glucocorticoids augment the chemically induced production and gene expression of interleukin-1alpha...

7
Glucocorticoids Augment the Chemically Induced Production and Gene Expression of Interleukin-1a through NF-kB and AP-1 Activation in Murine Epidermal Cells Yasuhiro Miyazaki, Hiroo Yokozeki, Sherif Awad, Ken Igawa, Kazuya Minatohara, Takahiro Satoh, Ichiro Katayama,* and Kiyoshi Nishioka Department of Dermatology, School of Medicine, Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan; *Department of Dermatology, School of Medicine, Nagasaki University, Nagasaki, Japan To clarify the mechanism of the glucocorticoid- induced augmentation of skin response, we attemp- ted to demonstrate the modulatory effect of glucocorticoids on the regulation of cytokines pro- duced by keratinocytes stimulated with various chemicals in vitro. Haptens, irritants, and a super- antigen (staphylococcal enterotoxin B) induced a signi®cant release of interleukin-1a and tumor necrosis factor a, but not interleukin-10, from a murine keratinocyte cell line, Pam 212 cells. Glucocorticoids (10 ±6 -10 ±12 M) signi®cantly augmen- ted the production of interleukin-1a by Pam 212 cells at both the protein and mRNA levels when stimulated by either haptens or irritants, but not by staphylococcal enterotoxin B, whereas gluco- corticoids alone had no effect. In contrast, glucocorticoids had no effect on the production of tumor necrosis factor a and interleukin-10 by chemically stimulated Pam 212 cells. Electrophoretic mobility shift assays revealed that chemical stimul- ation induced NF-kB activation in Pam 212 cells; however, augmented NF-kB activation by 10 ±6 -10 ±8 M of glucocorticoids was observed in Pam 212 cells stimulated by both haptens and irritants, but not by staphylococcal enterotoxin B. Furthermore, pyr- rolidine dithiocarbamate inhibited the hapten- induced interleukin-1a production and NF-kB expression by Pam 212 cells. Pyrrolidine dithiocarba- mate did not completely abrogate the hapten- induced interleukin-1a production augmented by glucocorticoids, however. To determine the effect on transcription factors other than NF-kB, AP-1 activity was examined by electrophoretic mobility shift assays. Hapten was founded to induce AP-1 activation in Pam 212 cells. In addition, AP-1 activ- ation was augmented in the hapten-stimulated Pam 212 cells in the presence of 10 ±8 -10 ±10 M of gluco- corticoids. The augmented in¯ammatory reaction by glucocorticoids may therefore re¯ect the augment- ation of interleukin-1a production by keratinocytes mediated through the NF-kB and AP-1 pathway. Key words: contact hypersensitivity/cytokine/glucocorti- coids/hapten/keratinocyte. J Invest Dermatol 115:746±752, 2000 G lucocorticoids (GC) have been used as an anti- in¯ammatory drug for more than half a century. We recently reported that GC augment the in¯amma- tory reaction of both contact hypersensitivity (CHS) and irritant response (Igawa et al, 1997). Topical GC application reduced the number of epidermal Langerhans cells in the epidermis whilst also enhancing the effecter phase of murine CHS (Grabbe and Luger, 1995). Dexamethasone has also been shown to potentially enhance phorbol-ester-induced interleukin- 1b (IL-1b) expression and nuclear factor kB (NF-kB) activation (Wang et al, 1997). These ®ndings suggest that GC may activate nuclear factors such as NF-kB to enhance production of epidermal cytokines to modulate the in¯ammatory reaction of CHS and irritant response. Keratinocytes are well known to play a major role in the initiation of primary contact irritation and CHS reaction (Enk and Katz, 1992a). One of the major roles of keratinocytes is the synthesis and release of cytokines, chemokines, and growth factors including IL-1a, tumor necrosis factor a (TNF-a), IL-6, transforming growth factor a (TGF-a), TGF-b, and granulo- cyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) (Barker et al, 1991). The production of TNF-a and GM-CSF by keratinocytes is upregulated by both allergens and irritants, whereas IL-1a is upregulated by allergens but not by irritants (Enk and Katz, 1992a). Both IL-1a and TNF-a are produced by organ-cultured human skin by the stimulation of superantigens such as staphylo- coccal enterotoxin B (SEB) (Matsunaga et al, 1996; Schanker et al, 1996). These IL-1a and TNF-a can bind to their receptors on keratinocytes to stimulate the production of other cytokines, chemokines, and adhesion molecules, which modulate the function of other resident cell types in the skin, attract polymorphonuclear leukocytes and T lymphocytes from the peripheral blood stream, Manuscript received October 25, 1999; revised June 26, 2000; accepted for publication June 28, 2000. Reprint requests to: Dr. Hiroo Yokozeki, Department of Dermatology, School of Medicine, Tokyo Medical and Dental University, 1-5-45 Yushima, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8519, Japan. Abbreviations: CHS, contact hypersensitivity; DNBS, 2,4-dinitroben- zenesulfonic acid sodium salt; GC, glucocorticoids; MS, methyl salicylate; NF-kB, nuclear factor kB; PDTC, pyrrolidine dithiocarbamate; SEB, staphylococcal enterotoxin B; TNBS, 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid sodium salt. 0022-202X/00/$15.00 ´ Copyright # 2000 by The Society for Investigative Dermatology, Inc. 746

Upload: kiyoshi

Post on 06-Jul-2016

214 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Glucocorticoids Augment the Chemically Induced Production and Gene Expression of Interleukin-1alpha through NF-kappaB and AP-1 Activation in Murine Epidermal Cells

������������� ��� ��� ��� ��� ������ ����� ����������� ���� �������� �� �������������� ������� ����� ������ ���� ����� �� !����� ����� �� ����

�������� ������ ����� �������� ������ ���� ��� ����� ����� ��������� �������� ����� ������ ������� � ��� ������ ������������������ �� ������� �� ����� �� ������� ���� ����� ��� ����� !��"����� ���� #����$ ����������� �� ������� ��

����� �� ������� �������� !��"����� �������� #����

"� ������� ��� ������ �� ��� ������������������� ��� �������� �� ��� ������# $� ���� ���� �� � ������� ��� �������� ������ ��������������� �� ��� ���������� �� �������� ������� %� ������������ �� ����� $��� �������� ���� �� �����& '�����# ��������# �� � ������������ (������������� ����������� �) ����� �����*���� ������ �� �������������� �� �� �������� ������ �# %�� ��� �������������+# ��� � ����� ������������ ���� ����# �� ,�, ����&������������� (�+-.��+-�, !) ����*������ ��� ����� ��� ��������� �� �������������� %� �� ,�,���� �� %��� ��� ������� �� /�� �� �� $����� ����� %� ������ ������ �� ��������# %�� ���%� ������������� ����������� �# $����� �������������� ����� �� �� ������& �� �������#������������� �� �� ������ �� ��� ��������� ���� �� ������ ������ � �� �������������+ %���� ������ �� ����� �� ,�, ����& ��������������� �%����� ���� ��� �� ���� ���� ��� ���� �� �������� ����� ����� ���� ����� �� �� ,�, ����0��$� ��# ��� ���� ����� ���� ����� %� �+-.��+-1

! �� ������������� $� �%�� � �� �� ,�, ������ ����� %� %��� ������ �� ��������# %�� ���%� ������������� ����������� �& ������� ���# ����������� ��������%� ��� ����%��� ��� ������������ �������������� ��������� �� ������������� %� �� ,�, ����& ���������� ��������%�� ��� � ��� �� ������� �%������ ��� ������������ �������������� ��������� ��� ���� %��������������# ��$� ��& "� ���� ��� ��� �������� ������������ ������ ����� ���� �����# �������� ��� $� ��� ��� %� ��������������� �%��������� ���& '����� $� ����� �� ����� �������� ����� �� �� ,�, ����& �� ������# ���� ���� ������ $� ��� ���� �� ��� ��������� ����� �� ,�, ���� �� ��� ������� �� �+-1��+-�+ ! �� ��������������& "�� ��� ���� ��2� ����� �������� %�������������� �� ��������� ��2��� ��� ��� ��������� �� �������������� ��������� %� ������������ ����� ������� ��� ����� �� ���� ����$��&�� ���� ������� ����������������������������������������������������������� � ������ �������� ��� � !"��#$#%%%

% ������������� &%'( ��"� )��� ���� �� �� ����*��+������� ���� ��� ���� ���� �� � � ������, -������� �������� ���� %' ������� ��� ��+����*��� �������� �� )��� ������� �����������"�� &'��(��� �������� �������� &����� �� �� .//0(, ������ %'

��� ������� ������� ��� ���)�� �� �������� 1��������� �� � ����� ��������� ��� �� � �� ��������� ��� �������� ����� �� ������'�� &%��))� ��� 1���� .//2(, ��3���������� ��� � �� )�������� �� �������� ������� ����)� *�����*������� ����� �����*.� &�1*.�( �3�������� ��� ��� ��� ������ �4 &�5*�4( ����"�����&-��� �� �� .//0(, ����� 6������ ������� ���� %' �� ����"���

��� ��� ������� ���� �� �5*�4 �� ������� ���������� �� �������� �������� �� ���� ��� ��� ��+������� �������� �� '�� ����������� ��������,

������������ ��� �� ����� �� � � � ��7�� �� � �� ������������� �� ������ ������� ���������� ��� '�� �������� &8�� ������� .//9�(, :�� �� ��� ��7�� �� �� �� ������������ �� ����������� ��� �� ���� �� �������� ���������� ��� ������ ���������� ����� �1*.� ����� �������� ������ � &��5*�( �1*; ������������ ������ ������ � &�%5*�( �%5*� ��� ����� �*���<���������� �� ��*����� ����� ������ &%*'�5( &4������� �� .//.(, ��� ���������� �� ��5*� ��� %*'�5 )������������ �� ������ ���� ) )��� � ������ ��� ��������� ��������1*.� �� ������ ���� ) � ������ )�� ��� ) ��������� &8�� ��� ���� .//9�(, 4��� �1*.� ��� ��5*� ��� �������� ) �����*�� ���������� ���� ) ��� ����� ����� �� ������������� ���� �� ����� �*����� ��������3�� 4 &�84( &�������� �� �� .//;$ �������� �� �� .//;(, ����� �1*.� ��� ��5*� ��� )��� �� ����� ��������� �������������� �� ����� ��� ��� ���������� �� ����� �������� ���������� ��� �������� �� ��� �� ����� ���� ��� ��� ���������� ����� �������� �� ���� �� ��� ���� ������� �� ��������� ��� �������� ��� � �������� ���� ��� ��������� ) ��� ������

��������� �����"�� :���)�� 92 .///$ ��"���� #��� 9; 9===$ ����������� ��) ������� #��� 9> 9===,

?������ ��@����� ��A ��, ����� �������� ���������� �� ������� �� ����� �� ������� ���� ����� ��� ����� !��"����� .*2*B2������� 4����*�� ���� ..C*>2./ #����,

�))��"�������A '�� ������� �����������"��$ ��4� 9 B*�������)��*������ ����� ���� ������ �� �$ %' � �������������$ � ���� �� �� ���$�5*�4 ��� ��� ������ �4$ D��' ���� ����� ���������)�����$ �84 ����� ������ ��������3�� 4$ ��4� 9 B ;*��������)�������� ����� ���������� �� �,

==99*9=9E<==<F.2,== G '������� � 9=== ) ��� ������ ��� ��"��������"� ������� �� ���,

34.

Page 2: Glucocorticoids Augment the Chemically Induced Production and Gene Expression of Interleukin-1alpha through NF-kappaB and AP-1 Activation in Murine Epidermal Cells

��� ����"��� ��6 ������� �� � &���� �� �� .//=(, � �� �1*.= �� ����� ��� ����*��+������� �������� �������� ) ������������ &8����� ���� .//9)$ ?�"�� ��� ! ���� .//9(, -� ���������@��������� ������� �� ��� %' ���� ��� ��� ���������� �� ������������� ���� �1*.� ��5*� ��� �1*.= ������� )������� ����� ���� ������������,

�5*�4 �� � ������������� ������ ���� ��� ����"��� ��+������������ �� �������� �� � ������"� �3��� ������������, ��� ����"������� �5*�4 �� ������� ) ������� �� ����� ������� �� �� � ��� ���)������ ����"�� �� �5*�4 ���� ���� ��� ������������� �� ����� ���������� ��� �������� �� ��� �� &'��)� �� �� �� .//2( � �������� ������� ��� ��� ������� ������� �� ��������� ��� ������ ��� ����������� �� �?�� ��� �������� �� �������� ) ������������������� ��� �5*�4 ������������� ������, �D*. �� � �� � ��7����� ��� ������ �� ��� ���������� �� �1*.�$ ����"�� �� �� ��� ��� ��� ������� �D*. �� ����"���� �� ��� �� ����������������� ���� ���� ������� �,

�� ���� ���� �� ����� �� � ���� ������� %' ���� ��� ������������� �� �������� ���� �� �1*.� ��5*� ��� �1*.= )������� ����� ���� ������������ ��� � �� �� � ������� ��������� ��� �������� ��� �������� ) ������� ����� ���� �� ����������������� "�� ��� ����"����� ������ �� �5*�4 �� �D*.,5���������� ��� ���� ���� ������ �� %' �� ��� ����"����� ���5*�4 �� ������� ����� ���� ������������ ��� �������� �����6�� ��� ���������� ���� ������ %' ��� ������� �������� �����+������� �������� �� )��� '�� ��� ��� �������� �������� �� ����,:�� 6������ ����������� ���� ������� ��������� ��� � ������������������� � �����6���� �� ���� �� �1*.� ��� ��5*� )�� ��� �1*.=���� ������������, %' ������ ���� ��� �1*.� ���������� ��������� ����� ���� ������������ )�� ��� ���� �� ��5*� ��� �1*.=, ��� ����"����� �� �5*�4 ��� �D*. ��� �������� ) %' �� �� ������������ ����� ���� ) ������� ��� ��������� ��� �������"����� �� �5*�4 ��� �� ������ �)������� ) �����3������,

��8?��1� ��� 8��:��

/������ 9 B ;*��������)������ �� ����� ���� ������ �� � &��4�( ��������� ����� �� ���� &���( ���� ��������� ���� ������� ���@��&���� #����( ���� �� �� ��� &�( ����� ������ ��������3�� 4 &�84( ���� ����� ���������)����� &D��'( ��� �����*9= ���� �����&��������� %�����( 9 B*�������)������ �� ����� ���� ������ �� �&��4�( ��� �3��� ��� ���� ���� ����� &���� #����( ����*��������� ���� -��� D��� '������ ���������� &:���� #����( +��������� ������������� &5��'( ���7������ �*�� ����)�� ����D������� &��� ����� '�( ���� )�"��� ����� &54�( ���� 5 ��1�)��������� &?���"� � �( ��3���� ������ ��3���� ���� 4���������������� &%�����( ?�H*9 ������������� ��@ ��� �� ������ �����)���� ���� ����)���� ���� ������ &#����( ���� �*��������� ������ ������� ��� �5*�4 ��� ����*�5*�4 �;2 ���� �� � ��� ����)�� ���� ����� '��� 4�������� �� &����� '��� '�( �������������� ����3�����*���7������ ���� ������))�� ������� �) �� �������� &�������(,

����� �� ���� ���� �� ��� ����������� �� ����� ����� ������ �� �������� �� ��� ����"�� ���� 4�14<' ����� D�� 9.9&����� �� �� ./>=( ��� ���� ���������� ��� �3���������, D�� 9.9 �� ����� �� ����� �� ��3*�� �� ���� � ���� &'������ 92>.=( �� �� )����I������� �������� ������ &�8( ���� ������� ���� 0J 54� 2 �� ������� .== ! ��� � �� ������ �� ��� .==�� ��� � �� �����������,� �3��������� ���� ��������� �� ��� �������+���� �����, 1����������� � ���� ��� �������) � �� D�� 9.9 �� � ����� �������� ���� 5��'*���7������ �*�� ����)��,

���� �������� �� � ���� ��� ���� ���� C*B*�*� � 4�14<' ����&#���� �1' #����( ) �������������, H��) � �� � ���� � ���� �� �8���������� 9=J 54� �� C0�' �� 2J ':9, :� ��� �� ����� �� ��������� ��� ��� ���� ���� �����*���� �8 �� ������� ��� �3���������,

�� ����� �� ������� �� ������������ $��� ��� ���� D�� 9.9 �� ����� �� ����� ��� 9B � �� C0�' ���� "����� �������������� �� ��4� &.,=K=,=. �( ��4� &.,=K=,=. �( ��� &.==K.�� ��� � ( � &.,=K=,=.J( ��� �84 &.,=K=,=.�� ��� � ( �� �����*���� �8 �� ����������� �� �)����� �� .=K;*.=K.; ������������� ��� ���� ���� ��������� ����)���� �� �8 ���� 0J 54�, ��� ��� ������ �3����������"�� �� ���� ��� ������ ������������� �� ��� ������� � �� ����� ���

������� ���������� �� ������������ ��� �� �� ���A =,. � ��4� =,. �� ��4� =,===9J �3��� ��� .=�� ��� � ��� =,=.J � .,=����� � �84, ���� ������ ������������� �� ������� � ��� ���� �� ����3��������� �� ����� ��� ������������, D��' ��� ����� �� ��� �� ����+���� ;= ��� )����� ��� �������� �� ������� �, ��� �� ���� ���������������� �� ����� ��� �������� ��� �����* ����� ���������)��� ����&81���(, ��� ��� �3������ �� D�� 9.9 �� � �� ����� ��� 9B � ���� ��������� ������� � ��� ������������� ���� ������� ��� -������) ������,

�5�6� �� �������� D�� 9.9 �� � ���� ����)���� �� ��3*�� �� ���� � ���� ���� =,.� ��4� =,. � ��4� .=�� ��� � ��� =,=.J � ��� .,= �� ��� � �84 �� ��� �������� �� �)����� ��.=K;*.=K.; ������������� �� C0�' ��� 9B �, ��� �� ���� ����� ������ ����� ��� ������ �� K0=�', ��� �� ���� �� �1*.� ��� ��5*� ���� ����� ���� ����� ��� ��������� ) ����� �� L��������� 81��� ��� &?M�������( ��� �� �1*.= ) �� ����� ����*.=E 81��� ��� &%�����(��������� �� ��� ���� ���I� ������������, ��� �������"�� �� ��� ���� ��� .= ����� � ,

/�� ����������# �� ��� ������������# �� ���� ���� ������������� (/"���/) ?�� ��� �3������� ���� D�� 9.9 �� � �� ������� �����*���� �8 ��� 9 � ���� �� ������� ������ ������� � ��������������� ) ����� ?��*�� &4����3 '�.=.(, ��� ��"����������������� ��3���� ��� �������� ) ��3��� B� �� .=� )�����&.== � ����*�' �� >,C 2== � �' .2 � �' 9( B� ����3���� ������ ��3���� &;9,2 �9;= ! ��� � ( B� �� .== �������������� &���( 9� �� ���D &9,2 � ����( B� �� 9= ! ���� ��)���� ���� ����)���� B� �� C ! ���� �� ?�H*9 ������������� ��� >� �� �����, �� ��� ���� ��� �"�� ���� � ��� � �@����� �� C=� ��� ��)� ����> �� ��� .=� �� ���� ?��, ��� ��)�� ���� "����3�� ���� )���+ ��� ��� ��� .= ��� �� ���� ����������� ��� ��� ;= ��� �� B9�', ?�"����������������� ��� ������"���� �� /2�' ��� 2 ���, ��� ��"���� ���������������3���� ������� �� ���� �� ��� ������ �� K0=�', ��� D'? ��3������������� ��"����*��������)�� ?�� &=,.�� ���� ?��( 2� �� .= �)����� B� �� ���D &9,2 � ����( 9,2� �� 9=� ��*������ ��� 9,2� �� 9=� ����*������ =,B� �� 2 ! ���� ��@ ��� �� ������ ���C=,. � �� �����, ���������� ��� ��)�� ���� ����������� �� � ������ �� ��&��� ��� �6�� D'*0==$ ���8' #����(, ��� �6������ ��� ��������� ���9; �� �� �� /B�' ��� . ��� �� ;=�' ��� . ��� ��� �� 09�' ��� 9 ��� ������� �� �1*.� ��� ��� 99 �� �� ��� ���� �� �*�����, ��� �1*.�������� ���� 2�*��% ��% �'' ��' ��' �'' ��' ��% %�%�%' '%*C� �������� ��� 2�*��% �'% %�' �'� '�� ''� %�%��% �%� ��� %%*C� ����������, ��� ���� �*����� ������� ���� 2�*%�% %%' '%' �'� �%% '�' '��*C� �������� ��� 2�*'�' ���%�� %�' �'% '�' %�� ��'*C� ����������, ��� D'? ������������ ������6�� ) � ������������� �� .,0J ������� �� ���������� =,2����� � �������� )������ ��� ������������ ����� � ���"�� �� ����, �������� �������� ��� ����@���������� ) ����� � ������������� ������� &8D�C=== D' ���� #����(,

��������������� �%����� ���� ��� (�!6�) D�� 9.9 �� � ������ ����� �� � 2= � �� ���� +��� ���� ������ ��4� ��4� ��� �� � ����� �������� �� �)����� �� ������������� ��� 9 �, ��� �� � ���� ������)��@���� ��� �� � ���� �� � �3�������� )����� ���������� 9= ��8D8� �� 0,2 B== � ��' . � �' 9 =,2 � ��� ��������������������� ���� &8���( =,. � ��� ���� �� *)��&�*�������� �����(*� � �� ��*����������� ���� .J ������� D*B= =,2 � ��� ��� . ����� ���� �� ��� +������ &D�5( ��� ���� ����)���� ��� C= ��� �����, ��� ����� ��� ��� �3����� ��� ������������ ��� ������ �� K>=�'&��� ��*:������ �� �� .//C(, ����� �������)����� ���� 9�� �� &��*�'( ����������6� ���������� ��� .2�� �� ��� ����� ��� ��� �3����� ��������)���� �� � )������ )����� ���������� .= � ����*�' �� 0,/ =,. �8��� 9 � ��� . � D�5 2J � ���� ��� .== � �' ���������3����� .= === ��� �� ����� �� C9D* �)� �� ���)� ��� C= ��� ������ �����������, ��� ��@������ �� ���� �*�������� � ������ ������� ����5*�4 ���� 2�*�%� �%� %%% %�' ��� ''' �%% '*C� &�����'��� 4�������� ��( ��� ��� )������ ���� ��� �5*�4 ��� 2�*�%� �%�%%' %�' ��� ''' �%% '*C� &����� '��� 4�������� ��( ��� �������� �5*�4 �����, ��� ��@������ �� ���� �*�������� � ������ ���������� �D*. ���� 2�*'%'��%�'�%�'�'�%''%%��*C� &����� '���4�������� ��(, ��� )������ �������� ��3����� ���� ��������� ���� ����� ������ ������ ���)�� ) � ������������� �� � ����"� 2J &��<"� (�� ��� ����� �� �� ������)�� ) ������)�� �� �� &./>/(, 5�� �������������� B�� �� ����*�5*�4 �;2 ����)�� �� ��������� ��))�� ����� ��������� �� ��� �������� ��3���� ���� ������� ���� ��� ��� ��� �3�����, ����������� ��3���� ��� ��)7����� �� � ������������� �� ���"���� ������)����� ���������� ��� �� � ���� ����� ��� ����������������,

H:1, ..2 �:, B :'�:48? 9=== %1!':':?��':��� �!%8�� '��:���8 D?:�!'��:� :5 �8?����:'��8� 343

Page 3: Glucocorticoids Augment the Chemically Induced Production and Gene Expression of Interleukin-1alpha through NF-kappaB and AP-1 Activation in Murine Epidermal Cells

7����� � ���%��� ������ ��� ��� �3������ ���� �������� ��������)�� �)�"� &1������ �� �� .//;(, -������ ������) �� ��� ��� ������������� ) ��� ������ ������)�� ���"���� , 8@�� ������� �� ��� ����� ���� ����� �3����� ������� &2=��( �� ���������� ) � 4������� ����&4��*��� ?������� '�( ���� ����� ���� ���� ��� �� �������� /J���*�� ��� ����� �� �, ����� ��������� �������� ���� ����������� ������ "�� ����� ��+������ &DH�5( ���)����� &���� ���� #����(, ������)����� ���� ���� �������)���� �"������� �� B�' �� ���������*)������� �� ��� &D4�( �� 0,; ���������� =,=2J �����*9= ��� 2J ������ � ��� ���� ����)���� �� ����*�5*�4 �;2 ����)�� �� ���� .A9== ��D4� �� B�' ��� > �, ��� ���� �������� ������ �� D4� ���������� =,=2J�����*9= ��� ����)���� ��� C= ��� �� ����������� ����3�����*���7���������� ������))�� ������� �) �� �� ���� .A.=== �� D4�, ������������"�������� ��� �������� ���� �� �������� ����� ����������� ��������� ���&�������� ������������ !,�,(,

?8�!1��

�5��� �� "���� %�� ��� �5��+ �� �� ,�, ���� ��� ��������� �� ,�, ���� %� ��� �� ������� �� ������# ��������#�� ����������� ��� ������� �� ���� ���� D�� 9.9 �� � ����������� ) ����)����� D�� 9.9 �� � ���� ��� ������

������������� �� ������� �A =,. � ��4� =,. � ��4� ��������� =,=.J � .=�� ��� � ��� �� ��������� ��� .,=�� ��� � �84 �� � ������������, ��� ���������� �� �1*.� ��� �������� )����� ����� ���� ������� ��������� ������������ �� �� �� �������,��5*� ��� � �� ������ �������� ) D�� 9.9 �� � ����� ���� )� ����� ������� �, �� �������� �������� ���������� �� �1*.= ������ �)���"�� �� D�� 9.9 �� � ����� ���� ) �� �� ��� ������� �&��� �(, ���� �� ���� �� ���� �)������ �� ��� ����������� ��������� ����� ���� �������� �� � �� 4�14<' ���� &���� ��������(, �1*.� ��� ���� ������ �������� ) D�� 9.9 �� ������ ���� ) ��4� ������� �84 ������� ��� ��������� ����������� ��5*� ���� D�� 9.9 �� � &��� �(,

������ �� ������������ �� ��� �5��� ��������� �� �� ,�, ���� �� ����� %� ��� ���� ��� �������� �� ����*��������� �� ��� D�� 9.9 �� �� ���� �������� �1*.� ������������ D�� 9.9 �� �, ���� ����������� ��� �� �)���"�� D�� 9.9�� � ����� ���� ) ������� ��� ���������, ������������*����� ����D�� 9.9 �� � ��� ��� ���� ���� ����������� �� �1*.����������� &��� ,&(, ��� ���������� �� ��5*� ��� �1*.= )������� ����� ���� D�� 9.9 �� � ��� ��� ������ ���� ) .=K.= ������������� &��� ,' ((, ��� ����������� �� �1*.� )������������� ��� �)���"�� �� ��4�*����� ���� �������� �� ��� 4�14<' ���� &��� ,�(,

��� ����*��������� ������ �� ������������� ��� ��� ��� ��������� ����� ���� D�� 9.9 �� �, ?� ���"� ���� ���������*����� �� ������������� .=K.9*.=K> ������ �������� �1*.����������� �� D�� 9.9 �� � ����� ���� ) ������ =,. � ��4� =,=.J � &��� 8& '( ��4� �� ��� &���� ��� �����( �������������������� ��� ��� ������� �1*.� ���������� �� D�� 9.9 �� ������ ���� ) �84 &��� 8((, ��� ������ �� �1*.� �������� �� ����� ���� ����� ��� ��� ��� �� �� ����� ������ ) ��� �����3�������� �� ��4� �� ������������� �� "��)� �� �� D�� 9.9 �� �)����� ��� ����� ��� �3��������� ��� ���������� �� ���� ���� /0J���� �������� ) ��� ����� ) �� �� �3� ����� ����,

'����������� ������� ��� �������� �� �5��� /���� ����� ���� ����� �� �� ,�, ���� �� ����� %������� ��� ���������� �� �1*.� ������� ) ��4�*�������D�� 9.9 �� � ��� ������ ���� ) ������������� ���������, ?�*D'? ��� ��������� �� ������ ��� �?�� �3�������� �� �1*.� )D�� 9.9 �� � ����� ���� ���� ������� ��� �������������, ������� �� ��� 4 ��� ����� ����� �� D�� 9.9 �� � ���� =,. ���4� �� =,. � ��4� ��� 9 � ���� ��� �� � B*�� � ������ ������� �1*.� �?�� �3��������, ���� ������ ���� �?�� �3����������� ������� �������� .,/ ��� .,2 ����� ��������"� ) .=K>

������ �& ������� �� �������� ������ �� ��� ������ �� �����������������& D�� 9.9 �� � ���� ����)���� ��� 9B � ���� "���� � � ���&'����� ( �� ���� =,. � ��4� =,. � ��4� =,=.J � .=�� ��� � ��� .,=�� ��� � �84 �� �8, ��� �� ���� ������������ ������ ����� ��� �1*.� ��5*� ��� �1*.= ���� �������� ) 81���, ������������� ��� ����� � �� �� ���� ����������� �3���������, � ���������� ��� ��� ��� ��������� ����� �������I� � ���� ���� �� N =,=2 ��� ��� N =,=.����� ������ &"���� � � ���(,

������ ,& ������ �� ������������ �� ��������� �� ����� �������� %� �� ,�, ������ ����� �� ���� �� ����� $��� "��6#9��6# 696# !6# �� 6��& D�� 9.9 �� ����� ����)���� ��� 9B � ���� "���� � � ��� &'��*��� ( �� ���� =,. � ��4� =,. � ��4� =,=.J � .=�� ��� � ��� .,=�� ��� � �84�� �8 �� ��� �������� �� �)����� �� .=K.= �������������, ��� �� ���� ������������ ������ ����� ��� �1*.� & ( ��5*� &�( ��� �1*.=&�( ���� �������� ) 81���, ��� �� ���� �����*������� �� ��4�*����� ���� ����� �������� �� � ���� �������� �1*.� &�(, ��� ���� �� �����*���� ��� ���� �� ����� ����������� �3���������,H� ��� ��� ��� ���� � �� �� ����� ��������*������, � ���������� ��� ��� ��� ���� ������������I� � ���� ���� �� N =,=2 ��� ��� N =,=. ������ ��4� ��������� �� ��� �)����� �� ���������*����,

341 ���O��� �� � ��8 #:!?��1 :5 ��H8���%���H8 �8?��:1:%�

Page 4: Glucocorticoids Augment the Chemically Induced Production and Gene Expression of Interleukin-1alpha through NF-kappaB and AP-1 Activation in Murine Epidermal Cells

������������� &��� 4(, � -������ ) �� ��� ��� �� �5*�4 ��"�� ������ ������������� �������� ��� ��� ��� ����� ������� �� �;2 ���5*�4 �� ��4�*����� ���� &��� :# ���� �( �� ��4�*����� ����&��� :# ���� �( D�� 9.9 �� �,

����� ���� ����� ����� %� ������ ��������� ����%��� %��9"� �� 8�� ��� ��������� �� ��"�������� ������� �� ���������� ��������� �� �84 ���� ��"� "�� �� ��� ����"����� �� �5*�4, �5*�4 ����"����� ��� ������� �� D�� 9.9 �� � ) ���������������� ������������ ��� �������, =,. � ��4� =,==9J�3��� ��� ��� .,=�� ��� � �84 ����"���� �5*�4 ������ ���=,. � ��4� .=�� ��� � ��� ��� =,=.J � ����"������������ &��� .&(,

D��' �� �� �����3����� ���� ���� �� � ������ ���"�����, �� �� ������� ����)���� �� �5*�4 ����"����� ��� 2=� D��' �� �� ������� ����)����� �� ��4�*������) � ��� )������ �� �5*�4&��� .'# ���� �(, � .==*�� � �� �� �3���� �� ��� �5*�4� ������ ������ ���� ��� � �������� )������ �� ��� �3����� ������4�*������� D�� 9.9 �� � &��� .'# ���� �(, �� �������� � .==*�� � �� �� �3���� �� ��� ������ �5*�4 � ������ ������ ��� ��� ������� &��� .'# ���� �(,

'����������� ������� ��� �������� �� ����� %��������� ��� �� ��������� ����� �� ����������� �����# %����� 6����� �����# �� ,�, ���� ������������� ����������� �5*�4 ����"����� �� D�� 9.9 �� � ����� ���� ) ������� �, �

������������� �� .=K;K.=K> ������������� �������� ������������ �� �5*�4 )������ ����"�� �� ��4�*����� ���� D��9.9 �� � ������� .=K.= ������������� ��� �� ������ �� ���)������ ����"�� &��� 3&(, ��� �5*�4 ���� �3 ��� ������������ )�������� ������� �;2 )�� ��� ) ��� ������ ��% &��� 3'(,'������������� �� .=K> ��� .=K.9 ������������� ������������"����� �� �5*�4 �� �*����� ���� D�� 9.9 �� � &��� 3((,������������� ����)���� ������ ���� �������� ��� ��������� ���5*�4 �� �84*����� ���� D�� 9.9 �� � ����"�� &��� 3�(,

�9"� ����%�� ������������������ ����� ���� ������� �5��� ������ ��� ��������� ����� �� ,�,���� D��' ����)���� ������ �5*�4 ����"����� ) ��4�,D��' �� ���������� �� ����)�� ������������ �� �1*.� �� ������� �5*�4 ����"����� ) �������������, �� ����� �� ��� 1 2= � D��' ������ ����)���� �1*.� ���������� ) D�� 9.9�� � ����� ���� ) ������ =,. � ��4� � ��� �� � ���)������� ��=,. � ��4� ��� .=K> �������������, ��� ����)���� ���� ���5*�4 ����"����� �� D�� 9.9 �� � ����� ���� ) ��4� � ��� ������� ��������� ���� ���� �� �1*.� ���������� ������� �� ���� ���� ��� ���� �� �1*.� ���������� �� ��� ���� �� D�� 9.9 �� ������ ���� ) � ���)������� �� ��4� ��� ������������� &��� 1(,

������ 8& 9��������� ��� � �� �5��� ��������� ��� �� ,�,���� �� ����� $��� ������ �� �������� �� ��� ������� �� ������� �� ������������& D�� 9.9 �� � ���� ����)���� ��� 9B � ����=,. � ��4� & ( =,=.J � &�( . �� ��� � �84 &�( �� �8 �� ����������� �� �)����� �� ������������� &.=K;K.=K.; (, ��� �� ���������������� ���� �� ����� ��� �1*.� ��� �������� ) 81���, ������� �� ��������� ��� ���� �� ����� ����������� �3���������, H� ��� ��� ������� � �� �� ����� ��������������, � ���������� ��� ��� ��� ���� ������������I� � ���� ���� �� N =,=2 ��� ��� N =,=. ����� ��� �1*.� �� ����������� ) =,. � ��4� �� ��� �)����� �� �������������,

������ 4& "�� �������� �� �5��� /�� �� �� ,�, ������ ����� $��� ������ �� ��� ������� �� �%���� �� �������������& D�� 9.9 �� � ���� �������� �� ������)�� �� �������� ��� �������,��� �� � ���� ����� ���� ��� 9 � ���� =,. � ��4� ��� =,. � ��4��� ��� �������� �� �)����� �� ������������� & (, ���� ��� �3������� �� ����� ���"� ������������� "� ��� ����� ���� �� "��������� �� �*����� ���� ������� ) �� &�(, ��� ���� �� ��������� ��� ���� �� ����� ������������3���������, H� ��� ��� ��� ���� � �� �� ����� ��������������, ����������� ��� ��� ��� ���� ����� �������I� � ���� ���� �� N =,=2 ����� ����1*.� �?�� �3�������� ������� ) =,. � ��4� �� =,. � ��4� ����� �)����� �� �������������,

H:1, ..2 �:, B :'�:48? 9=== %1!':':?��':��� �!%8�� '��:���8 D?:�!'��:� :5 �8?����:'��8� 34;

Page 5: Glucocorticoids Augment the Chemically Induced Production and Gene Expression of Interleukin-1alpha through NF-kappaB and AP-1 Activation in Murine Epidermal Cells

���� �� ���� �� ���� � �� �)���"�� �� D�� 9.9 �� � ����� ���� ����� &���� ��� �����(,

'����������� ������� ��� ���� %����� ���� ��� ��"��6��� ����� �� ,�, ���� ��4� &=,. �( ��������D*. )������ ����"��, � �� .=K>K.=K.= ������������� ����������� �D*. )������ ����"�� �� ��4�*����� ���� D�� 9.9 �� �

������� .=K; �� .=K.9 ������������� ��� �� ������ �� ���)������ ����"�� &��� ;(,

���'!���:�

��� ������ ����������� &��4� ��� ��4�( ��� ��������� &� ������( ��� �84 ������� ��� ���������� �� )��� �1*.� ��� ��5*�)�� ��� �1*.= ���� �� ����� ������ D�� 9.9 �� � &��� �(, ��4���� ��� ��������� ������� �� �1*.� ������� �84 ��� ��� ���������������� �� ��5*�, ����� ���� �������� ���� ��� ��������� �������� ��������� ���������� ��� ������� ��������� ��� ���� ������������ ������� �� ������� ����� ��� ���� ��������� ���������)������ ������� ����������� ��������� ��� �84,

������� ��������� ��� � ������������ ����� ���� ��� ����������������� �� ������������, ��� ���������� �� �1*.� ��� ��5*�

������ :& ������ �� ������������ �� ������� ������������ �� �������� �.: �� �� ,�, ���� �� ����� $��� "��6 �� 9��6& D��9.9 �� � ���� ����)���� ��� 9 � ���� =,. � ��4� &����� � �( =,. ���4� &����� � �( �� �8 �� ��� �������� &����� � � �( �� �)����� &������ � �( �� .=K> �������������, 83����� �������� &2=�� ��� ���( ������������� ) ���*�� ��� ����� �� � ������������� ��� ���� ����� �����*) ����� �� DH�5 ���)�����, ������*�������� �� ��� ���)�������� ��������� ���� �������� �����6� ��� ��� �;2 �� ��� ������ ������������)�� ��� ����������� ����3�����*���7������ ����� ������))�� ����������� ��� ��������� ����� ��� ����)��, ������) ��� ���� ��"� ���� ������� �������� ����� ����������� -������ ) ������ ���, ����� ���� ����������� ��� 6������ �� ����� ����������� �3���������,

������ .& ���� ����� �� ������������ ������ ����� �� �� ,�, ������ ����� $��� ����� ��� ����& D�� 9.9 �� � ���� ������� ���� ��������� =,. � ��4� =,. � ��4� =,===9J �3��� ��� .= �� ��� � ��� =,=.J � ��� .,=�� ��� � �84, ��� ��� ������� �3������ ������������ ��� ����)���� ���� ����� �)� �� � ������ ������ ���)��, ������� ���� �������*��� ���� �3�� ���� ��� ��� ) �� 8�� & (, D��9.9 �� � ���� ������� ���� 2=� D��' ��� . � ��� =,. � ��4� ������� ����)���� ��� 9 � &�(, ��� ���� .==*�� � �� � ������ �������������������� �� ��� ������ "������ �� ��� �5*�4 ����� ���� ������� ����� )������ �������� &�(, ����� ���� �� ��������� ��� 6������ �� ��������������� �3���������,

������ 3& ������ �� ������������ �� ��� ���� ��� �� ������������������ ����� �� �� ,�, ���� �� ����� $��� "��6& D�� 9.9 �� ����� ������� ���� �� ������� =,. � ��4� �� ��� �������� �� �)����� ��������������� &.=K;*.=K.= ( & (, ��� ��� ������� �3������ ���� ����������� ����)���� ���� ����� �)� �� � ������ ������ ���)��, ��� ���� �����������*��� ���� �3�� ���� ��� ��� ) �� 8��, (�( ��� ����� ���������� ���� ����� ��� ����)����� ������� �;2, D�� 9.9 �� � ��������� ���� ���� =,=.J � &�( . �� ��� � �84 &�( �� ��� �������� ���)����� �� ������������� &.=K;*.=K.9 (, ����� ���� �� ��������� ���6������ �� ����� ����������� �3���������,

3:+ ���O��� �� � ��8 #:!?��1 :5 ��H8���%���H8 �8?��:1:%�

Page 6: Glucocorticoids Augment the Chemically Induced Production and Gene Expression of Interleukin-1alpha through NF-kappaB and AP-1 Activation in Murine Epidermal Cells

��� ������ ���� )�� ���� �� �1*.= �������� ���) �, ��� �������� ��.=K;*.=*.9 ������������� �� ��� ������� ����� ���� ��������*���� ��������� �1*.� ����������, �� ���� ������������ ����)���"�� �� ������ ��� ��5*� �� �1*.= ���������� �� ���� ���� ����"��, �� �������� �� ����� ���� ������ �� �� �������� ���� .=K2*.=K; ������������� ������� )��� ��� ����������"� ��� � ���"��* ��*� ������ �� ���� �� �������� ������� ����"����� ������ &8��5() D�� �� � &������ ��� ������ ./>;(, ��� ������ ��� �������������� )������ ��� ���� ��� ����� �� ������ �� �� ������������� �� )� ��� �� ��� ��������� ����� ����� ������ �� D���� � ��� ��� ��������� ���� ������ �� ��� ����� ��� ����� �����, ����� ����� D�� 9.9 �� � ���� ����� ���� ) ������� �$ ����"�� �� ����� ����� ��� ���� ����� ���� ) � ���"�� �� ���������, -���� ��� ������� ����"�� ����� ��� 81��� ������ ������� ������ ���� � )������ ������@�� �� ��������� ��� 8��5 ����"��, ���8��5 ����"�� �� � ���)������� �� �1*.� �1*; ��� ��5*�����"�����, 8"�� �� ��� ����� ������ �������������� &.=K;( �� %'����)���� ��� ���������� �� �1*; ������� ����� ����� &���� ��������( ��� ��� ��� ������� ��� ���������� �� �1*.� ��� ��5*��� D�� 9.9 �� � ������� ����� ����� &��� 8&-((, ����� ������������� ���� ��� 8��5 ����"�� �� ���� )� ����)���� ) .=K; %'���� D�� 9.9 �� � ������� �� ����� ����� �"�� �� ��� �����, �� ��� ���� ����� �)���"������ ���)��� ������ �������� ���� ������� �� �������������� �������� '�� ������� ���� ����� ���������������� ����)���� '�� &���)��� ��� �8��� .///(,

%' ����)�� �� ��+������� �������� ) ��������� � "����� ����������� � ������, %' ��"� )��� ����� �� ������ ��� ������������ ���*��+������� �������� ���� �� �1*. &����� �� �� .//C( ��5*� &����� �� �� .//C( ����������*� &'������ � �� �� .//2( �1*9 &H���� �� �� .//=( ��� ��������� ����)���� ������ &�5(&'� ����� �� �� .//2(, :� ��� ����� ���� %' ������ ��� ����3�������� �� ���� ������� ��������� �� �1*;? �1*.? ��� %*'�5*? &����� �� �� .//=$ � ���� �� �� .//;(, �� ��� � �� ������ )��� ������������ ���� ��� ������ ��� ������� �� %' ��������)��� � ����� ��� ���� ����� ��������� �������� &�)���� �� �� ./>B$����� �� �� .//0( ������� ��� ���� ���� ��� ������ ��� ������� �� %'���������� ��� ���)�� �� �������� �K�P 1��������� �� � �� ������������ ��� � ��� ����� ������ �� ���� &�)���� �� �� ./>B(, ���

������� ��������� �� %'*������� ������������ �� ������������������ ����"�� ������� �� )� �� � ��������,

� �� ���� �� %' ������ ���� �1*.� ���������� ) D�� 9.9�� � ����� ���� ) ������� ��� ��������� &��� ,&( ������� ������������� �� ��5*� �� �1*.= ) ������� ����� ���� D�� 9.9�� � ��� ��� �����6���� �������� �� ��� �������� �� %' &��� ,'#((, %' � �� ������ ���� ��� �3�������� �� �?�� ��� �1*.� ��������*����� ���� D�� 9.9 �� � &��� 4(, ����� 6������ ������������ � �� ���� �� %' ��� ��� �)� �� �� ������� '�� ������������� ����� �� �1*.� ���������� �� ������������, ��� �� ������������������ �� %' ��� )��� �������� �� ������ ��� ��� ���)���� �5*������"� �� � �� ������� ���������� &� ��� �� �� ./>>( ��� �� �����6���� ������� ���� �� ���*��� �����������"���������� ��������� � �����6���� �������� �� ��� ���)�� �� � �� ��� ��� ��� ����� �������� ��� �� ���*��� �����������"���������� ���� &���)��� �� �� .///(, %' ������� ��� ���������� ���������� �� ���� ��� ��� ���� ��������,

��� ������) � �3�������� �� �1*.� �� ���� ���� "�� �������������������� ���� �5*�4 ��� �D*. &1�� �� �� .//B(, ���)�� ��� ��� *����� �������� ��������� �1*.� �������� ��� �5*�4����"����� �� ������ ������������ &'������ �� �� .//;(, '����������������� ���� �� ��' 9 ��� '�' 9 ������� �5*�4 )����������"�� ���� ��)��@���� ���� ���� ��� ������������� �� �1*; ���H'�*. ����� �� ����� ������� �� �� � &'��)� �� �� �� .//2(,����� ����� ) ����������� ���� ���� ��� ������ �� )� ���������� �������������� �� ������� �� �� � �� )�� �� � �� ���� �� ����� �� ���� ���� �� ����������� �������� ��� 6)��) ���� &���� ���

������ 1& ������ �� �9"� �� �5��� ������ �� ��� ���� ��� �������������� ������ ����� �� �� ,�, ���� �� ����� $��� "��6�� '�& D�� 9.9 �� � ���� ������� ���� 2=� D��' ��� . � ������ ��� ���� ����)���� ��� 9B � ���� "���� � � ��� &'����� ( �� ���� =,. ���4� �� ��� �������� �� �)����� �� .=K> �������������, ��� ���������� �3������ ���� �������� ��� ����)���� ���� ����� �)� �� � ���*��� ������ ���)��, ��� ���� ���� �������*��� ���� �3�� ���� ��� ���) �� 8��, ��� �� ���� ������������ ���� �� ����� ��� �1*.� ����������� ) 81���, ��� ���� �� ��������� ��� ���� �� ����� ������������3���������, H� ��� ��� ��� ���� � �� �� ����� ��������������, ����������� ��� ��� ��� ���� ����� �������I� � ���� ���� �� N =,=2 ����� ����1*.� �� ���� ���� D�� 9.9 �� � ����� ���� ���� ��4� � �� ����*��������� �� ��� �)����� �� D��', ����� ���� �� ��������� ��� 6������ ������� ����������� �3���������,

������ ;& ������ �� ������������ �� ��� ���� ��� �� ������������������ ���� �� �� ,�, ���� �� ����� $��� "��6& D�� 9.9 �� ����� ������� ���� �� ������� =,. � ��4� �� ��� �������� �� �)����� ��������������� &.=K;*.=K.9 (, ��� ��� ������� �3������ ���� �������� �������)���� ���� ����� �)� �� � ������ ������ ���)��, ��� ���� ���� �������*��� ���� �3�� ���� ��� ��� ) �� 8��, ��� 6���� ����� ���� .=K>*.=K.= ������������� �������� ��� ����"����� �� �D*. �� ��4�*����� ���� D�� 9.9 �� �, ����� ���� �� ��������� ��� 6������ �� ���������������� �3���������,

H:1, ..2 �:, B :'�:48? 9=== %1!':':?��':��� �!%8�� '��:���8 D?:�!'��:� :5 �8?����:'��8� 3:�

Page 7: Glucocorticoids Augment the Chemically Induced Production and Gene Expression of Interleukin-1alpha through NF-kappaB and AP-1 Activation in Murine Epidermal Cells

�� �� .//B(, ��� �� ��������� )�� � �� ������� ��� �84 ��������5*�4 ����"����� �� D�� 9.9 �� � �� ���� �3�������� &��� .&(,������������� �� � ������������� �� .=K> �������� ������������� �� �;2 ������� ��� �� ��� �5*�4 � ������ ) D��9.9 �� � ����� ���� ���� ������ ��4� �� ��4� &��� :( ������������ ��� )������ �� �5*�4 �� ������* �� ��������*����"����D�� 9.9 �� � &��� 3&# ((, ��3���������� �������� ����)� *�����*������� �1*.� ���� �3�������� ��� �5*�4 ����"����� �� ��������� ������� �� ��� &-��� �� �� .//0(, %' �� ��"� ���)� �� �� ������� �5*�4 ����"����� �� ������� ����� ���� �� ���� ����� ������������ ��� ��������,

��� ����������� �� �5*�4 ����"����� ��� �������� �� ��4�*�� �*����� ���� D�� 9.9 �� � �� ����� �� ��� �������� �� .=K;*.=K> ������������� &��� 3&# (( ������� ��� ����������� ���1*.� ���������� ��� �)���"�� ��� � ����� �� ��������������������������� )������ .=K; ��� .=K.9 , � �� ���"� ������������������� �� ������������� ����"���� �5*�4 �� ��������)� ����1*.� ���� �� ��� ��� ���� ������� � ���� ���� ��������������� �� ������ "������ �������������� ����� � ��������� �5*�4 �� ��������� �1*.� �� ��� �� �� ��� �����,

�5*�4 ����"����� �� ������ ������ �� ) ������"� �3���������� ��� ��� �� � �� ����3 ����� ��� ��� )� ����)���� )�����3�����, �� ���� �3�������� ��4� ������� ��� ������ ����"������� �5*�4, ���� ����"����� ��� ������ ����)���� ) D��'&��� .'( )�� ��� ) ����*��5*� ����� ��� ����)����� ������*�1*.� ����� ��� ����)����� &���� ��� �����(, D����������� �1*.� ������� )��� ) ��4� � ��� ��� ) ��4� � ��������������� ��� � �� ������ ����)���� ) D��' &��� 1(, :��6������ �������� ���� ��� ����3*��������� ������� ���� ��"� "����� %'*��������� ����������� �� �1*.� ���� �������������, ����� ����)����� �� �1*.� �?�� �3�������� ��� �1*.� ������������� ������ ��� �� ��� �3�������� �� �� ��� ���� ������������������� ������� ��� � �� ��"� "�� �� ��� �1*.� ����������������� �� ��4�*������� ��� ��4�*� ��*�������������*������� �1*.� �����������, �� �D*. �� ���������� �� )� ��� �������)�) � ��������� �� ��� ����� �������������� ������ �� �1*.������������ &1�� �� �� .//B$ '������ �� �� .//;( ��� �D*. ����"���� D�� 9.9 �� � ��� � �� �3������ ) 8��, ��4� ��������D*. ����"����� �� D�� 9.9 �� � ��� �� �� ����� ���� ����������� �D*. ����"����� ��� �)���"�� �� D�� 9.9 �� ������ ���� ) ��4� �� ��� �������� �� ���� ����� &.=K>*.=K.=(�� %' &��� ;(, ����� ���� ��������� ���� %' ��������� ������������� �� �1*.� �� ��� D�� 9.9 �� � ����� ���� ) ��4�������� ��� ����"����� �� ��� �� �5*�4 )�� �D*. �� �� ,� ������ ������� ��� ����"��� ������������� ������ �5*�4 ����D*. ����� ��������� ��� ���)�) �� ��� �� ��� ������� ����������� �3���, ��� ���� �� %' ������� ��� ������*������� �5*�4 ��� �D*. ����"�����Q %' � ��� ��� ��� ������ �1*.� �� �������� D�� 9.9 �� � ��� ��� ��� ����"��� ������ �5*�4 ��� �D*., ��%' ������� ����� ������������� ������� �� �� ��� �������� ��������� �� ��������� )�� ��� �84 %' ���� ������ �������� ������� ������* �� ��������*������� ����� ������������ ������ ���"������ ��� ������ �� ��� �5*�4 �� �D*. �3��������, ������������) � ��������� �� ���� %' �� ���� ��� � ������"���� �����D �������� � ����� )������ ������� ����� ���� ��������� ������� ����"����� �� �5*�4, ��� �3��� ��������� �� ��� ����� ������������ ������ ���� �� �������� ) %' �� ��� �������� ��������� �� ��������� ����"�� �� ��� ��� ���, �� � ���� ��������������� ������� ��"����������� ���� � )� ���� �� ��� ����������,

�� ���� ����� &�( ��� �� ������� ��� ��������� )�� � �������������� ������� ��� ���������� �� �1*.� ��� ��5*� )����� �1*.= ���� D�� 9.9 �� �$ &��( %' ������� ��� �������������� ��� �3�������� ��� ���������� �� �1*.� �� D�� 9.9 �� ������ ���� ) ������ ������� �� ���������$ ��� &���( ��� ����"����� ���5*�4 ��� �D*. �� ��"� "�� �� ��� ������������ �� �1*.����������� �� ������*����� ���� ������ ������������ ������� )%', 4���� �� ����� 6������ ��� ��������� ��+������� ��������) %' �� ��+��� ��� ������������ �� �1*.� ���������� )

������������ �������� ������ ������� ��� ����"����� �� ��� �5*�4 ������,

���� ��� ��� ���! �� ���� "! #����������� $%��& '��(')�� '(��(�)*

�'�('()�+ ,�- ��� ������! �, ���.����� �, /� ��&

?858?8�'8�

�)���� - ����� 1 D�������� � ����� %A 8����� �� � ������������������ ���������� �� *������� ������ ���������, / 0--���� .CCA0/9K0/0 ./>B

� ���� -� 4���� �� ?����� �� ?����� #A ?��� ����� �� ������� ���������� �������� �3�������� ) � ������������, / ����� ���� ;=A2;CK209 .//;

����� � 1�� �- � ���� �'A ����)����� ) � ������������� �� ��� ��������� �� �1*.� �1*.� ��� �1*;A ��������� ) �������� �?�� ���)� ��, ��� 1��-�.��BCA.0BK.>9 .//C

���� # D��� D 4���� # �� ��A '������ ���� ����� �� ����������� ��������,/ 0����� ��-���� /BA.=.�K.=0� .//=

���� ��� � %����� D �� ��)���� �5 H����� ' ����� �4 -� ���� 4A ����� ����3 ���)����� ��������� ����� �������� ������ � ��� ��� ����� �����*;��������� ) � "�� �� �����������, / � ��2�.�� .BAC02KC0/ .//B

4����� #�-� ���� ?� %���6��� %8 ��3�� H ����� ��� 4#A ������������ ������������ �� ��+��������, ���.�� CC0A9..K9.B .//.

'� ����� � 4�������� # ��� '� �� ��A �5 �� � � ������������*����������� ���� �� ������� ����������, %���� C00A;>K0. .//2

'������ � ���� � H������� H %���� #�D 4����� # ����� ��A ������"��������������� ���� ����� �� ��� �5�*� �������� ) � ������������� ����������� ������"� ������� �� �*#��, / ���� ���- 90=A.92B>K.922; .//2

'��)� �� ?��� 4������ 84 ���� ' ���� ��*:������ �A ����"����� ����� ��� ������*�4 ��� ���� �3�������� �� ����� ������� �� �� � ) ��������� ������� ����� ��� ��)� �, / 0--���� .22A9B2/K9B;0 .//2

'������ 8 ����)��� ' �����"��� %� � '1A ?� � �� ������������ �����)�� ���*������� ����� �����*. ���������� �� ������ ������������, / 0�������-���� .=0A09=K092 .//;

���)��� 5� �8��� 4�A 8�������� "����� ���������"� ������ �� ������ �������� ������ ������ ��������, 1�. %��� .�� 3.� 43 /;A.=2/K.=;B .///

8�� �� ���� ��A 8�� �� ��� �� �"���� �� ��� ��������� ����� �� ������� �������"��,1�. %��� .�� 3.� 43 >/A.C/>K.B=9 .//9�

8�� �� ���� ��A ������6������ ��� ��������� �� �����������*����"�� �1*.=,/ 0--���� .B/A/9K/2 .//9)

%��))� � 1���� ��A ?���"� �� ��� ��7���� �� �������� 1��������� �� � )������ �� ������� ������� ��� ������� �������� ��� �������� ����� �� ������������� �����������"��, / 0--���� .22AB9=0KB9.0 .//2

����� � ������� � ��������� � ����� � �������� � �������� �A ������ � ������������ �������� )��� � ����� ��� ���*� ����� ��������� ��������� ������ ���� ��� ��� �� �������� ����� �� ������� �������"��, ���#�� 0�� B;ACCKB. .//0

������ �� ������ #A ������������� ������� )��� ����������"� ��� !H*� �������� ���� �� �������� ������� ����"����� ������ &8��5( ) �� �����������������, / 0����� ��-���� >0A20=K20C ./>;

1������ #� 1��� #� ��� � ?��� � 1������� ��A ?��� ����� �� �5*�4 ����"������� � �� ��� . ��� � �� ��� 9 �� �, / 0--���� .2;A2;K;C .//;

1�� -� 4�� �� �D 1�������� 5 5����� �A ����� ������������ ���������"� "�� �� ����)� ����� ��� ��������� ��������� �� ����� �����*.� �?�� �������� ������������, / ���� ���- 9;/A.0/0.K.0/>= .//B

� ��� ! ����� # 4��������� % ���� 'A ������������������ ��������������� ��������� ����)���� ������ &�5( �� �3��������� � ����� ������� ����������,���� �2 0--���� 0.A.;B ./>>

�������� � ������� � �������� � �������� �A ������������*������� ��������3�������� �� �����*�� ����� ����� ����, / ��-���� 3.� ..A.=BK..= .//;

?�"�� # ! ���� �8A ������� ���������� �� �� ���*��� �����������"�� )������������ ���� !H*���������� ������������, �� �������� �� � ��� ����������*����"�� �1*.=, / 0--���� .2AC>;2KC>0. .//9

�������� % D������*8 ��� � 4������ �A ������������ ������� 1��������� �� ��� ����� �� �������� ) �������� �� *����"�� �1*.� ��� ��5*�, ����0--���� .0.A9B=K9B2 .//;

��� ��*:������ � 4����� ? H����)����� H �������� % 5���� -A ��� ����� ����� ������������ � ������ ��������� �)������� ��� �����3�� ��� ����*�������"� ������� �� ��5, ���5 / .9AC=/2KC.=B .//C

������)�� 8D ������� ��������� -A ?���� ��������� �� ��������� )�������������� ���� R����*�3������I �������� ���� � ��� ���)�� �� �� �, %�.� .���6�� .0A;B./ ./>/

����� 1 -�� �1 '������ #A % ������������ ��*���� ����� �� ����*��6�������� ����� ; ��������� �� ����� ������ �� �� �, 1�. %��� .�� 3.� >0A9>C>K9>B9 .//=

H���� � ��������� � ��������� � �� ��A �������������� ���� ����� �� ��� �1*9 ����) � ������������ ��������A �� � �� ������� �������� ��� �������*��������"�2�*+������ ��@������, / ���� ���- 9;2A>=02K>=>= .//=

-��� � O���� ## ��� - 1�� �� D��� -A ��3���������� ������ ������������)� �����*������� �1*.� ���� �3�������� ��� ��� ��� ������ �5*�4����"�����, / 0--���� B2/A2CBK2C0 .//0

����� �� ��� �*�� ��� D ���� �� 4 ���� � #?A � ���"� �� ��������������������� �� ��������������� �������� �� ���� �� �� ����, ���.� 6�� B=AB;/BKB0=C ./>=

3:, ���O��� �� � ��8 #:!?��1 :5 ��H8���%���H8 �8?��:1:%�