glycobiologie et myogenese - unité de … scientifique/2008/14 - 13... · et myogenese :...
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GLYCOBIOLOGIEET
MYOGENESE :
UTILISATION DES SOURIS GDF8 -/-
Véronique BLANQUETFabrice DUPUYLionel FORESTIERLaëtitia MAGNOLEmilie PINAULTKarine VUILLIER
Séminaire du 13 juin 2008
Unité de Génétique Moléculaire AnimaleUMR 1061
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Quels sont les acteurs, associés à la glycobiologie, qui interviennent dans le développement musculaire ?
PROBLÉMATIQUE :
« La glycobiologie est une nouvelle discipline scientifique qui allie les fondements de la biochimie et de la biologie moléculaire des glucides, pour étudier et comprendre la structure , la biosynthèse et la biologie des glycanes ».
DÉFINITION :
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Comparaison entre : souris « sauvage » et souris GDF8 -/-
Echantillons biologiques : 20 souris sauvages (Orléans) et 20 souris GDF8 -/- (Limoges) :
(Fond génétique Fvb)
- 5 individus ♂ âgés de 3 sem - 5 individus ♂ âgés de 12 sem- 5 individus ♀ âgés de 3 sem - 5 individus ♀ âgés de 12 sem
muscle squelettique – foie – cœur – cerveau
APPROCHE SCIENTIFIQUE :
Etude Transcriptomique (Glyco-TLDA)
Etude Protéomique (2D-DIGE)
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Droit fémoral
DÉMARCHE EXPÉRIMENTALE :
Broyat musculaire
Broyage dans l’azote liquide
ARN totaux
ADNc
Données PCR-q
20 mgRNA easy kit
AgilentcDNA Archive Kit
TLDA
Transcriptomique Protéomique
Protéines totales
Protéines microsomales
Données protéomiques
Electrophorèse 2DDIGE
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Approche Transcriptomique
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RÉSULTATS PCR QUANTITATIVE
Marqueurs myogéniques
Pax3 Pax7 Tropomyosine
GDF8+/+ 3 sem
GDF8+/+ 12 sem
GDF8-/- 3 sem
GDF8-/- 12 sem
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RÉSULTATS PCR QUANTITATIVE
Analyse de l’expression du Glycogénome par TLDA
Gene function Number of known genes1
Number of analyzed genes2
Glycosyltransferase 192 148 (77%)
Glycosidase 74 53 (72%)
Sugar carrier 33 26 (79%)
Translocase 2 2 (100%)
Sugar metabolism 26 23 (88%)
Lectin 165 101 (61%)
Sulfotransferase 50 22 (44%)
Total 542 375 (69%)
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RÉSULTATS PCR QUANTITATIVE
Expression du Glycogénome :Nombre de gènes exprimés différentiellement
EchantillonsGDF8 +/+
12 semainesGDF8 -/-
3 semaines
GDF8 +/+
3 semaines79 51
GDF8 -/-
12 semaines8 42
- Individus ♂- T-test ≤ 5 %- RQ ≥ ± 1,5
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RÉSULTATS PCR QUANTITATIVEExpression du Glycogénome :
In Vivo vs. In Vitro
79 gènes chez la souris GDF8+/+ 54 gènes dans les C2C12
20 gènes communs (12 gènes varient différemment)
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RÉSULTATS PCR QUANTITATIVE
Expression du Glycogénome :
Gènes d’intérêt
Gene symbolGDF+/+
3sem/12semGDF-/-
3sem/12sem
3 sem GDF+/+/GDF-
/-
12 sem GDF+/+/GDF-/-
4732435N03Rik x (↘)Amy1 x (↗) x (↗)Art1 x (↗) x (↘)Art4 x (↘)Athl1 x (↘) x (↘)B3galnt1 x (↘)B3galt1 x (↘)B3gat1 x (↘) x (↘) x (↗)B3gnt2 x (↘)B4galnt1 x (↗)B4galt2 x (↘)B4galt4 x (↘)B4galt6 x (↘) x (↘)…
64 gènes d’intérêt
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RÉSULTATS PCR QUANTITATIVEFonctions Biologiques des 64 gènes
(http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html)
9 gènes
12 gènes
5 gènes
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Approche protéomique
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���� Etude des protéines microsomales
���� Matériel biologique : muscle squelettique � Laëtitia54 mâles âgés de 3 semaines
18 GDF8-/- et 36 FVB = 4 pools �4 portées différentes
(autres tissus prélevés : foie et cœur)
���� Technologie 2D-DIGE/SM
���� Extraction : “fractionnement ” appliqué à une analyse protéomique
Selon Maribel E. Bruno et al. Archives of Biochemis try and Biophysics. Sept. 2002
Comparaison différentielle d’enzymes de la glycosylation dans le muscle de souris :
lignées GDF8-/- et FVB
microsomes
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• Broyage du muscle dans un mortier avec azote• Reprise de la poudre dans Tampon (8 vol muscle/ poids poudre)
� 50mM Hepes, 1 mM EDTA, 0.25M Sucrose, 1mM DTT, inhibiteurs de protéases• Homogénéisation par sonication
• Centrifugation n°1 10 000 g 20 min à 4°Cculot = débris, membranes, noyaux et mitochondries
• Centrifugation n°2 10 000 g 20 min à 4°Cculot = reste mitochondries
• Centrifugation n°3 100 000 g 60 min à 4°C (X 2)culot = fraction microsomale surnageant : fraction soluble cytosolique
• Purification et concentration de l’échantillon
• Fraction « microsomale » tampon adapté pour gel 2D
• Dosage protéique
���� Rendement : 150 mg de tissu musculaire pour ~ 150 µg de fraction microsomale extraite
microsomesFractionnement simple
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Glucose regulated protein : GRP78 ���� Marqueur spécifique des microsomesFamille des HSP 70 - Localisation dans RE
Western Blot sur marqueur biochimique
microsomes
Quantification de la protéine GRP78 après révélation par Western Blot
1
0,5
0 00
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Microsomemuscle
Soluble muscle TS3 TS12µ: microsomes
FS : fraction soluble
M : marqueurs
TS3 : fraction totale muscle 3 semaines
TS12 : fraction totale muscle 12 semaines
Enrichissement en protéines
« microsomales»
10% SDS-PAGE, 20µg/puits NC - HRP
Logiciel Image Quant TL
Suivi du fractionnement
µ FS M TS3 TS12
72 kDa
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SDS-PAGE 10% 0.75 mm 10*10.5 cm 20 µg de protéines/puitscoloration bleu colloïdal
(1) Microsomes Foie (2) Microsomes Muscle(3) Fraction soluble Foie(4) Fraction soluble Muscle(5) Fraction totale Muscle
1 2 3 4 5
Fraction microsomale du muscle (2) 9 bandes = 115 protéines
Fraction soluble du muscle (4) 5 bandes = 40 protéines
Suivi du fractionnementIdentification de protéines pertinentes en SM
microsomes
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Fraction microsomale du muscle (2)
� Plus grande proportion de protéines microsomales dans la fraction microsomale par rapport à la fraction solubl e
� Présence de protéines cytoplasmiques et mitochondrial es dans la fraction microsomale
Suivi du fractionnementIdentification de protéines pertinentes en SM
Fraction soluble du muscle (4)
microsomes
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Suivi du fractionnementDéveloppement de la technologie MRM
Objectif : détecter de façon spécifique la GRP78 dans la fraction microsomale (mélange complexe de protéines)
Principe :
Séquence protéique
Peptides trypsiques + masse
DTHKSEIAHRFKDLGEEHFKLVNELTEFAKQEPERNECFLSHK ...
597.3625.3582.3539.6...
Fragment le plus probable ���� masse
496.3859.4708.4734.4...
Couple de masses pour chaque peptide trypsique
Analyse par MS/MS uniquement de ces peptides là
microsomes
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8 pools d’animaux 3 semaines : 4 « Sauvages » et 4 « Hy permusclés »4 gels marqués : IEF pH4 - 7 18 cm/SDS-PAGE 10% (150 µ g/gel)
Gels Cy3 Cy5 Cy2 Decyder
N°1 S1 H1 SIN°2 H2 S2 SIN°3 S3 H3 SIN°4 H4 S4 SI
2 gels préparatifs : comparaison cartes protéiques fluorescentesN°5: 450 µg � pool HypermuscléN°6 : 450 µg � pool Sauvage
� Piquage des spots variants et analyse par SM (Emilie)
Approche 2D-DIGE
12 images analysées
Normalisation : référens
Analyse statistique
microsomes
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Mise en évidence des protéines différentiellement exprimées dans le muscle de souris hypermusclépar rapport au sauvage ( lignées GDF8 -/- et FVB)
���� Etude du protéome total
���� Matériel biologique : muscle squelettique � Laëtitia
16 mâles âgés de 3 et 12 semaines8 animaux GDF8-/- et 8 animaux FVB
(autres tissus prélevés : foie, cœur et cerveau)
���� Technologie 2D-DIGE/SM
protéome total
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• Analyses des 12 semaines :� 47 spots variants , 34 spots piqués
� 24 protéines identifiées en SM
� 50% ~ des protéines contractiles
Résultats préliminairesprotéome total
Gel fluorescent Cy2 Gel coloré au bleu colloïdal - sa uvage
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Résultats préliminaires
• Analyses des 3 semaines :
� en cours
• Comparaison 12 et 3 semaines
protéome total
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Merci…