Glykoproteiinihormonien analytiikkaHenrik Alfthan

HUSLABKliinisen kemian laitos

Glykoproteiinihormonit

• Rakenne• Molekyylimuodot• Määritystekniikat• Menetelmien kehitys• Määritysongelmat

Yazaki K et. al. Am J Obstet Gynecol 138:189, 1980

Wide L et. al. JCEM 76:885, 1993

IFCC työryhmä hCG-määritysten standardoimiseksi

• Peter Berger, Innsbruck• Jean-Michel Bidart, Paris• Steven Birken, New York• Rudolf Lequin, Eindhoven• Rob Norman, Adelaide• Cathie Sturgeon, Edinburgh (secretary)• Ulf-Håkan Stenman, Helsingfors (chairman)

hCG-työryhmän tehtävät

• Uudet standardit• Selkeä nimikkeistö• Epitooppikartta• Referenssimenetelmät?

IstukkagonadotropiiniStandardit ja lyhenteet

• hCG, CG, human chorionic gonadotropin• hCGβ: vapaa β-ketju• hCGα: vapaa α-ketju• hCGβcf: vapaan β-ketjun ”core fragmentti”• hCGn: ”nicked hCG”, katkos aa 42-48 β-

ketjussa• hCGβn: ”nicked hCGβ”

3D epitope map of hCG

hCGβCTP

hCGα

hCGβ

P.Berger 2000

Menetelmien kehitys

• Vasta-aineet– Immunisointi (pudistetulla) antigeenillä– Vasta-aineiden puhdistus– Vasta-aineiden karakterisointi

Birken S et. Al. Methods 21, 3 (2000)

Sandwich immunoassay

hC

G

hC

Gß

hC

Gß

cf

solid

i

F16-

6G5

F16-

6G5

F16-

6G5

F144-2G2 469 1326 134416F144-6G8 833 2214 193641F52-3C11 524 690 176914F142-7F3 238 1436 267F144-12E4 479 31719 51F140-2F6 4257 27391 165F143-1C10 27449 1137 57F140-11C5 171935 2032 0F132-13C11 156902 141 209F132-9F10 12136 5152 256F130-8D4 175827 12994 147F140-5E2 71498 179408 260889F19-9C11 21129 693920 48958F94-8F8 1264 34480 15374F132-3C10 1124 408 1714F95-5C4 0 0 416F95-1E8 1155 0 50F95-1B2 22 0 1036F20-4E7 3408 33702 8315F20-6E11 3206 25717 36F144-4F10 58 0 0

hC

G

hC

Gß

hC

Gß

cf

solid

i

F16-

6G5

F16-

6G5

F16-

6G5

F144-2G2 469 1326 134416F144-6G8 833 2214 193641F52-3C11 524 690 176914F142-7F3 238 1436 267F144-12E4 479 31719 51F140-2F6 4257 27391 165F143-1C10 27449 1137 57F140-11C5 171935 2032 0F132-13C11 156902 141 209F132-9F10 12136 5152 256F130-8D4 175827 12994 147F140-5E2 71498 179408 260889F19-9C11 21129 693920 48958F94-8F8 1264 34480 15374F132-3C10 1124 408 1714F95-5C4 0 0 416F95-1E8 1155 0 50F95-1B2 22 0 1036F20-4E7 3408 33702 8315F20-6E11 3206 25717 36F144-4F10 58 0 0

hC

G

hC

Gß

hC

Gß

cf

solid

i

F16-

6G5

F16-

6G5

F16-

6G5

F144-2G2 469 1326 134416F144-6G8 833 2214 193641F52-3C11 524 690 176914F142-7F3 238 1436 267F144-12E4 479 31719 51F140-2F6 4257 27391 165F143-1C10 27449 1137 57F140-11C5 171935 2032 0F132-13C11 156902 141 209F132-9F10 12136 5152 256F130-8D4 175827 12994 147F140-5E2 71498 179408 260889F19-9C11 21129 693920 48958F94-8F8 1264 34480 15374F132-3C10 1124 408 1714F95-5C4 0 0 416F95-1E8 1155 0 50F95-1B2 22 0 1036F20-4E7 3408 33702 8315F20-6E11 3206 25717 36F144-4F10 58 0 0

hC

G

hC

Gß

hC

Gß

cf

solid

i

F16-

6G5

F16-

6G5

F16-

6G5

F144-2G2 469 1326 134416F144-6G8 833 2214 193641F52-3C11 524 690 176914F142-7F3 238 1436 267F144-12E4 479 31719 51F140-2F6 4257 27391 165F143-1C10 27449 1137 57F140-11C5 171935 2032 0F132-13C11 156902 141 209F132-9F10 12136 5152 256F130-8D4 175827 12994 147F140-5E2 71498 179408 260889F19-9C11 21129 693920 48958F94-8F8 1264 34480 15374F132-3C10 1124 408 1714F95-5C4 0 0 416F95-1E8 1155 0 50F95-1B2 22 0 1036F20-4E7 3408 33702 8315F20-6E11 3206 25717 36F144-4F10 58 0 0

hC

G

hC

Gß

hC

Gß

cf

solid

i

F19-

9C11

F19-

9C11

F19-

9C11

F144-2G2F144-6G8F52-3C11 57 38 62F142-7F3 21 797 21F144-12E4 145 301 26F140-2F6 14 105 220F143-1C10 33 398 72F140-11C5 0 43 0F132-13C11 0 268 0F132-9F10 932 4780 36F130-8D4 0 0 0F140-5E2 12 343 114F19-9C11F94-8F8 128 23 142F132-3C10 300 9822 567F95-5C4 5038 130376 3194F95-1E8 3479 161301 4221F95-1B2 6162 211771 8612F20-4E7 4708 192136 360F20-6E11F144-4F10 263 5378 1632

hC

G

hC

Gß

hC

Gß

cf

solid

i

F19-

9C11

F19-

9C11

F19-

9C11

F144-2G2F144-6G8F52-3C11 57 38 62F142-7F3 21 797 21F144-12E4 145 301 26F140-2F6 14 105 220F143-1C10 33 398 72F140-11C5 0 43 0F132-13C11 0 268 0F132-9F10 932 4780 36F130-8D4 0 0 0F140-5E2 12 343 114F19-9C11F94-8F8 128 23 142F132-3C10 300 9822 567F95-5C4 5038 130376 3194F95-1E8 3479 161301 4221F95-1B2 6162 211771 8612F20-4E7 4708 192136 360F20-6E11F144-4F10 263 5378 1632

Tracer-Eu°

Solid 6G5 F94-14E5 F93-5G2 F20-6E11

9C11 0-sample 270 1200 500 645

hCGßn (2000 pmol/L) 320000 250000 190000 3624

hCGß intact (2000 pmol/L) 280000 230000 170000 205591

hCG (2000 pmol/L) 4400 4400 1600 1961

Antibody reactivity with hCGβn

Tracer-Eu°

Solid 6G5 F94-14E5 F93-5G2 F20-6E11

9C11 0-sample 270 1200 500 645

hCGßn (2000 pmol/L) 320000 250000 190000 3624

hCGß intact (2000 pmol/L) 280000 230000 170000 205591

hCG (2000 pmol/L) 4400 4400 1600 1961

Antibody reactivity with hCGβn

IstukkagonadotropiiniKliininen käyttö

• Raskausdiagnostiikka– Raskaustestit– Raskauskomplikaatiot– Downin syndrooma

• Syöpädiagnostiikka– Istukkasyöpä ja rypäleraskaus– Gastrointestinaalisyöpä– Gynekologinen syöpä

Serum hCG and hCGβ in nonpregnant women and men

0

5

10

15

20

25

hCG

(pm

ol/L

)

0

2

4

6

8

10

<30 30-39 40-49 50-59 60-69 >70

hCGβ

(pm

ol/L

)

Age (years)

FEMALES

0

5

10

15

20

25

0

2

4

6

8

10

<30 30-39 40-49 50-59 60-69 >70

Age (years)

MALES

100908070605040302010

100

1000

10000

100000

1000000

Days af t er LMP

hCG

(IU

/L)

Serum hCG during early fetal loss and abortionTwo individuals

50040030025011

10

100

1000

10000

100000

1000000

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

Days

hCG

(pm

ol/L

) [

]

hCGβ

(pm

ol/L

) [

]

Levonova®Hysterectomy Lung metastases

Serum hCG and hCGβ during treatment of choriocarcinoma

Figure 1. Survival curves for ovarian cancer patients presenting with a preoperative hCGß concentration < or � 2 pmol/L.

Time (months)

7260483624120

1.0

.9

.8

.7

.6

.5

.4

.3

.2

.1

0.0

hCGβ <2.0 pmol/L

hCGβ �2.0 pmol/L

21 died, 82 censored

34 died, 9 censoredp<0.001

Sur

viva

l pro

babi

lity

Frequency of elevated serum levels of hCGβ in pancreatic diseases

CA19-9 CEA hCGβ

(%) (%) (%)

Benign diseases 28 8 9

Pancreatic cancer 90 50 72

Aiheita pohdiskeluun

• Menetelmien herkkyys• Menetelmien spesifisyys• Mittausalue• Ristireaktiot• Eri molekyylimuodot• Analyytin labiilisuus

AuraTek

OriPreg

Concise Plus

Clearview II

Biocard hCG U

Biocard

hCG S/U Rapipreg

6050403020100

hCG (IU/L)

Sensitivity of various pregnancy tests

Recognition of hCGβSample description: Base pool spiked with hCGb IRP 75/551. “Expected” response in an assay recognizinghCG and hCGβ on an equimolar basis is 388 IU/L.

Total MethodsMethod Development 124In-house Dab RIA, L/P (1) 248Tosoh-A1A (Total) 251Bayer Immuno-I 311Bayer ADVIA Centaur (New) 319In-house Dab RIA, L/P (2) 320Bayer ACS: 180 (New) 324Bayer ACS: 180 (Old) 326Bayer ADVIA Centaur (Old) 347Socolab PCx 366Abbott Architect 380Roche ElecSys (Total) 387Roche Cobas Core 461Beckman Access 521Abbott AxSYM 528Abbott IMx (Total) 566DPC Immulite 584J&J Vitros Eci 630DPC Immulite 2000 670Roche Enzymun 874

UKNEQAS, November 14th, 2000

Recognition of hCGβSample description: Base pool spiked with hCGβ IRP 75/551. “Expected” response in an assay recognizing hCG and hCGb on an equimolar basis is 388 IU/L.

Intact MethodsBehring DADE Dimension -2BioMérieux Vidas -1Wallac Delfia 2Roche ElecSys (Intact) 6Biochem MAIAclone 30Tosoh-AIA (Intact) 118

UKNEQAS, November 14th, 2000

1000100101,1100

1000

10000

100000

hCG

hCGa

hCGß

+4C

Time (h)

Con

cent

ratio

n (p

mol

/L)

Stability of hCG in pregnancy serum

1000100101,1100

1000

10000

100000

hCG

hCGa

hCGß

+20C

Time (h)

Con

cent

ratio

n (p

mol

/L)

1000100101,1100

1000

10000

100000

hCG

hCGa

hCGß

+37C

Time (h)

Con

cent

ratio

n (p

mol

/L)

Epäspesifiset häiriötekijät• Suola ja pH• EDTA ja sitraatti• Proteiinieffekti• Komplementti

– Ei IgG2 vasta-aineita*• Humaanivasta-aineita eläimiä vastaan

– Heterofiiliset vasta-aineet– Reumatoidifaktori– Human anti-mouse antibodies (HAMA)

* Bormer OP. J Immunol Methods 1989;121:85

Direct

hCG (IU/L) 2213LHspec (IU/L) 56LH (IU/L) >6500FSH (IU/L) 77PRL (mU/L) 1244hCGβ (pmol/L) >16000hCGα (pmol/L) >36000hGH (mU/L) >453PSA (µg/L) 56

Potilastapaus

100010010110

100

1000hCG

LHspec

LH*

FSH

PRL

hCGß*

hCGa*

hGH*

Dilution factor

Rec

over

y (%

)

After Ref.Direct dil 1:2 values

NMShCG (IU/L) 2213 19,7 <5LHspec (IU/L) 56 12,2 1-75LH (IU/L) >6500 14,9 1-75FSH (IU/L) 77 9,1 1-20PRL (mU/L) 1244 171,4 100-500hCGβ (pmol/L) >16000 654 <2hCGα (pmol/L) >36000 1542 <40hGH (mU/L) >453 9,1 <12PSA (µg/L) 56 2,2 <0,1

R.U.

A.P.

6000050000400003000020000100000

Mean+SD

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Solid: 5008Sample (1:100)Rabbit anti-human-IgM (µ-chain)Tracer: Swine anti-rabbit-IgG-Eu

Fluorescence (cps)

Patie

nts

Seerumi vai virtsa?

• Biologinen yhdiste metaboloituu kehossa

• Seerumin ja virstan pitoisuudet eivät välttämättä korreloidu

• Korrelaatiot menetelmäkohtaisia• Spesifisyys

Korrelaatio seerumin ja virtsan hCG-pitoisuuksien välillä raskauden aikana

1000010001001011

10

100

1000

10000

S-hCG

U-hCG (IU/L, corrected)

y = 55 + 0,72x R = 0,94

1000010001001011

10

100

1000

10000

S-hCG (IU/L)

U-hCG (IU/L, uncorrected)

Luteinisoiva hormoni (LH)

• Glykoproteinihormoni• Heterodimeeri, α- ja β-alayksikkö• Seerumissa pääasiallinen muoto intakti αβ-dimeeri

• Virtsassa esiintyy vaihtelevassa suhteessa LH, LHβ, LHβcf

100-10-20-300

10

20

30

40

LH DELFIA

LHspec DELFIA

Day of cycle

LH im

mun

orea

ctiv

ity (I

U/L

)

1201008060402001

10

100

Days of storage

LH (

IU/L

)

+4C

1201008060402001

10

100

Days of storage

LH (

IU/L

)

-20C

Ongelmien välttäminen

• Preanalyyttiset tekijät• Menetelmien valinta• Ongelmien tiedostaminen• ”Työkalupakki”