O’Cuinn eta lank., 1990; Bauer, 1987) edota beste
entzima batzuekin ikusi den bezala hauek gune extrazelularrera askatzea eta bertan
egitea beren fimtzioa (Vincent eta lank., 1996; Cummins eta lank., 1998).
Ugaztunetan, piroglutamil peptidasa I entzimak, piroglutamil peptidasa II
bezala, TRH seinalizazio bidean (Boler eta lank., 1969) eta neurotensinen sisteman
(Mineyama eta Saito, 1998) zerikusia du. Bakterioetan, PAP aktibitateak N-muturrean
blokeatuta dauden peptidoen toxizitatea gutxitzeko (Awade eta lank., 1994) eta
elikagaiak bereganatzeko funtzioa du (Doolittle eta Armentrout, 1968).
68 SARRERA
Doktore-Tesia As ier Valdivia Palacín 69
Piroglutamil peptidasa I hipertensioaren patogenesian zerikusia duela behatu
da, entzima honek, parte hartzen baitu odol presioa kontrolatzen duten peptido askoren
metabolismoan. Animalia hipertentsoetan piroglutamil peptidasa I aktibitatea,
neurohipofisian eta guruin adrenalean, asko igotzen déla ikusi da. Horregatik, bi guruin
hauen arteko erantzun koordinatuan parte har dezakela pentsatzen da (Prieto eta lank.,
1998).
Piroglutamil peptidasa I entzimaren aktibitatea bularreko minbizian maila
baxuagoak ditu, patogenesi honetan eginkizunik izan ahal duela adieraziz (Carrera eta
lank., 2003).
Bestaldetik, Alzheimer gaixotasunean metatzen diren /3-amiloide peptidoen
artean, N-muturrean glutamil hondarra duten peptidoak daude (Lamer, 1999).
Zahartzaroan edo estres egoeretan, jS-amiloidetako glutamil aminoazidoa ziklatu ahal
da, piroglutamil hondarra emanez eta piroglutamil peptidasa I entzimaren substratu
bihurtuz, N-muturrean piroglutamil aminoazidoa duten plakek, glutamikoa dutenek
baino errazago ematen dituzte peptido agregatuak (He eta Barrow, 1999), plaka senilen
metatzeari lagunduz. Hau déla eta piroglutamil peptidasa I plaka senilen metatzearen
prebentziorako entzima déla ohar daiteke (Ramirez-Exposito eta lank., 2001).
SARRERA 69
70 Asier Valdivia Doktote-Tesia
1.6.4. PEPTIDASEN GARRANTZIA GIZA
UGALKORTASUNEAN
N Aminopeptidasa (ApN) duela gutxi deskribatu izan zen giza hazian (Huang
eta lank., 1997; Ryan eta lank., 1993). Arienti eta lankideek CD13/N aminopeptidasa
deskribatu zuten haziaren prostasometan, entzima hau espermatozoideetara
prostasomen fusioaren bidez transferitua izaten zela proposatuz (Arienti eta lank.,
1997). Beste ikasketa batzuk ere espermatozoideetan entzima honen aktibitatea
deskribatu dute (Schaller eta Glander, 2000).
Hazian deskribatutako Endopeptidasa Neutroa (NEP), hasieratik bradikinina eta
angiotensinaren degradazioari lotuta azaldu da. Honela, Angiotensinaren Entzima
Bihurtzailea (AEB/ACE/ECA) eta NEP haziaren plasmen eta zelula espermatikoetan
(gutxiago), deskribatuak izan dira (Boettger eta lank., 1993). Arratoien barrabiletatik
klonatu izan da NEP-aren antzeko entzima, baina zatiki solugarrian diharduena,
mintzetik jariatua edo banatua izaten dena (Ghaddar eta lank., 2000). Bestalde, NEP II
izendatu duten metaloproteasa bat ere klonatu izan da eta arratoien tubulu
seminiferoetan espresatzen déla ikusi da (Ouimet eta lank., 2000).
Bradikininarentzat proposatutako espermatozoideen motilitatearen ahalmenean
duen eragin aktibatzailea kontutan izanik, NEP eta AEB-ren inhibitzaileak erabiliz,
efektu hau egonkortu eta handitu egiten déla ikusi izan da (Siems eta lank.,
2003).Bestalde, NEP en espresioa behatu izan da uteroan eta granulosaren zeluletan.
(Pintado eta lank., 2003).
Berriz ere, duela gutxi, NEP delako Endopeptidasa Neutroaren isoforma
solugarria edo jariatuaren genearen espresioa behatu izan da, espermatidak inguratzen
dituzten Sertoli zelulen zitoplasman eta espermatideen zitoplasma sinzitialaren
70 SARRERA
Doktore-Tesia Asiet Valdivia Palacín 71
besikuletan, entzima honî espermatogenesian zeregin garrantzitsuren bat (oraindik
argitu gabekoa) leporatuz (Thomas eta lank., 2004).
Prolil endopeptidasa animali-hazian deskribatu zen lehenengo aldiz, aszidio
izeneko tunikatuaren hazian hain zuzen ere (Yokosawa eta lank., 1983). Boettger eta
bere lankideek, aharian eta ordotsan bradikininaren degradazioa aztertzen ari zirela,
entzima honen presentzia espezie hauen hazian arbuiatu egin zuten arren (Boettger eta
lank., 1993), geroxeago entzima hau untziaren hazian zegoela antzeman zuten, TRH
eta FPP-ren entzima anderatzaile honen jatorria ez zela apurtutako espermatozoideek
plasma seminalera askatutakoa, ugal guruin laguntzaileren batek jariatua baizik (Siviter
and Cockle, 1995). Sardinzarraren barrabiletatik isolatu eta purifikatu zuten prolil
endopeptidasa, eta espermatozoidearen mugikortasunarekin erlazionatu zuten. Izan ere,
prolil endopeptidasaren inhibitzaileez sardinzarraren espermatozoideak inkubtatzean,
hauen motilitatea jeitsi egiten zen (Yoshida eta lank., 1999).
Duela gutxi saguetan egindako ikerketak iradokitzen dutenez, Prolil
Endopeptidasaren genearen produktua, espermatide fasean dauden zeluletan, maila
altutan topatu izan da. Horregatik entzima honek espermiogenesian zeregin
garrantzitsua izan dezakela iradoki da (Kimura eta lank., 2002). Lan berberean,
epididimoaren bukaerako tartean (cauda epididimis) eskuratutako espermatozoideetan
topatu izan da ere Prolil Endopeptidasa. Gertakari hau arraro samarra da; izan ere,
entzima hau zatiki solugarrikoa bezala deskribatu ohi izan da, eta espermatozoide
epididimarioak euren zitosolaren edukin gehiena galdu izaten dute euren heltze
prozesuan. Honela, Prolil Endopeptidasa mintzari estuki elkartuta azaldu behar den
entzima zitosolikoa dugu. Bukatzeko, eta entzimaren presentzia espermatozoidearen
tarteko zatikian kokatzen zela behatu ondoren, entzimaren inhibitzaileekin inkubatu
zituzten, hauek espermatozoideen mugikortasuna adierazgarriki murrizten zutela
behatuz (Kimura eta lank., 2002).
Piroglutamil peptidasa I eta Il-a, hazi-plasman, TRH eta FPP peptidoen
degradazioan parte hartzen duten entzimak direla deskribatua izan da (Siviter eta
SARRERA 71
Cockle, 1995). Titi tximinoaren (Callithrix jacchus) hazian ere deskribatua izan da
aktibitate hau, peptido berdinekin erlazionatuta (Kennedy eta lank., 1997).
72 Asier Valdivia___________________________________________ Doktore-Tesia
72 SARRERA
Doktore-T esia Asier Valdivia Palacín 73
HELBURUAK
HELBURUAK 73
74 Asier Valdivia Doktoie-Tesia
74 HELBURUAK
Doktote-T esia Asier Valdivia Palacio. 75
2. HELBURUAK
Giza ugaíkortasunaren ezagutza aintzinetik izan da gizartearentzat helburu
garrantzitsua. Bizidun guztietan dagoen ugaltzeko grina edo nahia, euren esentzia
genetiko hurrengo belaunaldi batera hedatzera bultzatzeko grina (Dawkins, 1976),
guztien bizimodua markatzen duen eragingarri nagusietakoa da. Gizakion artean,
betidanik izan da ugalkuntzaren prozesua, biziaren sorrera ikertzera eta ezagutzera
bideratutako esfortsu jarraia.
Gero eta gehiago dira ugalkuntzaren koritzeptua ikuspegi ezberdinetetaik
begiratu behar déla esaten dutenak. Izan ere, ugalkuntza, gure gizarteetan, faktore
ugariren menpe dago. Ugal osasunaren faktoreez gain (dieta, bizimodua, ingurunea,...),
eragingarri sozioekonomikoak, kulturalak, etabar, kontuan hartu behar dira.
Mendebaldeko gizarte moderno etan giza ugaíkortasunaren fenomenoa arreta
handiz aztertzen da. Izan ere, herrialde hauetan populazioaren zahartzea eta populazio-
piramideen alderanztea, jaiotze-kopuruaren islada dira. Arrazoi ezberdinengatik
gertatzen den ugal-adinaren atzerapena izan daiteke zergatietako bat. Atzerapen honek
ekar ditzakeen ugal-osasunaren asaldurak oso ikertuak izaten ari dira gaur egun.
Bestalde, ugal funtzio fisiologikoaren ezagutza orokorra gero eta garrantzi handiagoa
hartzen ari da ikerkuntza biomedikoaren alorrean, honen bidez, ugal-osasunaren
baldintzak hobetzeko eta arazoak gainditzeko informazio egokiena lortu ahal izateko.
Doktore Tesi hau giza ugaíkortasunaren alorrean peptido bioaktiboen
metabolismoak eduki dezakeen garrantziaren inguruan zenbait alderdi argitzera
HELBURUAK 75
76 Asier Valdivia Doktore-Tesia
zuzendua dago. Ikerkuntza-lan hau giza haziaren fisiologian ildo berri batean
murgiltzeko saioa bezala ulertu behar da, peptido bioaktiboen anderakuntza giza hazian
ez baita ia aztertu. Honela, gorputzeko beste organu eta sistemetan peptido bioaktiboen
eragin fisiologikoak aztertzen dituzten lan mordoa egonik, giza hazian peptido hauen
garrantzia nolakoa den oso ikerkuntza gutxitan aztertua izan da eta are gutxiago
peptido hauen metabolismoa eta funtzioa eraentzen dituzten sistema entzimatikoak.
Helburu orokor honen zehazpen bezala, zenbait helburu zehatzago aipatu
beharko genituzke. Izan ere, eta tesi honen esperimentazio-aldia bukatzean egiaztatu
ahal izan dugun bezala, oso eremu zabalari buruz ikertzen ari garela kontutan izan
behar da, tesi bakar batean bildu eta sakondu ezin daitekena.
Aide batetik, peptido bioaktiboen anderakuntzan parte hartzen duten zenbait
entzima garrantzitsuen aktibitateak giza hazian identifikatzea, ezberdintzea, baloratzea
eta beste ehunetan behatutakoekin konparatzea izango genuke lehenengo asmoa. Atal
honen barruan, berriz ere, gure ikerkuntza mugatu behar izan dugu, ezin baititugu
deskribatu diren peptidasa guztiak hazian ikertu. Kasu honetan, entzefalinak anderatzen
dituzten peptidasa nagusiak (N aminopeptidasa eta endopeptidasa neutroa), eta TRH
hormona eta honen zenbait molekula analogo anderatzen dituzten peptidasa
garrantzitsuenen aktibitateak (piroglutamil peptidasa I eta prolil endopeptidasa) aztertu
izan dira. Honen barruan, azpihelburu bezala, aktibitate hauek hazian ezberdindu eta
identifikatu ahal izateko saioak (substantzia inhibitzaile nahiz aktibatzaileen bidez),
beste ehunetan lortutako aktibitate balioekin konparaketa eginez, aktibitate hauen heina
edo tamaina finkatzea eta baloratzea eta saio-entzimatiko zehatzak egiteko baldintza
esperimentalen fmkapena (sustrato-kontzentrazio optimoaren determinazioa) aipatuko
ditugu.
Beste aide batetik, giza haziaren metabolismo peptidikoaren fisiologian
esanguratsuagoak eta espezifikoagoak diren ikerketak egiteko grinarekin, giza haziaren
zenbait patologietan peptido bioaktibo hauen sistema erregulatzaileak (anderatzaileak,
zehazki) inolako zerikusirik ote zuten frogatu nahi izan genuen, eta zerikusirik
izateko tan, honen inguruko ahalik eta zehaztasun gehien lortu. Honetarako, haziaren
76 HELBURUAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 77
zatikapen azpizelularrerako teknika egokituz, haziaren zenbait zatikitan
(espermatozoideen zatiki solugarria, espermatozoideen mintzei lotutako zatikia, likido
edo fluido seminala eta prostasomak), patologia ezberdinen artean, entzima
anderatzaile edo peptidasa hauen aktibitateen arteko ezberdintasunik ote zegoen behatu
genuen.
Hemendik aurrera, eta eremua mugatu dugun arren, ikerkuntza hauek bide ugari
eta oso ezberdinetara hedatu daitezkelaz jabetu gara.
HELBURUAK 77
78 Asier Valdivia Doktore-Tesia
78 HELBURUAK
Doktore-T esia Asier Valdivia Palacín 79
MATERIALA ETA
METODOAK
MATERIALA ETA METODOAK 79
80 Asier Valdivia Doktore-T esia
80 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 81
3. MATERIALA ETA
METODOAK
Doktore tesi hau Euskal Herriko Unibertsitateko ikerketa errektoreordetzak
bideratutako hiízarmen baten bidez, Medikuntza eta Odontología Fakultateko
Fisiología Sailean eta Bilboko Euskalduna-Bilbao Klinikako Seminologia eta Ugalketa
Lagunduko Unitatean burutu izan da. Lagin biologikoen (gizatiarrak eta arratoienak)
erabilpena Gurutzetako Hospitaleko Batzorde Etikoaren onespenez egin da. Giza
haziaren erabilpena, emaleen Onespen Informatuaz egin da.
3.1. ERABILITAKO EHUN BIOLOGIKOEN
LORPENA
Tesi honetan erabilitako arratoiak Sprague Dawley arrazako aixatoi albinoak
(Ratus norvégiens) izan dira. Euskal Herriko Unibertsitateko Abeldegian haziak izan
dira. Erabilitako animalia guztiak 3 hilabeteko adina (arratoi helduak) zuten eta arrak
ziren. Hauetatik honako ehun hauek isolatu ziren: Garuna, bihotz-bentrikuloko
miokardioa, izterreko muskulua, birika, giltzurruna eta gíbela.
Giza hazi laginak Bilboko Euskalduna-Bilbao Klinikatik lortu izan dira.
Emaileak, ugalketarako arazoak dituzten bikoteetako partaideak edota inseminazio
artifizialerako emaile osasuntsuak eta ugalkorrak ziren.
MATERIALA ETA METODOAK 81
82 Asier Valdivia Doktote-Tesia
3.2. MATERIALA
3.2.1. PRODUKTU KIMIKOAK
Hona hemen, esperimentuetan erabilitako erreaktibo kimikoen zerrenda:
- Alanina-p-naftilamida. Sigma //Aldrich.
- Azetato sodikoa. Merck.
- Azido Klorhidrikoa 12 N. Probus SA.
- Azido Azetiko Glaziala. Probus S.A.
•• Azido Ortofosforikoa %85. Merck.
- Bchi-albumina. Sigma // Aldrich.
- Bestatina. Sigma // Aldrich.
- Coomasie urdin distiratsua G-250. Sigma // Aldrich.
- DAG (N'Dansyl-D-Ala-Gly). Sigma // Aldrich.
- DAGNPG (N-Dansyl-D-Ala-Gly-p-nitro-Phe-Gly). Sigma // Aldrich.
- Dimetil Sulfoxidoa (DMSO). Sigma // Aldrich,
- DL-Ditiotreitol (DTT). Sigma // Aldrich.
- EDTA. Merck.
- Etanol absolutua. Probus S.A.
- Fosforamidon. Sigma // Aldrich.
- Kloral Hidratoa. Merck.
- Leuhistina. Sigma // Aldrich.
- Magnesio Sulfatoa. Merck.
P -Naftilamina. Sigma // Aldrich.
- Nembutal. Serva.
- Piroglutamil-p-Naftilamida. Sigma // Aldrich.
- Propilenglikola. Panreac.
- Puromizina. Sigma // Aldrich.
Sakarosa. Panreac.
82 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-T esia Asiet Valdivia Palacín 83
Sodio Kloruroa. Merck.
Sodio Fosfato Dibasikoa. Merck.
Sodio Fosfato Monobasikoa. Merck.
- Tiorfan. Sigma // Aldrich.
- Tris (hidroximetil)aminometanol (Trizma base). Sigma // Aldrich.
- Tritón X-100. Sigma // Aldrich.
- Z-Gly-Pro-[3-Naftilamida. Bachem.
MATERIALA ETA METODOAK 83
84 Asier Valdivia Doktore-Tesia
3.2.2. TRESNERIA ETA EKIPAMENDUA
- Abiadura handiko zentrifugailu hozgama Sorvall RC 28S.
- Angelu finkozko Sorvall SM-24 crrotorea, polietilenozko hodi bereziekin.
- Angelu finkozko KONTRON TFT 45.6 errotorea, polietilenozko (titaniozko
tapoidunak) hodiekin.
- Angelu finkozko KONTRON TFT 65.13 errotorea, polietilenozko (titaniozko
tapoidunak) hodiekin.
- Bolumen aldakorreko (0-25 (J.L, 0-100 ¡aL) mikropipeta kapilareak. Drummond.
Bolumen aldakorreko pipeta automatikoak. Nychiryo eta Brand.
- Boumen aldakorreko dispensadorea (l-5ml). Eppendrof Multipette 4780.
Bolumen ezberdinetako plastikozko pipeta puntak. Beortek.
Espektrofluorofotometroa. Shimadzu RF-540.
Espektrofluorofotometriarako kuartzozko kubetak (3ml).
- Espektro fotómetro a. Shimadzu UV-2401 PC.
- Espektrofotometriarako plastikozko eta kuartzozko kubetak (1 eta 3 mi).
- CPS-240A zelula-kokagailu termokontrolagarria.
- Hodien eskuzko irabiagailua. Reax 2000. Selecta.
- Homogeneizagailua, teflonezko enboloduna. Heidolph.
- Homogcneizatzeko, beirazko ontzitxoak (1, 2, 5 mi).
- Inkubadorea. Hotcold S, 0°-60°C bero-tartea. Selecta.
- Kolorimetroa. SPECTRONIC 601. Bausch & Lomb.
- pH-metroak Micro-pH 2001 eta Micro-pH 2002. Crison.
- Mettler LV-2 dosifikadore elektrikoa.
- Zehaztasunezko Balantza. R180D. Sartorius.
- Termoegonkortutako irabiagailu magnetikoa. Agimatic.
- Ultrazentrifugagailua. KONTRON CENTRIKON T2070.
- Gradilak. Beortek.
- Material kirurgikoa.
- Plastikozko saiodiak (3ml / 5ml). Eurotubo.
- Beirazko materiala (ontziak, probetak, matrazeak,...).
84 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-T esia Asier Valdivia Palacin 85
3.3. SOLUZIOAK ETA BUFFERRAK
3.3.1. SOLUZIOINDARGETZAILEAK
Tris-HCl 0,2 M, pH 7,4
- Trizma base 0,2M
- Ur distilatua (pH 7,4-n doitu egiten da HC1 1N erabiliz)
Prestatzeko modua: (1000 ml). Trizma baseren 24,22g uretan disolbatu, pHa doitu eta
ur distilatu gehiago gehitu, bukaerako bolumena lOOOmlkoa izan arte.
Tris-HCl lOmM
- Tris-HCl 0,2M, pH 7,4
- Ur distilatua
Prestatzeko modua: (100ml) 0,2 M-eko buffer-aren 5 ml hartu eta ur distilatuz diluitu,
100-eko bolumena bukaeran izan arte.
Tris-HCl 30mM, 130mM NaCl
- Tris-HCl 0,2M pH 7,4
- NaCl
- Ur distilatua
Prestatzeko modua: (100 ml) 0,2 M-eko buffer-aren 15 ml hartu eta ur distilatuz
diluitu, 100-eko bolumena bukaeran izan arte. NaCl-ren 0,76 gr gehitu eta diluitu.
MATERIALA ETA METODOAK 85
86 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Fosfato 0,2M, pH 7,4 Buffer-a
Sodio Fosfato monobasikoa 38 mM
- Sodio Fosfato dibasikoa 162 mM
- Ur distilatua
Prestatzeko modua: A soluzioa'. (Sodio fosfato monobasikoa 0,2 M): sodio fosfato
monobasikoaren 27,6 g pisatzen dira eta 1000 ml ur distilatutan disolbatzen dira. B
soluzioa (sodio fosfato dibasikoa 0,2 M): Sodio fosfato dibasikoaren 28,6 g pisatu eta
1000 mi ur distilatutan disolbatzen dira.
Fosfato 0,2 M tanpoi-disoluzioaren 1000 mi prestatzeko, A disoluzioaren 190 ml eta B
disoluzioaren 810 mi nahastu egiten dira.
Azetato 0,1 M, pH 4,2 tanpoi-soluzioa
- Azido azetiko glaziala 73,6 mM
Sodio azetatoa 26,4 mM
- Ur distilatua
Prestatzeko modua: A soluzioa (azido azetikoa 0,2 M): 11,55 mi eta 1000 ml-tara
eramaten dira ur distilatuz. B soluzioa (sodio azetatoa 0,2 M): Sodio azetatoaren 27,6 g
1000 ml ur distilatutan disolbatu egiten dira.
Azetato 0,1 M tanpoiaren 1000 mi prestatzeko: A soluzioaren 368 ml eta B soluzioaren
132 mi nahastu eta ur distilatuz, bukaerarako bolumenera eraman.
86 MATERIALA ETA METODOAK
Doktote-Tesia Asiet Valdivia Paíacín 87
3.3.2. BESTELAKO SOLUZIOAK
Bradford erreaktiboa (proteina kantitatea zehazteko erabilitako soluzioa)
- Coomasie urdin distiratsua 0,117 mM
- Etanola %5-ean
- Azido Ortofosforikoa%15-ean
Prestatzeko modua: 1000 ml prestatzeko, 100 mg Coomasie urdin distiratsu pisatu
behar dira, 50 ml etanolean disolbatuz. Azido ortofosforikoaren 100 ml gehitzen dira
eta azkeneko bolumenera ur distilatuz eramten dira. Prestakina bi orduz nahastu egiten
da, irabiatuz. Gehiegizko kolorantea, disolbatu ez dena, erauzteko asmoz, disoluzioa
birritan iragazi egiten da, iragaz-paperez.
Auestesiarako prestakina (Equitensin)
- Kloral hidratoa %4-an (0,257 M)
- Nembutal %1-ean
- M gS04 %2-an (0,086 M)
- Etanola % 10-ean
- Propilen-Glikola %40an
Prestatzeko modua: Kloral hidratoren 21,25 g, etanolaren 49’4 ml~tan disolbatzen dira.
Jarraiki, nembutalaren 4,86 g, propilen-glikol 198 ml eta magnesio sulfatoren 10,64 g
gehitzen zaizkio, bukaerako bolumenera 500 ml ur distilatuz eramanez.
Perfusiorako soluzioa
- NaCl 0,15M
- Fosfato tanpoia 0,25 mM
MATE RIALA ETA METODOAK 87
88 Asier Valdivia Doktofe-Tesia
Plasmako peptidasak erauzteko erabiltzen da perfusio prozesua.
Prestatzeko modua: 1000 mi prestatzeko, NaCl-ren 9 g pisatzen dira eta ur distilatuan
disolbatzen dira, fosfato tanpoiaren (0,2 M) 125 mi gehitzen zaizkio eta bukaerako
bolumenera eramaten da, ur-distilatua gehituz.
88 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-Tesia Asiet Valdivia Palacín 89
3.3.3. SAIO ENTZIMATIKOTARAKO SUSTRATO
SOLUZIOAK
Tesi honen helburuetako bat, ondoren patología seminalekin erlazioan jarriko
diren zenbait aktibitate entzimatikoren ikerketarako baldintza zinetikoak finkatzea
izango da (sustrato kontzentrazioa, inhibidore eta gehigarrien erabilpena,...). Beraz,
sustrato-soluzioei buruz hitzegiterakoan, aurretiko aktibitateei buruzko ikasketetan
erabilitako erreferentzia kontzentrazioari buruz arituko gara (s kontzentrazioa), garun
ehunarekin erabilitako sustrato kontzentrazioa hain zuzen ere. Tesi honen bigarren
fasean erabilitako sustrato kontzentrazio finalak s kontzentrazio honekíko ezberdinak
izango dira kasu askotan. Hona hemen aktibitate entziraatiko bakoitzerako sustrato aren
erreferentzi a kontzentrazioak :
Alanina aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko sustrato soluzioa
- Ala-p-naftilamida 125 (_iM
- Behi-albumina 0,1 mg/ml
- Fosfato tanpoia 50 mM
Soluzio hau APN entzimaren aktibitatea neurtzeko da. Sustrato hori, APN entzinw,
gain, PSA k degradatu egiten du ere bai. Tesi honetan frogatuko dugun moduan, PSA-k
ez du aktibitate adierazgarririk giza hazian.
Prolil Endopeptidasa aktibitatea neurtzeko sustrato soluzioa
- Z-Gly-Pro-P-naftilamida 125 ¡iM
- Behi-albumina 0,1 mg/ml
- Fosfato tanpoia 50 mM
MATERIA1A ETA METODOAK 89
90 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Piroglutamil peptidasa aktibitatea neurtzeko sustrato soluzioa
- pGlu-{3-nañilamida 125
- Behi-albúmina 0,1 mg/ml
- Fosfato tanpoia 50 mM
Endopeptidasa Neutroaren (NEP) aktibitatea neurtzeko sustrato soluzioa
- N Dansyl-Aia-Gly-p-nitro-Phe-Gly (DAGNPG) 50 |-iM
Behi-albumina 0,1 mg/mL
- Tris-HCl tanpoia 50 mM, pH 7,4
3.3.4. ZATIKIAZPIZELULARREN PURUTASUN
SAIOETARAKO SOLUZIOAK
Laktato Deshidrogenasa (LDH) aktibitatea neurtzeko soluzioa
- NADH (NADH/NAD+ zuzen estandarra egiteko) 0,2 mM
Pirubatoa 1,6 mM
- NaCl 200 mM
- Behi-albumina 0’ 1 mg/mL
- Tris-HCl tanpoia 80 mM, pH 7,2
90 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacin 91
3.4. METODOAK
3.4.1. EHUNENISOLAMENDUA ETA GIZA HAZIAREN
LAGINEN LORPENA
Tesi honetan arratoi eta giza ehunak erabili dira. Arratoiak, Sprague-Dawley
arrazako arratoi txuriak (Ratus norvegicus) izan dira. Guztiak arrak izan dira. Arren
erabiltzearen zergatia, hauen neuropeptido eta peptidasa mailak, bestelako aldagai
ñsiologiko askoren modura, emeek euren ugal-ziklo hormonalagatik pairatu ditzaketen
aldagarritasuna ekiditzearena da. Arratoietatik, honako ehun hauek isolatu dira:
Muskulu-ehuna (izterretik lortua) (Mu), gibei-ehuna (Gi), birika (Bi), giltzumma (Gil),
bihotz-ehuna (Bih.) eta garuna (Ga). Animalia guztiak EHU-ko abeltegi nagusian
hazitakoak izan dira.
Giza haziaren laginak, Euskalduna-Bilbao Klinikaren Hazi-bankuko
Laborategiak eta Lagunduriko Ugalketa Unitateak, eta Euskal Herriko Unibertsitateak
xedatu zuten hitzarmenari esker lortu egin dira. Euskalduna-Bilbao Klinikan jaso
egiten ziren emaile eta gaixoengandik, euren onespen informatuaz.
Ikasketa hau, lagin biologikoen eta giza laginen erabilpena dela eta,
Osakidetzaren Ikerkuntza Klinikoaren Batzorde Etikoaren oniritziaz burutu da.
MATERIALA ETA METODOAK 91
92 Asier Valdivia Doktote-Tesia
3.4.2. HAZI-LAGINEN ESPERMIOKOPURUAREN,
MUGIKORTASUNAREN, MORFOLOGIAREN ETA
BIDERAGARRITASUNAREN AZTERKETA
Hazi laginak, Euskalduna Klinikaren Seminologia Laborategian aztertuak izan
ziren. Isuriketaren orduerdi ostean, minimoz (haziaren guztizko urtzea eman zedin). eta
ordu bi bete baino lehen (mugikortsunaren erorketa sakona gertatzen hasten denean),
aztertu egin ziren, trebatutako espezialistengatik.
Zelulen kontaketarako, Makler Kamara arrunta erabili zen. Makler k am ara,
erdialdean ehun lauki berdinez osatutako sareta laukiarra duen hemozitometroa da.
Bertan, hazi laginaren tanta txikia ipintzen da, gainean kuartzozko tapaki edo kubrea
jartzean, saretaren eremuan 10 ul-ko hazi bolumena besterik ez du uzten, soberan
dagoena saretaren kanpoan geratzen delarik. Merkatuko kamararik íauena dugu,
Makler motakoa, zelulen pilaketa galerazten dueña. Honez gain, fase-kontrastezko
Nikkon mikroskopioaz, X 20-ko handipenezko objektiboarekin, erabili zen.
Kontaketan, elkarren ondoko hamar laukietako zelula (espermatozoide) mota
bakoitzaren kopuruak kontatzen dira birritan, bi aldien batazbestekoa egiten delarik.
Prozedura hau seminograman azterzten diren paramétra guztiekin egiten dea, hala ñola,
espermatozoideen mugikortasuna (A, B, C eta D motako zelulak eta euren
proportzioa), espermatozoide bizi eta totalen arteko proporzioa, morfologia eta
espermatozoideen kopuru totala eta haziaren mi bakoitzeko. Bideragarritasunaren
(espermatozoide bizien proportzioa) estimazioa egiteko eosina tindapena erabili da.
92 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 93
Haziaren azterketarako erizpideak
Hazi patologien estimazio eta sailkapenerako O.M.E.-ren erizpideak eta
nomenklatura erabili izan dira (O.M.E., 1999).
Espermatozoideen kontzentrazioa:
Giza hazi-laginen espermatozoideen edukina oso aldakorra izanik ere, badaude
erreferentziazko balio batzuk minmotzat jotzen direnak. Honela, 20 x 106
espermatozoide ml-ko edota 40 x 106 espermatozoide isuritze bakoitzeko, baino
gutxiago agertzen duten laginak, Oligozoospermiko-tzat joko dira. Era berean,
espermatozoiderik azaltzen ez duten haziak, Azoospermikoak izango dira.
Mugikortasuna:
• A motako mugikortasuna: higidura progresiboa (Ierro zuzena) eta azkarra
erakusten duten espermatozoideen proportzioa.
• B motako mugikortasuna: higidura ez-progresiboa (sigi-sagakoa) edota
motelegia erakusten duten espermatozoideen proportzioa.
• C motako mugikortasuna: tokitik mugitzen ez diren edota ibilbide zirkular
hertsia egiten duten espermatozoide mugikorren proportzioa.
• D motako mugikortasuna: mugimendurik ez duten espermatozoideen
proportzioa (geldiak) .
O.M.E.k gomendatzen duenez, A mota eta B motako espermatozoideak batera,
espermatozoide guztien % 50 baino gutxiago badira, edota A motakoak %25a baino
gutxiago badira, hazi lagina astenozoospermikoa déla onartuko da.
MATE RIALA ETA METODOAK 93
94 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Bideragarritasuna:
Hildako espermatozoide eta bizien arteko proportzioa bame hartzen duen
parametroa dugu hauxe. O.M.E.-ren erizpideei jarraituz, giza hazi lagin batean
espermatozoideen %50 edo gehiago bizirik egon behar dute, bideragarritasunaren
ikuspegitik nórmala delà esateko. Honela, hemendik beherako portzentaiekin azaltzen
diren haziak, nekrozoospermikoak direla esango dugu.
Morfología:
Kontzeptu honek espermatozoideen itxurari buruz egiten digu. Hazi lagin baten
espermatoide guztien %15a baino kopuru baxuagoa baldin badira forma nórmala
dutenak, hazi hori teratozoospermikoa déla esango dugu.
Aldagai hauen guztien (eta beste zenbaiten) balioak, hein normalean erakusten
dituzten laginak normozoospermikoak kontsideratzen dira. Parametro hauen guztien
balorazioa eta azterketa Euskalduna Klinikako profesionalek egin zuten.
94 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 95
3.4.3. LAGIN ENTZIMATIKOEN LORPENERAKO
PROZEDURAK
Bi protokolo ezberdin erabili izan dira lan honetan, ehun biologikoekin
esperimetatzeko prestaketa egokia izan ditzaten. Lehenengo prozedura mota, giza
haziaren eta animali ehunen laginen zatiki solugarri eta mintzari lotutakoen
homogenatuak lortzera zuzendua zegoen. Bigarrena, apur bat konplexuagoa, patologia
ezberdineko haziekin egindako ikasketa burutzeko erabili ziren zatiki zelular eta
parazelularren eskurapenera bideratua zegoen.
Homogenatuen lorpenerako protokoloa.
1.- Ehunak tris-HC! 10 mM tanpoi hipotonikoren 2ml-tan ipini. Hazi laginak
(izoztuta gorde izan direnak) urtzen utzi eta tris-HCl 10 mM tanpoi hipotonikoren
2 ml-tan diluitu (Shock osmotikoa eraginez).
2.~ Ehunak homogeneizatzen dira, tefloizko enboloa duen homogeneizagailu
mekanikoaren bidez, minutu batez (minimo) 800 bira-minutuko abiaduran. Hazi
diluituak ere antzeko prozesua jasaten zuen.
3.- Animalien ehunetatik homogenizaziotik lortutako gaiak ultrazentrifugatzen da
100.000 g-tan, 35 minutuz. Giza haziaren homogeneizazio-produktuak 2 orduz,
100.000 g-tan ultrazentrifugatu ziren.
4.- Zentrifugazioaren ostean lortutako gainjalkinak (SI) eta pellet-ak (Pl)
banatzen dira. Pellet-ak Tris-HCl 10 mM-ez garbituak izan ondoren, tanpoi honen
2 mL-tan berreseki eta homogeneizatzen (30 segunduz) dira.
5.- Gainjalkinak eta berresekitako pellet-ak berriz ere ultrazentrifixgatzen dira,
animali ehunak 35 minutuz, 100.000 g-tan, eta giza hazia 2 orduz (abiadura
berean).
MATE RIALA ETA METODOAK 95
-96 Asier Valdivia Doktore-Tesia
6,- Sl-en ultrazentnfugazioaz eskuratutako gainjalkinak (S2) gordetzen ditugu
(Pellet-a bota). P1 pellet-en ultrazentnfugazioaz eskuratutako pellet berna (P2)
kontserbatu dugu (gainjalkina bota).
7.- P2 pellet berriak berriz ere Tris-HCl 10 mM-ez garbitzen dira, eta tanpoi
beraren 2 mL-tan berreseki eta homogeneizatzen dira (30 segunduz, 800 b/min)
Honela, mintzen zatikiko homogenatuak (Hm) lortuko dira haziarentzat eta
animali ehunentzat. S2 gainjalkinak, ordea, zatiki solugarrien homogenatuak
izango dira.
Honela, honako laginak lortuko genituzke, prozedura honen bidez:
HOMOGENATU MINTZEKO
SOLUGARRIAK HOMOGENATUAK
(Hs) (Hm)
Animali-EhunakGi-S, Mu-S, Bir-S, Gil-S,
Ga-S, Bih-S
Gi-M, Mu-M, Bir-M, Gil-
M, Ga-M, Bih-M
Giza hazia Ss Sm
Ikus daitekenez, ultrazentrifiigazio bi egiten dira, ezaugarri berdinekoak eta
jarraian. Honen helburua, zatikien purutasuna ziurtatzea eta kutsadura ahalik eta gehien
ekiditea da. Zelulen apurketa, tanpoi hipotonikoaren bidez (Tris-HCl 10 mM) egiten
da, homogeneizazio mekanikoaren bidez ere prozesua sakontzen den arren.
Esan bezala, honela lortutako laginen homogenatuak haziko peptidasen
aktibitateen heina zehazteko eta garunetarako garatu izan den teknika (aktibitate
entzimatikoa behatzekoa) hazi-ehunaren ikerketari doitzeko erabili izan dira. Arratoi-
ehunen homogenatuak konparaketak egiteko erabili dira.
96 MATERIALA ETA METODOAK
Doktofe-Tesia Asiet Valdivia Palacín 97
MATERIALA ETA METODOAK 97
98 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Haziaren zatiki zelular eta parazelularren eskurapenerako protokoloa
Honen bidez, lau zatiki azpizelular/parazelular lortuko ditugu:
Zatikiaren ¡zena Zatikia
SpS Espermatozoideen zatiki solugarria
SpM Espermat. Mintzari lotutako zatikia
Ls Likido seminala
P Prostasomak
1.- Hazi lagin freskoak jaso eta Tris-HCl 30 mM, NaCl 130 mM tanpoi disoluzio
isotonikoaz diluitzen (1:1) dira.
2.- Laginak zentrifugazio motel baiera eramaten dira (600 g, 10 minutuz).
3,- Gainjalkinak (SI) gordetzen dira. Pellet-ak Tris-HCl 30 mM, NaCl 130 mM
tanpoiaz garbitu, eta 2 mL gehituta, zentrifugako hodietan berreseki
(homogeneizatu gabe), hodi-irabiagailuaren abiadura motel batean eta eskuz,
pellet-a askatu eta banatu arte (kontuz, bitsa atera ez dadin).
4,- Berresekitako pellet-ak (PI), berriz ere, aurreko baldintzetan zentrifugatzen
dira (600g, 10 min.).
5.- Oraingo honetan, gainjalkinak arbuiatu eta berriz ere pellet-ak (P l’) garbitu
eta berresekiyzen dira Tris-HCl 30 mM, NaCl 130 mM buffer-ean.
6,- SI gainjalkinak eta PI* pellet-ak zentrifugazio berri batera eraman ziren
(800g, 15 min.)
7,- SI gainjalkinaren pellet-a arbuiatzen zen, P l’-ren gainjalkinarekin egiten zen
moduan. Honela, S2 (Sl-en zentrifugazioaren gainjalkina) eta P2 (PI’
zentrifugazioaren ondoko pellat-a) izango ditugu.
8.- P2, honako honetan, Tris-HCl 10 mM tanpoi hipotonikoaz berreseki eta
homogeneizatzen da. Zatiki honetan espermatozoideak daude, eta pausu honen
bidez apurtzen ditugu, zitosolen edukina kanporatua izaten dela.
98 MATERIALA ETA METODOAK
9.- Homogeneizatutako P2 pellet-a, (preSp zatikia, oraindik aurrera) eta S2
gainjalkina (Ls+P zatikia) izoztuko dira.
10.- preSp eta Ls+P zatikiak urtzen utziko dira, inguruko tenperaturan.
11.- preSp zatikia ultrasonatzen da (6 pultso, bakoitza 30” , eta 15” -ko tarteak
eginez). Honen helburua, espermatozoideen mintzen zatiak handiegiak ez izatea
(mintzen zatitzea hobetzea).
12.- preSp eta Ls+P zatikiak ultrazentrifugatzen dira, bakoitza programa ezberdin
batez. PreSp zatikia 35 minutuz, 100.000 g-tan eta Ls+P 2 orduz (eta azelerazio
berean). Honen arrazoia, Ls+P zatikian dauden prostasoma (P) izeneko partikula
txikiek, hauspeatzeko denbora gehiago behar dutela da.
13.- Ls+P zentriñigazio-produktuaren gainjalkina (preLs) eta hauspeakina (preP)
banatu eta gorde egiten dira. Hauspeakina edo pellet-a garbitu, homogeneizatu eta
berreseki egiten da, Tris-HCl 10 mM tanpoiaz. PreSp zatikiaren pelletarekin
(preSpM) gauza bera. Gainjalkinak gordetzen dira (preSpS eta preLs).
14.- Bananduriko zatiki guztiak berriz ultrazentrifugatzen dira. preLs eta preP,
berriz 100.000 g-tan 2 orduz, eta preSpS eta preSpM, 35 minutuz.
15.- preSpM eta preP zatikien ultrazentrifugazioaren pelletak garbituak,
berresekituak eta homogeneizatuak izaten dira Tris_HCl 10 mM tanpoiaz.
Honela, SpM eta P zatikiak lortuko ditugu, PreLs eta preSpS zatikien
gainjalkinak, Ls eta SpS zatikiak izango dira, hurrenez hurren.
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 99
MATE RIALA ETA METODOAK 99
100 Asier Valdivia Doktore-Tesia
HAZI GORDIN AREN
LAGINA
1r
ZENTRIFUG. 600 g,10 min.
i ZENTRIFUG. ¡ ! ZENTRIFUG. ¡1 800 g ! ! 600 g !; !5 min. ¡ ¡ 10 min. ;
Ls + P P1'(garbitu eta berreseki)
Gainjalkinaarbuiatu
,----------- kSHOCK
OSMOTIKOA
IZOZTU— , ----------------------------1
¡ ZENTRIFUG. I-20° C Esperm. Pellet 4 I 800 s !
** ¡ 15 min. •
b’RTU(ing.Tn) Espermat.
Ls + P,----------- 1
^ ¡ IJT.TRAZF.NT. 1^ 1 100.000 g !
1 2 ordu. ¡
ULTRASONATU( 6 x 3 0 ”)
preLs preP(gainjal) (pellet)
ULTRAZENT. 100.000 g
2 ordu
! ULTRAZENT. I * 100.000 g ! ; 2 ordu !
preSps preSpm(gainjal.) (pellet-a)
\garb.ber.h.
ULTRAZENT. 100.000 g
2 ordu.
, Esperm.. solugarria
(SpS)
Esperm.mintza(SpM)
100 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 101
3.4.4. AKTIBITATE ENTZIMATIKOA NEURTZEKO
TEKNIKA
Ikerketa honetan ikasi izan diren peptidasen aktibitatea ikertzeko
fluoreszentziazko teknikak erabili izan dira. Fluoreszentzia molekula askok duten
ezaugarri fisikoa da. Molekula hauek elektroi kitzikagarriak dituzte euren orbital
molekularretan. Elektroi hauek, lotura kimikoen parte ez direnak, energía jasotzean
(argiaren moduko erradiazio batetik, adibidez) energi-egoera altuago batera pasa
daitezke denboralki. Elektroiaren energia-egoera aldatzeko, energia maila minimo
batekoa izan behar du (elektroiaren energia-egoera basala zein den arabera aldatzen
delarik). Energia-igorpena eten egiten denean, egoera kitzikatuan dagoen elektroia
“gehiegizko” energia hori kanporatuko du, egoera basalera bueltatzeko (hauxe bait da
energia minimodun egoera). Energi askapen hau era ezberdinetan gerta daiteke (bero
moduan,...). Askapena argi moduan ematen denean, argi horri fluoreszentzia deituko
diogu.
Peptidasen aktibitatea neurtzeko, oso erabiliak izan dira P-naftilaminaren
eratorri aminoazidikoak. P-naftilamina sustantzia fluoreszentea da, baina aminoazido
bati lotuta dagoenean, amida lotura baten bidez (aminoazil-p-naftilamida moduan), ez
du fluoreszentziarik igortzen. Peptidasen ekintza dala eta, p-naftilamina askatua izaten
den heinean, entseiu-ingurunean fluoreszentzia gora egiten du. Sustrato fluorogenikoa
kontzentrazio asean egonik, entzimen aktibitatearen menpe (edo zehazki, entzima
kantitatearen menpe) egongo da soilik. Hori déla eta, suposa daiteke proteina ugari
dagoen ehunetan, aktibitate (eta fluoreszentzia, beraz) gehiago behatuko déla, baldintza
fisiologikoen eragina eztaliz. Honela, proteina eta entzimatan joria den lagin batean
behatzen dugun aktibitatea eta proteinatan txiroagoa den beste baten aktibitatearekin
konparaezinak izango lirateke. Arazo hau ekiditzeko, proteina kantitatearen neurketa
egiten genuen, aztertzen genuen lagin bakoitzean, Bradford metodoa erabiliz
(aurrerago azaldua).
MATERIALA ETA METODOAK 101
102 Asier Valdivia Doktoie-Tesia
3.4.4.1. Aminopeptidasen eta prolil endopeptidasaren
aktibitateen behaketa
Aminopeptidasen ikasketarako sustrato artifizialen aretan erabilienak p-
naftilaminaren deribatu aminoazidikoak izan dira. Honela, aminoazidoa, amida lotura
baten bidez lotuta egoten da P-nafti lamina molekulari, aminoazil-p-naftilamida
molekula moduan. Molekula honek ez du fluoreszentziarik igortzen. Aldiz,
aminopeptidasa jakin baten ekintzak aminoazidoa P-naftilaminatik askatzen duenean,
P-nañilamina askea ziklatu egiten da ahalmen fluoreszentea bereganatuz. Gure
esperimentuetan erreakzio entzimatikoa ikertzeko, agertzen den p-naftilamina
(produktu fluoreszentea) 345 nm-ko uhin luzera (X,ex) duen argi igorpen batez eszitatu,
eta 412 nm-ko uhin luzeran (Âem) p-naftilamina honek, egonkortzeko, igortzen duen
fluoreszentzia neurtzen dugu. Lortutako fluoreszentziaren balio numerikoak, p-
naftilamina kontzentrazio jakinez egindako fluoreszentzia patroi-zuzen batean
interpolatzen ditugu, erreakzioan zehar sortu de P-naftilamina kantitatea kalkulatzeko
(Greenberg, 1962; Alba eta lank.., 1989). N Aminopeptidasa eta Piroglutamil Peptidasa
I-en aktibitateak honelako sustratoen bidez (Alanil-P-Naftilamida eta Piroglutamil-P~
Naftilamida) aztertu egin ziren.
Prozedura:
Ehunaren lagina, giza tenperatura fisiologikoan (37° C), sustrato fluorogeniko
artifizialaren soluzioarekin inkubatzen da 30 minutuz. Laginean dauden
aminopeptidasek sustratoa (aa-p-Naftilamida) degradatuko dute aminoazidoa eta p-
naftilamina askatuz.
[ÂMINOPEPTIDASAKl
aa-P-Nañilamida -> aa + P-naftilamina
102 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-Tesia Asiet Valdivia Palacín 103
30 mimituen buraan, erreakzioa gelditzeko, azetiko/azetato disoluzio baten ml
bat gehitzen da, ingurunearen pH-a jeisteko. Ondoren, inkubazio hodi bakoitzaren
edukina espektrofluorimetroan neurtzen da.
Prolil endopeptidasaren kasua oso antzekoa da. Kasu honetan, entzima hau
endopeptidasa bat izanik, apurtu beharreko lotura kimikoa dipeptido baten bamean
kokatzen da. Erabilitako sustratoa Z-Gly-Pro-p-naftilamida (zGlizil-Prolil-p-
Naftilamida) izango da.
3.4.4.2. Entzefalinasa aktibitatearen behaketa
Entzefalinasa edo endopeptidasa neutroaren (NEP) aktibitatea neurtzeko ere,
teknika fluorimetrikoa erabiliko dugu. Kasu honetan ere, lagina sustrato soluzioarekin
30 minutuz inkubatuko dugu, 37° C-tan. Ezberdintasuna, eta erabilitako sustratoa ez
delà p-naftilaminaren deribatua. Fluorogenoa N-Dansyl-D-Ala-Gly-pN02-Phe-Gly
(DAGNPG) sustratoa da. Hemen bai sustratoa bai produktua fluoreszenteak dira (aa-p-
Naftilamidaren kasuan, soilik produktua, P-Naftil amina, zen fluoreszentea). Honek
sustrato-produktu patroi-zuzen konbinatua egitera behartzen gaitu, fluoreszentzia
balioak interpolatzeko.
SN-Dansyl-D-Ala-Gly-pN02-Phe-Gly —> N-Dansyl-D-Ala-Gly-NH2 +
COOH-Phe-Gly
Erabilitako uhin-luzerak hauek dira:
À,ex -> 342 nm
A-em 562 nm
MATE RIALA ETA METODOAK 103
104 Asier Valdivia D oktoie-T esia
Entzimen aktibitatearen kalkulua
Peptidasen aktibitatearen balioak, Peptidasa Aktibitate-Unitatetan
(P.A.U./U.A.P.) ematen da. Unitate hauek, sustrato fluorogenikoaren pikomol bat
minutuko, hidrolizatzen duen entzima kantitatea adierazten dute. Azkeneko emaitzak
aktibitate espezifiko bezala ematen da; hau da, Peptidasa Aktibitate-Unitateak, mg
proteina bakoitzeko (pmol aa-p-naftilamida hidrolizatua / min / mg proteina).
Entzefalinasaren kasuan unitateak era berean ematen dira: Entzefalinasa Aktibitate-
Unitateak, proteinaren miligramo bakoitzeko.
Hazi-patologien arteko aktibitateen konparaketaren ikerketan, datuak aktibitate
espezifiko moduan emateaz gain (P.A.U./ mg proteina), aktibitatea hazi lagin
bakoitzaren espermatozoide kopuruarekiko eman zen (P.A.U./ Espermatozoide milioi),
aztertutako espermatozoideen zatikietan (espermatozoideen zatiki solugarria eta
espermatozoideen mintzari lotutako zatikiak).
104 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-Tesia Asiet Valdivia Palacín 105
3.4.5. PROTEINEN KONTZENTRAZIOAREN
KUANTIFIKAZIOA
Lagínetan dagoen proteina kontzentrazioa kalkulatzeko metodoa, Coomasie
Urdin Distiratsu izeneko koloranteak polipeptidoekiko duen afinitatean oinarritzen da
(Bradford, 1976). Teknika kolorimetrikoa da, hau da, zenbait konposatu kimikok argia
absorbatzeko duten gaitasunean oinarritzen da. Bradford metodoa proteina
mikrogramoak ere detektatzeko gai da, método errepikakorra eta azkarra izanik.
Oinarria eta prozedura
Kolorantea proteinetara lotzen da, gai kimiko horren absortzio uhin-luzeran
aldaketa sortuz, 465 nm-tik 595 nm-tara pasaz. Absortzioaren gehikuntza, kolorantea
saturantea izanik, proteina kontzentrazioarekiko zuzenki proporztionala da. Honela,
absortzioaren gehikuntza espektro fotómetro edota kolorimetroan neurtuz, proteina
kantitate ezagunekin egindako absotzio patroi-zuzen batean interpolatu daiteke.
Lagin bakoitzaren 10 ¡j.1, 2,5 ml Bradford erreaktiborekin inkubatzen dira 7
minutuz. Lagin bakoitzeko hiru saihodi prestatzen dira hórrela, metodoaren
errepikakortasuna eta zehaztasuna optimizatzearren. Saihodi bakoitzaren edukinaren
absorbantzia kolorimetroan neurtzen da, absortzioaren uhin-luzera kontrolatzen duen
monokromadorea 595 nm-tan finkatuz.
Patroi-zuzena egiteko, behi-seroalbuminaz prestatutako kontzentrazio jakineko
alikuota baten bolumen ezberdinez egindako eskala prestatzen da. Hodi bakoitzean
alikuotaren p.1 ezberdinak jarriko ditugu (0 |il-tik, 25|il-ra) eta bakoitza 2 ml Bradford
erreaktiboarekin inkubatuko dugu 7 minutuz. Era honetan antolatutako patroi-zuzena
kolorimetroan neurtzen da, aurreko parametroekin. Lortutako absortzio emaitzak,
kontzentrazioarekiko proportzionaltasun zuzena azaltzen duen Y = aX + b funtzio
zuzenera doitzen direla ikusiko dugu. Zuzen horretan interpolatuko ditugu gure
laginekin lortutako absorbantziaren balioak.
MATERIALA ETA METODOAK 105
106 Asier Valdivia Doktote-T esia
3.4.6. SUSTRATO-KONTZENTRAZIO EGOKIAREN DOIPENA
Tesi honen helburuetako bat, aktibitateak konparatzeko kontzentrazioa doitzea
da. Aktibitateak konparagarriak izan daitezen, entzimaren abiadura maximoan aztertu
behar dira. Abiadura maximoa, Michaelis-Menten-en zinetika jarraitzen duten
entzimekin, eta hauxe da aztertutako peptidasek jarraitzen dutena, sustratoa
kontzentrazio asegarrian dagoela lortzen da, saioa irauten duen denbora guztian zehar.
Hortaz, tesiaren hasierako atalean, aktibitate ezberdinak defmitu eta deskribatzen
ditugunean, entzima horiek aztertzeko beharrezkoa den sustrato kontzentrazioa doitu
behar dugu, 30 minutuko saio baterako.
Baina giza hazirako sustrato-kontzentrazio egokiak definitzeko, erreferentzia
bat erabili behar dugu. Hortarako, aproposena garunetako ikerkuntzan erabilitako
kontzentrazioa erreferentzi bezala erabiltzea deritzogu. Erreferentziazko kontzentrazio
honi S deituko diogu. S kontzentrazioa jatorritzat hartuta, sustrato-kontzentrazio
hazkorrak eta beherakorrak erabiltzen zituen patroi-kurba osatu zen. Hau da, S
kontzentrazio aren múltiplo ak ziren sustrato kontzentrazioez, saio entzimatikoak burutu
ziren. Honela, sustrato bakoitzaren honelako kontzentrazioak bame hartzen dituen
eskala osatuko da:
OS - 0,25S - 0,5S - S - 2S - 4S - 8S - X6S
16S (2 mM)-ko sustrato-kontzentrazioa bakarrik DAGNPG (NEP entzimaren
sustratoa) erabili izan da. Bestelako aktibitate entzimatikoen sustratoekin, (pGlu-(3-
Nañilamidaren eta Ala-[3-Naftilamidaren kasuetan) 8S (1 mM) izan da saiatutako
kontzentraziorik altuena eta Z-Gly-Pro-P-Naftilamidaren kasuan (8S kontzentrazioan
sustratoa prezipitatzen baitu) 2S (250 ¡iM) erabili dugu kontzentrazio máximo bezala.
Sustratoak albuminadun fosfato bufferean prestatu dira eta buffer bera erabili da
diluzioak egiteko. Entseiua, giza haziaren zatiki solugarria eta mintzari lotutakoaren
homogenatuetan saiatu zen.
106 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-Tesia Asiet Valdivia Palacín 107
Sustrato-kontzentrazio ezberdinen soluzioak eskema honi jarraituz pretatu dira:
6,61 mg pGlu-f}-NA
8s (ImM)
26 ml P+ albúmina
13 ml 8s
+ 4s (500 nM)
13 ml P+ alb.
13 ml 4s
+ 2s (250 mM)
13 m lP+ alb.
13 ml 2s
+ s (125 nM)
13 m lP+ alb.
13 ml s
+ 0,5s (75 nM)
13 ml P+ alb.
13 ml 0’5s
+ 0,25s(37,5 nM)
13 m lP+ alb.
MATERIALA ETA METODOAK 107
108 Asier Valdivia Doktote-T esia
3.4.7. INHIBITZAILEEN ETA SUBSTANTZIA
GEHIGARRIEN BIDEZKO AKTIBITATE
ENTZIMATIKOEN BEREIZKETA
3.4.7.I. Aktibatzaile tipikoak: EDTA eta DTT
Entseiu entzimatikoetan askotan erabiltzen ohi dira sustantzia gehigarriak, bai
ikertu nahi dugun entzimaren aktibitatea areagotzeko edota mantentzeko (aktibatzaile
edota babesleak), bai aztergaia den entzimaren aktibitatea, antzeko ekintza (sustrato
beraren gaineko ekintza, adibidez) duten entzimengandik ezberdintzeko.
Kasu honetan, aztertutako entzimengan beste ehunetan saiatu izan diren
sustantzia babesle bi, EDTA eta DTT, giza hazian topatzen diren aztertutako
entzimetan duten efektua aztertuko dugu.
EDTA, sustantzia kelatzailea da; hau da, ioi metalikoak bahitu egiten ditu
ingurunetik. Ekintza horrek odolaren antikoagulatzaile bezala erabilia izatera zuzendu
du. Bestalde, gogoratu behar dugu, aminopeptidasak eta endopeptidasak,
metalopeptidasak direla. Honek esan nahi du, beren gune aktiboan ioi metalikoak
dituztela haien ekintza burutzeko (Zn^ normalean). Antzeko ezaugarri fisiko-kimikoak
dituzten ioiek, beraz, entzimaren aktibitatean eragina izan dezakete. Hau ekiditeko,
EDTA erabiltzen ohi da, sustrato soluzioaren ioi-kutsaduraren efektua galerazteko,
hain zuzen.
DTTren (Ditiothreitol) kasuan, helburua entzimaren sulfhidrilo edo Tiol taldeak
babestea da. Talde kimiko hauek entzima askoren konformazio aktiboa mantentzen
dituzten disulfuro zubiak oxidaziotik babesteaz gain, gune aktibo ugaritan topa
daitezke, eta entzimaren ekintzan garrantzi handia dute. DTT eragile erreduktore
sendo a duen 2 talde sulfhidrilo eta 3 karbonodun azukrea dugu. Honen gehikuntzaz
ingurunea erreduktore bihurtzen da, entzimaren Tiol taldeen oxidazioa zailago
bihurtuz. Honela, entzimaren aktibitatea ez da kaltetzen.
108 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-Tesia Asiet Valdivia Palacín 109
Aipatutako bi gai kimiko hauek aktibatzaile bezala hartzen badira ere, hauen
benetako ekintza entzimaren jatorrizko aktibitatearen endakapena edo murrizpena
galeraztea da, maila altuenean, saiakuntza dirauen bitartean behintzat, mantenduz.
Honela, sustantzia kimiko bi hauen eragina ikertzeko, bai eta ekintza hau
positiboa (Hau da, entzimaren aktibitatea indartzen dutela beren presentziaz) izanez
gero, hauen kontzentrazio optimoa topatzeko, honako prozedura esperimentala erabili
zen.
Aide batetik, aurretik egindako esperimentuekin lortutako sustrato
kontzentrazio eta lagin kantitate optimoak erabili ziren. Beraz, aktibitate bakoitzerako
sustrato kontzentrazio egokia zuen albuminadun fosfato tanpoi egokia prestatu zen.
Fosfato buffer horren bolumen batean 32 mM-eko DTT kontzentrazioa (16 mM-ekoa
EDTA-ren kasuan) prestatzen zen. Kontzentrazio máximo horretatik hasita,
sustratodun bufferraren bidez, diluzioak prestatu egin ziren.
MATERIALA ETA METODOAK 109
110 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Honela, adibidez:
33,07 mg pGlu-P-NA
260 ml P + albúmina
+ => :\2 mM DTT
256,6 mg DTT
26 ml 32 mM DTT
+ => ;L6 mM DTT
26 ml P+ alb.+ pGlu-P-NA
26 ml 16 mM DTT
+ 8 mM DTT
26 ml P+alb.+ pGlu-P-NA
26 ml 8 mM DTT
+ => 4 mM DTT
26 ml P+ alb.+ pGlu-p-NA
26 ml 4 mM DTT
+ => 2 mM DIT!
26 ml P+ alb.+ pGlu-p-NA
26 ml 2 mM DTT
+ => 1 mM DTT
26 ml P+ alb.+ pGlu-p-NA
26 ml 1 mM DTT
+ => 0,5 mM DTT
26 ml P+ alb.+ pGlu-p-NA
0 mM DTT
110 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-Tesia Asiet Valdivia Palacín 111
EDTA-ren saiakuntzan erabilitako EDTA kontzentrazioak hauexek izan ziren:
0; 0,125 Mm; 0,25 mM; 0,5 mM; 1 mM; 2 mM; 4 mM; 8 mM; 16 mM.
Garunean egindako ikerkuntzetan 2 mM-eko DTT eta EDTA kontzentrazioak
erabiltzen ziren.
3.4.7.2. Inhibitzaile espezifikoen erabilpena
Esperimentu hauek bakarrik Mintzeko Alanina Aminopeptidasa (APN) eta
Endopeptidasa Neutroa (NEP) edo enkefalinasa entzimen kasuetan burutu ziren. Honen
arrazoia, bi entzima hauek degradatzen dituzten sustratoak, beste entzima batzuk ere
degradatzen dituztela, da. Entzima hauen ikerkuntzarako, sustrato bera degradatzen
duten entzima kutsatzaileak espezifikoki inhibitu behar dira. Alderantziz ere,
inhibitzaile hauek erabilita, behatzen ari garen fluoreszentzia, benetan ikertu nahi
dugun entzimaren aktibitateari sor zaion ala beste entzima batek eraginda ote denentz
jakin dezakegu.
APN eta NEP entzimen, erabilitako sustrato arekiko, entzima kutsatzaileak
hauexek dira: APN-ren kasuan PSA edo puromizinarekiko sentikorra eta NEP-en
kasuan AEB/ACE (Angiotensinaren Entzima Bihurtzailea).
Esan beharra dago ez dagoela erabateko espezifikotasuna azaltzen duen
inhibitzailerik; beti dute eragina aktibitate bat baino gehiagotan. Honela, Alanina
Aminopeptidasaren Solugarriaren (PSA) kasuan, puromizina da inhibitzailerik
espezifikoenetakoa, kontzentrazio altuetan APN ere inhibitzen duen arren. AEB/ACE
inhibitzeko Kaptopril erabiltzen dugu.
Bestalde, entzima kutsatzaileen inhibizioa burutzeaz gain, alderantzizko
ikerketa egin zen; hau da, APN eta NEP-en inhibizio entseiuak. APN inhibitzeko
Leuhistina erabili zen eta NEP-entzako Tiorfan eta Fosforamidon.
MATERIALA ETA METODOAK 111
112 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Prozedura, aurreko kasuetan bezala, sustrato kontzentrazio egokia mantenduz,
inhibitzaile kontzentrazio maximodun disoluzio batetik hasita, diluzioak prestatuz
burutu zen. Erabilitako kontzentrazioak (0-koaz kanpo):
Puromizina: 0,625pM-etik, 1280 ¡iM-eraino
Kaptopril: 1,953 nM-etik, 250 nM-eraino
Tiorfan: 0,08 nM-etik, 320 nM-eraino
Fosforaraidon : 0’08 nM-etik, 320 nM-eraino
Leuhistina: 15,625 nM-etik, 16000 nM-eraino
112 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 113
3.4.8. EHUNEN ARTEKO AKTIBITATE
PEPTIDASIKOEN KONPARAKETA
Atalaren hasieran aipaíutako arratoi ehunak eta giza haziaren arteko
konparaketa egin zen. Honen helburua, aurretik aipatuta genuenez, aztertutako
entzimen aktibitatearen neurriaren ikuspegi orokorra izatea eta peptidasa hauen
garrantzia aztertzeko lehenengo erizpide kuantitatibo bat lortzea da.
Ikerketa edo saiakuntza hauek auirera eramateko, ehunak erauzi eta prozesatu
ondoren (zentrifiigazio, homogeneizazio, tratamendu osmotiko, etab.), lan honetan
egindako ikerketa guztietan bezala, aktibitate entzimatikoen neurketaren saiakera egin
zen, fluorimetriaren bidez. Honetarako erabilitako sustratoen kontzentrazioa, aurreko
entseiuetan lortutako emaitzetan oinarrituta, giza haziarentzako behatutako
kontzentrazio optimoa erabili zen, sustantzia gehigarrien kontzentrazio egokia ere
erabiliz.
MATERIALA ETA METODOAK 113
114 Asier Valdivia Doktoïe-Tesia
3.4.9. METODO ESTATISTIKOAK
Emaitzen analisi estatistikoa Bariantzaren Analisia (ANOVA) eginez aztertu
zen. Adierazgarritasunaren muga minimoa p<0,05-an ezarri zen. Honela aztertu ziren
hazi-patologia ezberdinen batazbesteko aktibitate entzimatikoak, zatiki azpizelular
ezberdinetan. Post-hoc analisirako B.E.A./D.M.S. (Batazbestekoen arteko
Ezberdintasun Adierazgarria) test-a erabili zen. Analisi estatistikorako SPSS 11.5
software-a erabili zen. Bi aldagaietako korrelazio linealak kalkulatu ziren, entzima
bakoitzaren, zatiki bakoitzeko zatikien eta aldagai seminologiko ezberdinen artean.
114 MATERIALA ETA METODOAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 115
EMAITZAK
EMAITZAK 115
116 Asier Valdivia Palacín Doktote-T esia
116 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 117
4. EMAITZAK
4.1. TEKNIKAREN DOIKETA
4.1.1. SUSTRATO KONTZENTRAZIO OPTIMOA
Haziko aktibitate peptidasikoen ikerketa hasi ahal izateko, lehenbizi aktibitate
hauen heina finkatzea beharrezkoa zen. Suposatzen genuen bezala, aktibitate mailak
ezberdinak izateagatik, haziaren ikerketarako behar izango genituen sustrato
fluorogenikoaren kontzentrazioak beste ehun batzuetan erabilitakoen ezberdinak
izango dira. Aktibitate entzimatikoak euren artean konparagarriak izan daitezen, hauen
behaketa, entzimek abiadura maximoan (Vmax) dihardutela egin behar da. Praktikan,
denbora-tarte (saio entzimatikoa diharduen bitartekoa) eta lagin entzimatikoaren
bolumen jakin batzuetarako, entzimek degradatu beharreko sustrato a kontzentrazio
asean egon behar duela ziurtatu behar dugu. Beraz, lehenengo saiakerak, sustratoaren
kontzentrazio hazkorrez patroiak osatzea eta hortik aktibitate bakoitzerako sustrato
kontzentrazio optimoa estimatzea bilatuko dute. Erreferentziazko sustrato
kontzentrazio [S] bezala, garunean beste ikerkuntza batzuetan erabili izan diren
kontzentrazioak hartuko ditugu, berauek patroiaren erdiko kontzentrazio bezala utzita.
Saiakeraren errferentziazko denbora 30 minutu ziren eta aktibitate bakoitzaren
behaketarako, garunean erabilitako lagin bolumenak garuneak erabilitakoak (10 p.1
Ala-P-Naftilamidaren aktibitate degradatzailearen ikerkuntzan eta 50 (il gainontzeko
sustratoen aktibitate degradatzaileekin).
Saiakera hauetan hazi homogenatuak erabili ziren; hau da, haziaren eduki
guztiaz osatutako banaketa gordinak. Hauen zatiki solugarria eta mintzari lotutakoa
EMAITZAK 117
118 Asier Valdivia Palacín Doktote-Tesía
bereizi egin ziren. Gerta daiteke, aktibitate berdin baterako, zatiki solugarriarentzat eta
mintzari lotutakoarentzat sustrato-kontzentrazio optimoa berdina ez izatea; kasu
hauetan bietako kontzentrazio altuena aukeratuko da optimo bezala.
Ala-P-Naftilamidaren degradazioa aztertzean (4.1. Inidia), argi ikusten da 4S
(500 ¡iM) kontzentrazioan lortu egiten déla abiadura maximoa. Hortik gorako
kontzentrazioetan, aktibitateak ez du nabarmenki gora egiten. Hori izango da, beraz,
aktibitate degradatzaile honi, aipatutako baldintzetan, ezarriko diogun sustrato
kontzentrazio.
DAGNPG (N-Dansyl-D-Ala-Gly-p-nitro-Phe-Gly) (4.2. Irudia eta taula),
sustratoaren degradazioa aztertzean irtenbide konplexuagoa bilatu behar izan genuen.
Sustratoaren izaera bereziagatik (sustratoa eta produktua, biak, fluoreszentzia igortzen
dute) eta topatu genituen aktibitate altuengatik ez genuen 16S inguruko
kontzentrazioaren inguruan baino, erreakzioaren asetze-puntua (abiadura
maximoarena) topatzen. Hartu genuen erabakia sustrato kontzentrazio a 90 pM finkatu
eta saiakera bakoitzean erabiliko genuen lagin kantitatea 5 aldiz jeistea izan zen. Hau
da, lagin bolumena 10 ^iL-tara doitu. Honela ziurtatu egiten da erreakzioa abiadura
maximoan gertatzen déla.
PGlu-P-Naftilamidaren aktibitate degradatzailearen azterketarako, mintzari
lotutako zatikian erreakziorako kontzentrazio egokiena 2S (250 mM)
kontzentrazioaren inguruan topatu zen, eta zatiki solugarrian 4S (500 jxM) puntuaren
inguruan, bi zatikientzat azken hau, 500 pM hobetsi zelarik (4.3. Irudia).
Z-Gly-Pro-p-Naftilamidaren aktibitate degradatzailearen kasuan, 2S-tik gorako
kontzentrazio ak prestatzerakoan sustratoak hauspeatu egiten zuen prestatutako
soluzioan. 2S kontzentrazioa hautatu genuen, beraz, egoki bezala.
118 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Paladín 119
EMAITZAK 119
120 Asier Valdivia Palacín Doktote-Tesia
SUSTRATOAREN KONTZENTRAZIO OPTIMOA
Ala-|3-Naftilamida
Sustrato
kontz.
x 125 \M
Aktibitatea Ehunekotan (%)
Ss Sm Ss Sm
0,25 24.713 31.543 19,48 6,48
0,5 45.575 62.566 35,93 12,85
1 74.961 119.537 59,09 24,55
2 106.768 235.561 84,17 48,38
3 126.422 362.501 99,66 74,46
4 126.851 463.338 100 95,15
8 112.832 486.851 88,95 100
4.1. Taula. Ala-p-Nañilamidaren kontzentrazio hazkorrez osatutako aktibitate-patroia,
giza haziaren homogenatu-laginen 10 ¡ul-rentzat. Hazi-homogenatuen zatiki
solugarriaren eta mintzari lotutakoaren batezbesteko aktibitateak adierazten dira,
aktibitate espezifiko moduan (unitateak = P.A.U. / mg proteina) eta ehunekotan (%),
(Ss = Hazi-homogenatu solugarria; Sm = Mintzari lotutako hazi-homogenatua),
Sustratoaren kontzentrazioak 125 [iM-en biderkagaiak dira.
120 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 121
SUSTRATOAREN KONTZENTRAZIO OPTIMOA
Ala-p-N aftilamida
500000 ■
450000 -
400000 •
o 350000 ■L_a 300000 ■O)E 250000 ■
3 200000 •<CL 150000 ■
100000 ■
50000 ■
<jJ
2 3 4 5 6 7
sustrato-kontzentrazioa x 125 |iM
4.1. Irudia. Lerroen bidezko, Ala-f3-Naftilamidaren aktibitate degradatzailearen
irudikapena, sustrato beraren kontzentrazioaren arabera. Haziaren homogenatuen zatiki
solugarriak eta mintzarí lotutakoak erabili izan dira (10 jal). Abzisa-ardatzean, Ala-{3-
Naftilamidaren kontzentrazio ezberdinak jartzen (non 1=125 jxM den). Ordenatuen
ardatzean aktibitate espezifíkoa adierazten da.
EMAITZAK 121
122 Asier Valdivia Palacín D oktore-T es ia
SUSTRATOAREN KONTZENTRAZIO OPTIMOA
DAGNPG
Sustrato-kontz. x 50 |u.M
Aktibitatea Ehunekotan (%)
Sm Sm
0,25 15 8,5
0,5 26,5 15
1 45,8 26
2 78,8 44,7
4 117,2 66,4
8 176,4 100
16 174,8 99,1
4.2. Taula. DAGNPG-ren kontzentrazio hazkorrez osatutako aktibitate-patroia, giza
haziaren homogenatu-laginen 10 Lil rentzat. Hazi-homogenatuen mintzati lotutako
zatüdaren batezbesteko aktibitatea adierazten da, aktibitate espezifiko moduan (unitateak
= U.A.P./ mg Proteina) eta ehunekotan (%). (Sm = Mintzari lotutako hazi-homogenatua).
Sustratoaren kontzentrazioak 50 [J,M-en biderkagaiak dira.
122 EMAITZAK
Doktore-T esia As ief Valdivia Palacín 123
SUSTRATOAREN KONTZENTRAZIO OPTIMOA
DAGNPG
Sustrato-kontzentrazioak x 50 jj.M
4.2. Irudia. Lerroen bidezko, DAGNPG-ren aktibitate degradatzailearen irudikapena,
sustrato beraren kontzentrazioaren arabera. Haziaren homogenatuen mintzari lotutako
zatikia erabili izan da (50 fil). Abzisa-ardatzean, DAGNPG-ren kontzentrazio
ezberdinak jartzen (non 1=50 /xM den). Ordenatuen ardatzean aktibitate espezifikoa
adierazten da.
EMAITZAK 123
124 Asier Valdivia Palacín Doktore-T esia
SUSTRATOAREN KONTZENTRAZIO OPTIMOA
pGlu-P-Naftilamida
sustrato- kontz.
x125 fjiM
Aktibitatea Ehunekotan (%)
Ss Sm Ss Sm
0,25 12,67 21,09 18,30 37,98
0,5 15,94 26,62 23,03 47,94
1 24,24 35,18 35,02 63,35
2 38,43 55,53 55,52 100
4 69,22 49,48 100 89,1
8 62,56 53,50 90,38 97,5
4.3. Taula. pGlu-P-Naftilamidaren kontzentrazio hazkorrez osatutako aktibitate-
patroia, giza haziaren homogenatu-laginen 50 jxl-rentzat. Hazi-homogenatuen zatiki
solugarriaren eta mintzari lotutakoaren batezbesteko aktibitateak adierazten dira,
áktibitate espezifiko moduan (unitateak = U.A.P./ mg Proteina) eta ehunekotan (%).
(Ss = Hazi-homogenatu solugarria; Sm = Mintzari lotutako hazi-homogenatua).
Sustratoaren kontzentrazioak 125 jj.M-en biderkagaiak dira.
124 EMAITZAK
Doktote-T esia Asiet Valdivia Palacin 125
SUSTRATOAREN KONTZENTRAZIO OPTIMOA
pGlu-P-Naftilamida
[sustrato] x 125 fj.M
4.3. Ii'udia. Lerroeti bidezko, pGlu-p-Naftilamidaren aktibitate degradatzailearen
irudikapena, sustrato beraren kontzentrazioaren arabera. Haziaren homogenatuen zatiki
solugarriak eta mintzari lotutakoak erabili izan dira (50 fil), Abzisa-ardatzean, pGlu-fî-
Nañilamidaren kontzentrazio ezberdinak jartzen (non 1—125 jxM den). Ordenatuen
ardatzean aktibitate espezifikoa adierazten da.
EMAITZAK 125
126 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
126 EMAITZAK
Doktore-T esia Asier Valdivia Palacín 121
4.1. TEKNIKAREN DOIKETA
4.1.2. AKTIBITATE ENTZIMATIKOEN BEREIZKETA
4.1.2.1. Inhibitzaile espezifikoen erabilera
Behin aktibitate degradatzaile bakoitzerako saiakeraren baldintza zinetikoak
(sustrato-kontzentrazio optimoa) finkatu ditugunean, aktibitate horien entzima
arduradunak zeintzuk diren zehaztu behar dugu. Honetarako, sustrato bakoitzarengan
eragin ditzaketen gai kimiko inhibitzaile espezifikoak edota aktibitate maila optimoak
eragiten duten substantzia gehigarriak (aktibatzaile ekintza dutenak) erabiliko ditugu.
Inhibizioa aztertzen dugunean, parametro zinetiko garrantzitsu bat izan behar
da kontutan: I.C. 50. Parametro honen bidez, lagin baten aktibitate entzimatiko zehatz
baten %50a inhibitzeko behar den inhibitzaile kontzentrazioa adierazi nahi da.
Kontzentrazio hau, entzima eta inhibitzailearen arteko afinitateak eta sustrato eta
entzimaren menpekoak mugatzen dute. Kasu guztietan, erabili dugun sustrato
kontzentrazioa, ehun bakoitzerako, aktibitate degradatzailearen sustrato kontzentrazio
optimoa izan da.
Zenbait aktibitateen zehazketarako, haziaz gain, arratoi-garunak erabili izan
dira. Honen helburua, ganmetako inhibizio patroiak eta entzimen deskribapena askoz
ere ezagunagoak izanik, haziarengan eman daitekeen inhibizio-patroiaren ulermena
hobetzea da.
Inhibizioa aztertzen dugunean, datuak konparagarriak izan daitezen,
aktibitateak ehunekotan adierazi dira. Kasu batzutan, haziaren datuak garunekoekin
konparatuta azaltzen dira; honen arrazoia, garunean, aidez aurretik, behatu diren
inhibidoreen efektuak, hazian behatzen direnekin konparatzean, argitasun handiagoz
EMAITZAK 127
128 Asier Valdivia Palacín Doktore-T esia
azaldu daitekelako entzima baten presentzia edo beste baten ez egotea. Beste batzutan
haziaren datuak berez adierazgarriak izango dira eta garunarekiko konparaketak ez du
informazio gehiagorik emango.
Aztertu dugun lehenengo inhibitzailea Puromizina izan da. Puromizina, Ala-p-
naftilamida sustratoa degradatzen duten PS A entzimaren inhibitzailea da, bere forma
solugarrian eta mintzari lotutakoan. Bi entzima hauek eta APN entzimak sustrato bera
degradatzen dute, baina puromizinaren ekintza inhibitzailea PSA-rengan handiagoa da.
Puromizinaren I.C. 50 PSArentzat 0,6-1,4 pM tartean dagoela deskribatu da (ehun
ezberdinetan) (Solhone eta lank., 1987; Yamamoto eta lank., 1998). Garunaren zatiki
homogenatu solugarriaren kasuan, ikusten den bezala, puromizinarekiko sentikortasun
handiagoa antzema daiteke, haziarekin konparatzerakoan eta 80 ¡iM-eko puromizina
kontzentrazioan aktibitatea guztiz inhibituta azaltzen da. Bertan lortutako I.C. 50a
beste ehunetan behatu izan direnen antzekoa da (0,9 pM). Garunaren, mintzari lotutako
zatikian, inhibizioaren prozesuarekiko erresitentzia handiagoa beha daiteke, APN-ren
presentziagatik (puromizinarekiko sentikortasunik gabekoa). Mintzari lotutako
zatikian, garunean, 80 pM-eko puromizina kontzentrazioan oraindik ere aktibitatearen
%12a dirau (4.4. Taula).
Haziaren kasuan lortutako inhibí zio-kurba, garunean topatutakoaren oso
ezberdina da. Hemen, homogenatuen zatiki solugarrian nahiz mintzari lotutakoan,
inhibizio profil bera aurkezten dute, garunarekin konparatuz, puromizinarekiko
erresistenteagoak direlarik. Honela, 80 pM-cko puromizina kontzentrazioan
aktibitatearen %40 daukagu eta betran lortutako I.C. 50a 65 p.M-ekoa da (4.4. Irudia).
I.C. 50-aren balio hau, beste ehunetan purifikatutako APN-aren balioekin bat dator (50
-78 uM) (Huang eta lank., 1997; Solhone eta lank., 1987). Ondorioz, esan genezake,
giza hazian dagoen Ala-p-Naftilaminaren aktibitate degradatzailea, APN entzimari sor
zaiola.
Badaude ehun anitzetan Ala-p-Naftilamida ahulki degradatzeko gaitasuna
duten zenbait entzima, hala ñola, Leuzil aminopeptidasa (Leu-Ap, E.C. 3.4.11.1), B
aminopeptidasa (AP B, E.C. 3.4.11.6) eta A aminopeptidasa (AP A, E.C. 3.4,11.7).
Beraz, eta hazian topatutako aktibitate-maila altuak direla eta, komenigarria zen APN-
128 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 129
aren inhibitzaile espezifikoren bat erabiltzea, behatzen ari ginen aktibitatea entzima
honi bakarrik zor zitzaiola egiaztatzeko. Honda, Leuhistina inhibitzailearen
kontzentrazio hazkorrez prestatutako inhibiziozko patroi kurba osatu zen (4.5. Taula),
hazi homogenatuekin. Lortutako I.C. 50-a 0,65 ¡xM-ekoa izan zen, purifikatutako
ApN-arekin lortutakoaren oso balio antzekoa (I.C. 50 0,83 |iM) (Aoyagi eta lank.,
1991). Inhibitzaile honen 16 ¡aM-eko kontzentrazio an entzimaren aktibitatea erabat
ezabatua azaltzen zen.
DAGNPG sustratoa, Endopeptidasa Neutroaren (NEP, E.C. 3.4.24.11) sustratoa
izateaz gain, Angiotentsinaren Entzima Bihurtzaileak (ECA, ACE, E.C. 3.4.15.2) ere
degradatu egiten du, lotura berdinarekiko afinitatea baitu. Beraz, esperimentu
bereizgarriak egin dira, aide batetik, hazian NEP entzimaren egotea finkatzeko (NEP-
aren inhibitzaile espezifikoak erabiliz, Tiorfan, Fosforamidon...) (4.6. Taula eta irudia)
eta bigarrenik, DAGNPG-aren degradazioan haziko ACE-aren erantzukizuna
estimatzeko (Kaptopril, ACE-aren inhibitzaile espezifikoaz) (4.7. Taula eta Irudia).
EMAITZAK 129
130 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
INHIBITZAILE ESPEZIFIKOAK
Ala-p-Naftilamidaren degradazioa
Puromizina
Garuna Giza-hazia
Aktibitatea (%) Aktibitatea (%)
[Pur] |xM Gs Gm Ss Sm
0 100 + 3,09 100 ±4,1 100 ±5,1 100 + 4,44
0,625 60,3 ± 3,97 67,3 ±4,31 97,4 ± 4,34 98,6 ± 3,84
1,25 42,0 ± 2,95 52,9 ± 3,20 95,5 ±4,40 96,5 ± 3,60
2,5 27,1 ±4,11 40,8 ± 3,08 94,5 ±3,71 93,2 ± 3,64
5 16,6 ± 3,30 33,7 ± 3,84 88,7 ±4,63 89,8 ±3,10
10 9,22 ± 2,35 24,7 ± 2,46 83,3 ± 3,86 81,4 ± 3,54
20 5,45 + 1,20 19,3 ± 1,69 69,6 ± 3,61 72,1 ±3,58
40 3,07 ± 0,97 15,5 ± 1,57 57,6 ±3,21 59,4 ± 2,88
80 1,96 + 0,80 11,9 ± 2,10 42,9 ± 2,94 44,2 ± 2,51
160 1,35 ±0,61 9,67 ± 1,30 29,3 ±2,19 32,1 ±2,02
320 1,21 ±0,38 8,37 ± 1,95 18,1 ±1,32 20,3 ± 1,76
640 0,89 ± 0,24 6,88 ± 1,30 9,84 ± 1,12 11,5± 1,10
1280 5,36 ± 0,68 6,41 ± 0,80
IC 50 (nM) 0,977 1,55 60,78 64,78
4.4. Taula. Ala-p-N aftilarnidaren aktibitate degradatzailea, puromizinaren kontzentrazio
hazkorrez osatutako inhibizio-patroia. Aktibitatearen ehuneko (%) batezbesteko baüoak
eta erroreak adierazten dira (n=10) . Aztertutako lagin homogenatuak, garunaren eta
haziaren zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak barne hartzen dituzte (Gs = garunaren
zatiki solugarria, Gm = garunaren mintzari lotutako zatikia, Ss — Haziaren zatiki
solugarria, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).
130 EMAITZAK
Doktore-T esia Asiet Valdivia Palacín 131
INHIBITZAILE ESPEZIFIKOAK
Ala-p-Naftilamidaren degradazioa
Puromizina
Puromizina (|xM)
4.4. Irudia. Puromizinaien eragina Ala-p-Naftüamidaren degradazioan. Aktibitate
portzentaiaren jaitsiera putomizinaren eraginez (n=10). Aztertutako lagin homogenatuak,
garunaren eta haziaren zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak barne hartzen dituzte (Bs
= garunaten zatiki solugarria, Bm = garunaren mintzari lotutako zatikia, Ss = Haziaren
zatiki solugarria, Sm — haziaren mintzari lotutako zatikia).
EMAITZAK 131
132 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
INHIBITZAILE ESPEZIFIKOAK
Ala-p-Naftilamidaren degradazioa
Leuhistina
Aktibitatea (%) Giza hazia
[Leu] nM Ss Sm
0 100 ± 4,10 100 ± 4'00
15,625 97,0 ± 4,40 98,2 + 3,95
31,25 93,7 ± 3,58 94,3 ±4,10
62,5 89,0 ± 4,36 91,6 + 4,51
125 79,8 ± 3,85 82,8 ± 3,30
250 68,3 ± 3,20 71,2 ±4,20
500 51,1 ±3,49 54,2 ±3,10
1000 37,0 ± 3,24 38,4 ± 2,64
2000 23,5 ± 2,64 25,1 ±2,81
4000 13,1 ± 1,20 15,7 ± 1,67
8000 7,16 ±1,68 8,76 ± 1,81
16000 3,39 ±1,10 4,88 ± 1,20
IC 50 (nM) 537,9 633,5
4.5. Taula. Ala-p-Naftilamidaren aktibitate degradatzailea, Leuhistinaren kontzentrazio
liazkorrez osatutako inhibizio-patroia. Aktibitatearen ehuneko (%) batezbesteko balioak
eta erroreak adierazten dita (n=10) . Aztertutako lagin homogenatuak, haziaren zatiki
solugarriak eta mintzari lotutakoak bame hattzen dituzte (Ss = Haziaren zatiki solugarria,
Sm — haziaren mintzari lotutako zatikia).
132 EMAITZAK
Doktote-Tesia Asiet Valdivia Palacín 133
INHIBITZAILE ESPEZIFIKOAK
Ala-J3-Naftilamidaren degradazioa
Leuhistina
Leuhistina (nM)
4.5, Irudia, Leuhistinaren eragina Ala-P-Naftilamidaren degradazioan. Aktibitate
portzentaiaten jaitsiera puiromizinaren eraginez (n=10). Aztertutako lagin homogcnatuak,
garunaren eta haziaren zatiki solugamak eta mintzari lotutakoak barne hartzen. dituzte (Ss
= Haziaren zatiki solugama, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).
EMAITZAK 133
134 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
INHIBITZAILE ESPEZIFIKOAK
DAGNPG-ren degradazioa
Tiorfan eta Fosforamidon
Tiorfan Fosforamidon
[Inhibitzailea] (nM) Aktibitatea (%) Aktibitatea (%)
0 100 + 7,06 100 ±5,12
0,078 98,3 ±5,41 86,2 + 4,53
0,156 96’0 + 4,28 79,6 ±5,16
0,312 92,3 ±4,13 67,3 ± 4,64
0,625 86,7 ± 5,86 56,3 ± 6,34
1,25 79,4 + 4,64 41,6 ±5,23
2,5 64,7 ± 5,23 28,6 ±4,60
5 50,1 ±3,61 15,5 ± 1,67
10 32,9 ±3,86 7,61 ± 2,05
20 18,4 + 2,31 5,65 ± 1,55
40 10,9± 1,15 3,74 ± 3,74
80 6,83 ± 1,89 2,68 ± 0,87
160 6,10 ± 2,11 2,13 ±1,22
320 5,62 ± 1,55 1,72 + 0,56
IC50 5 0,835
4.6. Taula. DAGNPGren aktibitate degradatzailea, Tiorfan-en eta Fosforamidon-en
kontzentrazio hazkorrez osatutako inhibizio-patroia. Aktibitatearen ebuneko (%)
batezbesteko balioak eta erroreak adierazten dita (n=10). Aztertutako lagín
homogenatuak, mintzari lotutakoak dira (Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).
134 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 135
INHIBITZAILE ESPEZIFIKOAK
DAGNPG-ren degradazioa
Tiorfan eta Fosforamidon
Inhibitzailea (nM)
4.6. Irudia. Tiorfan eta Fosforamidon-aren eragina DAGNPG-ren degradazioan.
Aktibitate portzentaiaren jaitsiera tiorfan eta fosforamidonaren. eraginez (n™10).
Aztertutako lagin homogenatuak, haziaren mintzari lotutako zatikiak bame hartzen dituzte
(Sm — haziaren mintzari lotutako zatilda).
EMAITZAK 135
136 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
INHIBITZAILE ESPEZIFIKOAK
DAGNPG-ren degradazioa
Kaptopril
[Kaptopril](nM)
Aktibitatea (%)
Ss Sm
0 100 + 5,61 100 + 6,30
1,953 68,6 ± 2,43 79,31 ±4,81
3,906 49,0 + 1,37 72,41 ± 2,50
7,812 31,4 ±4,41 51,74 ±2,84
15,625 21,6 ±2,13 34,48 ± 3,42
31,25 6,20 + 6,15 10,60 + 4,63
62,5 5,88 + 2,20 10,34 ± 1,80
125 0,98+1,74 10,40 + 1,11
250 0 + 0,98 10,20 ± 2'00
4.7. Taula. DAGNPGren aktibitate degradatzailea, Kaptoprilaren kontzentrazio
hazkorrez osatutako inhibizio-patroia. Aktibitatearen ehuneko (%) batezbesteko balioak
eta erroreak adierazten dita (n=10) . Aztertutako lagin homogenatuak, zatiki solugarriak
eta mintzari lotutakoak dita (Ss = Haziaren zatiki solugarria, Sm = haziaren mintzari
lotutako zatikia).
136 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asiei Valdivia Palacín 137
INHIBITZAILE ESPEZIFIKOAK
DAGNPG-ren degradazioa
Kaptopril
[Kaptopril] (nWl)
4.7. Iludía. Kaptoprilaren eragina DAGNPG-aren degradazioan. Aktibitate
portzentaiaren jaitsiera kaptoprilaren eraginez (n=10). Aztertutako lagin homogenatuak,
garunaren eta haziaren zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak barne hartzen dituzte (Ss
= Haziaren zatiki solugarria, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).
EMAITZAK 137
138 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
4.1. TEKNIKAREN DOIKETA
4.1.3. AKTIBITATE ENTZIMATIKOEN BEREIZKETA
4.I.3.2. Substantzia gehigarriak: EDTA eta DTT
Entzima batzuen ekintza besteengandik bereizteko, inhibitzaile espezifikoak
erabili beharrean, bestelako substantzia gehigarriak erabili daitezke. Hauek aktibatzaile
moduan ekin dezakete, zenbait entzimen ekintza areagotzea lortzen dutelako. Hauen
adibidea DTT (Ditiotreitol) dugu. DTT-ak, PGA I entzimaren aktibatzailea izanik,
PGA II-ren aktibitatea inhibitu egiten du (O’Cuinn eta lank., 1990). DTT-ak, prolil
endopeptidasaren aktibatzailea dela ere deskribatu izan da ( Zofaghari eta lank., 1986).
pGlu-p-naftilamida (0,5 mM) sustratoaz, eta DTT-aren kontzentrazio hazkorrez
osatutako aktibitate-patroia osatu zen (4.8. Irudia). Argi ikus daiteke pGlu-p-
Naftilamidaren aktibitate degradatzailea areagotu egiten dela, DTT-aren
kontzentrazioa gora egiten duenean. Esperimentu bera egin zen, Z-Gly-Pro-P-
Naftilamidaren (0,25 mM) degradazioa ikertuz. Hemen ere, DTT-aren eraginez,
aktibitateak gora egiten zuen (4.10. Irudia).
EDTA katioi dibalenteak (Ca++, M g^, Zn^,.--) kelatzen dituen substantzia bat
da. Ikerketa ezberdinek, peptidasa ezberdinen aktibitateengan eragina (aktibazioa nahiz
inhibizioa) omen duela deskribatu da. Bai pGlu-|3-Naftilamidaren, bai Z-Gly-Pro-p-
naftilamidaren aktibitate degradatzailean, giza hazian, izan ditzakeen eragina aztertu
izan da (4.9. eta 4.11. Irudiak). Esperimentu hauetan ez da EDTA-ren eragin
aipagarririk behatu.
138 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 139
EMAITZAK 139
140 Asier Valdivia Palacín Doktote-Tesia
SUBSTANTZIA GEHIGARRIAK
pGlu-p-Naftilamidaren degradazioa
DTT
Aktibitatea
[DTT] mM Ss Sm
0 100,2 ±5,64 136,4 ±6,36
0,5 120,1 ±7,24 151,8 ±3,22
1 100,9 ± 8,37 167,2 ± 10,6
2 138,8 ±4,50 182,6 ± 13,3
4 167,7 ± 14,7 206,0 ± 15,4
8 187,6 ±21,3 239,0 ± 18,3
16 232,9 ± 20,2 290,0 ± 16,5
32 293,0 ± 12,8 376,7 ±11,3
4.8. Taula. p Glu - fi-N a ftilami dar en aktibitate degradatzailea, DTTaren kontzentrazio
hazkorrez osatutako aktdbitate-patroia. Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak eta
erroreak adieiazten dira (n=10) (Unitateak = P.A.U./'mg proteina). Aztertutako lagin
homogenatuak, zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak dira (Ss = Haziaren zatiki
solugama, Sm — haziaren mintzari lotutako zadkia).
140 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asiet Valdivia Palacín 141
SUBSTANTZIA GEHIGARRIAK
pGlu-P-Naftilamidaren degradazioa
DTT
[DTTl mM
4.8. Irudia. DTTaren eragina pGlu--p-Naftüamidaren degiadazioan. Aktibitate
espezifikoaten igoera DTTaren eraginez (n=10). Aztertutako lagin homogenatuak,
haziaren zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak bame hartzen dituzte (Ss = Haziaren
zatiki solugarria, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).
EMAITZAK 141
142 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
SUBSTANTZIA GEHIGARRIAK
pGlu-P-Naftilamidaren degradazioa
EDTA
aktibitatea
[EDTA] mM Ss Sm
0 141,7 ±4,50 139,6 ±7,40
0,125 144,5 ±7,42 143,7 ±9,12
0,25 139,2 ±13,7 142,2 ±4,53
0,5 138,0 ±8,54 140,0 ±3,33
1 138,8 + 3,62 138,5 ±6,57
2 140,1 ±5,51 145,3 ± 10,5
4 132,4 ±5,23 145,3 ±4,20
4.9. Taula. pGlu-p-Naftilamidaren aktibitate degradatzailea, EDTAren kontzentrazio
hazkorrez osatutako aktibitate-patroia. Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak eta
erroreak adierazten dira (n= 10) (Unitateak = P.A.U./mg proteina). Aztertutako lagin
homogenatuak, zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak dira (Ss = Haziaren zatiki
solugarria, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).
142 EMAITZAK
Doktore-T esia Asiet Valdivia Palacín 143
SUBSTANTZIA GEHIGARRIAK
pGlu-j3-Naftilamidaren degradazioa
EDTA
[EDTA] mM
4.9. Iiudia. EDTArcn eragjna pGlu-P-Naftilamidaren degradazioan. Aktibitate
espezifikoaren igoera EDTAren. eraginez (n=10). Aztertutako lagin homogenatuak,
haziaren zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak barne hartzen dituzte (Ss = Haziaren
zatiki solugarria, Sin = haziaren mintzari lotutako zatikia).
EMAITZAK 143
144 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
SUBSTANTZIA GEHIGARRIAK
Z-Gly-Pro- P-Naftilamidaren degradazioa
DTT
Aktibitatea
[DTT] mM Ss Sm
0,00 236,9 ± 11,2 68,31 ±7,47
0,50 163,4 ±7,25 136,1 ± 14,2
1,00 247,7 ± 8,40 217,6 ±4,56
2,00 259,0 ± 3,54 260,9 ± 6,78
4,00 349,1 ± 6,70 302,0 ± 16,8
8,00 410,3 + 21,2 371,6 ±23,7
16,00 524,8 ± 14,6 518,4 ± 18,2
32,00 621,9 ±22,3 703,1 ±24,0
4.10. Tauía. Z-Gly-Pro-|3-Naftilamidaren aktibitate degradatzailea, DT Taren
kontzentrazio hazkorrez osatutako aktibitate-patroia. Aktibitate espezifikoaren
batezbesteko balioak eta erroreak adierazten dita (n=10) (Unitateak = P.A.U./tng
proteina). Aztertutako lagin homogenatuak, zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak dita
(Ss = Haziaren zatiki solugarria, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).
144 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 145
SUBSTANTZIA GEHIGARRIAK
Z-GIy-Pro-{3-Naftilamidaren degradazio a
DTT
[DTT] mM
4.10. Irudia. DTTaren eragina Z-Gly-Pro-P-Naftilamidaren degradazioan. Aktibitate
espezifikoaren igoera DTTaren eraginez (n= 10). Aztertutako lagin homogenatuak,
haziaren zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak bame hartzen dituzte (Ss = Haziaren
zatiki solugarria, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).
EMAITZAK 145
146 Asier Valdivia Palacín Doktote-Tesia
SUBSTANTZIA GEHIGARRIAK.
Z-Gly-Pro- P-Naftilamidaren degradazioa
EDTA
aktibitatea
[EDTA] mM Ss | Sm
0 85,4 ± 5,35 124,4 + 9,36
0,125 120,9 ± 17,8 95,7 ± 6,48
0,25 60,4 ± 25,6 48,8 ± 27,2
0,5 108,7 ±4,34 103,3 + 6,50
1 104,1+6,25 91,8 ±23,3
2 48,2 + 14,8 24,6 ±4,37
4 79,1 ±3,56 58,0± 20,6
4.11. Taula. Z-Gly-Pro-p-Naftikmidaren aktibkate degradatzailea, EDTAren
kontzentrazio hazkorrez osatutako aktibitate-patroia. Aktibitate espezifikoaren
batezbesteko balioak eta erroreak adierazten dira (n=10) (Unitateak — P.A.U./mg
pioteina). Aztertutako lagin homogenatuak, zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak dira
(Ss = Haziaren zatiki solugarria, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).
146 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 147
SURSTANTZIA GEHIGARRIAK
Z-Gly-Pro-j3-Naftilamidaren degradazioa
EDTA
[EDTA] mM
4.11. Ifudia, EDTAren eragina Z-Gly~Pro-(3-Naftilamidaren degradazioan. Aktibitate
espezifikoaren igoera EDTAren eraginez (n=10). Aztertutako lagin homogenatuak,
haziaren zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak bame hartzen dituzte (Ss = Haziaren
zatiki solugarria, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).
EMAITZAK 147
148 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
4.2. AKTIBITATE ENTZIMATIKOAK:
EHUNEN ARTEKO KONPARAKETAK
Ikertu diren entzimen aktibitateak ah al i k eta hoberen deskribatzeko,
esanguratsua izan daiteke hazian lortzen diren aktibitate-balioak eta ikertuak izan diren
beste ehunetan lortutako balioak konparatzea. Era honetan, entzima hauek giza
haziaren fisiologian izan ditzaketen garrantziaren inguruko beste datu bat lor daiteke,
Esperimentu talde honetan arratoi-ehunen eta giza haziaren homogenatuak erabili izan
dira, aurreko ataletan deskribatutako esperimentazio baldintzetan (sustrato
kontzentrazio optimoa erabiliz, inhibitzaileak,...).
N aminopeptidasaren kasuan (APN), argi ikusten da mailarik altuenak giza
hazian eta arratoi-giltzurrunean behatzen direla (4.12. Irudia), batez ere, mintzari
lotutako zatikian. Bi ehun hauek, birikarekin batera, mintzari lotutako zatikian, zatiki
solugarrian baino aktibitate maila altuagoak dituzte. Garunaren aldean, haziko
homogenatuen zatiki solugarrian nahiz mintzari lotutakoan, APN-ren aktibitatea 3 eta
16 aldiz handiagoa da hurrenez hurren (4.12. Taula).
APN-arekin gertatzen den moduan, endopeptidasa neutroaren (NEP) aktibitate
maila altuenak giltzummean, birikan eta giza hazian behatu dira hemen ere. Berriz ere,
haziko homogentatuetako bailoak garunekoak baino askoz aktibiate maila altuagoak
dituzte (10 aldiz). Entzima hau, mintzeko zatikian bakarrik deskribatu izan da, beraz ez
dago, zatiki solugarriaren daturik (4.13. Irudia).
Piroglutamil Peptidasa I (PGA I) aktibitate maila altuenak giltzummean (batez
ere), birikan eta garunean topatu izan dira. Kasu honetan, giza hazia erdimailako
aktibitatea aurkezten du. Ehun guztietan zatiki solugarriko aktibitateak handiagoak
148 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 149
izanda, haziaren kasuan zatiki solugarria eta mintzari lotutakoaren mailak oso
parekoak dira (4.14. Irudia).
Prolil endopeptidasaren kasuan, hazi-homogenatuetan behatutako aktibitateak,
beste ehunetakoak baino txikiagoak dira, modu nabari batean. Kasu guztietan, zatiki
solugarriak, mintzari lotutakoak baino aktibitate handiagoak ditu. Kasu honetan,
garuna eta birika dira, aktibitate-maila altuenak dituzten ehunak (4.15. Taula eta
irudia).
EMAITZAK 149
150 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
EHUNETAKO AKTIBITATE ENTZIMATIKOA
N Aminopeptidasa (APN)
aktibitatea
EHUNAK soiugarria mintza
Muskulua 6948 ± 657 4415 ±511
Bihotza 118071798 1945 ±401
Birika 4813,±325 9357 ± 220
Garuna 22654 ±1501 5954 ± 960
Giltzurruna 13311 ± 1989 125501 ± 13494
Giza hazia 9364218711 13120217628
4.12. Taula. APN aminopeptidasaren aktibitatea ehun ezberdinetan. Muskulua, biliotza,
bitika, garuna eta giltzurrun ehunak, arratoi-ehunak dira (n=10). Ehunen homogenatuen,
zatiki solugarriaren eta mintzari lotutakoaren batezbesteko aktibitateak eta euren erroreak
adieiazten dira, aktibitate espezifiko moduan (unitateak = P A.U. / mg Proteina).
150 EMAITZAK
Doktote-Tesia Asier Valdivia Palacín 151
EHUNETAKO AKTIBITATE ENTZIMATIKOA
N Aminopeptidasa (APN)
Ehunak
4.12. Itudia. APN aminopeptidasaren aktibitatea ehun ezberdinetan. Muskulua, bihotza,
birika, garuna eta giltzurrun-ehunak, arratoi-ehunak dka (n=10). Ehunen homogenatuen
zatiki solugarria eta mintzari lotutakoa aztertu egin dira. Aktibitatearen balioak, aktibitate
espezifikoa adierazten dute.
EMAITZAK 151
152 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
EHUNETAKO AKTIBITATE ENTZIMATIKOA
Endopeptidasa Neutroa (NEP)
aktibitatea
EHUNAK Mintza
Muskulua 16,0 + 3,92
Bihotza 4,08 ± 0,57
Birika 43,3 + 5,75
Garuna 6,92 ± 1,44
Giltzurruna 131,7 ± 4,29
Giza hazia 68,3 ± 9,47
4.13. Taula. Endopeptidasa Neutroaren akdbitatea eliun ezberdínetan. Muskulua,
bihotza, bkika, garuna eta giltzurrun-ehunak, arratoi-ehunak dita (n=10). Ehunen
homogenatuen mintzari lotutako zatikiaren batezbesteko aktibitateak eta euxen erroreak
adierazten dira, aktibitate espezifiko moduan (unitateak = PA .U ./ mg Proteina).
152 EMAITZAK
Doktote-Tesia Asier Valdivia Palacín 153
EHUNETAKO AKTIBITATE ENTZIMATIKO A
Endopeptidasa Neutroa (NEP)
160 "
140 ■
Ehunak
4.15. Irudia. Endopeptidasa Neutroaren aktibitatea ehun ezberdinetan. Muskulua,
bihotza, birika, garuna eta gil tzumm-ehunak, atíatoi-ehunak dira (n=10). Ehunen
homogenatuen mintzari lotutako zatikiak aztettu egin dita. Aktibitatearen balioak,
aktibitate espezifikoa adierazten dute.
EMAITZAK 153
154 Asier Valdivia Palacín Doktore-T esia
EHÜNETAKO AKTIBITATE ENTZIMATIKOA.
Piroglutamil Peptidasa I
aktibitatea
EHUNAK Solugarria mintza
Muskulua 99,40 ± 18,15 77,27 ± 38,63
Bihotza 294,2 ± 65,44 41,28 ±20,64
Birika 639,2 ± 92,54 109,7 ± 54,85
Giltzurruna 1900,3 ±225,8 276,5 ± 138,2
Garuna 406,7 ± 23,27 120,4 ±60,21
Giza hazia 202,9 ± 30,20 208,7 + 51,40
4.14. Taula. Piroglutamil Peptidasaren aktibitatea ehun ezberdinetan. Muskulua, bihotza,
bitika, garuna eta gjltzumm-ehunak, arratoi-ehunak dita (n=10). Ehunen homogenatuen
zatiki solugarriaren eta mintzari lotutakoaten batezbesteko aktibitateak eta euren erroreak
adierazten dita, aktibitate espezifiko moduan (unitateak = P.A.U./ mg Proteina).
154 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 155
EHUNETAKO AKTIBITATE ENTZIMATIKOA
Piroglutamil Peptidasa I
2500 -i
Ehunak
4.14. Irudia. Piroglutamil peptidasaren aktibitatea ehun ezberdinetan. Muskulua, bihotza,
birika, garuna eta giltzurrun-ehunak, arratoi-ehunak dira (n=10). Ehunen homogenatuen
zatiki solugarrian eta mintzari lotutakoan aztertu egin dira. Aktibitatearen balioak,
aktibitate espezifikoa adierazten dute.
EMAITZAK 155
156 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
EHUNETAKO AKTIBITATE ENTZIMATIKOA
Prolil Endopeptidasa
Aktibitatea
EHUNAK sofugarria Mintza
Muskulua 2913,08 121,93
Bihotza 2891,17 109,77
Birika 3977,27 234,02
Giltzurruna 1676,56 299,19
Garuna 4400,36 854,38
Giza hazia 405,16 240,34
4.15. Taula. Prolil endopeptidasaren aktibitatea ehun ezberdinetan. Muskulua, bihotza,
birika, garuna eta giltzurrun-ehunak, arratoi-ehunak dixa (11= 10). Ehunen homogenatuen
zatiki solugarriaren eta mintzari lotutakoaren batezbesteko aktibitateak eta euren erroreak
adierazten dira, aktibitate espezifiko moduan (unitateak = P.A.U./ mg Proteina).
156 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 157
EHUNETAKO AKTIBITATE ENTZIMATIKOA.
Prolil Endopeptidasa
a?& Q>°&
Ehunak
ü s o l u g a r r i a
■ m i n t z a
&
4.15. Ifudia. Prolil endopeptidasaren aktibitatea ehun ezberdinetan. Muskulua, bihotza,
birika, garuna eta giltzurrun-ehunak, arratoi-ehunak dita (n=10). Ehunen homogenatuen
zatiki solugarrian eta mintzari lotutakoan aztertu egin dira. Aktibitatearen balioak,
aktibitate espezifikoa adietazten dute.
EMAITZAK 157
158 Asier Valdivia Palacín Doktore-T esia
158 EMAITZAK
Doktore-T esia Asiet Valdivia Palacín 159
4.3. AKTIBITATE PEPTIDASIKOAK ETA
HAZI-PATOLOGIAK
Tesi honen bigarren xedea, aztertutako peptidasen karakterizazioa egin
ondoren, peptidasa hauek haziaren zenbaít patologiarekin erlazionatzea da.
Honetarako, aktibitate entzimatiko bakoitza, haziaren diagnostiko-talde ezberdinetan
aztertu egin zen.
Lau talde diagnostiko nagusitan bildu genituen hazi-laginak: normozoospermikoak,
astenozoospermikoak, nekrozoospermikoak eta astenoteratozoospermikoak. Hazi-lagin
patologikoetan, haziaren patología bat baino gehiago izatea oso nórmala da, batez ere,
nekrozoospermia aurkezten duten hazietan. Honela, oso zaila da nekrozoospermiaren
talde patologiko purua (bakarrik patología bakarra dituzten haziak) osatzea. Beraz,
talde batzu ekrozoospermikoen taldean bateratu ziren. Honetarako, Nekrozoospermia,
besteen gainetiko garratzia zuen patología bezala jotzea erabaki genuen,
nekrozoospermia azaltzen zuten lagin guztiak (bestelako patologiak ere izan arren)
automatikoki talde berean sailkatuz. Honezkero, taldeak hórrela antolatu ziren:
• Normozoospermikoak: Normozospermikoak soilik biltzen ditu (Talde purua)
• Astenozoospermikoak: Astenozoospermikoak soilik biltzen ditu (Talde purua)
• Nekrozoospermikoak: Nekrozoospermia azaltzen duten hazi-lagin guztiak
biltzen ditu (nekrozoospermiko puruak, astenoekrozoospermikoak,
astenonekroteratozoospermikoak eta nekroteratozoospermikoak)
• AstenoTeratozoospermikoak: astenoteratozoospermikoak soilik biltzen ditu
(Talde purua)
Bestelako patologiak aztertu arren, lagin-kopuru urria izateagatik, ikerketatik
kanpo utzi behar izan ziren.
EMAITZAK 159
160 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
Emaitzak bi eratara aurkeztu egiten dira. Aide batetik, giza haziaren lau zatikiren
aktibitate espezifikoak (P.A.U. / mg proteina) ikertu ziren. Zatiki hauek
espermatozoideen zatiki solugarria (SpS), espermatozoideen mintzari lotutako zatikia
(SpM), likido semin ala (Ls) eta prostasomen zatikia (P) izan ziren. Endopeptidasa
neutroaren kasuan, soilik aztertu zen prostasomen zatikia, beste zatikietan aktibitaterik
azaltzen ez duelako. Emaitzak ere, zatiki zelularretan (SpS eta SpM) soilik, aktibitate
entzimatikoa espermatozoide kopuru osoarekiko moduan adierazi ziren (P.A.U. /
espermatozoide milioi). Beste bi zatikietan (Ls eta P) horrelako aktibitate adierazpena
ez da aurkeztu, oso esanguratsua izango ez litzatekelako, jatorri ezberdineko haziaren
osagaiak direlako (lehenengoa besikula seminaletatik jariatua eta bigarrena prostata-
guruinetik).
N Aminopeptidasaren (APN) aktibibitate espezifikoa aztertzean beha daiteke,
nekrozoospermia duten hazien zatiki zelularretan (espermatozoideetan) aktibitatea
altuagoa dela, normozoospermikoen taldearen aldean. Ezberdintasuna estatistikoki
adierazgama izaten da espermatozoideen zatiki solugarrian (SpS) (p<0,01), eta
espermatozoideen mintzari lotutako zatikian (SpM) (p<0,05)(4.16 irudia). Aldiz,
astenozoospermikoek eta astenoteratozoospermikoek aktibitate baxuagoak azaltzen
zituzten, normozoospermikoen aldean (p<0,05). prostasomen (P) eta likido
seminalaren (Ls) zatikietan ere astenozoospermikoek aktibitate baxuagoak azaltzen
zituzten, baina kasu honetan, ezberdintasunak ez dira estatistikoki adierazgarriak.
Aktibitatea espermatozoide kopuruarekiko ematen denean, asteno eta
nekrozoospermikoen arteko ezberdintasun adierazgama dago , espermatozoideen
zatiki solugarrian (SpS) (4.17. irudia).
Endopeptidasa neutroaren (NEP) kasuan, prostasomen zatikia aztertu da, besteetan,
aurretik esan bezala, ez bait dago entzima honen aktibitaterik. Kasu honetan ez da
ezberdintasun estatistiko adierazgarririk topatu talde patologikoen artean (4.18. irudia).
Piroglutamil peptidasa I aktibitatea aztertzean (4.19. irudia), nekrozoospermiadun
hazi-laginek, normozoospermikoek baino aktibitate espezifiko altuagoak zituzten
(p<0,05) espermatozoideen zatiki solugarrian. Ez dago ezberdintasun estatistikoki
160 EMAITZAK
Doktore-T esia Asier Valdivia Paíacín 161
esanguratsurik bestelako hazi-zatikietan. Ezberdintasun hauek mantendu egiten dira
aktibitatea espermatozoideen milioiekiko adierazten dugunean (4.20.) (p<0,05).
Aktibitate maila altuagoak topatu izan dira ere Prolil Endopeptidasa aktibitatea
aztertzean (4.21. irudia) nekrozoospermiadun hazi-laginen taldean,
normozoospermikoen aldean (p<0,05), baina kasu honetan, espermatozoideen mintzari
lotutako zatikian. Hemen ere, aktibitatea espermatozideen milioiekiko ematen
dugunean, ezberdintasunak mantentzen dira (p<0,05) (4.22. irudia)
EMAITZAK 161
162 Asier Valdivia Palacín D oktote-Tesia
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI
PATOLOGIKOETAN
N Aminopeptidasa (APN)
Aktibitate Espezifikoa
PATOL. SpS SpM Ls P
N 25814 ±3727 41121± 9068 107512± 14325 368120 ±91574
A 10236 ±1577 31994 ±3938 92733 ± 14399 283138 ±32434
Ne 44628 ± 5081 112748 ±24747 105020 + 11070 382482 ± 27213
AT 18045 ±5874 14376 ±2412 139289 ±23672 346508 ±59213
4.16. Taula. N aminopeptidasaren aktibitatea giza hazi patologikoen zatiki ezberdinetan.
Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak (P.A.U./ mg proteina) eta erroreak
adierazten dira (n > 10). Hazi-laginak lau talde patologikoetan banatu ziren (N =
Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne = Nekrozoospermia, AT = Asteno-
Teratozoospermia). Aztertutako lau hazi-zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria
(SpS), Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM), Likido seminala (Ls) eta
Prostasomak (P) izan dira.
162 EMAITZAK
Doktore-Tesia As ier Valdivia Palacio 163
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI
P ATOLOGIKOET AN
N Aminopeptidasa (APN)
e 300000Q.D>E 250000
SpS SpM Ls
Haziaren zatiki azpizelularrak
■ N0A□ Ne□ AT
4.16. Itudia. N aminopeptidasaren aktibitatea giza hazi patologikoetan. Lau talde
patologiko ezberdintzen dira (N = Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne =
Nekrozoospermia, AT = asteno-teratozoospermia), (talde bakoitzak n >10). Aztertutako
hazi-zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS), Espermatozoideen mintzari
lotutako zatikia (SpM), Lákido seminala (Ls) eta Prostasomak (P) izan dira. Aktibitate
espezifikoa adierazten da. ÁNOVA-ren adierazgarritasuna adierazten da (*) p< 0,05; (**)
p<0,01.
EMAITZAK 163
164 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI
PATOLOGIKOETAN
N Aminopeptidasa (APN)
Aktibitatea / Espermat. kopurua
PATOLOGIAK SpS SpM
N 17,0 ±6,16 43,4 + 9,88
A 9,70 ±3,07 39,7 ± 11,3
Ne 45,2 ± 15,4 96,9 ± 29,2
AT 2,25 ± 0,84 47,9 ±14,7
4.17. Taula. N Aminopeptidasaren aktibitatea giza hazi patologikoen zatiki zelularretan.
Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak (P.A.U./ espermatozide x 106) eta erroreak
adierazten dira (n > 10). Hazi-laginak lau talde patologikoetan banatu ziien (N =
Nortnozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne = Nekrozoospermia, AT = Asteno-
Teratozoosperinia). Aztertutako haziaren zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria
(SpS) eta Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM) dira.
164 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 165
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI
PATOLOGIKOETAN
N Aminopeptidasa (APN)
140 n
IN
El Ne
□ AT
SpS SpM
Haziaren zatiki zelularrak
4.17. Irudia. N aninopeptidasaren aktibitatea, espermatozoide kopuruaren arabera, giza
hazi patologikoetan. Lau talde patologiko ezberdintzen dira (N ~ Normozoospermia, A =
Astenozoospermia, Ne = Nekrozoospermia, AT = asteno-teratozoospermia), (talde
bakoitzak ti >10). Aztertutako hazi-zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS) eta
Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM) izan dita. Aktibitate espezifikoa
adierazten da eta ANOVA-ren adierazgarritasuna ere adierazten da (*) p< 0,05; (**)
p<0,01.
EMAITZAK 165
166 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI
PATOLOGIKOETAN
Endopeptidasa Neutroa (NEP)
Aktibitate Espezifikoa
PATOLOGIA P
N 130,1 ± 15,1
A 93,3 ± 10,4
Ne 105,2 ± 9,0
AT 120,0 ± 13,1
4.18. Taula. Endopeptidasa neutroaien aktibitatea giza hazi patologikoen prostasomen
(P) zatikian. Aktibitate espezifikoaten batezbesteko balioak (P.A.U./ mg proteina) eta
erroreak adierazten dira (n > 10). Hazi-laginak lau talde patologikoetan banatu ziren (N =
Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne = Nekrozoospermia, AT = Asteno-
T eratozoosp ermia).
166 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 167
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI
PATOLOGIKOETAN
Endopeptidasa Neutroa (NEP)
N A Ne AT
Prostasomak
4.18. Itudia. Endopeptidasa neutroaren aktibitatea giza hazi patologikoetan. Lau talde
patologiko ezberdintzen dita (N = Normozoospennia, A = Astenozoospermia, Ne ~
Nekrozoospermia, AT = Asteno-teratozoospermia), (talde bakoitzak n >10). Prostasomen
(P) zatikian aztertu izan da. Aktibitate espezifikoa adierazten da eta ANOVA-ren
adierazgamtasuna ere adierazten da (*) p< 0,05; (**) p<0,01.
EMAITZAK 167
168 Asier Valdivia Palacín Doktore-T esia
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI
PATOLOGIKOETAN
Piroglutamil Peptidasa I (PGA I)
Aktibitate Espezifikoa
PATOLOGIAK SpS SpM Ls P
N 116,7 + 12,1 256,0 ± 38,7 172,4 ±88,2 169,7± 29,7
A 149,4 ±29,2 256,7 ± 46,9 144,4 ±63,0 197,7 ±50,8
Ne 273,5 + 20,5 292,8 ±13,6 185,5 ±31,6 213,7 + 8,18
AT 139,5 ±14,3 198,9 + 54,7 119,8+47,3 117,5 ± 18,3
4.19. Taula. Pkoglutamil Peptidasa I-aten aktibitatea giza hazi patologikoen zatiki
ezberdinetan. Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak (P.A.U./ mg proteina) eta
erroreak adierazten dira (n > 10). Hazi-laginak lau talde patologikoetan banatu ziren (N =
Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne = Nekrozoo spermia, AT = Asteno-
Teratozoospermia). Aztertutako lau hazi-zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria
(SpS), Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM), Likido seminaia (Ls) eta
Pros tas omak (P) izan dira.
168 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 169
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI
PATOLOGIKOETAN
Piroglutamil Peptidasa I (PGA I)
3 5 0 -
3 0 0 -
o 2 5 0 ■ i_Q-OJE 200-
ó
100
50 ■
SpS SpM Ls P
Haziaren zatiki azpizelularrak
4.19. Irudia. Piroglutamil Peptidasa I-aren aktibitatea giza hazi patologikoetan. Lau talde
patologiko ezberdintzen dira (N = Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne =
Nekrozoospertnia, AT = asteno-teratozoospermia), (talde bakoitzak n >10). Aztertutako
hazi-zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS), Espermatozoideen mintzari
lotutako zatikia (SpM), Likido seminala (Ls) eta Prostasomak (P) izan dira. Aktibitate
espezifikoa adierazten da eta ANOVA-ren adierazgarritasuna ere adierazten da (*) P<
0,05; (**) p<0,01.
EMAITZAK 169
170 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI
PATOLOGIKOETAN
Piroglutamil Peptidasa I (PGA I)
Aktibitatea / Espermat. Kopurua
PATOLOGIAK SpS SpM
N 0,27 ± 0,0965 0,62 ± 0,0983
A 0,23 ±0,0312 0,77 ±0,1522
Ne 0,44 ± 0,0975 0,99 ±0,1789
AT 0,29 ± 0,0432 0,84 ±0,2103
4.20. Taula. Pkoglutamil Peptidasa I-aren aktibitatea giza hazi patologikoen zatiki
zelularretan. Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak (P.A.U./ espermat.ozide x 106)
eta erroreak adierazten dira (n > 10). Hazi-laginak lau talde patologikoetan baña tu ziren (N
= Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne = Nekrozoospermia, AT = Asteno-
Teratozoospermia). Aztertutako haziaren zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugatria
(SpS) eta Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM) dira.
170 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 171
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI
PATOLOGIKOETAN
Piroglutamil Peptidasa I (PGA I)
oT-x 1 .
SpS SpM
Haziaren zatiki zelularrak
■ N
0 A
0 Ne
□ AT
4.20. Irudia. Piroglutamil Peptidasa I-aren aktibitatea, espermatozide kopuruaren arabera,
gÍ2 a hazi patologikoetan. Lau talde patologiko ezberdintzen dira (N = Normozoospermia,
A = Astenozoospermia, Ne = Nekrozoospermia, AT — asteno-teratozoospermia), (talde
bakoitzak n >10). Aztertutako hazi-zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS) eta
Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia ere (SpM) izan dira. Aktibitate espezifíkoa
adierazten da eta ANOVA-ren adierazgarritasuna ere adierazten da (*) p< 0,05; (**)
p<0,01.
EMAITZAK 171
172 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI
PATOLOGIKOETAN
Prolil Endopeptidasa
Aktibitate Espezifíkoa
PATOLOGIAK SpS SpM Ls P
N 726,7 ±106,9 271,9 ±32,6 140,3 ±9,23 168,2 ± 10,6
A 1106 ±269,2 245,9 ± 26,1 139,0 ± 13,9 164,0 ± 13,2
Ne 1334 ± 120,4 395,8 ± 22,0 150,2 ± 11,7 146,5 ±17,1
AT 705,5 ± 377,9 150,3 ±67,3 122,7 ± 12,0 152,7 ±10,7
4.21. Taula. Prolil Endopeptidasaren aktibitatea giza hazi patologikoen zatiki
ezberdinetan. Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak (P.A.U./ mg proteina) eta
erroreak adierazten dira (n > 10). Hazi-laginak lau talde patologikoetan banatu ziren (N =
Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne = Nekrozoospermia, AT = Asteno-
Teratozoospermia). Aztertutako lau hazi-zadkiak, Espermatozoideen zatiki solugarria
(SpS), Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM), Likido seminala (Ls) eta
Prostasomak (P) izan dira.
172 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 173
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI
PATOLOGIKOETAN
Prolil Endopeptidasa
SpS SpM Ls
■ N
HA UNe
□ AT
Haziaren zatiki azpizelularrak
4.21. Irudia. Prolil Endopeptidasaren aktibitatea giza hazi patologikoetan. Lau talde
patologiko ezberdintzen dira (N = Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne =
Nekrozoospermia, AT = asteno-teratozoospermia), (talde bakoitzak n >10). Aztertutako
hazi-zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS), Espermatozoideen mintzari
lotutako zatikia (SpM), Likido seminala (Ls) eta Prostasomak (P) izan dira. Aktibitate
espezifikoa adierazten da eta ANOVA-ren adierazgarritasuna ere adierazten da (*) p<
0,05; (**) p<0,0l.
EMAITZAK 173
174 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI
PATOLOGIKOETAN
Prolil Endopeptidasa
Aktibitatea / Espermat. kopurua
PATOLOGIAK SpS SpM
N 0,64 ± 0,2572 0,79 ±0,1579
A 1,18 ±0,2217 0,97 ±0,1675
Ne 1,13 ±0,3707 1,46 ± 0,2437
AT 1,08 ±0,2826 0,73 ±0,1351
4.22, Taula. Prolil Endopeptidasaren aktibitatea giza hazi patologikoen zatiki zelularretan.
Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak (P.A.U./ espermatozoide x 106) eta
erroreak adierazten dira (n > 10). Hazi-laginak lau talde patologikoetan banatu ziren (N =
Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne = Nekrozoospermia, AT “ Asteno-
Teratozoospermia). Aztertutako lau hazi-zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria
(SpS) eta Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM) dka.
174 EMAIT2AK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 175
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI
PATOLOGIKOETAN
Prolil Endopeptidasa
*
SpS SpM
Haziaren zatiki zelularrak
■ N
EA□ Ne
□ AT
4.22. itudia. Prolil Endopeptidasaren aktibitatea, espermatozoide kopuruaren atabera
(aktibitatea / espermatozoide milioiak), giza hazi patologikoetan. Lau talde patologiko
ezberdintzen dira (N = Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne =
Nekrozoospetmia, AT = asteno-teratozoospermia), (talde bakoitzak n >10), Aztertutako
hazi-zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS) eta Espermatozoideen mintzari
lotutako zatikia (SpM) dira. Aktibitate espeziñkoa adierazten da eta ANOVA-ren
adierazgarritasuna ere adierazten da (*) p< 0,05; (**) p<0,01.
EMAITZAK 175
176 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
176 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 177
4.4. AKTIBITATE PEPTIDASIKOA ETA
HAZIAREN PARAMETRO EZBERDINAK
Korrelazioak
ANOVA eta hipotesi-kontrasteaz gain, interesgarria zen, nolabaiteko korrelazio
matematikorik ote zegoen, aktibitate ezberdinen eta seminogramaren parametro
ezbedinen artean, frogatzea. Honela, zenbait korrespondentzia topatu ziren, zatiki
ezberdinetako (Espermatozoideen zatiki solugarria, Espermatozoideen mintzari
lotutako zatikia, Likido seminala eta Prostasomak) aktibitateen balioen eta hazi-
parametro ezberdinen artean.
Aztertutako hazi-neurri edo parametroak hiru kontzeptu nagusiri so egiten
zieten. Aide batetik, mugikortasuna islatzen duten zenbait parametro harremandu
ziren, hala ñola, A motako espermatozoideen portzentaia lagin bakoitzean (A mota %),
B motako espermatozoideen portzentaia (B mota %), bi hauen arteko batura (A+B %),
Espermatozoide mugikor baina progresibitaterik gabekoen portzentaia (C mota %),
mugikortasunik gabeko espermatozoideen portzentaia (D mota %), eta bi hauen arteko
batura (C+D mota %). Bestalde, lagin bakoitzeko espermatozoideen
bideragarritasunarekin korrelazioa bilatu zen, nekrozoospermiaren balorazioaren bidez
(Hildakoak %). Azkenik, espermatozoideen kontzentrazio a (Sperm/ml) eta aktibitate
peptidasikoak harremandu ziren.
N aminopeptidasaren (ApN) kasuan, ez zen inolako korrelaziorik behatu Likido
Seminalean (Ls) jasotako aktibitate-balioen eta haziaren parametroen artean. Bestelako
zatikietan, ordea, zenbait parametrorekin korrelazio adierazgarria behatu zen. C+D
taldearekin, Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS) eta mintzari lotutakoa (SpM) eta
EMAITZAK 177
178 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
Prostasomak (P), korrelazio negatibo adierazgarria (p<0,01) eman zuten. D motako
espermatozoideen portzentaiak ere, aurreko zatikiekin korrelazio negatibo
adierazgarria (p<0,05) izan zuen. SpS eta SpM zatikien aktibitate balioak eta hildako
espermatozoideen portzentaiak korrelazio positibo adierazgarria azaltzen zuten
(p<0,01). Gauza bera gertatzen zen, bi zatiki hauen eta espematozoideen
kontzentrazio aren balioen artean (p<0,01 etap<0,05) (4.23. Taula)
Endopeptidasa neutroaren aktibitate-balioek (Prostasometan soilik) ez zuten
inolako korrelazio adierazgarririk azaltzen aztertutako neurri seminologikoekin (4.24.
Taula).
Pirglutamil peptidasa I-aren kasuan, soilik espermatozoideen zatiki solugarrian
(SpS) behatu izan dira korrelazio adierazgarriak. Hauek, hildako espermatozoideen
portzentaiarekin positiboak izan dira (p<0,01) eta C+D motatakoen portzentaiarekin
eta espermatozoideen kontzentrazioarekin negatiboak (p<0,01) (4.25. Taula).
Prolil Endopeptidasaren kasuan, korrelazio negatibo adierazgarria (p<0,05)
behatu izan da B motako espermatozoideen portzentaiaren artean eta SpM zatikiko
aktibitate-balioen artean. A+B baturaren portzentaiaren eta aktibitate-balioen arteko
korrelazio positibo adierazgarria (p<0,05) behatu izan da P zatikian (4.26. Taula).
178 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 179
EMAITZAK 179
180 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA ETA HAZIAREN
PARAMETRO EZBERDINAK
N Aminopeptidasa (APN)
korrelazioaSpS SpM Ls P
A mota % Pearson -0,016 -0,012 0,067 0,079adieraz. 0,903 0,926 0,572 0,520
B mota % Pearson 0,028 0,010 0,075 0,089adieraz. 0,830 0,936 0,530 0,470
A + B % Pearsonadieraz.
0,0290,823
-0,0030,980
0,0910,442
0,1070,383
C mota %Pearsonadieraz.
-0,2430,064
-0,1830,157
0,1180,323
-0,1990,106
D mota %Pearson -0,326* -0,278* -0,197 -0,239*adieraz. 0,011 0,029 0,096 0,049
C + D % Pearsonadieraz.
-0,417**0,001
-0,342**0,007
-0,1080,366
-0,321**0,008
Hildakoak %Pearson 0,461** 0,339** -0,061 0,165adieraz. < 0,001 0,007 0,609 0,178
Sperm/ml Pearson -0,390** -0,283* 0,093 -0,132adieraz. 0,002 0,026 0,432 0,282
4.23. Taula. N aminopeptidasaren aktibitatea eta zenbait parametro seminalen arteko
korrelazioa. Mugikortasuna (A mota%, B mota%, A+B%, C mota%, D mota%, C+D
mota%), Bideragarrítasuna (HiIdakoak%) eta espermatozoide-kontzentrazioa (Sperm/mi),
haziaren zatiki ezberdinekin eriazionatu dira (Sps = Espermatozoideen zatiki solugarria;
SpM = Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia; Ls - Likido seminala; P =
Prostasomak). Korrelazioen adierazgarritasun estatistikoa * (p<0,05) eta ** (p<0,0l)
ikurren bidez adierazi da.
180 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 181
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA ETA HAZIAREN
PARAMETRO EZBERDINAK
Endopeptidasa Neutroa (NEP)
korrelazioaP
A mota % Pearsonadieraz.
0,0780,521
B mota % Pearsonadieraz.
-0,1250,305
A + B % Pearsonadieraz.
-0,0320,795
C mota % Pearsonadieraz.
-0,1440,239
D mota % Pearsonadieraz.
-0,0430,724
C + D % Pearson 0,05adieraz. 0,861
Hildakoak % Pearsonadieraz.
-0,1450,240
Sperm/ml Pearsonadieraz.
-0,0100,935
4.24. Taula. Endopeptidasa neutroaren aktibitatea eta zenbait paramétra seminalen
arteko kortelazioa. Mugikortasuna (A mota%, B mota%, A+B%, C mota%, D mota%,
C+D mota%), Bideragarntasuna (Hildakoak%) eta espermatozoide-kontzentrazioa
(Sperm/ml), haziaten zatiki ezberdinekin erlazionatu dira (Sps = Espermatozoideen zatiki
solugarria; SpM = Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia; Ls = Likido seminala; P =
Prostasomak). Korrclazioen adierazgarritasun estatistikoa * (p<0,05) eta ** (p<0,01)
ikurren bidez adierazi da.
EMAITZAK 181
182 Asier Valdivia Palacín Doktote-T esia
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA ETA HAZIAREN
PARAMETRO EZBERDINAK
Piroglutamil Peptidasa I (PGA I)
korrelazioaSpS SpM Ls P
A mota % Pearsonadieraz.
-0,0150,931
-0,0350,810
0,1120,400
0,0060,967
B mota % Pearsonadieraz.
0,0810,639
-0,0230,875
0,1290,329
0,2210,096
A + B %Pearsonadieraz.
0,0360,835
-0,0390,788
0,1520,252
0,1270,341
C mota % Pearsonadieraz.
-0,1430,412
0,0410,777
-0,1500,260
-0,0890,509
D mota %Pearsonadieraz.
-0,2850,092
-0,2320,105
-0,1120,399
-0,1840,167
C + D % Pearsonadieraz.
-0,368*0,030
-0,2050,154
-0,1940,146
-0,2180,104
Hildakoak % Pearsonadieraz.
0,458**0,005
0,2640,064
0,1550,242
0,1770,184
Sperm/ml Pearsonadieraz.
-0,353*0,035
-0,1820,205
-0,1250,346
-0,1190,373
4.25. Taula. Pkoglutamil peptidasa I-aren aktibitatea eta zenbait parametro seminalen
arteko kortelazioa. Mugikoitasuna (A mota%, B mota%, A+B%, C mota%, D mota%,
C+D mota%), Bideragarritasuna (Hildakoak%) eta espermatozoide-kontzentrazioa
(Sperm/ml), haziaren zatiki ezberdinekin erlazionatu dita (Sps = Espermatozoideen zatiki
solugarria; SpM = Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia; Ls = Likido seminala; P =
Prostasomak). Kotrelazioen adierazgarritasun estatistikoa * (p<0,05) eta ** (p<0,01)
ikurren bidez adietazi da.
182 EMAITZAK
Doktoie-Tesia Asier Valdivia Palacín 183
AKTIBITATE PEPTIDASIKOA ETA HAZIAREN
PARAMETRO EZBERDINAK
Prolil Endopeptidasa
korrelazioaSpS SpM Ls P
A mota % Pearson -0,069 0,056 0,009 0,201adieraz. 0,666 0,714 0,946 0,103
B mota % Pearson 0,070 -0,304* 0,084 0,203adieraz. 0,659 0,042 0,504 0,099
A + B % Pearson -0,014 -0,129 0,054 0,263*adieraz. 0,929 0,399 0,670 0,032
C mota % Pearson -0,031 0,072 -0,091 0,009adieraz. 0,847 0,639 0,473 0,945
D mota % Pearson -0,183 -0,176 0,010 -0,103adieraz. 0,247 0,248 0,934 0,406
C + D % Pearson -0,204 -0,098 -0,054 -0,097adieraz. 0,201 0,523 0,667 0,437
Hildakoak % Pearson 0,023 0,289 0,099 -0,157adieraz. 0,139 0,054 0,427 0,206
Sperm/ml Pearson -0,058 -0,033 0,033 0,076adieraz. 0,717 0,829 0,795 0,541
4.26. Taula. Prolil endopeptidasaren aktibitatea eta zenbait parametro seminalen arteko
korrelazioa. Mugikortasuna (A mota%, B tnota%, A+B%, C mota%, D mota%, C+D
mota%), Bideragarritasuna (Hildakoak%) eta espermatozoide-kontzentrazioa (Sperm/ml),
haziaren zatiki ezberdinekin eriazionatu dira (Sps = Espermatozoideen zatiki solugarria;
SpM = Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia; Ls = Likido seminala; P =
Prostasomak). Korrelazioen adierazgarritasun estatistikoa * (p<0,05) eta ** (p<0,01)
ikurren bidez adierazi da.
EMAITZAK 183
184 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
184 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 185
4.5. ZATIKIENISOLAMENDUAREN
DOITASUNA. LAKTATO
DESHIDROGENASA
Haziaren zatiki azpizelularren isolamendua modu egokian egiten genuela
behatzeko, markatzaile entzimatiko baten bidez, zatiki ezberdinen purutasuna frogatu
genuen. Honetarako, Laktato Deshidrogenasa (LDH) entzima solugama erabili
genuen. Entzima honek, batez ere kokapen zitosolikoa du. Honela, zatikien lorpen
prozesua egokia izanda, ez genuke, Prostasomen (P) zatikian ezta esparmotozoideen
mintzari lotutako zatikian (SpM), aktibitate adierazgarririk behatu behar. Era berean,
zelularen metabolismo energetikoaren entzimetako bat izanik, bere agerpena haziaren
Likidoan (Ls) ez luke oso garrantzitsua izan behar. Espero den aktibitaterik nagusiena,
espermatozoideen zatiki solugarrian behatu beharko genuke.
Lortutako emaitzek, esperotakoarekin bat datoz. LDH aktibitatearen maila
altuenak espermatozoideen zatiki solugarrian (SpS) behatu ziren, zatiki honen
edukinaren jatorri nagusia zitosolikoa bait da. Bestelako zatikietan behatutako LDH
aktibitateak 20 bat aldiz txikiagoak izaten dira (4.27. Taula eta Irudia).
(OHARRA: Hemendik aurrera, irudien numerazioa ez du aurreko irudiekin ondoz-
ondoktasuna errespetatzen. Taulen numerazio bera eman zaie, ulergarritasuna eta
Taula/Irudi koherentzia mantentzearren)
EMAITZAK 185
186 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
ZATIKIEN ISOLAMENDUAREN DOITASUNA
Laktato Deshidrogenasa (LDH)
Zatikiak aktibitatea ehunekotan (%)
SpS 100 ±5,3
SpM 4,64 ± 1,2
Ls 6,2 ± 2,5
P 2,2 ± 0,94
4.27. Taula. Laktato Deshidrogenasaren aktibitatea ehunekotan hazi-zatiki ezberdinetan.
Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS), Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia
(SpM), Likido seminaia (Ls) eta Prostasomak (P) dira, (n = 10)
186 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 187
ZATIKIEN ISOLAMENDUAREN DOITASUNA
Laktato Deshidrogenasa (LDH)
COa>ra15+-<
<
SpM Ls
Hazi-zatikiak
4.27. Irudia. Laktato Deshidtogenasaren aktibitatea ehunekotan hazi-zatiki ezberdinetati.
Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS), Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia
(SpM), Likido seminala (Ls) eta Prostasomak (P) dira. (N “ 10)
EMAITZAK 187
188 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
188 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 189
4.6. IKERTUTAKO PEPTIDASEN
BANAKETA HAZI-ZATIKIEZBERDINETAN
Lan honetan ikertutako aktibitate peptidasikoak ez dira homogeneoki hazian
banatzen. Haziaren osagai nagusi ezberdinetan, aktibitate batzuk, besteak baino
adierazgarriagoak izaten dira.
Orohar, aktibitate mailarik altuenak aurkezten dituen zatikia Prostasomena (P)
da entzefalinen anderatzaileentzat (APN eta NEP) (4.28. taula). Bestalde,
Espermatozoideen zatiki solugarria, Prolil Endopeptidasaren kasuan besterik ez da
gailentzen bestelako aktibitateekin konparatuz (4.28. d irudia).
Aipagarriena, Endopeptidasa Neutroaren (NEP) aktibitatea bakarrik
prostasometan behatzen déla izaten da.
EMAITZAK 189
190 Asier Valdivia Palacín Doktore-T esia
IKERTUTAKO PEPTIDASEN BANAKETA
HAZIAREN ZATIKIETAN
ZatikiakAktibitate Entzimatikoaren Portzentaia (%)
APN NEP PGA / PEP
SpS 7 0 16 55
SpM 9 0 36 21
Ls 18 0 24 11
P 66 100 24 13
4.28. Taula. N aminopeptidasa (APN), Endopeptidasa Neutroa (NEP), Piroglutamil
Peptidasa I (PGA I) eta Prolil Endopeptidasa (PEP) entzimen aktibitateak ehunekotan
hazi-zatiki ezberdinetan. Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS), Espermatozoideen
mintzari lotutako zatikia (SpM), Likido seminala (Ls) eta Prostasomak (P) dira, (n = 10)
190 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 191
IKERTUTAKO PEPTIDASEN BANAKETA
HAZIAREN ZATIKIETAN
b) Zatikiak NB=>
c) Zatikiak PGA I d ) Zatikiak FEP
4.28. Itudia. a) N aminopeptidasa (APN), b) Endopeptidasa Neutroa (NEP),.c)
Piroglutamil Peptidasa I (PGA I) eta d) Piolil Endopeptidasa (PEP) entzimen aktibitateak
ehunekotan hazi-zatiki ezberdinetan. Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS),
Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM), Likido seminala (Ls) eta Prostasomak
(P) dira, (n = 10)
EMAITZAK 191
192 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia
192 EMAITZAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 193
EZTABAIDA
EZTABAIDA 193
194 Asier Valdivia Doktore-Tesia
194 EZTABAIDA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 195
5. EZTABAIDA
Gizonezkoen ugalkortasunaren físiologiaren ezagutzan oraindik hutsune ugari
dago betetzeko. Hauen bamean gertatzen diren prozesu ugariren erregulazioaren
elementuak eta euren garrantzia zehazteke diraute. Hala ñola, giza hazian, biopeptido
erregulatzaile mota ezberdinen eta hauen funtzio eta efektu posibleen berri eman den
arren, hauei lotutako beste elementuei buruz oraindik ikertzeko dago. Honela,
peptidoen hartzaileak eta peptidoen anderakutza, eta beraz ekintza, eraentzen dituzten
peptidasen ikerkuntza, interesgarria gerta daiteke ugalkortasunaren prozesu askoren
en-egulazioa ulertzeko.
Helburuetan komentatu genuen bezala, Doktore-Tesi hau atal nagusi bi ditu.
Lehenik eta behin, giza haziko aktibitate peptidasikoen identifikazioa, deskribapena eta
konparaketa egitearena. Bigarren atal batean, hazi-patologia ezberdinak peptidasen
aktibitate hauekin harremanik baduten behatuko da.
5.1. GIZA HAZIKO PEPTIDASAK
Atal honetan, haziko aktibitate peptidasikoen identifikazioa eta deskribapena
egin genuen. Badira gure aurretik peptidasa ezberdinak, gizakiaren eta bestelako
espezieen hazian deskribatu dituzten lanak. Hala ñola, Dipeptidil Peptidasa II (Gossrau
eta Lodja, 1980) eta IV (Vanhoof eta lank., 1992; Wilson eta lank., 1998) deskribatu
izan dira ugaztunetan. AEB/ACE (Hohlbrugger eta lank., 1982), NEP edo
Endopeptidasa neutroa (Erdos eta lank., 1985), Prolil endopeptidasa eta Piroglutamil
peptidasa (Siviter eta Cockle, 1995), N aminopeptidasa (Arienti eta lank., 1997b) etc.
Haziaren fisiologian izan duten garrantzia déla eta, Doktore-Tesi honetan, TRH
hormona eta analogoen (FPP) anderakuntza eta Entzefalinen anderakuntza burutzen
zuten peptidasak aztertzea erabaki genuen. Honetarako, biopeptido hauek apurtzen
EZTABAIDA 195
196 Asier Valdivia Doktore-Tesia
dituzten peptidasak susbstantzia gehigarrien bidez eta inhibitzaile espezifikoen bidez
ezberdindu ziren.
S .l.l. ENTZEFALINEN PEPTIDASA ANDERATZAILEEN
BEREIZKETA
Entzefalinen anderakuntzan diharduten bide entzimatiko nagusiak bi dira:
Endopeptidasa Neutroak (NEP, EC 3.4.24.11), Entzefalinasa izenaz ere ezaguna dena
(Hersh, 1982), burutzen dueña eta Aminopeptídasek burutzen dutena. Azken hauen
barruan bi entzima dira entzefalinengatik afmitate altua dutenak, hala ñola,
puromizinarekiko Sentikorra den Alanil aminopeptidasa (PSA, EC 3.4.11.14) eta N
Aminopeptidasa (APN, EC 3.4.11.2.).
Angiotensina I-aren Entzima Bihurtzaileak (AEB/ACE, 3.4.15.2) entzefalinak
apurtzeko gaitasuna duen arren, hauengatik duen afmitatea txikia da.
Puromizina erabiltzen denean, PSA eta APN-ren aktibitateak bereizteko,
antzeko inhibizio-profíla behatzen da haziaren zatiki guztietan, bai solugarrietan bai
mintzari lotutakoetan. Profil hau bestelako ehunetan behatutako APN-aren profilaren
antzekoa da (Huang eta lank., 1997; Solhone eta lank., 1987). Aurkikuntza honek
hazian neurtutako aktibitatea APN-ri zor zaiola iradokitzen du, aktibitatea soilik
kontzentrazio altuentan inhibitze baita,
Gainera, sulfhidrilo-gehiagarriak, merkaptoetanol eta DTT-aren modukoak,
PSA aktibatzen dute baina ez APN. DTT-arekin entseiua burutu zenean, ez zen inolako
efekturik behatu Ala-p-naftilamidaren degradazioan, haziaren homogenatuetan. Honek,
berriz ere, Ala-p-naftilamidaren degradazioa hazian burutzen duen entzima APN déla
eta ez PSA.
Honen aldeko beste nabaritasuna leuhistina inhibitzailearen eragina da.
Leuhistinak, kontzentrazio baxuetan, PSA eta APN-ren inhibitzaile espezifiko bezala
196 EZTABAIDA
Doktore-T esia Asiei Valdivia Palacín 197
eragiten du, bestelako aminopeptidasen aktibitatetan inolako eraginik sortu gabe.
Berriz ere, inhibitzaile honekin lortutako datuek behatutako aktibitatea APN-ri
dagokiola adierazten digute.
Giza haziak aminopeptidasa aktibitate altuak erakusten ditu, hauek batez ere
prostasometan kokatzen direlarik. Aktibitate altu honek, entzimaren kontzentrazio
altuarekin harremana izan dezake, APN-a hazi-plasmako proteina guztien ehuneko 0,5-
1-a izan daitekela esaten duten ikerketekin bat eginik (Huang eta lank., 1997).
Bestalde, ikerketa honetan adierazten ditugun espermatozoideen gainazaleko
APN-ren aktibitate balioak, bertan APN-ren aktibitaterik ez dagoela adierazten duten
bestelako ikerketei (Arienti eta lank., 1997b) kontrajartzen zaizkie. Ikerketa horiek
esaten dutenez, espermatozoideek gainazalean adierazten duten APN aktibitatea,
prostasomak espermatozoideekin fuisonatzean (emakumearen ugal-traktuan edota pH
arinki azidoan) bereganatutakoa izango litzateke, baina gure esperimentuak
ejakulatutako haziarekin, prostasomekin fusionatu aurretik, burutu izan dira,
espermatozoideen mintzean azaltzen den APN aktibitatea beste jatorri batekoa izan
behar duela iradokiz. Aipatutako lanean erabilitako teknika espektrofotometrikoa, guk
erabilitako fluorimetrikoa baino sentikortasun gutxiagokoa izatea, izan daiteke lan
horretan APN aktibitaterik ez antzematearen arrazoia.
APN mintzeko entzimatzat hartzen den arren, hau hazi-likidoan azaltzea ez da
ustekabekoa. Izan ere, deskribatu izan da, bestelako mintzari lotutako entzima batzuk,
hala nola, Dipeptidil peptidasa IV (DPP IV) (Ohkubo eta lank., 1994) eta
Angiotentsinaren Entzima Bihurtzailea (AEB/ACE) (Hooper eta lank., 1997), bikapa
lipidikotik erauziak edo askatuak izaten direla, proteolisi-mekanismoen bidez. Hauxe
izaten da APN-ren kasua, papainaren bidez (Louvard eta lank., 1975) eta proteina
sekretasa (Hooper eta lank., 1997) baten bidez mintzetik erauzia izaten dena. APN-a
zitosolean agertzea harrigarria denez, lehen aldiz lan honetan izan baita deskribatua,
zatiki honetako aktibitatea kutsadura kontu bat dela pentsa daiteke. Haña ere, LDH-
arekin lortutako zatikien purutasun datuek eta erabilitako laginen prozesamendurako
jarraitutako protokolo zorrotzak ez dute kutsaduraren aldeko arrazoirik ekartzen.
EZTABAIDA 197
198 Asier Valdivia Doktore-T esia
Endopeptidasa Neutro aren, entzefalinen hidrolisia aztertzeko DAGNPG
sustratoa erabili zen Florentin eta lankideek (1984) deskribatu zuten metodoan
oinarrituta.
DAGNPG-ren aktibitate degradatzailea haziaren zatiki ezberdinetan
aztertzerakoan, bakarrik prostasomen zatikietara mugatzen zela ikusi genuen. Zatiki
hone tan aktibitate honen maila altuak jaso ziren; garunetako homogenatuekin
konparatuta 18 aldiz altuagoak. AEB/ACE-a giza hazian egoteagatik (Vanha-Perttula
eta lank., 1985) eta entzima honek DAGNPG substratoa degradatzeko duen gaitasuna
delà eta, Kaptopril izeneko AEB-ren inhibitzailearekin saioak egin ziren. Dakigunez,
AEB-k DAGNPG degradatzeko gai da, baina maila baxuagoan (Heder eta lank., 1988).
Kaptoprilaren bidez AEB-ri sor zaion aktibitatea desagertarazi egingo dugu. Saioak
egin ondoren, Kaptoprilaren 500 nM-eko kontzentrazioa erabiltzea erabaki genuen.
Kontzentrazio baxuegoekin ere, ikus daitekenez, aktibitatea egonkortu egiten da, baina
horiek ez dira kontzentrazio praktikoak, erabilitako buffer kantitateak prestatzeko.
Azkenik, NEP-en inhibitzaile espezifikoak, tiorfan eta fosforamidon erabili
ziren eta lortutako emaitzek, entzima hau egiten zuten DAGNPG-ren anderakuntzaren
erantzule nagusia.
Laburbilduz, entzefalinen anderakuntzan diharduten peptidasen aktibitate altuak
behatu dira, prostasomen zatikia aktiboena izanik. Lortutako datuak, aktibitate hura
APN-ri eta NEP-i zor zaiela ematen du. NEP-entzat lortutako emaitzak lehenengo aldiz
erakusten dute aktibitate hau prostasomen zatikian. Gainera NEP eta APN-ren maila
altuak, hazia, entzima hauen purifikaziorako ehun aproposa izan daitekela iradokitzen
dute. Honen adibidea DPP IV entzima da, proteina hau giza prostasometan isolatu izan
da, bi purifikazio-urratsetan, aktibitatearen berreskurapen altuarekin.
Azkenik, aztertutako entzimak erakusten dituzten aktibitate-maila altuak, eta
altuenak prostasomen zatikian izanda, besikula hauek espermatozoideen
mugikortasunean, haziaren urtzean, inmunosupresioan, kapazitazioan... eta antzeko
198 EZTABAIDA
Doktore-T esia Asier Valdivia Palacín 195
prozesuetan parte hartzen dutela kontutan hartuz, peptidasak prozesu hauetan guztictan
nolabaiteko zeregina izan ditzaketela pentsa daiteke. Are gehiago. entzima hauek
peptidoen anderakuntzan, mintzeko ektopeptidasa moduan, edota atxekidurarako
proteina moduan (CD13 eta CD 10), partehartzen dutela kontutan izaten badugu. Beraz,
peptidasa hauen funtzioak argituak izaten diren heinean, prostasomen zeregina
ugaikuntzan hobeto ulertuko da.
5.1.2. TRH HORMONA ETA ANALOGOAK
ANDERATZEN DITUZTEN PEPTIDASEN BEREIZKETA
Hiru dira TRH-a anderatzen duten peptidasa nagusiak. Horietako bi
aminopeptidasak dira; hala ñola, Piroglutamil Peptidasa I eta H (PGA I eta II). Bestea,
Prolil Endopeptidasa dugu. FPP-ren kasuan, PGA II ez da gai sustrato hau
hidrolizatzeko.
Entzima hauen saioek DTT-ren presentzian, hazian dagoen Piroglutamil
Peptidasa (PGA); I motakoa déla zehazten digute, DTT-a PGAI-en aktibatzailea baina
PGA H-aren inhibitzailea (O’Cuinn eta Iank., 1990). Emaitza hau, PGAI-k FPP-a
(Fertilization Promoting Peptide), TRH hormonaren haziko peptido analogo ugariena,
anderatzeko gai izatearen datuarekin bat dator. Alderantziz, PGA Il-k ezin izaten du
peptido honen anderatzea burutu, pGlu-His lotura soiiik hidrolizatzeko gai izategatik,
eta FPPak pGlu-Glu lotura du. Honetaz gain, TRH eta FPP-aren anderatzea DTT-aren
bidez azkartzen déla deskribatu izan da (Cockle eta Iank., 1994), PGA I hazian dagoela
berretsiz.
Piroglutamil Peptidasa I (PGA I) entzima kokapen zitosolikoa du ehun
gehienetan (O’Cuinn eta Iank., 1990; Yoshimoto eta Iank., 1979), “mintzari elkartua”
bezala ere deskribatu izan delarik (Yoshimoto eta Iank., 1979). Ikerketa honetan
entzima honen aktibitatea haziaren zatiki ezberdinetan ikasi dugu. Bitxia gertatzen da,
entzima honen aktibitate-mailarik altuenak haziaren zatiki mintzakaretan agertzea
(espermatozoideen mintzetan eta prostasometan). Emaitza hau ez dirudi entzima
EZTABAIDA 199
200 Asier Valdivia Doktore-Tesia
zitosolikoen kutsadura bati zor zaionik, LDH entzima markatzaile zitosolikoaren
aktibitate balio baxuak lortzen baitira haziaren mintzazko zatikietan (%4,5 eta %2,2
espermatozoideen mintzen zatikian eta prostasometan hurrenez hurren). Emaitza
hauek, mintzari elkartutako Piroglutamil Peptidasa I, ugalkutzaren fisiologian ala
patologian zeregin garrantzitsuren bat izan dezakela pentsarazten digute. Prostasomak
haziaren parte diren zelula kanpoko organuluak dira. Prostasometan eta
espermatozoideen mintzatan izateagatik, Piroglutamil Peptidasa I, hazi-likidoan
jariatutako TRH, FPP eta bestelako peptido analogoen aktibitatea, euren hidrolisiaren
bidez erregulatuz ekin dezakela ematen du, eta beraz, kapazitazioa bezalako prozesu
físiologikoak modulatuz (Fraser eta lank., 1997; Green eta lank., 1996).
Prolil Endopeptidasa entzimak nagusiki kokapen zitosolikoa dauka ehun
gehienetan (Cunningham eta O’Connor, 1997). Hauxe ere giza haziarentzat betetzen
déla dirudi, ehun honetan entzima honen aktibitate-maila altuena espermatozoideen
zatiki solugarrian jasotzen baita. Honela, enzima honek izango duen betebeharra maila
intrazelularrekoa izango da bereziki, espermatozoide-zeluletan. Hala ere, entzima
hoñen aktibitatea, bestelako zatikietan ere behatu izan denez, entzima honek likido
seminaleko peptido bioaktiboen anderakuntzan parte har dezakela, esan nahi du
(Siviter and Cockle, 1995).
200 EZTABAIDA
Doktore-Tesía Asier Valdivia Palacín 201
5.1.3. PEPTIDASAK. EHUNEN ARTEKO
KONPARAKETA
Arratoi ehunak. giza hazíarekin konparatu ditugu. Bcasitako peptidasak zabalki
izan dira deskribatuak ugaztunen ehun anitzetan (Jardinaud eta lank., 2004; Irazusta eta
lank., 2002; Rosenblum eta Kozarich, 2003; Awade eta lank., 1997). Interesgarria
diradi ehunen arteko konparaketa, giza haziarekin batera egitea.
Ikasi izan ditugun aktibitateetan, prolil endopeptidas arena izan ezik, hazian
lortutako aktibitate mailak altuenak edo altuenetakoak izan dira. Gehienetan ere,
giltzummean behatutako balioak, haziaren parekoak izaten dira, edo behintzat gertutik
jarraitzen diete. Giltzumma eta ugal-aparatua jatorri mesodermikoa izatea, izan daiteke
antzekotasun honen azalpen posible bat.
Honela, aminopeptidasek eta NEP-ek azaltzen dituzten aktibitate-maila altuek,
haziaren prozesu fisiologikoetan izan ditzaketen garrantziaren berri emango lekiguke.
ApN eta NEP-en kasuan, beste ikerketa batzutan hazian deskribatu izan dituzten
peptido opioideen maila altuak, hala ñola, entzefalinak (Fabri eta lank., 1989) eta (3-
endorfina (Davidson eta lank., 1989), peptidasa hauen mail a altuekin bat egiten dute.
Hau guztia, berriki ugaztunetan topatu izan diren m motako hartzaile opioidearen
aurkikuntzarekin batera, haziaren fisiologian nolabaiteko erregulazio opioidea
badagoela iradokitzen du.
Bestalde, giltzummean peptido erregulatzaile ugarik egiten dute euren funtzioa,
hala ñola, angiotensina, bradikinina, basopresina,... Hortaz, bertan peptido hauen
ekintzaren elementu erregulatzaile nagusiak, peptidasak, maila altuetan behatzea
logikoa dirudi.
EZTABAIDA 201
202 Asier Valdivia Doktore-T esia
202 EZTABAIDA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 203
5.2. GIZA HAZIAREN PATOLOGIAK ETA
PEPTIDASEN AKTIBITATEAK
Atal honetan, hazi lagin patologikoen zatiki ezberdinetan (espermazoideen
zatiki solugarria, espermatozoideen mintza, likido seminala eta prostasomak) aztertu
izan dira. Kontutan - izan diren hazi-patologiak espermatozoideen
bideragarritasunarekin, mugikortasunarekin eta morfologiarekin daude harremanean.
Lehenengo biak izaten dira, batez ere, peptido bioaktiboen sistemen bidez nolabaiteko
eraenketa fisiologikoa jasan dezaketen egoerak. Morfologian ere, espermatogenesiaren
prozesua ezaugarri honekin harreman zuzenean egonik eta espermatogenesian edota
heltzean, eta hau burutzen dituzten eremu histologikoetan entzefalinak (eta euren
peptidasak) zerikusia dutela ikusi denez (Kilpatrick eta lank., 1987; Mehta eta lank.,
1994; Garret eta lank,, 1990; Monsees eta lank., 1998; Osada eta lank., 2001),
nolabaiteko garrantzia izan dezaketela planteatu daiteke,
5.2.1. ENTZEFALINEN ENTZIMA ANDERATZAILEAK
ETA HAZI-PATOLOGIAK
APN-ren aktibitate handiagoa behatu izan da Nekrozoospermikoen (Ne)
espermatozoideen zatiki solugarri eta mintzari lotutakoan, Normozoospermikoetan (N)
lortutako balioen aldean. Are gehiago, APN-ren aktibitateak, zatiki solugarrian nahiz
espermatozoidearen mintzean, espermatozoide hilen ehunekoarekin korrelazio
adierazgarria zuela (Aldagai biko korrelazioen analisia) behatu da, nekrozoospermiak
eta N aminopeptidasaren aktibitateak zerikusia dutela esaten digularik. Peptidasen
aktibitate altuak eta heriotz zelularra beste ehunetan ere deskribatua izan da. Honela,
aminopeptidasen inhibitzaile espezifikoen emateak, zelulak heriotzetik babesten dituela
ikusi izan da (Shishido eta lank., 1999), eta muridoen prolil endopeptidasaren maila
altua adierazten duten T zelulek, aktibazioaren bidez eragindako heriotz zelularrerako
EZTABAIDA 203
204 Asier Valdivia Doktore-Tesia
sentikorragoak dira (Odaka eta lank., 2002). APN-ren espresioa gehitua ikusi izan da
neutrofilo apoptotikoetan, eta ektoproteasen aktibitateak handiagoak izaten ohi dira
HeLa zelula apoptotikoetan, alderantziz, zelula bideragarrietan aldaketa txikiagoak
ikusten diren bitartean (Piva eta lank., 2000). Hala eta guztiz ere, oraindik ez da jakina
APN-ren aktibitate-raaila handiak eta nekrozoospermiaren arteko harremana zergatia
ala ondoriokoa ote den.
Heriotz zelularrerako sentikortasuna eta aminopeptidasa aktibitate altuak, hauek
entzefalinen hidrolisiarekin erlazionatu behar dira, ehun eta Ierro zelular ezberdinetan,
entzefalinak eta bestelako opioideak zelulen superbizipena handitzen dutelako eta
nekrosia eta apoptosiaren aurrean babesten dituztelako (Hayashi eta lank., 2002).
Honela, hazi nekrozoospermikoen espermatozoideen zatiki solugarrian eta mintzari
lotutakoan behatutako APN-ren aktibitate-maila altuak, entzefalinen maila baxuen
arduradunak izango dira, eta ondorioz, espermatozoideak heriotz zelularrerako
sentikorragoak izango dira. Hala eta guztiz ere, bestelako ikerketa batzuk babesaren
zeregina egokitzen diete peptidasei. Esate baterako, linfozito eta neutrofiloetan peptido
opioideak apoptosia errazten dute (Singhal eta lank., 2001; Sulowska eta lank., 2003),
eta aminopeptidasa zitosolikoak zelularen bideragarritasuna mantentzeko
ezinbestekoak omen direla ere deskribatu da (Constam eta lank. 1995). Era berean, N
aminopeptidasa maila altuak azaltzen dituzten zelula leukemikoak apoptosiaren
aurreko babesa izaten dute (Mishima eta lank., 2002), eta aminopeptidasen
inhibitzaileak apoptosia eragiten dute zelula tumoraletan (Sekine eta lank., 2001).
N Aminopeptidasaren maila baxuagoak behatu izan ziren hazi
asienozoospermikoetan (A) ezberdintasun hauek espermatozoideen zatiki solugarrrian
adierazgarriak gertetzen zirelarik. Honekin hatera, korrelazio negatibo adierazgarria
antzeman zen APN-ren aktibitatea eta espermatozoide ez-mugikorren (D eredukoak)
ehunekoaren artean, prostasomen zatikian, N aminopeptidasa eta mugikortasunaren
arteko harremana badagoela adierazten dueña. Honekin lotuta, prostasomak isuritako
espermatozideen mugikortasunaren eragileak direla deskribatu izan da (Carlsson eta
lank., 1997). Are gehiago, APN prostasometatik espermatozoideen mintzara
transferitua izaten déla deskribatu izan da, espermatozoiden ezaugarri biologikoak
204 EZTABAIDA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 205
aldatzearren (Axienti eta lank., 1997). APN-ren aktibitate baxuak motilitate gutxiko
hazi-laginetan, bere prostasometako aktibitate altuarekin batera, APNak prostasomen
mugikortasunaren efektu areagotzailearekin zerikusia duela esaten digute.
Astenozoospermia oso ohizko hazi-patologia izaten da heroinazaleetan (Ragni
eta lank., 1988), espermatozoideen mugikortasuna sistema opioidearen bidez
modulatuta egon daitekela azalduz. Zehazki, heroina-emate kronikoaren bidez
mugikortasunaren jeitsiera batera eramaten duela dirudi. Ordea, aldarazitako
entzefalinen espresioa duten saguetan espermatozide-mugikortasun aldarazia duela
ikusi izan da (O’Hara eta lank., 1994). Gure emaitzak peptido opioideen maila altuak
mugikortasunaren aurkako efektua dutela esaten duen hipotesiarekin bat datoz,
mugikortasunik gabeko espermatozoideen proportzio handia duten haziak, APN-ren
aktibitatearen maila baxuekin erlazionatu izan direlako, eta hone! a entzefalinen maila
altua mantendu daitezkelako. Hala ere, ugalezintasun mota batzuetan,
espermatozoideen maila peptidasikoen aldaketak efektu konpentsatzailea izatea
proposatu izan da (Neinmark eta lank., 1998); honela, aminopeptidasen maila baxuak,
astenozoospermiari lotutako entzefalinen maila baxuekin harremandu daitezke
(Fujisawa eta lank., 1996). Izan ere, entzefalinak espermatozoideen mugikortasuna
gutxitu (Fraioli eta lank., 1984; Foresta eta lank., 1986) ala handitu (Fujisawa eta lank.,
1996) egin dezaketela proposatu izan da.
Entzefalinak euren ekintza, batez ere, mintzaren kanpoaldeko hartzaileei lotuta
burutzen dutenez, espermatozoideen zatiki solugarrian, espermatozoideen zitosolak
bame dituena, behatutako aktibitate handien esanahia ez da, momentum, agerikoa. Hala
eta guztiz ere, entzefalinak maila intrakrinoan izan dezaketen zeregina garrantzitsua
izan daiteke, Ventura eta lankideek proposatzen dutenez, peptido opioideen bestelako
kokapenak deskribatzen dituztenean (Ventura eta lank., 1998). Gainera,
aminopeptidasak akrosometan dauden entzefalinen gain eragin dezakete; hauek
espermatozoidetatik erauziak izaten dira, erreakzio akrosomikoaren ondoren (Kew eta
lank., 1990).
EZTABAIDA 205
206 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Gure ikerketan, korrelazio negatiboa behatu dugu espermatozoideen kopurua militro
bakoitzeko eta APN-ren aktibiatearen, espermatozoideen zatiki solugarian, artean.
Honek, espermatogenesian eman daitezken akatsak, zitosoleko APN-ren maila altuekin
erlazionatu behar direla adierazi dezake. Honen inguruan aipagarria da, peptido
opioideak, zelula germinal eta Sertoli zelulen arteko elkarrekintza parakrinoetan
inplikatu izan direla, espermatogenesiaren prozesuaren mantentzerako garrantzitsuak
omen direlarik (Fabri eta lank., 1985; Morris eta lank., 1987).
Endopeptidasa Neutroa (NEP) bakarrik prostasomen zatikian deskribatu izan
da. Kokapen espezifiko honek haziko Endopeptidasa Neutroa prostatan sortarazten
déla esaten digu, hauxe bait da prostasomen sorrera-lekua (Ronquist eta Brody, 1985),
Patologien arteko ezberdintasun adierazgarririk ez behatzeak, bere aktibitate
mugatuarekin batera, espermatozoideen mugikortasunean eta bideragarritasunean,
APNa Endopeptidasa Neutroa baino garrantzitsuagoa déla esaten digu. Gainera, NEP-
aren, patología ezberdinen artean, aktibitatea konstante mantentzeak, APN-aren
aktibitateen aldaketen espezifikotasima indartzen du.
Laburbilduz, emaitza hauek, APN-aren aktibitatearen aldaketek gizonezkoen
ugalurritasunarekin erlazionatuta egon daitezkela adierazten digute, espermatozoideen
mugikortasun, bideragarritasun eta espermatogenesian. APN-ren ikerketa sakonagoek,
gizonezkoen ugal hodian, gizonei lotutako estrategia terapeutiko berriak garatzen
lagundu dezakete.
5.2.2. TRH ETA ANALOGOEN ENTZIMA
ANDERATZAILEAK ETA HAZI PATOLOGIAK
Piroglutamil Peptidasa I eta Prolil Endopeptidasaren aktibitateek, maila
altuagoak azaltzen zituzten nekrozoospermiadun gaixoen hazi zatikietan. Hala eta
guztiz ere, ez da bestelako ezberdintasun estatistiko adierazgarririk behatu haziaren
zatiki zehatz bateko aktibitatea eta bestelako patologiadun haziaren dagokion
206 EZTABAIDA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 207
zatikiarekin konparatzerakoan. Aktibitate entzimatiko altuen eta nekrozoospermiaren,
eta ez bestelako azpiugalkortasun baldintzen, arteko harremana, aktibitate maila altu
hauek espermatozoideen induzitutako heriotzean inplikatuta daudela pentsatzera
eramaten gaituzte. Izan ere, harreman hau bestelako ehimetan frogatu izan da.
Adibidez, garuncan, prolil endopeptidasaren irihibitzaile selektiboen ematea TRH-aren
anderatzea inhibituz, zelulak heriotzetik babesten dituela ikusi da (Shishido eta Iank.,
1999), eta prolil endopeptidasa maila altuak azaltzen dituzten muridoen T zelulak
aktibazíoaren bidezko induzitutako heriotz zelularrarekiko sentikorrak direla ere behatu
izan da (Odaka eta Iank., 2002). Prolil Endopeptidasaren mailarik altuenak zatiki
zitosolikoan azaltzen direnez, ez da usté entzima honek kanpoko hartzaileetara lotzen
diren peptidoen erregulazioan garrantzi handirik edukitzea. Ordea, peptidasa
zitosolikoak ezinbestekoak dirudite zelularen bideraganitasuna mantentzeko (Constam
eta Iank., 1995).
Peptidasa hauen maila altuak espermatozoideei heriotz zelularrerako
sentikortasuna ematen ornen diete, muridoen T zelulekin eta Prolil Endopeptidasarekin
gertatzen den moduan (Odaka eta Iank., 2002), zelula bamean dauden, heriotzetik
babesten duten peptidoen (TRH eta analogoak) mailak jeitsiaraziz baliteke. Hala ere,
pentsa daiteke aktibitate peptidasikoen mailaren igoera, heriotzaren zelularen ondorio
bat izatea, soberan geratzen den zelularen materiala prozesatzeko. Hala eta guztiz ere,
peptidasa aktibitate altuak heriotz zelularraren ondorioa badira, aktibitatearen
handipena zatiki guztietan itxoin zitekeen eta ez zatiki zehatzetan, hemen ikusten
dugun moduan. Ikerketa gehiago behar izango lirateke peptidasa hauen maila altuak
nekrozoospermiarekin harremanean daudenak, espermatozoideen heriotzaren zergatia
ala ondorioa ote diren argizteko.
Azkenik, peptidasa aktibitate hauek ikertu diren talde guztietan errore
estandarra nahiko handia da, eta honek bestelako faktore garrantzitsu batzuk aktibitate
entzimatiko hauekin erlazionatzen direla, ikasitako patologiaz gain.
EZTABAIDA 207
208 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Laburbi Iduz, Piroglutamil Peptidasa I eta Prolil Endopeptidasa entzimen
aktibitateak giza hazian ikertu ondoren, entzima hauek nolabaiteko egiteko bat,
nekrozoospermiari lotutako ugalurritasunean, dutela pentsa daiteke.
5.2.3. GIZA HAZIKO PEPTIDASAK ETA PEPTIDOAK.
LANERAKO HIPOTESIAK
Bestalde, peptidasen arteko ekintza koordinatuak edo, behintzat,
elkargurutzatuak daudela pentsa daiteke datu hauen arabera. Izan ere, bradikinina
APN-ren inhibizio konpetitiboa egiten duen sustantzia izanik eta motilitatearen
estimulatzaile bezala deskribatua izan déla kontutan hartuta, honen degradazioa
burutzen duen prolil endopeptidasak, mugikortasunean nolabaiteko eragina sortarazi
dezakela pentsa daiteke. Hala ere, ezin izan dugu prolil endopeptidasaren eta
astenozoospermiaren arteko harreman estatistikorik behatu.
APN solugarriaren astenozoospermikoetan behatzen diren maila baxuak, prolil
endopeptidasaren maila baxuekin batera emango balira, azken honek bradikininaren
degradazio gutxituarekin erlazionatuko genuke eta bradikinak APN-a inhibitzen duela
esa zitekeen. Esan bezala, ez prolil endopeptidasaren aktibitate murrizturik behatu
astenozoospermikoetan baina bai korrelazio positibo bat prostasometan behatutako
aktibitate bailoen eta A+B espermatozoide mugikorren baturaren artean.
Opioideek espermatozoideen mugikortasunean sortarazten duten efektua oso
eztabaidatua da oraindik. Entzefalinak, ugal aparatu arran zabalki espresatutako
peptidoak dira. Astenozoospermikoen hazi-plasman behatutako entzefalina mailak,
ohizkoak baino baxuagoak direla deskribatu den arren, ikerketa berean, met-
entzefalinarekin egindako inkubazioen bidez, met-entzefalinak mugikortasuna
mantentzen laguntzen duela deskribatzen da (Fujisawa eta lank., 1996).
Bestalde, badira entzefalinek espermatozoideen efektu moteltzailea dutela
esaten duten ikerketak (Foresta eta lank., 1985).
208 EZTABAIDA
Doktore-T esia Asier Valdivia Palacín 209
Era berean, hazitik isolatutako prostasomak espermatozoideen mugikortasunean
efektu areagotzailea dutela esaten duten ikerketak badaude (Carlsson eta lank., 2003).
Kontuan izanik, gure emaitzek diotenez, endopeptidasa neutroa (NEP) prostasometan
soilik dagoela, entzima honen, entzefalinen degradatzaile bezala duen ekintzari
buruzko lotura posible batean pentsatzea erraza da. Prostasometan ere, APN-aren
aktibitatea altua da. Beraz, gure datuak, entzefalinen degradazioak mugikortasunaren
aide egiten duela esaten dutenez, entzefalinek mugikortasunarekiko efektu murriztailea
esaten duten ikerketekin bat datoz.
Honekin batera, esan behar da bame peptido opioideek GnRH-ren askapena
inhibitzen dutela (Fabbri eta lank., 1989). Era berean, GnRH, LH eta FSH eta,
ondorioz, hormona sexualen askapenarekin erlazionatuta dago. Hormona hauek
ugalkuntzarekin erlazioantutako funtzio ugari dituzte (espermatogenesia,...). GnRH-ak
berak, espermatozoideek Zona Pellucida-ú lotzeko gaitasunean garrantzia duela
frogatu izan da (Morales, 1998; Morales eta lank., 1999). Honi, GnRH-ren II motako
hartzailearen transkriptoak espermatozoide helduetan detektatu izan direla (van Biljon
eta lank., 2002) lotu behar zaio. Gogora dezagun ere, Zona Pellucida-vekm lotzea
erreakzio akrosomikorako eta, beraz, emalkutzaren prozesurako faktore garrantzitsua
zela (Baldi eta lank, 2002). Berriz, biopeptido erregulatzaile sistema biren (opioideena
eta gonadotropinena) balizko elkargurutzamendua, peptidasen bidez ezartzeko aukera
daukagu. Kau honetan, piroglutamil peptidasa I aktibitatea aintzat hartu behar dugu;
izan ere, entzima honek LHRH (GnRH) anderatzeko gaitasuna dauka, eta entzima
honen deskribapena, haziaren zatiki ezberdinetan, egin dugu lan honetan.
Piroglutamil peptidasa I eta heriotz zelularrarekiko babes-funtzioa aipatu dugu
lehenago. Modu berean, entzima honen FPP (Fertilization Promoting Peptide)
bezalako, emalkuntzaren sustantzia gaitzaileen apurketan izan dezakeen garrantzia
agerian utzi da. Azkenik, erreakzio akrosomikoa eta emalkuntzarako ezinbestekoa den
espermatozoide-Zona Pellucida elkarrekintzan, entzima honek izan dezakeen
inplikazioa iradoki daiteke.
EZTABAIDA 209
210 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Opioideen garrantziaren, eta beraz bere sistemaren elementuen garrantzi
posiblearen beste adierazle bat, kanpoko sustantzia opiazeoak haziarengan dituzten
eraginak dira. Anitzak dira, opioide exogenoen haziarekiko duten eragin kaltegarriak
defendatzen dituzten ikerketak. Hauen artean, espemiatozoidearen ultraestrukturaren
akatsak, hauetako batzuk mugikortasunaren elementuekin (axonemaren egitura,...)
erlazionatutakoak, (El-Gothamy eta El-Samahy, 1992), mugikortasunaren jeitsiera
(Ragni eta lank., 1985; Ragni eta lank., 1988), eta abar, deskribatu dira. Honela, APN-
ak astenozoospermikoetan baxuagoa izateak, eta honen ondorioz emango ziren
entzefalinen (Bame peptido opioideak) haziko maila altuek, nolabaiteko harremana
iradokitzea po sib lea dirudi.
Aipatzekoa da ere, kininen (angiotensinak, bradikinina) metabolismoari,
espermatozoideen funtzioan eta ugal funtzioan, orohar, zerengin garrantzitsuak egotzi
zaizkiola (Schill etaMiska, 1992).
Honela, adibidez, angiotensina Il-k, prolil endopeptidasa eta NEP-en sustratoa
dena, espermatozoideen abiadura areagotzeko gai izaten da, inkubazioz (Mizutani eta
Schill, 1985; Vinson eta lank., 1995). Bradikininak ere gaitasun hau azaltzen du, baina
inkubazioa 22°C-tan egiten denean. Bradikininaren mugikortasunaren areagotzea nM-
eko kontzentrazioetan gertatzen déla, baina hau ez omen déla bradikininaren BK2
hartzaileen bidez gertatzen, diote Siems eta lankideek (2003). Bestalde, Kininasa II
entzimaren, zelula espermatikoetan azaltzen den AEB/ACE-ren isoentzimaren,
inhibitzaileekin hazia inkubatzean, mugikortasuna estimulatzen déla behatu da (Somlev
eta Subev, 1998). Bradikininak ere, zelula germinalen ugalketan eta proliferazioaren
erregulazioan, BI eta B2 hartzaileen bidez, partehartzea proposatu izan da
(Atanassova, 2003).
Gure lan honetan ez da prolil endopeptidasa edo NEP-aren inplikaziorik behatu
astenozoospermiarekin. Hala ere, hauen inhibitzaileak erabilita, espermatozoideen
mugikortasuna ñola aldatzen den ikasi duten ikerketek, hauek espermatozoidearen
motilitatea gutxitzen dutela diote, bide batez, prolil endopeptidasa espermatozoidearen
isatsean detektatu dutelarik (Kimura eta lank., 2002).
210 EZTABAIDA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 211
Era berean, angiotensina Il-k, erreakzio akrosomikoa bultzatzen du
kapazitatutako zezen espermatozoideetan. Esan dugu prolil endopeptidasak eta
piroglutamil peptidasak bíderagarritasun zelularrarekin eta FPP bezalako,
emalkuntzaren estimulatzaideak diren, peptidoen kontrolan inplikatuta egon daitezkela.
Zergatik ez emalkuntzarako beharezkoa den erreakzio akrosomikoan, angiotensinaren
mailak moduiatuz?
EZTABAIDA 211
212 Asier Valdivia Doktore-Tesia
212 EZTABAIDA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 213
ONDORIOAK
ONDORIOAK 213
214 Asier Valdivia Doktote-Tesia
214 ONDORIOAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 215
6. ONDORIOAK
Arestian aztertutako emaitzei so eginik, eta hasieran, lan honetarako,
finkatutako helburuak kontutan hartuz, honako ondorio hauek atera ditugu doktore tesi
honetan:
1.- Hazian behatutako peptidasek oso aktibitate-maila altuak dituzte, beste ehunen
aldean. N aminopeptidasak eta endopeptidasa neutroak, beste ehunetan baino aktibitate
gehiago azaltzen dute giza hazian, bai mintzari lotutako zatikietan, bai zatiki
solugarrietan. Prolil endopeptidasak eta piroglutamil peptidasa I-ek ere oso aktibitate
maila altuak azaltzen dituzte.
2.- Entzefalinen entzima anderatzaile nagusiak N aminopeptidasa eta endopeptidasa
neutroa dira giza hazian. PSA (Puromizinarekiko sentikorra den aminopeptidasa) ez
baita behatu eta
3.- Behatu eta aztertutako entzefalinen entzima anderatzaileen (ApN eta NEP)
aktibitatea zatiki mintzakaretan (espermatozoideen mintza eta prostasomak) topatzen
da nagusiki. Hala ere, ApN-ren maila altuak behatu izan dira zatiki solugarrietan.
Endopeptidasa neutroa soilik prostasometan behatu ahal izan dugu. Prostasomek,
haziaren fisiologian eta espermatozoideen prozesu zelular garrantzitsutan hartzen dute
parte.
4.- TRH, FPP eta hauen kideak piroglutamil peptidasa I-aren eta prolil
endopeptidasaren bidez anderatuak dira giza hazian. Entzima hauek zatiki solugarrietan
aktibitate-maila altuagoak dituzten arren, mintzeko zatikietan maila aipagarriak dituzte.
ONDORIOAK 215
216 Asier Valdivia Doktote-Tesia
5.- N aminopeptidasak aktibitate adierazgarriki baxuagoak ditu astenozoospermikoen
espermatozoideen zatiki solugarrian. Datu honek, entzefalinen eragin moteltzailea
indartu egiten du eta astenozoospermikoen hazian behatu diren opioide maila altuekin
ere bat dator.
6.- N aminopeptidasaren espermatozoidetako aktibitatearen eta hildako espermatozoide
kopuruaren artean lotura dago eta hildakoen kopuru handia denean, aktibitatea,
espermatozoidetako zatikietan, gora egiten du. Honek adierazten digu, peptidasek eta
bereziki ApN-k, nolabaiteko zeregina dutela espermatoideen heriotz prozesuetan.
7.-Piroglutamil peptidasa Iek aktibitate maila altuak ditu nekrozoospemikoen
espermatozoideen zatiki solugarrian. Hau, TRHa eta peptido analogoek duten eragin
zitobabeslearen ezabapenarekin lotu genezake eta peptidasa hauen maila altuek heriotz
zelularrarekiko sentikortasun handiagoarekin lotzen dituzten hipotesiekin bat dator.
8.- Prolil endopeptidasak, nekrozoospermikoen espermatozoideen mintzetan duen
maila altuagoak, entzima honek zelulen heriotzaren aurreko sentikortasuna handitzen
duela esaten duten ikerketekin bat dator.
9.- Peptido bioaktiboek ugalkuntzan dituzten zeregin fisiologiko garrantzitsuak
kontuan izanik, bere erregulazioan parte hartzen duten peptidasek ere ugalkortasunaren
eta haziaren fisiologian egiteko garrantzitsua izatea erraz onar daiteke.
216 ONDORIOAK
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 217
BIBLIOGRAFIA
BIBLIOGRAFIA 217
218 Asier Valdivia Doktote-Tesia
218 BIBLIOGRAFIA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 219
BIBLIOGRAFIA
Abe K, Watanabe N, Kosaka T, Yamada M, Tokui T, Ikeda T (2003) Hydrolysis of synthetic substrate, L-pyroglutamyl p-nitroanilide is catalyzed solely by pyroglutamyl aminopeptidase I in rat liver cytosol. Biol Pharm Bull 26:1528- 1533.
Abou-Haila A, Tulsiani DR (2000) Mammalian sperm acrosome: formation, contents, and function. Arch Biochem Biophys 379:173-182.
Agarwal A, Saleh RA, Bedaiwy MA (2003) Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction. Fértil Steril 79:829-843.
Agrawal Y, Vanha-Perttula T (1987) Effect of secretory particles in bovine seminal vesicle secretion on sperm motility and acrosome reaction. J Reprod Fértil 79:409-419.
Akil H, Mayer DJ, Liebeskind JC (1976) Antagonism of stimulation-produced analgesia by naloxone, a narcotic antagonist. Science 191:961-962.
Akil H, Owens C, Gutstein H, Taylor L, Curran E, Watson S (1998) Endogenous opioids: overview and current issues. Drug Alcohol Depend 51:127-140.
Alba F, Arenas JC, Lopez MA (1995) Comparison of soluble and membrane-bound pyroglutamyl peptidase I activities in rat brain tissues in the presence of detergents. Neuropeptides 29:103-107.
Albrizio M, Guaricci AC, Maritato F, Sciorsci RL, Mari G, Calamita G, Lacalandra GM, Aiudi GG, Minoia R, Dell'Aquila ME, Minoia P (2005) Expression and subcellular localization of the mu-opioid receptor in equine spermatozoa: evidence for its functional role. Reproduction 129:39-49.
Amann RP, Howards SS (1980) Daily spermatozoal production and epididymal spermatozoal reserves of the human male. J Urol 124:211-215.
Amodeo P, Lopez Mendez B, Guerrini R, Salvadori S, Temussi PA, Tancredi T (2000) Pain peptides. Solution structure of orphanin FQ2. FEBS Lett 473:157-160.
Arienti G, Carlini E, Palmerini CA (1997) Fusion of human sperm to prostasomes at acidic pH. J Membr Biol 155:89-94.
BIBLIOGRAFIA 219
220 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Arienti G, Carlini E, Verdacchi R, Cosmi EV, Palmerini CA (1997) Prostasome to sperm transfer of CD13/aminopeptidase N (EC 3.4.11.2). Biochim Biophys Acta 1336:533-538.
Arienti G, Carlini E, Verdacchi R, Palmerini CA (1997) Transfer of aminopeptidase activity from prostasomes to sperm. Biochim Biophys Acta 1336:269-274.
Ashworth RJ, Morrell JM, Aitken A, Patel Y, Cockle SM (1991) Pyroglutamylglutamylprohneamide is present in rat anterior and posterior pituitary gland. J Endocrinol 129:Rl-4.
Atanassova NN (2003) B2 bradykinin receptor mediates the stimulatory effect of bradykinin on rat germ cell proliferation in vitro. Andrologia 35:13-16.
Aumuller G, Riva A (1992) Morphology and functions of the human seminal vesicle. Andrologia 24:183-196.
Austin CR (1951) Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res (B) 4:581-596.
Awade AC, Cleuziat P, Gonzales T, Robert-Baudouy J (1994) Pyrrolidone carboxyl peptidase (Pep): an enzyme that removes pyroglutamic acid (pGlu) from pGlu- peptides and pGlu-proteins. Proteins 20:34-51.
Baccetti B, Capitani S, Collodel G, Strehler E, Piomboni P (2002) Recent advances in human sperm pathology. Contraception 65:283-287.
Baldi E, Luconi M, Bonaccorsi L, Forti G (1998) Nongenomic effects of progesterone on spermatozoa: mechanisms of signal transduction and clinical implications. Front Biosci 3:D1051-1059.
Baldi E, Luconi M, Bonaccorsi L, Forti G (2002) Signal transduction pathways in human spermatozoa. J Reprod Immunol 53:121-131.
Bauer K (1987) Adenohypophyseal degradation of thyrotropin releasing hormone regulated by thyroid hormones. Nature 330:375-377.
Beaudet A, Nouel D, Stroh T, Vandenbulcke F, Dal-Farra C, Vincent JP (1998) Fluorescent ligands for studying neuropeptide receptors by confocal microscopy. Braz J Med Biol Res 31:1479-1489.
Belluzzi JD, Grant N, Garsky V, Sarantakis D, Wise CD, Stein L (1976) Analgesia induced in vivo by central administration of enkephalin in rat. Nature 260:625- 626.
220 BIBLIOGRAFIA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 221
Bhandrau L, Emerson CH (1980) Evidence for the presence of the putative TRH metabolite, deamido-TRH, in human urine. J Clin Endocrinol Metab 51:410- 412.
Bhargava HN, Gulati A (1988) Binding of 3H-(3-MeHis2) thyrotropin-releasing hormone to spinal cord membranes of spontaneously hypertensive and Wistar- Kyoto normotensive rats. Pharmacology 37:349-355.
Bilek R (2000) TRH-like peptides in prostate gland and other tissues. Physiol Res 49 Suppl 1:S 19-26.
Boettger A, Kertscher U, Steinmann C, Baeger U, Siems WE, Heder G (1993) Degradation of bradykinin in semen of ram and boar. Biochem Pharmacol 45:1983-1988.
Bogenrieder T, Finstad CL, Freeman RH, Papandreou CN, Scher HI, Albino AP, Reuter VE, Nanus DM (1997) Expression and localization of aminopeptidase A, aminopeptidase N, and dipeptidyl peptidase IV in benign and malignant human prostate tissue. Prostate 33:225-232.
Boler J, Enzmann F, Folkers K, Bowers CY, Schally AV (1969) The identity of chemical and hormonal properties of the thyrotropin releasing hormone and pyroglutamyl-histidyl-proline amide. Biochem Biophys Res Commun 37:705- 710.
Boschi G, Launay N, Rips R (1980) Induction of wet-dog shakes by intracerebral 'acid' TRH in rats. Neurosci Lett 16:209-212.
Boudinot E, Morin-Surun M, Foutz AS, Foumie-Zaluski M, Roques BP, Denavit- Saubie M (2001) Effects of the potent analgesic enkephalin-catabolizing enzyme inhibitors RB101 and kelatorphan on respiration. Pain 90:7-13.
Bowers CR, Redding TW, Schally AV (1965) Effect of thyrotropin releasing factor (TRF) of ovine, bovine, porcine and human origin on thyrotropin release in vitro and in vivo. Endocrinology 77:609-616.
Brabant G, Wickings EJ, Nieschlag E (1981) The TRH-metabolic histidyl-proline- diketopiperazine (DKP) inhibits prolactin secretion in male rhesus monkeys. Acta Endocrinol (Copenh) 98:189-194.
Browder LW, Erickson, C.A., Jeffery, W.R. (1991) Developmental Biology, IH edition Edition: Saunders College Publishing.
Browne P, O'Cuinn G (1983) An evaluation of the role of a pyroglutamyl peptidase, a post-proline cleaving enzyme and a post-proline dipeptidyl amino peptidase, each purified from the soluble fraction of guinea-pig brain, in the degradation of thyroliberin in vitro. Eur J Biochem 137:75-87.
BIBLIOGRAFIA 221
222 Asier Valdivia Doktote-Tesia
Burgus R, Dunn TF, Ward DN, Vale W, Amoss M, Guillemin R (1969) [Synthetic polypeptide derivatives with thyrotropin releasing factor hypophysiotropic activity]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D 268:2116-2118.
Burgus R, Guillemin R (1970) Hypothalamic releasing factors. Annu Rev Biochem 39:499-526.
Bustos-Obregon E, Courot M, Flechon JE, Hocher eau-de-Rc vi crs MT, Holstein AF (1975) Morphological appraisal of gametogenesis. Spermatogenetic process in mammals with particular reference to man. Andrologia 7:141-163.
Camargo AC, Almeida ML, Emson PC (1984) Involvement of endo-oligopeptidases A and B in the degradation of neurotensin by rabbit brain. J Neurochem 42:1758- 1761.
Camina JP, Lage M, Menendez C, Grana M, Garcia-Devesa J, Dieguez C, Casanueva FF (2002) Evidence of free leptin in human seminal plasma. Endocrine 17:169- 174.
Cao J, O'Donnell D, Vu H, Payza K, Pou C, Godbout C, Jakob A, Pelletier M, Lembo P, Ahmad S, Walker P (1998) Cloning and characterization of a cDNA encoding a novel subtype of rat thyrotropin-releasing hormone receptor. J Biol Chem 273:32281-32287.
Carlsen E, Giwercman A, Keiding N, Skakkebaek NE (1992) Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years. Bmj 305:609-613.
Carlsson L, Nilsson O, Larsson A, Stridsberg M, Sahlen G, Ronquist G (2003) Characteristics of human prostasomes isolated from three different sources. Prostate 54:322-330.
Carlsson L, Pahlson C, Bergquist M, Ronquist G, Stridsberg M (2000) Antibacterial activity of human prostasomes. Prostate 44:279-286.
Carlsson L, Ronquist G, Stridsberg M, Johansson L (1997) Motility stimulant effects of prostasome inclusion in swim-up medium on cryopreserved human spermatozoa. Arch Androl 38:215-221.
Carrera MP, Ramirez-Exposito MJ, Valenzuela MT, Garcia MJ, Mayas MD, Martinez- Martos JM (2003) Serum pyrrolidone carboxypeptidase activity in N-methyl- nitrosourea induced rat breast cancer. Horm Metab Res 35:502-505.
Chaillet P, Marcais-Collado H, Costentin J, Yi CC, De La Baume S, Schwartz JC (1983) Inhibition of enkephalin metabolism by, and antinociceptive activity of, bestatin, an aminopeptidase inhibitor. Eur J Pharmacol 86:329-336.
222 BIBLIOGRAFIA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 223
Chang MC (1951) Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature 168:697-698.
Chang MC, Berkery D, Schuel R, Laychock SG, Zimmerman AM, Zimmerman S, Schuel H (1993) Evidence for a cannabinoid receptor in sea urchin sperm and its role in blockade of the acrosome reaction. Mol Reprod Dev 36:507-516.
Cicero TJ, Bell RD, Wiest WG, Allison JH, Polakoski K, Robins E (1975) Function of the male sex organs in heroin and methadone users. N Engl J Med 292:882-887.
Cockle SM, Aitken A, Beg F, Morrell JM, Smyth DG (1989) The TRH-related peptide pyroglutamyglutamylprolinamide is present in human semen. FEBS Lett 252:113-117.
Cockle SM, Aitken A, Beg F, Smyth DG (1989) A novel peptide, pyroglutamylglutamylproline amide, in the rabbit prostate complex, structurally related to thyrotrophin-releasing hormone. J Biol Chem 264:7788-7791.
Cockle SM, Prater GV, Thetford CR, Hamilton C, Malone PR, Mundy AR (1994) Peptides related to thyrotrophin-releasing hormone (TRH) in human prostate and semen. Biochim Biophys Acta 1227:60-66.
Cohen-Dayag A, Tur-Kaspa I, Dor J, Mashiach S, Eisenbach M (1995) Sperm capacitation in humans is transient and correlates with chemotactic responsiveness to follicular factors. Proc Natl Acad Sci U S A 92:11039-11043.
Comb M, Seeburg PH, Adelman J, Eiden L, Herbert E (1982) Primary structure of the human Met- and Leu-enkephalin precursor and its mRNA. Nature 295:663-666.
Constam DB, Tobler AR, Rensing-Ehl A, Kemler I, Hersh LB, Fontana A (1995) Puromycin-sensitive aminopeptidase. Sequence analysis, expression, and functional characterization. J Biol Chem 270:26931-26939.
Cosentino MJ, Cockett AT (1986) Structure and function of the epididymis. Urol Res 14:229-240.
Cross NL (1998) Role of cholesterol in sperm capacitation. Biol Reprod 59:7-11.
Cummins PM, O'Connor B (1996) Bovine brain pyroglutamyl aminopeptidase (type- 1): purification and characterisation of a neuropeptide-inactivating peptidase. Int J Biochem Cell Biol 28:883-893.
Cummins PM, O'Connor B (1998) Pyroglutamyl peptidase: an overview of the three known enzymatic forms. Biochim Biophys Acta 1429:1-17.
Cunningham DF, O'Connor B (1997) Proline specific peptidases. Biochim Biophys Acta 1343:160-186.
BIBLIOGRAFIA 223
224 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Czekay G, Bauer K (1993) Identification of the thyrotropin-releasing-hormone- degrading ectoenzyme as a metallopeptidase. Biochem J 290 ( Pt 3):921-926.
Dacheux JL, Paquignon M (1980) Relations between the fertilizing ability, motility and metabolism of epididymal spermatozoa. Reprod Nutr Dev 20:1085-1099.
Dando PM, Fortunato M, Strand GB, Smith TS, Barrett AJ (2003) Pyroglutamyl- peptidase I: cloning, sequencing, and characterisation of the recombinant human enzyme. Protein Expr Purif 28:111-119.
Danielson PB, Hoversten MT, Fitzpatrick M, Schreck C, Akil H, Dores RM (2001) Sturgeon orphanin, a molecular "fossil" that bridges the gap between the opioids and orphanin FQ/nociceptin. J Biol Chem 276:22114-22119.
Davidson A, Vermesh M, Paulson RJ, Graczykowski JW, Lobo RA (1989) Presence of immunoreactive beta-endorphin and calcitonin in human seminal plasma, and their relation to sperm physiology. Fértil Steril 51:878-880.
De Gandarias JM, Irazusta J, Silio M, Gil J, Saitua N, Casis L (1998) Soluble and membrane-bound pyroglutamy 1-peptidase I activity in the developing cerebellum and brain cortex. Int J Dev Biol 42:103-106.
Debuse M (1998) Lo esencial en sistema endocrino y aparato reproductor: Harcourt.
del Rio-Garcia J, Smyth DG (1990) Distribution of pyroglutamylpeptide amides related to thyrotrophin-releasing hormone in the central nervous system and periphery of the rat. J Endocrinol 127:445-450.
Doolittle RF, Armentrout RW (1968) Pyrrolidonyl peptidase. An enzyme for selective removal of pyrrolidonecarboxylic acid residues from polypeptides, Biochemistry 7:516-521.
Douglas WW (1973) How do neurones secrete peptides? Exocytosis and its consequences, including "synaptic vesicle" formation, in the hypothalamo- neurohypophyseal system. Prog Brain Res 39:21-39.
Dresdner K, Barker LA, Orlowski M, Wilk S (1982) Subcellular distribution of prolyl endopeptidase and cation-sensitive neutral endopeptidase in rabbit brain. J Neurochem 38:1151-1154.
Duntas L, Nelson DK, Grab BM, Rosenthal J, Maier V (1993) A fast protein liquid chromatography (FPLC) method for study of thyrotropin-releasing hormone (TRH) and its metabolite histidyl-proline diketopiperazine (CHOP) in human blood: degradation in liver and pancreatic diseases. Neuropeptides 25:357-361.
224 BIBLIOGRAFIA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 225
Dyer SH, Slaughter CA, Orth K, Moomaw CR, Hersh LB (1990) Comparison of the soluble and membrane-bound forms of the puromycin-sensitive enkephalin- degrading aminopeptidases from rat. J Neurochem 54:547-554.
Eblen A, Bao S, Lei ZM, Nakajima ST, Rao CV (2001) The presence of functional luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptors in human sperm. J Clin Endocrinol Metab 86:2643-2648.
Edwardson JA, McDermott JR (1982) Neurochemical pathology of brain peptides. Br Med Bull 38:259-264.
el-Gothamy Z, el-Samahy M (1992) Ultrastructure sperm defects in addicts. Fértil Steril 57:699-702.
Emerson CH, Vogel W, Currie BL (1980) Concentrations of thyrotropin-releasing hormone (TRH) and deamido-TRH, and TRH deamidase activity in brain. Endocrinology 107:443-449.
Emson PC, Goedert M, Williams B, Ninkovic M, Hunt SP (1982) Neurotensin: regional distribution, characterization, and inactivation. Ann N Y Acad Sci 400:198-215.
Erdos EG, Schulz WW, Gafford JT, Defendini R (1985) Neutral metalloendopeptidase in human male genital tract. Comparison to angiotensin I-converting enzyme. Lab Invest 52:437-447.
Erdos EG, Skidgel RA (1989) Neutral endopeptidase 24.11 (enkephalinase) and related regulators of peptide hormones. Faseb J 3:145-151.
Evers JL (2002) Female subfertility. Lancet 360:151-159.
Fabbri A, Jannini EA, Gnessi L, Ulisse S, Moretti C, Isidori A (1989) Neuroendocrine control of male reproductive function. The opioid system as a model of control at multiple sites. J Steroid Biochem 32:145-150.
Favier AE (1992) The role of zinc in reproduction. Hormonal mechanisms. Biol Trace Elem Res 32:363-382.
Fernandez D, Valdivia A, Irazusta J, Ochoa C, Casis L (2002) Peptidase activities in human semen. Peptides 23:461-468.
Flesch FM, Gadella BM (2000) Dynamics of the mammalian sperm plasma membrane in the process of fertilization. Biochim Biophys Acta 1469:197-235.
Florentin D, Sassi A, Roques BP (1984) A highly sensitive fluorometric assay for "enkephalinase," a neutral metalloendopeptidase that releases tyrosine-glycine- glycine from enkephalins. Anal Biochem 141:62-69.
BIBLIOGRAFIA 225
226 Asier Valdivia Doktore-T esia
Foresta C, Caretto A, Indino M, Betterle C, Scandellari C (1986) Localization of met- enkephalin on human spermatozoa and evidence for its physiological role. Arch Androl 17:19-24.
Foresta C, Tramarin A, Scandellari C, Arslan P (1985) Effects of a met-enkephalin analogue on motility, 02 consumption, and ATP content of human spermatozoa. Arch Androl 14:247-252.
Foumie-Zaluski MC, Perdrisot R, Gacel G, Swerts JP, Roques BP, Schwartz JC (1979) Inhibitory potency of various peptides on enkephalinase activity from mouse striatum. Biochem Biophys Res Commun 91:130-135.
Fraioli F, Fabbri A, Gnessi L, Silvestroni L, Moretti C, Redi F, Isidori A (1984) Beta- endorphin, Met-enkephalin, and calcitonin in human semen: evidence for a possible role in human sperm motility. Ann N Y Acad Sci 438:365-370.
Fraser LR (1998) Fertilization promoting peptide: an important regulator of sperm function in vivo? Rev Reprod 3:151-154.
Fraser LR (1998) Role of fertilization promoting peptide (FPP) in modulating mammalian sperm function. Front Biosci 3:D1187-1191.
Fraser LR, Adeoya-Osiguwa SA (2001) Fertilization promoting peptide—a possible regulator of sperm function in vivo. Vitam Horm 63:1-28.
Fraser LR, Hosseini R, Hanyalogou A, Talmor A, Dudley RK (1997) TCP-11, the product of a mouse t-complex gene, plays a role in stimulation of capacitation and inhibition of the spontaneous acrosome reaction. Mol Reprod Dev 48:375- 382.
Frayne J, Jury JA, Barker HL, Perry AC, Jones R, Hall L (1998) Macaque MDC family of proteins: sequence analysis, tissue distribution and processing in the male reproductive tract. Mol Hum Reprod 4:429-437.
Fujisawa M, Kanzaki M, Okada H, Arakawa S, Kamidono S (1996) Metenkephalin in seminal plasma of infertile men. Int J Urol 3:297-300.
Fujiwara K, Kobayashi R, Tsuru D (1979) The substrate specificity o f pyrrolidone carboxylyl peptidase from Bacillus amyloliquefaciens. Biochim Biophys Acta 570:140-148.
Fukusumi S, Ogi K, Onda H, Hinuma S (1995) Distribution of thyrotropin-releasing hormone receptor mRNA in rat peripheral tissues. Regul Pept 57:115-121.
Garrett JE, Garrett SH, Douglass J (1990) A spermatozoa-associated factor regulates pro enkephalin gene expression in the rat epididymis. Mol Endocrinol 4:108-118.
226 BIBLIOGRAFIA
Doktote-Tesia Asier Valdivia Palacín 227
Gatti JL, Chevrier C, Paquignon M, Dacheux JL (1993) External ionic conditions, internal pH and motility of ram and boar spermatozoa. J Reprod Fértil 98:439- 449.
Gatti JL, Druart X, Guerin Y, Dacheux F, Dacheux JL (1999) A 105- to 94-kilodalton protein in the epididymal fluids of domestic mammals is angiotensin I- converting enzyme (ACE); evidence that sperm are the source of this ACE. Biol Reprod 60:937-945.
Gee NS, Matsas R, Kenny AJ (1983) A monoclonal antibody to kidney endopeptidase- 24.11. Its application in immunoadsorbent purification of the enzyme and immunofluorescent microscopy of kidney and intestine. Biochem J 214:377- 386.
Geris KL, Berghman LR, Ladram A, Kuhn ER, Darras VM, Harvey S (2000) Modulation of the growth hormone-releasing activity of thyrotropin-releasing hormone in the chicken by its gene-related peptide preproTRH((160- 169))(Ps4): enhanced somatostatinergic tone? Neuropeptides 34:51-57.
Gershengom MC, Thaw CN (1991) Regulation of thyrotropin-releasing hormone receptors is cell type specific: comparison of endogenous pituitary receptors and receptors transfected into non-pituitary cells. Endocrinology 128:1204- 1206.
Ghaddar G, Ruchon AF, Carpentier M, Marcinkiewicz M, Seidah NG, Crine P, Desgroseillers L, Boileau G (2000) Molecular cloning and biochemical characterization of a new mouse testis sohible-zinc-metallopeptidase of the neprilysin family. Biochem J 347:419-429.
Gibson AM, McDermott JR, Lauffart B, Mantle D (1989) Specificity of action of human brain alanyl aminopeptidase on Leu-enkephalin and dynorphin-related peptides. Neuropeptides 13:259-262.
Giros B. GC, Solhonne B, Schwartz JC (1985) Characterization of aminopeptidases responsible for inactivating endogenous met-enkephalin in brain slices using peptidase inhibitors and aminopeptidase M antibodies. Mol Pharmacol 29:281- 287.
Gkonos PJ, Kwok CK, Block NL, Roos BA (1994) Identification of the human seminal TRH-like peptide pGIu-Phc-Pro-NH2 in normal human prostate. Peptides 15:1281-1283.
Glander HJ, Lammert A, Paasch U, Glasow A, Kratzsch J (2002) Leptin exists in tubuli seminiferi and in seminal plasma. Andrologia 34:227-233.
BIBLIOGRAFIA 227
228 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Goldstein A, Tachibana S, Lowney LI, Hunkapiller M, Hood L (1979) Dynorphin-(l- 13), an extraordinarily potent opioid peptide. Proc Natl Acad Sci U S A 76:6666-6670.
Goossens F, De Meester I, Vanhoof G, Scharpe S (1996) Distribution of prolyl oligopeptidase in human peripheral tissues and body fluids. Eur J Clin Chem Clin Biochem 34:17-22.
Gossrau R, Lojda Z (1980) Study on dipeptidylpeptidase II (DPP II). Histochemistry 70:53-76.
Goverde HJ, Bisseling JG, Wetzels AM, Braat DD, Pesman GJ, Sweep FC, Meuleman EJ (1998) A neuropeptide in human semen: oxytocin. Arch Androl 41:17-22.
Green CM, Cockle SM, Watson PF, Fraser LR (1994) Stimulating effect of pyroglutamylglutamylprolineamide, a prostatic, TRH-related tripeptide, on mouse sperm capacitation and fertilizing ability in vitro. Mol Reprod Dev 38:215-221.
Green CM, Cockle SM, Watson PF, Fraser LR (1996) Fertilization promoting peptide, a tripeptide similar to thyrotrophin-releasing hormone, stimulates the capacitation and fertilizing ability of human spermatozoa in vitro. Hum Reprod 11:830-836.
Green CM, Cockle SM, Watson PF, Fraser LR (1996) A possible mechanism of action for fertilization promoting peptide, a TRH-related tripeptide that promotes capacitation and fertilizing ability in mammalian spermatozoa. Mol Reprod Dev 45:244-252.
Greene LJ, Spadaro AC, Martins AR, Perussi De Jesus WD, Camargo AC (1982) Brain endo-oligopeptidase B: a post-proline cleaving enzyme that inactivates angiotensin I and H. Hypertension 4:178-184.
Griffiths EC, Baris C, Visser TJ, Klootwijk W (1985) Thyrotrophin-releasing hormone inactivation by human postmortem brain. Regul Pept 10:145-155.
Griffiths EC, McDermott JR, Smith AI (1982) Mechanisms of brain inactivation of centrally-acting thyrotrophin-releasing hormone (TRH) analogues: a high- performance liquid chromatography study. Regul Pept 5:1-11.
Gros C, Giros B, Schwartz JC (1985) Identification of aminopeptidase M as an enkephalin-inactivating enzyme in rat cerebral membranes. Biochemistry 24:2179-2185.
Guillemin R, Burgus R (1972) The hormones of the hypothalamus. Sci Am 227:24-33.
228 BIBLIOGRAFIA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 229
Guyton AC, Hall, J.E. (1997) Tratado de Fisiología Médica, IX edición Edition: McGraw-Hill Interamericana.
Guzick DS, Overstreet JW, Factor-Litvak P, Brazil CK, Nakajima ST, Coutifaris C, Carson SA, Cisneros P, Steinkampf MP, Hill JA, Xu D, Vogel DL (2001) Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. N Engl J Med 345:1388-1393.
Hammerstedt RH, Parks JE (1987) Changes in sperm surfaces associated with epididymal transit. J Reprod Fértil Suppl 34:133-149.
Harrison LM, Kastin AJ, Zadina JE (1998) Opiate tolerance and dependence: receptors, G-proteins, and antiopiates. Peptides 19:1603-1630.
Hawkes WC, Turek PJ (2001) Effects of dietary selenium on sperm motility in healthy men. J Androl 22:764-772.
Hawkins EF, Wade R, Engel WK (1987) Lack of usefulness of DN-1417 for characterization of a CNS receptor for thyrotropin-releasing hormone. J Neurochem 49:239-245.
He W, Barrow CJ (1999) The A beta 3-pyroglutamyl and 11-pyroglutamyl peptides found in senile plaque have greater beta-sheet forming and aggregation propensities in vitro than full-length A beta. Biochemistry 38:10871-10877.
Heder G, Bottger A, Siems WE, Halatsch WR, Steinmann C (1988) [The determination of neutral metalloendopeptidase (enkephalinase A) in biological material]. Pharmazie 43:637-639.
Heinlein CA, Chang C (2004) Androgen receptor in prostate cancer. Endocr Rev 25:276-308.
Hersh LB (1982) Degradation of enkephalins: the search for an enkephalinase. Mol Cell Biochem 47:35-43.
Hersh LB (1985) Characterization of membrane-bound aminopeptidases from rat brain: identification of the enkephalin-degrading aminopeptidase. J Neurochem 44:1427-1435.
Hersh LB, Aboukhair N, Watson S (1987) Immunohistochemical localization of aminopeptidase M in rat brain and periphery: relationship of enzyme localization and enkephalin metabolism. Peptides 8:523-532.
Hohlbrugger G, Schweisfurth H, Dahlheim H (1982) Angiotensin I converting enzyme in rat testis, epididymis and vas deferens under different conditions. J Reprod Fértil 65:97-103.
BIBLIOGRAFIA 229
230 Asier Valdivia Doktoíe-T esia
Hooper NM, Karran EH, Turner AJ (1997) Membrane protein secretases. Biochem J 321 ( Pt 2):265-279.
Hooper NM, Keen J, Pappin DJ, Turner AJ (1987) Pig kidney angiotensin converting enzyme. Purification and characterization of amphipathic and hydrophilic forms of the enzyme establishes C-terminal anchorage to the plasma membrane. Biochem J 247:85-93.
Horak S, Polanska J, Widlak P (2003) Bulky DNA adducts in human sperm: relationship with fertility, semen quality, smoking, and environmental factors. Mutat Res 537:53-65.
Horita A (1998) An update on the CNS actions of TRH and its analogs. Life Sci 62:1443-1448.
Huang K, Takahara S, Kinouchi T, Takeyama M, Ishida T, Ueyama H, Nishi K, Ohkubo I (1997) Alanyl aminopeptidase from human seminal plasma: purification, characterization, and immunohistochemical localization in the male genital tract. J Biochem (Tokyo) 122:779-787.
Hughes J (1983) Biogenesis, release and inactivation of enkephalins and dynorphins. Br Med Bull 39:17-24.
Hui KS, Wang YJ, Lajtha A (1983) Purification and characterization of an enkephalin aminopeptidase from rat brain membranes. Biochemistry 22:1062-1067.
Irazusta J, Larrinaga G, Gonzalez-Maeso J, Gil J, Meana JJ, Casis L (2002) Distribution of prolyl endopeptidase activities in rat and human brain. Neurochem Int 40:337-345.
Jackson IM, Reichlin S (1974) Thyrotropin-releasing hormone (TRH): distribution in hypothalamic and extrahypothalamic brain tissues of mammalian and submammalian chordates. Endocrinology 95:854-862.
Jardinaud F, Banisadr G, Noble F, Melik-Parsadaniantz S, Chen H, Dugave C, Laplace H, Rostene W, Foumie-Zaluski MC, Roques BP, Popovici T (2004) Ontogenic and adult whole body distribution of aminopeptidase N in rat investigated by in vitro autoradiography. Biochimie 86:105-113.
Jones R (1998) Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis. J Reprod Fértil Suppl 53:73-84.
Jones RC (1998) Evolution of the vertebrate epididymis. J Reprod Fértil Suppl 53:163- 181.
230 BIBLIOGRAFIA
Doktore-T esia Asiet Valdivia Palacín 231
Jope T, Lammert A, Kratzsch J, Paasch U, Glander HJ (2003) Leptin and leptin receptor in human seminal plasma and in human spermatozoa. Int J Androl 26:335-341.
Jouannet P, Wang C, Eustache F, Kold-Jensen T, Auger J (2001) Semen quality and male reproductive health: the controversy about human sperm concentration decline. Apmis 109:333-344.
Kakidani H, Furutani Y, Takahashi H, Noda M, Morimoto Y, Hirose T, Asai M, Inayama S, Nakanishi S, Numa S (1982) Cloning and sequence analysis of cDNA for porcine beta-neo-en4orphin/dynorphin precursor. Nature 298:245- 249.
Kalwant S, Porter AG (1991) Purification and characterization of human brain prolyl endopeptidase. Biochem J 276 ( Pt l):237-244.
Kato T, Nakano T, Kojima K, Nagatsu T, Sakakibara S (1980) Changes in prolyl endopeptidase during maturation of rat brain and hydrolysis of substance P by the purified enzyme. J Neurochem 35:527-535.'
Kato T, Okada M, Nagatsu T (1980) Distribution of post-proline cleaving enzyme in human brain and the peripheral tissues. Mol Cell Biochem 32:117-121.
Kelly RW (1995) Immunosuppressive mechanisms in semen: implications for contraception. Hum Reprod 10:1686-1693.
Kennedy AM, Morrell JM, Siviter RJ, Cockle SM (1997) Fertilization-promoting peptide in reproductive tissues and semen of the male marmoset (Callithrix jacchus). Mol Reprod Dev 47:113-119.
Kenny AJ (1986) Regulatory peptide metabolism at cell surfaces: the key role of endopeptidase-24.11. Biomed Biochim Acta 45:1503-1513.
Kerr MA, Kenny AJ (1974) The purification and specificity of a neutral endopeptidase from rabbit kidney brush border. Biochem J 137:477-488.
Kew D, Muffly KE, Kilpatrick DL (1990) Proenkephalin products are stored in the sperm acrosome and may function in fertilization. Proc Natl Acad Sci U S A 87:9143-9147.
Kew D, Muffly KE, Kilpatrick DL (1990) Proenkephalin products are stored in the sperm acrosome and may function in fertilization. Proc Natl Acad Sci U S A 87:9143-9147.
BIBLIOGRAFIA 231
232 Asier Valdivia Doktore-T esia
Khan Z, Aitken A, García JR, Smyth DG (1992) Isolation and identification of two neutral thyrotropin releasing hormone-like peptides,pyroglutamylphenylalanineproline amide and pyroglutamylglutamineproline amide, from human seminal fluid. J Biol Chem 267:7464-7469.
Kidd SA, Eskenazi B, Wyrobek AJ (2001) Effects of male age on semen quality and fertility: a review of the literature. Fértil Steril 75:237-248.
Kilpatrick DL, Borland K, Jin DF (1987) Differential expression of opioid peptide genes by testicular germ cells and somatic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 84:5695-5699.
Kim J, Coetzee GA (2004) Prostate specific antigen gene regulation by androgen receptor. J Cell Biochem 93:233-241.
Kimura A, Matsui H, Takahashi T (2002) Expression and localization of prolyl oligopeptidase in mouse testis and its possible involvement in sperm motility. Zoolog Sci 19:93-102.
Kimura A, Ohnishi J, Okimura H, Hamabata T, Takahashi T (1998) Localization of prolyl endopeptidase mRNA in small growing follicles of porcine ovary. Mol ReprodDev 50:121-127.
King AC, Cuatrecasas P (1981) Peptide hormone-induced receptor mobility, aggregation, and internalization. N Engl J Med 305:77-88.
Kodentsova VM, Vrzesinskaya OA, Spirichev VB (1994) Male fertility: a possible role of vitamins. Ukr Biokhim Zh 66:17-22.
Koida M, Walter R (1976) Post-proline cleaving enzyme. Purification of this endopeptidase by affinity chromatography. J Biol Chem 251:7593-7599.
Kosterlitz HW, Waterfield AA (1975) In vitro models in the study of structure-activity relationships of narcotic analgesics. Annu Rev Pharmacol 15:29-47.
Kucheria K, Sax en a R, Mohan D (1985) Semen analysis in alcohol dependence syndrome. Andrologia 17:558-563.
Kunzle R, Mueller MD, Hanggi W, Birkhauser MH, Drescher H, Bersinger NA (2003) Semen quality of male smokers and nonsmokers in infertile couples. Fértil Steril 79:287-291.
Lamberton RP, Lechan RM, Jackson IM (1984) Ontogeny of thyrotropin-releasing hormone and histidyl proline diketopiperazine in the rat central nervous system and pancreas. Endocrinology 115:2400-2405.
232 BIBLIOGRAFIA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 233
Lamer AJ (1999) Hypothesis: amyloid beta-peptides truncated at the N-terminus contribute to the pathogenesis of Alzheimer's disease. Neurobiol Aging 20:65- 69.
Lauffart B, Mantle D (1988) Rationalization of aminopeptidase activities in human skeletal muscle soluble extract. Biochim Biophys Acta 956:300-306.
Leppaluoto J, Koivusalo F, Kraama R (1978) Thyrotropin-releasing factor: distribution in neural and gastrointestinal tissues. Acta Physiol Scand 104:175-179.
Levy R, Eustache F, Pilikian S, Clavel C, Cordonier H, Benchaib M, Lomage J, Pinatel MC, Guerin JF (1996) Effect of gastrin-releasing peptide on sperm functions. Mol Hum Reprod 2:867-872.
Li CH, Lemaire S, Yamashiro D, Doneen BA (1976) The synthesis and opiate activity ofbeta-endorphin. Biochem Biophys Res Commun 71:19-25.
Lilja H, Laurell CB (1984) Liquefaction of coagulated human semen. Scand J Clin Lab Invest 44:447-452.
Lin JW, Ju W, Foster K, Lee SH, Ahmadian G, Wyszynski M, Wang YT, Sheng M (2000) Distinct molecular mechanisms and divergent endocytotic pathways of AMPA receptor internalization. Nat Neurosci 3:1282-1290.
Lin LN, Brandts JF (1983) Evidence showing that a proline-specific endopeptidase has an absolute requirement for a trans peptide bond immediately preceding the active bond. Biochemistry 22:4480-4485.
Louvard D, Maroux S, Vannier C, Desnuelle P (1975) Topological studies on the hydrolases bound to the intestinal brush border membrane. I. Solubilization by papain and Triton X-100. Biochim Biophys Acta 375:235-248.
Lynch DR, Snyder SH (1986) Neuropeptides: multiple molecular forms, metabolic pathways, and receptors. Annu Rev Biochem 55:773-799.
Ma Y, Zhang S, Xia Q, Zhang G, Huang X, Huang M, Xiao C, Pan A, Sun Y, Lebo R, Milunsky A (2002) Molecular characterization of the TCP 11 gene which is the human homologue of the mouse gene encoding the receptor of fertilization promoting peptide. Mol Hum Reprod 8:24-31.
Mack S, Bhattacharyya AK, Joyce C, van der Ven H, Zaneveld LJ (1983) Acrosomal enzymes o f human spermatozoa before and after in vitro capacitation. Biol Reprod 28:1032-1042.
Maes M, Goossens F, Scharpe S, Calabrese J, Desnyder R, Meltzer HY (1995) Alterations in plasma prolyl endopeptidase activity in depression, mania, and schizophrenia: effects of antidepressants, mood stabilizers, and antipsychotic drugs. Psychiatry Res 58:217-225.
BIBLIOGRAFIA 233
234 Asier Valdivia Doktore-T esia
Maes M, Goossens F, Scharpe S, Meltzer HY, D’Hondt P, Cosyns P (1994) Lower serum prolyl endopeptidase enzyme activity in major depression: further evidence that peptidases play a role in the pathophysiology of depression. Biol Psychiatry 35:545-552.
Malfroy B, Swerts JP, Guyon A, Roques BP, Schwartz JC (1978) High-affinity enkephalin-degrading peptidase in brain is increased after morphine. Nature 276:523-526.
Manaker S, Eichen A, Winokur A, Rhodes CH, Rainbow TC (1986) Autoradiographic localization of thyrotropin releasing hormone receptors in human brain. Neurology 36:641-646.
Mantle D, Falkous G, Ishiura S, Blanchard PJ, Perry EK (1996) Comparison of proline endopeptidase activity in brain tissue from normal cases and cases with Alzheimer's disease, Lewy body dementia, Parkinson's disease and Huntington's disease. Clin Chim Acta 249:129-139.
Matsas R, Stephenson SL, Hryszko J, Kenny AJ, Turner AJ (1985) The metabolism of neuropeptides. Phase separation of synaptic membrane preparations with Triton X-l 14 reveals the presence of aminopeptidase N. Biochem J 231:445-449.
McDonald JK, Barret, A. (1986) Mammalian proteases: A Glossary and Bibliography. London.
McKelvy JF, Blumberg S (1986) Inactivation and metabolism of neuropeptides. Annu Rev Neurosci 9:415-434.
McLellan S, Dyer SH, Rodriguez G, Hersh LB (1988) Studies on the tissue distribution of the puromycin-sensitive enkephalin-degrading aminopeptidases. J Neurochem 51:1552-1559.
Mehta MK, Garde SV, Sheth AR (1995) Occurrence of FSH, inhibin and other hypothalamic-pituitary-intestinal hormones in normal fertility, subfertility, and tumors of human testes. Int J Fértil Menopausal Stud 40:39-46.
Mehta ND, Don J, Zinn SA, Millette C, Wolgemuth DJ, Kilpatrick DL (1994) Proenkephalin gene expression in testicular interstitial cells is down-regulated coincident with the appearance of pachytene spermatocytes. Endocrinology 135:1543-1550.
Mendez M, Cruz C, Joseph-Bravo P, Wilk S, Charli JL (1990) Evaluation of the role of prolyl endopeptidase and pyroglutamyl peptidase I in the metabolism of LHRH and TRH in brain. Neuropeptides 17:55-62.
234 BIBLIOGRAFIA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 235
Metayer S, Dacheux F, Dacheux JL, Gatti JL (2002) Germinal angiotensin I-converting enzyme is totally shed from the rodent sperm membrane during epididymal maturation. Biol Reprod 67:1763-1767.
Meunier JC, Mollereau C, Toll L, Suaudeau C, Moisand C, Alvinerie P, Butour JL, Guillemot JC, Ferrara P, Monsarrat B, et al. (1995) Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor. Nature 377:532- 535.
Mineyama R, Saito K (1998) Partial purification and some properties of pyroglutamyl peptidase from Enterococcus faecalis. Microbios 94:47-62.
Mishima Y, Matsumoto-Mishima Y, Terui Y, Katsuyama M, Yamada M, Mori M, Ishizaka Y, Ikeda K, Watanabe J, Mizunuma N, Hayasawa H, Hatake K (2002) Leukemic cell-surface CD13/aminopeptidase N and resistance to apoptosis mediated by endothelial cells. J Natl Cancer Inst 94:1020-1028.
Mizutani T, Schill WB (1985) Motility of seminal plasma-free spermatozoa in the presence of several physiological compounds. Andrologia 17:150-156.
Mobbs BG, Johnson IE, Connolly JG (1980) The effect of therapy on the concentration and occupancy of androgen receptors in human prostatic cytosol. Prostate 1:37-51.
Monsees TK, Gomig M, Schill WB, Miska W (1998) Possible involvement of proteases in the regulation of spermatogenesis. Andrologia 30:185-191.
Morain P, Lestage P, De Nanteuil G, Jochemsen R, Robin JL, Guez D, Boyer PA (2002) S 17092: a prolyl endopeptidase inhibitor as a potential therapeutic drug for memory impairment. Preclinical and clinical studies. CNS Drug Rev 8:31-52.
Morales P (1998) Gonadotropin-releasing hormone increases ability of the spermatozoa to bind to the human zona pellucida. Biol Reprod 59:426-430.
Morales P, Vantman D, Madariaga M (1999) Sperm penetration through the human zona pellucida as a predictor of in vitro fertilization. Andrologia 31:131-135.
Mori M, Jayaraman A, Prasad C, Pegues J, Wilber JF (1982) Distribution of histidyl- proline diketopiperazine [cyclo (His-Pro)] and thyrotropin-releasing hormone (TRH) in the primate central nervous system. Brain Res 245:183-186.
Moriyama A, Nakanishi M, Sasaki M (1988) Porcine muscle prolyl endopeptidase and its endogenous substrates. J Biochem (Tokyo) 104:112-117.
BIBLIOGRAFIA 235
236 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Morley JE, Garvin TJ, Pekary AE, Hershman JM (1977) Thyrotropin-releasing hormone in the gastrointestinal tract. Biochem Biophys Res Commun 79:314- 318.
Morley JE, Sawin CT, Carlson HE, Longcope C, Hershman JM (1981) The relationship of androgen to the thyrotropin and prolactin responses to thyrotropin-releasing hormone in hypogonadal and normal men. J Clin Endocrinol Metab 52:173-176.
Morris ID, Bardin CW, Musto NA, Thau RB, Gunsalus GL (1987) Evidence suggesting that germ cells influence the bidirectional secretion of androgen binding protein by the seminiferous epithelium demonstrated by selective impairment of spermatogenesis with busulphan. Int J Androl 10:691-700.
Multigner L, Oliva A (2002) Secular variations in sperm quality: fact or science fiction? Cad Saude Publica 18:403-412.
Munkelwitz R, Gilbert BR (1998) Are boxer shorts really better? A critical analysis of the role of underwear type in male sub fertility. J Urol 160:1329-1333.
Naghettini AV, Nogueira PC, Juliano M, Bueno AA, Casarini DE, de Abreu Carvalhaes JT (2001) Tubular urinary enzymes in acute post-infectious glomerulonephritis. Pediatr Nephrol 16:719-722.
Nakanishi S, Inoue A, Kita T, Nakamura M, Chang AC, Cohen SN, Numa S (1979) Nucleotide sequence of cloned cDNA for bovine corticotropin-beta-lipotropin precursor. Nature 278:423-427.
Noble F, Banisadr G, Jardinaud F, Popovici T, Lai-Kuen R, Chen H, Bischoff L, Parsadaniantz SM, Foumie-Zaluski MC, Roques BP (2001) First discrete autoradiographic distribution of aminopeptidase N in various structures of rat brain and spinal cord using the selective iodinated inhibitor [125I]RB 129. Neuroscience 105:479-488.
Noble F, Foumie-Zaluski MC, Roques BP (1999) [Enkephalin catabolism inhibitors and antalgics of the future: from preclinical research to clinical trials]. Therapie 54:121-133.
O'Connor B, O'Cuinn G (1985) Purification of and kinetic studies on a narrow specificity synaptosomal membrane pyroglutamate aminopeptidase from guinea-pig brain. Eur J Biochem 150:47-52.
O'Cuinn G, O'Connor B, Elmore M (1990) Degradation of thyrotropin-releasing hormone and luteinising hormone-releasing hormone by enzymes of brain tissue. J Neurochem 54:1-13.
O'Cuinn G, O'Connor B, Elmore M (1990) Degradation of thyrotropin-releasing hormone and luteinising hormone-releasing hormone by enzymes of brain tissue. J Neurochem 54:1-13.
236 BIBLIOGRAFIA
Doktote-T esia Asier Valdivia Palacín 237
Odagaki Y, Hayashi A, Okada K, Hirotsu K, Kabashima T, Ito K, Yoshimoto T, Tsuru D, Sato M, Ciardy J (1999) The crystal structure of pyroglutamyl peptidase I from Bacillus amyloliquefaciens reveals a new structure for a cysteine protease. Structure Fold Des 7:399-411.
Odaka C, Mizuochi T, Shirasawa T, Morain P, Checler F (2002) Murine T cells expressing high activity of prolyl endopeptidase are susceptible to activation- induced cell death. FEBS Lett 512:163-167.
O'Hara BF, Donovan DM, Lindberg I, Brannock MT, Ricker DD, Moffatt CA, Klaunberg BA, Schindler C, Chang TS, Nelson RJ, et al. (1994) Proenkephalin transgenic mice: a short promoter confers high testis expression and reduced fertility. Mol Reprod Dev 38:275-284.
Ohkubo I, Huang K, Ochiai Y, Takagaki M, Kani K (1994) Dipeptidyl peptidase IV from porcine seminal plasma: purification, characterization, and N-terminal amino acid sequence. J Biochem (Tokyo) 116:1182-1186.
O'Leary RM, Gallagher SP, O'Connor B (1996) Purification and characterization of a novel membrane-bound form of prolyl endopeptidase from bovine brain. Int J Biochem Cell Biol 28:441-449.
O'Leary RM, O'Connor B (1995) Identification and localisation of a synaptosomal membrane prolyl endopeptidase from bovine brain. Eur J Biochem 227:277- 283.
Ondetti MA, Rubin B, Cushman DW (1977) Design of specific inhibitors of angiotensin-converting enzyme: new class of orally active antihypertensive agents. Science 196:441-444.
Orlowski M, Wilk E, Pearce S, Wilk S (1979) Purification and properties of a prolyl endopeptidase from rabbit brain. J Neurochem 33:461-469.
Ortega-Alvaro A, Chover-Gonzalez AJ, Lai-Kuen R, Mico JA, Gibert-Rahola J, Foumie-Zaluski MC, Roques BP, Maldonado R (1998) Antinociception produced by the peptidase inhibitor, RB 101, in rats with adrenal medullary transplant into the spinal cord. Eur J Pharmacol 356:139-148.
Osada T, Watanabe G, Kondo S, Toyoda M, Sakaki Y, Takeuchi T (2001) Male reproductive defects caused by puromycin-sensitive aminopeptidase deficiency in mice. Mol Endocrinol 15:960-971.
Ouimet T, Facchinetti P, Rose C, Bonhomme MC, Gros C, Schwartz JC (2000) Neprilysin H: A putative novel metalloprotease and its isoforms in CNS and testis. Biochem Biophys Res Commun 271:565-570.
BIBLIOGRAFIA 237
238 Asier Valdivia Doktoie-Tesia
Palacios JM, Dietl MM (1987) Regulatory peptide receptors: visualization by autoradiography. Experientia 43:750-761.
Pan C, Cardarelli PM, Nieder MH, Pickford LB, Gangwar S, King DJ, Yarranton GT, Buckman D, Roscoe W, Zhou F, Salles A, Chen TH, Horgan K, Wang YH, Nguyen T, Bebbington CR (2003) CD 10 is a key enzyme involved in the activation of tumor-activated peptide prodrug CPI-0004Na and novel analogues: implications for the design of novel peptide prodrugs for the therapy of CD10+ tumors. Cancer Res 63:5526-5531.
Pardo G, Legua V, Remohi J, Bonilla-musoles F (1985) [Review and update: marijuana and reproduction]. Acta Ginecol (Madr) 42:420-429.
Pariset CC, Feinberg JM, Dacheux JL, Weinman SJ (1985) Changes in calmodulin level and cAMP-dependent protein kinase activity during epididymal maturation of ram spermatozoa. J Reprod Fértil 74:105-112.
Pekary AE, Hershman JM, Friedman S (1983) Human semen contains thyrotropin releasing hormone (TRH), a TRH-homologous peptide, and TRH-binding substances. J Androl 4:399-407.
Pert CB, Pert A, Chang JK, Fong BT (1976) (D-Ala2)-Met-enkephalinamide: a potent, long-lasting synthetic pentapeptide analgesic. Science 194:330-332.
Peterkofsky A, Battaini F, Koch Y, Takahara Y, Dannies P (1982) Histidyl-proline diketopiperazine: its biological role as a regulatory peptide. Mol Cell Biochem 42:45-63.
Pintado CO, Pinto FM, Pennefather JN, Hidalgo A, Baamonde A, Sanchez T,Candenas ML (2003) A role for tachykinins in female mouse and ratreproductive function. Biol Reprod 69:940-946.
Pizzi M, Boroni F, Benarese M, Moraitis C, Memo M, Spano P (1999) Neuroprotective effect of thyrotropin-releasing hormone against excitatory amino acid-induced cell death in hippocampal slices. Eur J Pharmacol 370:133-137.
Porkka KP, Visakorpi T (2004) Molecular mechanisms of prostate cancer. Eur Urol 45:683-691.
Porter JN HR, Hesseltie CW, Krupka G, Lowery JA, Wallace WS, Bohonos N,Williams JH (1952) Antibiot. and Chemoterapy.
Prasad C, Mori M, Wilber JF, Pierson W, Pegues J, Jayaraman A (1982) Distribution and metabolism of cyclo (His-Pro): a new member o f the neuropeptide family. Peptides 3:591-598.
238 BIBLIOGRAFIA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 239
Prieto I, Martinez A, Martinez JM, Ramirez MJ, Vargas F, Alba F, Ramirez M (1998) Activities of aminopeptidases in a rat saline model of volume hypertension. Horm Metab Res 30:246-248.
Puri S, Puri VN (1985) Urinary vasopressin in male infertility. Arch Androl 14:263- 265.
Ragni G, De Lauretis L, Bestetti O, Sghedoni D, Gambaro V (1988) Gonadal function in male heroin and methadone addicts. Int J Androl 11:93-100.
Ragni G, De Lauretis L, Gambaro V, Di Pietro R, Bestetti O, Recalcati F, Papetti C (1985) Semen evaluation in heroin and methadone addicts. Acta Eur Fértil 16:245-249.
Ramirez-Exposito MJ, Robert-Baudouy J, Mayas MD, Garcia MJ, Ramirez M, Martinez-Martos JM (2001) Acetylcholinesterase inhibitor SDZ ENA 713 (Rivastigmine) increases brain pyrrolidone carboxyl peptidase activity. Eur Neuropsychopharmacol 11:381-383.
Raz E (2004) Guidance of primordial germ cell migration. Curr Opin Cell Biol 16:169- 173.
Reaux A, Foumie-Zaluski MC, David C, Zini S, Roques BP, Corvol P, Llorens-Cortes C (1999) Aminopeptidase A inhibitors as potential central antihypertensive agents. Proc Natl Acad Sci U S A 96:13415-13420.
Reinscheid RK, Nothacker H, Civelli O (2000) The orphanin FQ/nociceptin gene: structure, tissue distribution of expression and functional implications obtained from knockout mice. Peptides 21:901-906.
Reinscheid RK, Nothacker HP, Bourson A, Ardati A, Henningsen RA, Bunzow JR, Grandy DK, Langen H, Monsma FJ, Jr., Civelli O (1995) Orphanin FQ: a neuropeptide that activates an opioidlike G protein-coupled receptor. Science 270:792-794.
Relton JM, Gee NS, Matsas R, Turner AJ, Kenny AJ (1983) Purification of endopeptidase-24.11 ('enkephalinase') from pig brain by immunoadsorbent chromatography. Biochem J 215:519-523.
Ronquist G, Brody I (1985) The prostasome: its secretion and function in man. Biochim Biophys Acta 822:203-218.
Roques BP, Noble, F., Foumie-Zaluski M.C. (1999) Endogenous opioid peptides and analgesia: Cambridge University Press.
BIBLIOGRAFIA 239
240 Asier Valdivia Doktofe-T esia
Roques BP, Fourni e-Zaluski MC, Soroca E, Lecomte JM, Malfroy B, Llorens C, Schwartz JC (1980) The enkephalinase inhibitor thiorphan shows antinociceptive activity in mice. Nature 288:286-288.
Rosenblum JS, Kozarich JW (2003) Prolyl peptidases: a serine protease subfamily with high potential for drug discovery. Curr Opin Chem Biol 7:496-504.
Ryan JW, Chung AY, Nearing JA, Valido FA, Shun-Cun C, Berryer P (1993) A radiochemical assay for aminopeptidase N. Anal Biochem 210:27-33.
Saez F, Frenette G, Sullivan R (2003) Epididymosomes and prostasomes: their roles in posttesticular maturation of the sperm cells. J Androl 24:149-154.
Saez F, Motta C, Boucher D, Grizard G (1998) Antioxidant capacity of prostasomes in human semen. Mol Hum Reprod 4:667-672.
Safavi A, Hersh LB (1995) Degradation of dynorphin-related peptides by the puromycin-sensitive aminopeptidase and aminopeptidase M. J Neurochem 65:389-395.
Safran M, Wu CF, Emerson CH (1982) Thyrotropin-releasing hormone metabolism in visceral organ homogenates of the rat. Endocrinology 110:2101-2106.
Sastry BV, Janson VE, Owens LK (1991) Significance of substance P- and enkephalin- peptide systems in the male genital tract. AnnN Y Acad Sci 632:339-353.
Sastry BV, Janson VE, Owens LK, Tayeb OS (1982) Enkephalin- and substance P-like immunoreactivities of mammalian sperm and accessory sex glands. Biochem Pharmacol 31:3519-3522.
Schaller J, Glander HJ (2000) Flow cytometric analysis o f enzymes in live spermatozoa before and after cryostorage. Andrologia 32:357-364.
Schalling M, Persson H, Pelto-Huikko M, Odum L, Ekman P, Gottlieb C, Hokfelt T, Rehfeld JF (1990) Expression and localization of gastrin messenger RNA and peptide in spermatogenic cells. J Clin Invest 86:660-669.
Scharrer B (1978) Peptidergic neurons: facts and trends. Gen Comp Endocrinol 34:50- 62.
Schill WB, Miska W (1992) Possible effects of the kallikrein-kinin system on male reproductive functions. Andrologia 24:69-75.
Schneider JS, Giardiniere M, Morain P (2002) Effects of the prolyl endopeptidase inhibitor S 17092 on cognitive deficits in chronic low dose MPTP-treated monkeys. Neuropsychopharmacology 26:176-182.
240 BIBLIOGRAFIA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 241
Schuel H, Burkman LJ, Lippes J, Crickard K, Mahony MC, Giuffiida A, Picone RP, Makriyannis A (2002) Evidence that anandamide-signaling regulates human sperm functions required for fertilization. Mol Reprod Dev 63:376-387.
Schulze W (1982) Evidence of a wave of spermatogenesis in human testis. Andrologia 14:200-207.
Schwartz JC, de îa Baume S, Yi CC, Chaillet P, Marcais-Collado H, Costentin J (1983) Peptidases involved in the inactivation of exogenous and endogenous enkephalins. J Neural Transm Suppl 18:235-243.
Scott R, MacPherson A, Yates RW, Hussain B, Dixon J (1998) The effect of oral selenium supplementation on human sperm motility. Br J Urol 82:76-80.
Sekine K, Fujii H, Abe F, Nishikawa K (2001) Augmentation of death ligand-induced apoptosis by aminopeptidase inhibitors in human solid tumor cell lines. Int J Cancer 94:485-491.
Serrano II, Garcia-Suarez D (2001) Molecular aspects of mammalian fertilization. Asian J Androl 3:243-249.
Shah C, Modi D, Gadkar S, Sachdeva G, Puri C (2003) Progesterone receptors on human spermatozoa. Indian J Exp Biol 41:773-780.
Shan L, Molberg O, Parrot I, Hausch F, Filiz F, Gray GM, Sollid LM, Khosla C (2002) Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue, Science 297:2275-2279.
Sharif NA (1988) Chronic prolactin, gonadal and thyroid hormone treatments in vivo alter levels of TRH and muscarinic receptors in male and female rat tissues. Brain Res 449:364-368.
Sharma RK, Agarwal A (1996) Role of reactive oxygen species in male infertility. Urology 48:835-850.
Shen R, Sumitomo M, Dai J, Harris A, Kaminetzky D, Gao M, Bumstein KL, Nanus DM (2000) Androgen-induced growth inhibition of androgen receptor expressing androgen-independent prostate cancer cells is mediated by increased levels of neutral endopeptidase. Endocrinology 141:1699-1704.
Shi ZX, Xu W, Mergner WJ, Li QL, Cole KH, Wilber JF (1996) Localization of thyrotropin-releasing hormone mRNA expression in the rat heart by in situ hybridization histochemistry. Pathobiology 64:314-319.
Shimizu T, Tani K, Hase K, Ogawa H, Huang L, Shinomiya F, Soné S (2002) CD13/aminopeptidase N-induced lymphocyte involvement in inflamed joints of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 46:2330-2338.
BIBLIOGRAFIA 241
242 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Shirai M, Matsuda S, Mitsukawa S, Nakamura M, Yonezawa K (1975) FSH, LH and testosterone levels in human seminal plasma. Tohoku J Exp Med 116:201-202.
Shishido Y, Furushiro M, Tanabe S, Shibata S, Hashimoto S, Yokokura T (1999) Effects of prolyl endopeptidase inhibitors and neuropeptides on delayed neuronal death in rats. Eur J Pharmacol 372:135-142.
Siems WE, Maul B, Wiesner B, Becker M, Walther T, Rothe L, Winkler A (2003) Effects of kinins on mammalian spermatozoa and the impact of peptidolytic enzymes. Andrologia 35:44-54.
Simon EJ (1973) In search of the opiate receptor. Am J Med Sci 266:160-168.Siviter RJ, Cockle SM (1995) Peptides related to thyrotrophin-releasing hormone are
degraded in seminal plasma by an enzyme similar to prolyl endopeptidase. J Endocrinol 144:61-66.
Solhonne B, Gros C, Pollard H, Schwartz JC (1987) Major localization of aminopeptidase M in rat brain microvessels. Neuroscience 22:225-232.
Somlev B, Subev M (1998) Effect of kininase II inhibitors on bradykinin-stimulated bovine sperm motility. Theriogenology 50:651-657.
Spillantini MG, Sicuteri F, Salmon S, Malfroy B (1990) Characterization of endopeptidase 3.4.24.11 ("enkephalinase") activity in human plasma and cerebrospinal fluid. Biochem Pharmacol 39:1353-1356.
Stanziola L, Greene LJ, Santos RA (1999) Effect of chronic angiotensin converting enzyme inhibition on angiotensin I and bradykinin metabolism in rats. Am J Hypertens 12:1021-1029.
Starz-Gaiano M, Lehmann R (2001) Moving towards the next generation. Mech Dev 105:5-18.
Steers WD (1994) Physiology of the vas deferens. World J Urol 12:281-285.
Stegmayr B, Ronquist G (1982) Stimulation of sperm progressive motility by organelles in human seminal plasma. Scand J Urol Nephrol 16:85-90.
Stone TW (1983) Actions o f TRH and cyclo-(His-Pro) on spontaneous and evoked activity of cortical neurones. Eur J Pharmacol 92:113-118.
Straub RE, Freeh GC, Joho RH, Gershengom MC (1990) Expression cloning of a cDNA encoding the mouse pituitary thyrotropin-releasing hormone receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 87:9514-9518.
Sullivan JM, Dluhy RG, Wacker WE, Solomon HS, Williams GH, Samaha JK (1978) Interrelationships among thiazide diuretics and calcium, magnesium, sodium, and potassium balance in normal and hypertensive man. J Clin Pharmacol 18:530-543.
242 BIBLIOGRAFIA
Doktore-Tesia Asiet Valdivia Palacín 243
Sutton KA (2000) Molecular mechanisms involved in the differentiation of spermatogenic stem cells. Rev Reprod 5:93-98.
Tanemura K, Kurohmaru M, Kuramoto K, Hayashi Y (1993) Age-related morphological changes in the testis of the BDF1 mouse. J Vet Med Sci 55 ROSTIO.
Tanemura K, Kurohmaru M, Kuramoto K, Matsumoto M, Hayashi Y (1994) Age- related changes in cytoskeletal components of the BDFl mouse Sertoli cell. Tissue Cell 26:447-455.
Tate SS (1981) Purification and properties of a bovine brain thyrotropin-releasing- factor deamidase. A post-proline cleaving enzyme of limited specificity. Eur J Biochem 118:17-23.
Taylor A (1993) Aminopeptidases: towards a mechanism of action. Trends Biochem Sci 18:167-171.
Templeton A (1995) Infertility-epidemiology, aetiology and effective management. Health Bull (Edinb) 53:294-298.
Terenius L (1973) Characteristics of the "receptor" for narcotic analgesics in synaptic plasma membrane fraction from rat brain. Acta Pharmacol Toxicol (Copenh) 33:377-384.
Tesarik J, Mendoza C (1992) Defective function of a nongenomic progesterone receptor as a sole sperm anomaly in infertile patients. Fértil Steril 58:793-797.
Thomas JE, Rylett CM, Carhan A, Bland ND, Bingham RJ, Shirras AD, Turner AJ, Isaac RE (2005) Drosophila melanogaster NEP2 is a new soluble member of the neprilysin family o f endopeptidases with implications for reproduction and renal fonction. Biochem J 386:357-366.
Thom NA, Russell JT, Torp-Pedersen C, Treiman M (1978) Calcium and neurosecretion. Ann N Y Acad Sci 307:618-639.
Tobler AR, Constam DB, Schmitt-Graff A, Malipiero U, Schlapbach R, Fontana A (1997) Cloning of the human puromycin-sensitive aminopeptidase and evidence for expression in neurons. J Neurochem 68:889-897.
Tres LL, Rosselot C, Kierszenbaum AL (2004) Primordial germ cells: what does it take to be alive? Mol Reprod Dev 68:1-4.
Tsuru D, Fujiwara K, Kado K (1978) Purification and characterization of L- pyrrolidonecarboxylate peptidase from Bacillus amyloiliquefaciens. J Biochem (Tokyo) 84:467-476.
BIBLIOGRAFIA 243
244 Asier Valdivia Doktote-T esia
Turner AJ (1986) Processing and metabolism of neuropeptides. Essays Biochem:69-119.
Turner AJ, Matsas R, Kenny AJ (1985) Are there neuropeptide-specific peptidases? Biochem Pharmacol 34:1347-1356.
Turner AJ, Matsas R, Kenny AJ (1985) Endopeptidase-24.11 and neuropeptide metabolism. Biochem Soc Trans 13:39-42.
Usmani BA, Harden B, Maitland NJ, Turner AJ (2002) Differential expression of neutral endopeptidase-24.11 (neprilysin) and endothelin-converting enzyme in human prostate cancer cell lines. Clin Sci (Lond) 103 Suppl 48:314S-317S.
Utleg AG, Yi EC, Xie T, Shannon P, White JT, Goodlett DR, Hood L, Lin B (2003) Proteomic analysis of human prostasomes. Prostate 56:150-161.
Vallee BL GA (1984) The metallobiochemistry of zinc enzymes. Adv Enzimol:283- 430.
Vanha-Perttula T, Ronkko S, Lahtinen R (1990) Hydrolases from bovine seminal vesicle, prostate and Cowper's gland. Andrologia 22 Suppl 1:10-24.
Vanhoof G, De Meester I, van Sande M, Scharpe S, Yaron A (1992) Distribution of proline-specific aminopeptidases in human tissues and body fluids. Eur J Clin Chem Clin Biochem 30:333-338.
Ventura C, Maioli M, Pintus G, Posadino AM, Tadolini B (1998) Nuclear opioid receptors activate opioid peptide gene transcription in isolated myocardial nuclei. J Biol Chem 273:13383-13386.
Vezina D, Mauffette F, Roberts KD, Bleau G (1996) Selenium-vitamin E supplementation in infertile men. Effects on semen parameters and micronutrient levels and distribution. Biol Trace Elem Res 53:65-83.
Vincent B, Beaudet A, Dauch P, Vincent JP, Checler F (1996) Distinct properties of neuronal and astrocytic endopeptidase 3.4.24.16: a study on differentiation, subcellular distribution, and secretion processes. J Neurosci 16:5049-5059.
Vinson GP, Puddefoot JR, Ho MM, Barker S, Mehta J, Saridogan E, Djahanbakhch O (1995) Type 1 angiotensin II receptors in rat and human sperm. J Endocrinol 144:369-378.
Vredenburgh-Wilberg WL, Parrish JJ (1995) Intracellular pH of bovine sperm increases during capacitation. Mol Reprod Dev 40:490-502.
244 BIBLIOGRAFIA
Doktote-Tesia Asier Valdivia Palacín 245
Wade MA, Jones RC, Murdoch RN, Aitken RJ (2003) Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis. Reproduction 125:175-183.
Wagner GW, Tavianini MA, Herrmann KM, Dixon JE (1981) Purification and characterization of an enkephalin aminopeptidase from rat brain. Biochemistry 20:3884-3890.
Waksman G, Bouboutou R, Devin J, Bourgoin S, Cesselin F, Hamon M, Fournie- Zaluski MC, Roques B (1985) In vitro and in vivo effects of kelatorphan on enkephalin metabolism in rodent brain. Eur J Pharmacol 117:233-243.
Walter R, Shlank H, Glass JD, Schwartz IL, Kerenyi TD (1971) Leucylglycinamide released from oxytocin by human uterine enzyme. Science 173:827-829.
Wen XH, Yang ZW (2000) Quantitative (stereological) study on the spermatozoal storage capacity of epididymis in rats and monkeys. Asian J Androl 2:73-77.
Wenger T, Bouhdiba M, Saint Pol P, Ciofi P, Tramu G, Leonardelli J (1990) Presence of neuropeptide—Y and its C-terminal flanking peptide immuno-reactivity in the seminiferous tubules of human testis. Andrologia 22:299-303.
WHO laboratory manual for the examination of huma semen and sperm-cervical mucus interaction. World Health Organization. 1999. Cambridge University Press.
Wilk S (1983) Prolyl endopeptidase. Life Sci 33:2149-2157.
Wilk SaW, E.K. (1989) Pyroglutamyl Peptidase II: a thyrotropin releasing hormone degrading enzyme: purification and specificity studies of the rabbit brain enzyme. Neurochem Int 15:81-90.
Williams RS, Cheng L, Mudge AW, Harwood AJ (2002) A common mechanism of action for three mood-stabilizing drugs. Nature 417:292-295.
Willingham MC, Maxfield FR, Pastan I (1980) Receptor-mediated endocytosis of alpha 2-macroglobulin in cultured fibroblasts. J Histochem Cytochem 28:818- 823.
Wilson MJ, Ruhland AR, Pryor JL, Ercole C, Sinha AA, Hensleigh H, Kaye KW, Dawkins HJ, Wasserman NF, Reddy P, Ahmed K (1998) Prostate specific origin of dipeptidylpeptidase IV (CD-26) in human seminal plasma. J Urol 160:1905-1909.
Winokur A, Utiger RD (1974) Thyrotropin-releasing hormone: regional distribution in rat brain. Science 185:265-267.
BIBLIOGRAFIA 245
246 Asier Valdivia Doktore-Tesia
Wong WY, Merkus HM, Thomas CM, Menkveld R, Zielhuis GA, Steegers-Theunissen RP (2002) Effects of folic acid and zinc sulfate on male factor subfertility: a double-blind, randomized, placebo-controlled trial. Fértil Steril 77:491-498.
Wong WY, Thomas CM, Merkus HM, Zielhuis GA, Doesburg WH, Steegers- Theunissen RP (2000) Cigarette smoking and the risk of male factor subfertility: minor association between cotinine in seminal plasma and semen morphology. Fértil Steril 74:930-935.
Wong WY, Thomas CM, Merkus JM, Zielhuis GA, Steegers-Theunissen RP (2000) Male factor subfertility: possible causes and the impact of nutritional factors. Fértil Steril 73:435-442.
Xu Y, Wellner D, Scheinberg DA (1995) Substance P and bradykinin are natural inhibitors of CD13/aminopeptidase N. Biochem Biophys Res Commun 208:664-674.
Yanagimachi R (1994) Mammalian Fertilization, In: Physiology of Reproduction (Knobil E, Neill, J., ed), pp 189-317. New York: New York Raven Press.
Yokosawa H, Miyata M, Sawada H, Ishii S (1983) Isolation and characterization of a post-pro line cleaving enzyme and its inhibitor from sperm of the ascidian, Halocynthia roretzi. J Biochem (Tokyo) 94:1067-1076.
Yoshida K, Inaba K, Ohtake H, Morisawa M (1999) Purification and characterization of prolyl endopeptidase from the Pacific herring, Clupea pallasi, and its role in the activation of sperm motility. Dev Growth Differ 41:217-225.
Yoshimoto T, Ogita K, Walter R, Koida M, Tsuru D (1979) Post-proline cleaving enzyme. Synthesis of a new fluorogenic substrate and distribution of the endopeptidase in rat tissues and body fluids of man. Biochim Biophys Acta 569:184-192.
Yoshimoto T, Shimoda T, Kitazono A, Kabashima T, Ito K, Tsuru D (1993) Pyroglutamyl peptidase gene from Bacillus amyloliquefaciens: cloning, sequencing, expression, and crystallization of the expressed enzyme. J Biochem (Tokyo) 113:67-73.
Yu ZH, Chow PH, Pang SF (1994) Identification and characterization of 2[125I]- iodomelatonin binding sites in the rat epididymis. J Pineal Res 17:195-201.
Zadina JE, Hackler L, Ge LJ, Kastin AJ (1997) A potent and selective endogenous agonist for the mu-opiate receptor. Nature 386:499-502.
Zagon IS, McLaughlin PJ (1989) Endogenous opioid systems regulate growth of neural tumor cells in culture. Brain Res 490:14-25.
246 BIBLIOGRAFIA
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 247
Zhang JP, Meng QY, Zhang LJ, Mao YL, Sun ZX (2002) [Study of correlation and effect of smoking on semen quality of men]. Zhonghua Nan Ke Xue 8:35-37.
Zorgniotti AW, Sealfon AI, Toth A (1980) Chronic scrotal hypothermia as a treatment for poor semen quality. Lancet 1:904-906.
WEBGUNEAK
http://dsc.discoverv.com/fansites/onthecase/humanbodv/zoom 03 .html (azaleko
argazkia)
http://www.biologv.queensu.ca/facultv/montgomerie.html
http ://www. sefertilidad .com
http://www.asesa.org
BIBLIOGRAFIA 247
Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín
Doktore-Tesi hau Ikerkuntza Errektoreordetzak emandako íkerlarien
Formaziorako Doktoreaurreko dirulaguntzaz eta Euskara
Errektoreordetzak emandako Euskaraz Tesiak Egiteko dirulaguntzaz
egin ahal izan d a .