UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

Facultad de Ciencias de la SaludEscuela Profesional de Medicina Humana

Cátedra de Fisiología Humana

GUÍA DE PRÁCTICASde

FISIOLOGIA HUMANAAutores:

Docentes del CursoDr. Carlos Ramírez VelascoDra. Pedro Núñez HuamaníDr. Enrique Ávila Zamora

Dr. Edgar Zárate Sáez

LIMA  -  PERÚ

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE FISIOLOGIA HUMANAOBTENCION DE MUESTRAS BIOLOGICAS PARA EXPERIMENTACION EN

ANIMALES Y SERES HUMANOS.MANEJO DE ANIMALES DE

EXPERIMENTACION.

Introducción

Definición de Bioseguridad:Es el conjunto de normas preventivas para proteger la salud y brindar seguridad al personal que trabaja ensalud frente a los diferentes riesgos producidos por agentes: biológicos, físicos, químicos y mecánicos.

Agentes de riesgo o causantes de daño: agentes biológicos trasmitidos por ingesta, inhalación, inoculación,y por contacto directo a través de piel y mucosas.

Agentes  físicos  y  mecánicos:  Temperaturas  extremas,  radiaciones  ionizantes,  contacto  y  conexioneseléctricas, defectuosas, vidrios rotos.Agentes químicos: corrosivos, tóxicos, carcinogénicos, inflamables, explosivos.

La Bioseguridad implica una acción de conjunto: Todos deben cumplir las normas de  Bioseguridad: "Eldescuido de una persona es el riesgo de todos"

Riesgo  Biológico:  es  la  probabilidad  de  infectarse  con  un  agente  patógeno  (agente  patógeno  se  llama  atoda aquella noxa que es capaz de producir una enfermedad en la actividad laboral.

Exposición: Es un contacto que implica riesgo con un patógeno capaz de trasmitirse por la vía donde seestá produciendo la exposición.

Propósito de la Bioseguridad:Promover la salud de los trabajadores de salud  mediante la vigilancia de las actividades de cada área detrabajo   en   salud   para   prevenir   las   exposiciones   a   fluidos   con   riesgo   biológico   y   vigilancia   delcumplimiento de las normas de bioseguridad. Además promover, sugerir y establecer políticas que apoyenla educación continua de los trabajadores de salud.

Debe tenerse un suministro oportuno y continuo de insumos necesarios para la protección.La disponibilidad de agua potable es primordial.Disponibilidad de lavamanos cerca del área de atención de pacientes ó Laboratorio de trabajo.

PRACTICAS DE SEGURIDAD

Todo el personal que trabaja en el laboratorio fisiológico o  ingresa a él debe seguir reglas de seguridad.Las normas de seguridad son obligatorias y son esenciales no solamente   para la acreditación académica,sino   porque   consisten   en   prácticas   que   otorgan   seguridad   y   protección   al   personal,   alumnos   einvestigadores  que  trabajan  en  los  laboratorios  bioquímicos,  fisiológicos,  bacteriológicos,  biológicos,químicos,  etc.  Muy  especialmente  en  el  campo   médico  donde  trabajamos  con  muestras  ó   materialbiológico que es considerado potencialmente patógeno ó patógeno. La máxima seguridad y protección esnecesaria en estos casos

PRACTICAS GENERALESSe  prohíbe  fumar,  comer  y  aplicarse  cosméticos,  para  evitar  la  diseminación  de  agentes  infecciosos  oproductos  químicos  tóxicos  de  las  mallas  hacia  la  boca.  Con  el  fin  de  evitar  el  contacto  con  agentesinfecciosos o diseminarlos, debe utilizarse alguna prenda protectora sobre la ropa, como el guardapolvo,

mandil, ó la bata de laboratorio. Estas prendas de protección externa no deben usarse fuera del laboratorio.Los zapatos han de ser  de punta  y talón cerrado. No  es conveniente que las personas que trabajan en ellaboratorio usen lentes de contacto debido al desprendimiento de vapores y a las salpicaduras que puedenproducirse.  Los  lentes  de  contacto  inhiben  el  lagrimeo  y  permiten  que  las  sustancias  permanezcan  mástiempo en la córnea.Se recomienda el uso de lentes de protección o protectores para la cara a las personas que usan lentes decontacto, en particular si hay alto riesgo de vapores, aerosoles o salpicaduras. La joyería de tipo colgante,el  cabello  largo  y  barba  son  riesgosos,  ya  que  es  posible  que  entren  en  contacto  con  muestras  u  otrassuperficies, o se enreden o queden atrapados en instrumentos con movimiento, como máquinas rotatorias ocentrifugas. Se prohibe estrictamente pipetear con la boca todo tipo de muestra, reactivo, agua o cualquierotra sustancia biológica deberán usarse pipetas manuales automáticas.

DERRAMES . .Es  necesario  desarrollar  y  tener  políticas  escritas  y  procedimientos  para  instruir  a  los  alumnos  y  a  los

empleados  acerca  de  la  manera  de  manejar  derrames  químicos  y  biológicos.  Existen  en  el  comercioestuches  con  insumos  para  ambos  tipos  de  derrames..  Si  no  existen  tales  normas  en  la  institución  ellaboratorio debe desarrollarlas con el fin de asegurar el ambiente de trabajo.

LAVADO DE MANOSEl  lavado  de manos  es  una  de  las  principales  maneras  de  evitar  la  diseminación  de  agentes  infecciosos.Aunque se utilicen guantes, el lavado de manos es necesario. Por que es posible que  éstos tengan huecosmicroscópicos.  Al  tratar  con  pacientes,  es  necesario  lavarse  las  manos  tras   atender  a  cada  uno  de  ellosaunque se utilicen guantes.

LIMPIEZANo debe permitirse que la basura, los desperdicios biológicos, infecciosos. y el material de vidrio sucio seacumulen  en  grandes  cantidades  en  el  laboratorio.  Los  recipientes  con  muestras  de  desecho  y  agentesetiológicos   deben   taparse   cuando   no   se   estén   empleando.   Es   necesario   limpiar   con   frecuencia   lassuperficies   de   trabajo   con   algún   desinfectante   al   comenzar   y   terminar   cada   turno.   El   personal   delaboratorio  fisiológico  es  responsable  de  mantener  el  área  de  trabajo  limpia  y  sanitaria,  aunque  hayaservicio de limpieza adicional por parte de la institución.

ETIQUETAS Y SEÑALESTodos  los  recipientes  que  contienen  productos  químicos  deben  etiquetarse  con  claridad,  indicando  elnombre  del  producto  y  cualquier  precaución  para  su  manejo.  Las  áreas  en  que  se  almacenan  productosinflamables,  peligrosos  o  tóxicos  y  carcinógenos,  o  en  las  cuales  se  utilizan   deben  estar  marcadasclaramente. Las áreas en que se almacenan o analizan sangre o liquidos corporales deben estar marcadasclaramente con el signo de riesgo biológico.

DESECHO DE DESPERDICIOSExisten  normas de la  OSHA  con respecto  al desecho  de productos biológicos. El desecho  de  materialesbiológicos, como desperdicios infecciosos, se examina y regula en la actualidad por leyes específicas delMinisterio de Salud Pública.AGUJAS Y  OBJETOS PUNTIAGUDOS.

Las agujas y otros objetos puntiagudos constituyen un riesgo físico de infección potencial para el personalde laboratorio fisiológico. Todas las agujas desechables y demás objetos punzantes deben colocarse en unreclpl9nte resistente a la perforación y a prueba de fugas, marcado con el símbolo de riesgo biológico.Estos recipientes se descartan, siguiendo las políticas de la institución, cuando están llenos hasta la mitad olas  tres  cuartas  partes.  La  mayoría  de  las  instituciones  incineran  los  recipientes  que  contienen  objetospunzantes.  Inmediatamente  después  de  usada  una  aguja  deberá  incinerarse  y  para  ello  existen  en  laactualidad  equipos  especiales  incineradores  de  agujas  llamados      destructores      de      agujas.     Nunca,  deberáreenfundarse ó   volverse a colocar la cubierta de las agujas a menos que se utilice algún dispositivo comopinzas diseñadas para este fin, para evitar la punción cutánea accidental. Las agujas nunca deben  cortarse,ya que esto puede provocar salpicaduras de sangre o de otros líquidos al medio.

SEGURIDAD CONTRA INCENDIOSTipos de IncendioEn   el   laboratorio   Fisiológico   u   otros   laboratorios   biológicos   se   requieren   líquidos   inflamables   ycombustibles  para  ciertos  procedimientos,  y  en  ellos  también  existe  el  riesgo  potencial  de  incendioseléctricos  y  de  basura.  El  científico  del  laboratorio  debe  comprender  estos  peligros  y  la  manera  deafrontarlos en caso de urgencia. Los incendios se clasifican de la clase A a la D.

Los  incendios  de  clase  A ocurren  con  combustibles  ordinarios,  como  madera  o  papel;  los  de  la  clase  Bocurren  con  líquidos  inflamables;  en  los  de  la  clase  C  participan  circuitos  eléctricos  energetizados,  sinimportar el combustible; y los de la clase D, son producidos por metales combustibles como el sodio. Paracada tipo de incendio se requiere un extinguidor diferente y adecuado  con el fin de controlar de maneraeficiente el fuego y evitar que se éste se extienda.

Extintores ó Extinguidores para incendios. Clases.Los extintores contra incendios contienen diferentes sustancias y están marcados según el tipo de incendiopara  el  que  deben  emplearse.  Los  extintores  clase  A están  llenos  de  agua  y  nunca  deben  utilizarse  paraincendios de tipo eléctrico. ya que el agua puede conducir la electricidad de regreso a la persona que tieneel extintor en las manos. Los extintores clase B contienen productos químicos secos, espuma acuosa queforma una capa (AFFF) o dióxido de carbono. Los extintores clase C están llenos de dióxido de carbono oHalon; los de la clase D de un polvo seco especial que contiene un enlazante termoplástico que permite

que el agente forme una corteza sólida al calentarse. Hay extintores que pueden emplearse para Incendiosde  clases  A  ,B  y  C.  Contienen  un  polvo  seco  y  pueden  utilizarse  con  eficacia  y  seguridad  para  las  tresclases de incendios. Generalmente este tipo de extintores es el que se compra para uso en el hogar o en lasoficinas. Sin embargo, si se emplea para incendios de equipo eléctrico en el laboratorio, es probable quesea difícil o imposible eliminar posteriormente dicho polvo de los instrumentos. Por tanto, se recomiendanlos extintores de dióxido de carbono para incendios de equipo eléctrico.Causas de  incendio y su PrevenciónLas causas fundamentales de incendios en el laboratorio son descuido, falta de conocimiento acerca de losproductos químicos que se utilizan, permitir que se efectúen procedimientos sin.la  vigilancia  adecuada,  sobrecarga  de  circuitos  eléctricos  ,  llamas  de  gas  abiertas.  Es  necesario  impartirperiódicamente  conferencias  para  instrucción  sobre  seguridad  en  el  trabajo,  con  el  fin  de  recordar  a  losempleados la manera segura de proceder para evitar incendios y otros tipos de accidentes.

En caso de que se produzca un incendio es necesario ponerse en contacto con el departamento debomberos y   solicitar      ayuda      antes      de      intentar      extinguirlo,     Se pierde tiempo importante cuando se trata deapagar el incendio primero, y después se solicita ayuda. Los pasos que deben seguirse en caso de incendioson:1. Rescatar a cualquier persona que se encuentre en peligro.2. Aislar el incendio cerrando alguna puerta.3. Solicitar ayuda.4. Intentar extinguido.5. Evacuar las instalaciones en caso de que no se pueda apagar el fuegoPor  supuesto,  cuando  hay  varias  personas  presentes,  estos  pasos  pueden  llevarse  a  cabo  de  manerasimultánea y rápida  en un   esfuerzo      conjunto.    Es necesario adiestrar al personal de laboratorio en el uso delos extintores  contra incendios. En  general, el  departamento  de incendios de la  localidad  o  el comité  deseguridad de la institución proporciona este entrenamiento.

SEGURIDAD BIOLOGICAProtección PersonalLa dispersión epidémica del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) ha revivido la preocupaciónacerca  de  las  enfermedades  que  se  transmiten  por  la  sangre  entre  las  personas  que  trabajan  en  ellaboratorio.  Se  sabe  que  las  personas  que  laboran  en  los  laboratorios  médicos  en  general,  fisiológicos,

bacteriólogos,  biólogos y otros relacionados con la salud  en general, conforman  un grupo  de alto  riesgopara infecciones por virus de hepatitis B   relacionadas con el trabajo y virus de inmunodeficiencia humana(HIV).   En   1987   el   Centro   de   Enfermedades   Transmisibles   USA   (CDC)   y   la   OSHA   publicaronrecomendaciones para proteger a las personas que trabajan al cuidado de la salud y a otras de adquirir lainfección por HIV y se actualizaron nuevamente en 1988. Entre las recomendaciones se aconseja que "setomen  precauciones  congruentes  al  manejar  sangre  y  líquidos  corporales  de  todos  los  pacientes  y  lasmuestras que se obtengan".Esto  se  conoce  como      precauciones      universales.     Las  recomendaciones  incluyen  el  uso  de  equipo  paraprotección personal, como guardapolvos, mandiles, batas, guantes descartables y protectores para los ojosal manipular  sangre y líquidos corporales en el laboratorio. La revisión de los CDC en 1988 recomendóusar equipo de protección personal para manejar todas las sustancias biológicas y animales. Deben tratarsetodas   las   secreciones   y   excreciones   corporales   como   potencialmente   infecciosas,   ya   que   hay   otrasenfermedades  además  de  HBV  y  HIV  que  se  transmiten  a  través  de  diversos  líquidos  del  organismohumano y de los animales.En  1991  la  OSHA  publicó  una  regulación  final  la  Occupational  Exposure  to  Bloudborne  Pathogens(Exposición ocupacional a patógenos que se transmiten por la sangre). Esta regla indica que el patrón debeproporcionar equipo de protección personal que no permita que los materiales potencialmente infecciososentren en contacto con la ropa. la piel, los ojos y la boca del trabajador en condiciones normales de uso. Laregla también indica la manera correcta de disponer de objetos punzantes y otros desperdicios con riesgobiológico y señala la necesidad de administrar la vacuna de HBV y el tratamiento tras alguna exposición atodos los empleados que corran este riesgo.Además de describir equipo de protección personal, dicha norma incluye instrucciones para el lavado demanos,  transporte  de  muestras,  uso  de  pipetas,  forma  de  recoger  derrames,  desechos  de  desperdicios  ydescontaminación del equipo.

Derrames

Es necesario que las personas que limpian algún derrame biológico utilicen guantes descartables y bata delaboratorio.  Se  colocan  toallas  desechables  sobre  el  derrame  y  se  vacía  desinfectante  sobre  ellas.  Trasdejarlo  reposar  algunos  minutos.  se  recoge  la  sustancia  y  el  desinfectante  con  material  absorbente  (loscojinetes absorbentes son útiles para derrames grandes)  A continuación se coloca el material contaminadoen  un  recipiente  para  riesgos  biológicos:  bolsas  plástico  grueso   color   rojo  en  el  Perú  y  bolsa  de  colornegro para basura doméstica.Después  de  absorber  la  mayor  parte  de  material,  el  área  se  limpia  con  un  desinfect8nte  de  fuerzaintermedia o alta, por ejemplo, dilución de Lejía 1:10. La solución desinfectante se absorbe con materialdesechable. El área se enjuaga con agua y se seca para evitar que quede resbalosa. Es conveniente prepararun  conjunto  de  utensilios  para  limpiar  derrames  con  riesgo  biológico  que  contenga  todos  los  materialesnecesarios para efectuar la limpieza de este tipo y tenerlo a la mano en el laboratorio en que se manejandichas muestras.

SEGURIDAD QUIMICA

Hoja De Datos Sobre Seguridad De MaterialesEn Agosto de .1987.)a OSHA enmendó la norma Federal Hazard Communication Standard29CFR   1919:   1200   (Rigllt   to   Kriow/HCS   Standard),   haciéndola   extensiva   a   todas   las   industrias,incluyendo las instalaciones para el cuidado de la salud. Esta norma establece que los responsables de cadaárea determinen si se utilizan productos químicos peligrosos en el trabajo y proporcionen a los empleadoshojas con datos de seguridad en el uso del material riesgoso y marquen adecuadamente los recipientes quecontienen el producto, indicando el riesgo, y se mantendrá una lista de productos químicos peligrosos, esdecir, un inventario de productos químicos, y proporcionen al empleado información y entrenamiento,  ydesarrollen un programa de comunicación de riesgos por escrito.Información  que  contiene         la      hoja      de      datos      de      seguridad      para  cada  material  ó  grupo  de  sustanciasrelacionadas, de uso en Laboratorio fisiológico y otros Laboratorios biológicos.

1. Identificación del producto químico (nombre químico, y sinónimo y/o nombre vulgar.)

2. Ingredientes peligrosos3. Datos físicos4. Datos de incendios y explosiones5. Información de riesgos para la salud6. Datos de reactividad7. Procedimientos para derrames, fugas y desecho8. Información de protección personal.9. Precauciones especiales y comentarios

Manejo de AnimalesLa  mejor  manera  para  aprender  a  manejar  correctamente  los  animales  de  laboratorio  es  la  instrucciónpráctica directa. Pueden enunciarse aquí algunos principios generales.El personal de laboratorio puede recibir de casi todos los animales (conejos. cobayas. ratones)., pequeñosarañazos cuando el animal trata de escapar; pero raras veces intenta éste lesionar al operador. En el caso delas  ratas,  las  cosas  cambian;  pueden  realizar  muchos  esfuerzos  para  escapar.  y  producir  mordeduraspeligrosas, También los monos deben manejarse con cuidado. En cualquier caso, es indispensable que aunlos  pequeños  arañazos  de  animales  se  traten  en  forma  adecuada;  si  el  animal  ha  sido  inyectado  conmaterial patológico la naturaleza de dicho material puede obligar a tomar ciertas medidas para proteger alpersonal contra las consecuencias de la mordedura. Por  lo tanto, debe reportarse de inmediato, y tratarsemédicamente cualquier lesión, por pequeña que sea.

Toma de Muestras de SangreLa  muestra  de  sangre  para  las  pruebas  de  laboratorio  pueden  tomarse  en  diferentes  sitios:  capilar  operiférica,  venosa   y  ocasionalmente  arterial.  Esta   muestra  se  utiliza  para  la  valoración  de  diversosparámetros del medio interno que puede llevarse a cabo  en sangre completa o una fracción de la misma.sea plasma o suero. Si la muestra sanguínea no se recoge con una técnica adecuada puede ocurrir que losexámenes proporcionen información inexacta o incorrecta ó bien que la muestra se rechace y sea necesariorepetir la punción. Deben tomarse precauciones en todos los casos por lo que la obtención y manipulaciónde las muestras se harán con guantes quirúrgicos descartables..

Sangre Capilar o PeriféricaLa sangre que suele llamarse capilares, al menos parte arteriolar se obtienen por o general de: a). La yema

del  dedo;  b). el  borde del  lóbulo  de  la  oreja;  y c).  el  talón  en  los  niños  pequeños  En  cualquier  de  estossitios  el  área  debe  de  estar  tibia  (ni  fría  ni  congestionada)  ya  que  de  otra  manera  la  composición  de  lasangre varia por la éxtasis o la dilución. Sin embargo debe recordarse que aun ejecutando una buena toma,los  valores  de  los  parámetros  difieren  entre  la  sangre  capilar  y  la  venosa.   Usar  alcohol  y  lancetasdescartables.

TECNICA1.   Limpie la piel con una torunda de algodón con alcohol de 70º o con otro desinfectante adecuado

y deje secar.2.   Haga  una  punción  profunda  (2-  3  mm  con  una  lanceta  o  aguja  estéril  desechable.  La  punción

debe efectuarse de un golpe y rápidamente para que resulte casi indolora (sobre todo el borde dellóbulo de la oreja).

3.   La  primera  gota  de  sangre  se  elimina  por  que  contiene  desechos  tisulares.  La  sangre  no  debeexprimirse o se obtendrá una muestra diluida; peso sí puede hacerse presión a distancia del sitiode la punción. Tras concluir la toma de la muestra se entrega al paciente una torunda limpia quedebe presionar sobre el sitio de lesión.

SANGRE VENOSAPor  lo  general  se  utiliza  una  de  las  venas  de  las  fosas  ante  cubitales,  pero  con  frecuencia  también  sepuncionan las venas de las manos   las muñecas o cualquier vena visible   de buen calibre (en los pacientesprematuros es posible punzar las venas del cuero cabelludo  ó la yugular externa o la femoral) Las venasdeben  examinarse  cuidadosamente;  si  son  profundas  y  no  se  palpan  con  facilidad  se  descartan. Para

facilitar el examen se usa un torniquete de jebe.

EQUIPO.La muestras se toman previa desinfección con alcohol y  con jeringas desechables con aguja de calibre 19ó 20 x1  (cuanto más bajo es el numero mas es el grosor de la aguja, las de menor grosor pueden hemolizarla muestra y las de mayor grosor se reservan para la obtención de sangre para transfusiones).

TECNICA1.   El paciente debe estar acostado o sentado cómodamente y con el brazo apoyado en una  mesa o

soporte.  Algunas  pacientes   –  en  especiales  los  jóvenes  –  pueden  sufrir  malestar  o  inclusodesmayarse. Por tanto manténgase alerta ante señales como palidez o piel fría.

2.   Coloque el torniquete con un medio lazo   para poder retirarlo fácilmente. No efectué demasiadapresión ya que puede detener la circulación arterial.

3.   Pida  al  paciente  que abra  y  cierre  el  puño  un  par  veces  para  obtener  mayor  distensión  de  lasvenas. Algunas veces las venas no se ven con claridad pero se palpan.

4.   Una vez elegido el sitio de punción se procede a limpiar con alcohol y se deje secar. Enseguida sefija la vena sosteniendo el brazo del paciente con la mano mientras se estiran y comprimen con elpulgar y los tejidos blandos situados justo debajo del escogido para punzar. La jeringa se sujetaentre el pulgar y los tres últimos dedos de la otra mano y sus dorsos se apoyan con el brazo delpaciente. El dedo índice se coloca sobre el casquillo de la aguja y sirve como guía. El bisel de laaguja debe quedar hacia arriba.

5.   Cuando  la  vena  es  prominente  se  punza  en  forma  directa  con  la  aguja  colocada  horizontal  ydirigida en paralelo a la vena. Al perforar la pared se percibe una sensación de crujido. Cuando elacceso a la vena no es tan perceptible, la punción se efectúa en dos tiempos: primero se punza lapiel  y  luego  la  vena.  Para  que  la  sangre  entre  a  la  jeringa  se  hace  una  tracción  ligera  sobre  elembolo evite realizar una tracción excesiva porque la vena puede contraerse e impedir el paso dela sangre hacia la jeringa. Algunas veces al puncionar se traspasa la vena; entonces debe retirarseligeramente   la   aguja   al   verificar   la   entrada   de   la   sangre.   Esta   operación   puede   producirhematomas;  si  se  advierte  señales  de  extravasación  de  sangre  a  los  tejidos,  retire  la  aguja  deinmediato y aplique presión local.

6.   Antes  de  retirar  la  aguja,  quite  el  torniquete  y  pida  al  paciente  que  abra  el  puño.  En  cuanto  seadquiera  la  destreza  necesaria,  esta  última  operación  se  efectúa  cuando  la  sangre  termina  deentrar a la jeringa. El paciente debe mantener la presión con una torunda en el sitio de la puncióny el brazo flexionado durante unos minutos para evitar hematomas.

7.   Tras   la   obtención   de   la   sangre,   se   retira   la   aguja   de   la   jeringa   con   una   pinza   de   metal   y   con   un movimiento   de   torsión   y   con   la   ayuda   de   otra   pinza   se   coloca   el   extremo   del   embolo   sobre   la pared   interna   del   tubo.   Nunca   realizar   el   reenfundamiento   de   la   aguja   sin   pinzas.   La  sangre sevacía suavemente para evitar que se forme espuma y produzca hemólisis. Si la determinación que

se   va   efectuar   exige   sangre   completa   o   plasma   la   muestra   se   coloca   con   un   tubo   conanticoagulante  y  se  invierte  con  suavidad  varias  veces  para  mezclar.  Si  en  cambio  se  deseaobtener suero, la sangre se coloca en tubo, de preferencia de 37 ª C para que el coágulo se formemás  rápido.  La  retracción  del  coágulo  puede  acelerarse  separando  de  la  pared  del  tubo  con  unaplicador de madera. Es imperativo usar destructores de agujas en todos los casos.

USO DE VACUTAINEREn muchos laboratorios se utilizan actualmente los tubos Vacutainer para obtener las muestras de sangrevenosa, en lugar de las jeringas. Los tubos están sellados con un tapón de goma y extraen un volumen desangre predeterminado. La aguja desechable se enrosca en el tubo de manera que el tapón de goma alcancéjusto la línea guía. La aguja más corta se mete dentro del tapón de goma, pero no penetra y por lo tanto norompe el vació. Una vez que se tiene la certeza de que la aguja   ha abordado la vena, se empuja el tubohasta el fondo del sujetador lo que rompe el vacío y la sangre entra al tubo. Cuando el flujo cesa, el tubo seretira y si se desea puede sustituirse por el otro para obtener otra muestra .No debe usarse el Vacutainerpara dosaje de gases arteriales.

SANGRE ARTERIALPara la determinación de gases se requiere punción arterial. En esos casos la arteria se ubica localizado ellatido  por  palpación  muy  cuidadosa.  La  punción  es  necesariamente  más  profunda  y  se  requiere  mayorcautela para impedir hematomas. Debe practicarla el médico.

ANTICOAGULANTESLos cuatro  anticoagulantes  mas usados  son  una  mezcla de  oxalato  amoniaco  y potasio, citrato  trisodico,Sequestrene (EDTA) y heparina. Los tres primeros impiden la coagulación al sustraer el calcio del plasmasanguíneo  por precipitación o  fijación en forma  no  ionizada,  e inhibe  la activación  de los factores de lacoagulación.El  citrato  trisodico  se  utiliza  para  impedir  la  coagulación  de  la  sangre  destinada  a  transfusiones.  ElSequestrene y la heparina pueden servir para el mismo fin, pero no la mezcla de oxalatos porque es toxica.La  mezcla  de  oxalato  de  amonio  y  (6partes)  y  oxalato  potasio  (4partes)  en  la  cantidad  de  2  mg/ml  desangre  no  afecta  el  volumen  globular  medio  y puede  usarse  para  hemoglobina,  hematocrito  y recuentosglobulares. En frotis de sangre su utilidad esta limitada a los primeros minutos por que se desarrollan conrapidez formas dentadas en los hematíes, vacuolización en el citoplasma de los  granulocitos y artefactosen  los  núcleos  de  linfocitos  y  monocitos  y  otras  deformidades.  Asimismo,  la  sangre  tomada  con  estamezcla de anticoagulantes no puede emplearse para determinados químicas de nitrógeno   ni  potasio.

El citrato trisódico en solución acuosa al 3.8%, se mezcla a razón de 1/9 con sangre para investigacionesde coagulación. El Sequestrene  (EDTA) se emplea en una concentración de 1 a 2 mg/ml de  sangre. La saldi sódica o di potásica de Etilendiaminotetracetato es tal vez el anticoagulante que mas se emplea para elrecuento de las células sanguíneas. Hay que mezclarlo minuciosamente con la sangre. Para el estudio delhematocrito   es   equiparable   al   oxalato   y   para   estudios   morfológicos   lo   supera,   ya   que   impide   ladeformación   y  artefactos  incluso  después  de  un  reposo  prolongado.  Se  consiguen  frotis  aceptables  auncuando  hayan  pasado  2  o  3  hs  y  hasta  24  hs  si  la  sangre  se  refrigera.  También  es  posible  realizar  elrecuento de plaquetas aun después de unas pocas horas.La heparina, a razón de 0.1 a 0,2 mg/ml de sangre, no afecta el tamaño corpuscular ni el hematocrito. Es elmejor  anticoagulante  para  prevenir  la  hemólisis  y  para  las  pruebas  de  fragilidad  osmótica.  No  resultasatisfactoria para recuentos de leucocitos o cuando han de prepararse frotis (o extensiones de sangre porque en este segundo caso produce un fondo azul en las preparaciones teñidas con el colorante de Wright.

CUIDADO, INOCULACIÓN Y SANGRIA DE LOS ANIMALES  yDIAGNOSTICO DE SUS ENFERMEDADESFundamentos

1.   Para determinadas investigaciones de laboratorio fisiológico es indispensable disponer de losanimales apropiados.

2.   Los animales habrán de ser sanos y seleccionados con cuidado y estar instalados con limpieza ycomodidad, así como adecuada y suficientemente alimentados.

3.   Pocos métodos de inyección y sangría producen mayor dolor que los similares empleados en losseres humanos, y todos los métodos operatorios de importancia habrán de efectuarse con elanimal anestesiado. Por otra parte estos animales habrán de ser tratados con la solicitud quemerecen por los servicios que prestan a la humanidad .

ALOJAMIENTO DE LOS ANIMALES.Las jaulas para los animales pequeños, como conejos, cobayos, ratones y ratas deben construirse ydisponerse de modo que los animales se conserven sanos y cómodos. Se evitara atestar las jaulas con lotesdemasiados numerosos. Convendrá disponer de jaulas separadas para los animales normales que no seutilicen.Los animales recién llegados al laboratorio deberán ser examinados cuidadosamente, a fin de comprobarque no están enfermos, antes de colocarlos en las jaulas de los normales. Si se dispone de suficienteespacio será conveniente guardarlos en aislamiento durante una semana a diez días.

Las  jaulas  se  construirán  de  modo  que  permitan  la  limpieza  y  desinfección  mas  completas  y  poseansuficiente luz y ventilación, deben construirse expresamente para fines experimentales fisiológicos.Debe  disponerse  de  compartimientos,  y jaulas  de  aislamiento  para  los  animales  inoculados  y   deberánestar solos, en jaulas aparte, para  protegerlos de las molestias o herida que entre ellos pudieren infligirse.Los compartimientos de animales deben estar bien iluminados y ventilados .Se procurara conservar a unatemperatura uniforme, día y noche.

IDENTIFICACION  DE  LOS  ANIMALESEs conveniente adoptar un sistema seguro para la identificación de los animales .La practica de rotular  lasjaulas sirve para la distinción de los lotes numerosos de animales aun cuando para conseguir un registrocompleto conviene numera a cada animal y anotar los detalles relativos al sexo, descripción, etc.

Chapas.Para los conejos y cobayos pueden emplearse unas   pequeñas  chapas de aluminio que se fijan a una orejade animal por  medio  de una  grapa o  un  hilo  metálico  que  perfore estos órganos  y atraviese también losorificios de las chapas.Para los animales de  mayor tamaño pueden adquirirse identificadores especiales ..Pueden obtenerse en lascasas de artículos veterinarios.

Descripción.Cuando  se  use  únicamente  este  método  de  identificación  y  haya  que  alojar  juntos   en  una  misma  jaulavarios  animales,  deben  seleccionarse  los  que  presenten  señales  o  colores  diferentes  .Para  facilitar  elregistro  debe disponerse de  sellos  de  goma  con  dibujos de  ratón  ,  cobayo  o  conejo.  Este  método  seutiliza  junto  con  el  de  la  chapa  metálica  a  fin  de  asegurar  la  identificación si  la  chapa  se  perdiera.Asimismo, debe anotarse cuidadosamente cualquier deformidad o seña particular .El sexo debe registrarseen la descripción (macho y hembra).Señales o marcas para identificación de animalesLos animales pequeños, como  ratones y ratas, pueden  marcarse en el cuerpo  o  en la cola   pintándose lapiel  y  el  pelo  con  colorantes  (soluciones  alcohólicas  saturadas  de  fucsina  o  ácido  picrico).Las  jaulashabrán de rotularse.

PREVENCION Y TRATAMIENTO DE LOS ACCIDENTES EN LOSLABORATORIOS DE  FISIOLOGIA

Las  personas  que  trabajan en  los  laboratorios  fisiológicos  se  hallan  rodeadas  de  múltiples  peligros,  demodo  especial  a  causa  de  las  infecciones  que  pueden  contraer  durante  el  manejo  de  los  animales  deexperimentación, ó durante el trabajo mismo con ellos como actos quirúrgicos, exposición de órganos, uotros  trabajos  que  así  lo  demanden  los  experimentos fisiológicos,  ó  al  manipular productos  sépticosdurante las  investigaciones  o  sufrir  quemaduras  o  la  deglución  accidental productos biológicos  óproducirse a heridas consecutivas rotura de cristales ,etc. A estos peligros están principalmente   expuestoslos investigadores poco experimentados que los ignoran o se entretienen o distraen   mientras trabajan conanimales de experimentación  ó con productos infecciosos. ó con ácidos, álcalis, etc.

PREVENCION DE  LOS  ACCIDENTESDeben emplearse siempre guantes de goma descartables en los experimentos, el investigador   ha de tenerespecial  cuidado  en  no  herirse  los  dedos  con  las  agujas  y  evitar  cortarse  con  los  instrumentos  afiliados,como  bisturís,  sierras,  etc.  Deben  usarse  pipetas  automáticas  manuales  de  volúmenes  regulables conpunteras descartables.Las pipetas de vidrio, en caso de ser usadas, aunque no es recomendable  hacerlo, habrán de tener la  partebucal tapada con algodón de modo obligatorio y tendrán bulbos de goma para aspiración, y nunca aspirarcon la boca. Pueden utilizarse asimismo diversas jeringas. De igual modo, al aspirar ácidos, álcalis y otrassoluciones  peligrosas  por  medio  de  pipetas,  deben  usarse  pipetas  con  bulbos  de  goma  de  aspiración  y

nunca hacerlo con la boca. Vale la redundancia, el alumno deberá tomar todas estas preocupaciones con elmáximo cuidado. Es de suma importancia preocuparse del trabajo sin conversar ni distraerse.

Las manos del operador habrán de estar libres de cortes y escoriaciones, particulares en la proximidad delas  uñas,  debiendo  lavarse  cuidadosamente  con  jabón  y  agua  y  luego  sumergirlas  en  una  solucióndesinfectante antes y  después de haber manipulado productos infecciosos y antes de las comidas.Una   vez   terminado   el   experimento   deberá lavarse   la   superficie   de   las   mesas   con   una   solucióndesinfectante;  algunas  veces  es  recomendable  trabajar  sobre  una  toalla  humedecida  en  una  de  estassoluciones, como por ejemplo  lisol o  tricresol al 2 por 100.

Las pipetas, tubos de ensayo y demás instrumentos empleados en la experimentación   fisiológica tambiénse  desinfectarán  con  una  solución  lisol  o  tricresol  al  2  por  100,  o  se  esterilizarán  inmediatamente  porebullición  durante 20 minutos o autoclave  que es lo ideal.

Los  recipientes,  láminas  portaobjetos  u  otro  material  contaminado  con  orina  ò  heces  ò  secrecionesbiológicas de los animales, ò contaminados con productos biológicos humanos, no se volverán a tocar porningún  concepto  sino  que  se  someterán  a  un  proceso  de  desinfección  inmediata,  como  hemos  indicadolíneas más arriba

Los calentadores y demás aparatos eléctricos se comprobarán con frecuencia para verificar la exactitud desu   funcionamiento, reparando sin pérdida de tiempo sus averías a fin de evitar cortos circuitos incendios.El  mechero  de Bunsen  no  debe utilizarse  nunca en la  proximidad  de  materias   inflamables .Siempre severificara que la llave de mechero   quede bien cerrada antes de retirarse del Laboratorio   , igualmente seasegurará de cerrar la llave del balón contenedor del gas ó la llave general del gas del Laboratorio de ser elcaso.  El  éter,  el  alcohol  y  similares  deben  mantenerse  alejados  de  todo  posible  contacto  eléctrico.  Esobligación del servicio de mantenimiento realizar revisiones  periódicas de mantenimiento preventivo.

FISIOLOGIA DE LA MEMBRANA  SEMIPERMEABLEFRAGILIDAD OSMÓTICA

IntroducciónTodas las células del organismo  están rodeadas de una membrana limitante, a través de la cual obtienensus alimentos y el oxígeno y excretan sus productos de deshecho y el C02 resultante   de su metabolismo.La membrana celular tiene propiedades bien establecidas: Solo deja entrar las sustancias que se necesitany  solo  deja  salir   las  secreciones,  los  productos  de  desecho  y  las  sustancias  no  indispensables,  en  otraspalabras,  es  semipermeable.  Estas  funciones  las  realiza  a  través  de  diversos  mecanismos,  que  hemosrevisado  con  detalle  en  las  clases  teóricas.  En  la  presente  práctica  trataremos  de  una  de  ellas  que  es  laOsmosis. En  general la osmosis significa el paso de líquidos a través de una  membrana  semipermeable.Cuando dos soluciones de diferentes concentraciones están separadas por una membrana semipermeable,el solvente y los solutos atraviesan la membrana siguiendo las leyes que rigen el fenómeno de la ósmosis.El  agua  es  transportada  a  través  de  la  membrana  celular  por  una  fuerza  hidrostática  llamada  presiónosmótica,  dicho  de  otro  modo,   la  presión  osmótica  es  la  fuerza  de  atracción  que  ejercen  las  partículassobre  el  agua atrayéndola.  La  osmolaridad  depende  del  número  de      partículas     que se  encuentran  essolución. La Unidades de Osmolaridad son el Osmol /Kg H2O , en medicina usamos el sub múltiplo miliOsmol /Kg H20Un Osmol por Kg es la fuerza para atraer agua que ejerce un MOL de partículas que se encuentran en 1Litro  ó  Kg  de  solución. Cada  partícula  (átomo)  ejerce  una  presión osmótica  independientemente;  porejemplo un mol de glucosa   disuelto en un Kg (litro ) de agua ejerce una presión osmótica de 1 Osmol /kgagua; en  cambio  un  mol  de  ClNa  disuelto  en  un  litro  de  agua  ejercerá  una  presión  Osmótica  de  dosOsmoles debido a las dos partículas en que se disocia, una de sodio y otra de cloro. (Na+ y Cl- )La  capacidad  de  una  partícula  para  producir  un  flujo  de  agua  a  través  de  la  membrana  celular  se  llamatonicidad.Una solución extracelular que permite que el agua fluya hacia   dentro de la célula haciendo   que ésta sehinche se llama hipotónica (Hipo osmolar)Una solución que permite que el agua fluya hacia fuera de la célula se llama  hipertónica. (Hiper osmolar)

La  membrana  del  glóbulo  rojo  nos  servirá  en  la  presente  práctica  para  demostrar  este  fenómeno  yasimismo  demostrar  que  la  membrana  tiene  ciertos  límites  de  resistencia  normales  a  variaciones  de  latonicidad en el medio interno.Aplicación clínica.Existen algunas  enfermedades  en  las  cuales  se  producen  alteraciones en  la  membrana que  generanhemólisis  por  mayor  fragilidad  de  la  membrana,  son  defectos  genéticos  heterogéneos  que  afectan  a  lasproteínas constitutivas de la membrana del eritrocito.   La Enfermedad Esferocitosis es una de ellas, en laen la cual se ha demostrado una disminución de la proteína  membranal  Espectrina del hematíe, y el gradode déficit de la proteína   Espectrina   parece asociarse con la gravedad clínica de esta enfermedad, pues loshematíes son muy frágiles y  se hemolizan  produciendo anemia intensa.

FundamentoSe llama   resistencia globular osmótica a la que presentan los hematíes suspendidos en soluciones salinashipotónicas. Si empleamos soluciones salinas de 0.76  a 0.9 % y suspendemos dentro de ellas los hematíesveremos  que éstos  se  conservan  sin  alteración  durante  varias  horas,  y  que  una  vez  sedimentados(espontáneamente  ó  por  centrifugan),  el  líquido  que  sobrenada  es  claro y  transparente  como  la  mismasolución   salina.   Pero   si   efectuamos   suspensiones   de   hematíes   en   soluciones   de   cloruro   sódico   aconcentraciones progresivamente decrecientes observaremos que al llegar a una determinadaconcentración  empiezan  a  destruirse,  liberándose  la  Hb,  lo  que  confiere  al  líquido  una  ligera  coloraciónrojiza que no desaparece por centrifugación. Esto se le llama hemólisis inicial o resistencia mínima, quenormalmente se  presenta   entre las concentraciones de 0.46  y 0.42  %.Esta  hemólisis  de los hematíes  vaaumentando  en  cantidad  a  medida  que  la  solución  de  cloruro  sódico  va  siendo  más  hipotónica  hastapresentarse una hemólisis total. Esta hemólisis total  se observa entre las concentraciones de 0.34 a 0.30 %

Esta práctica sirve para   determinar la resistencia de la membrana de los glóbulos  rojos a la hemólisis enpresencia  de  diferentes  concentraciones  de  soluciones  salinas  hipotónicas  a  temperatura  ambiente   yveremos en cuál de ellas se presenta hemólisis inicial y total.

.Reactivos y Equipos Necesarios1. Solución salina al 0.9 %2.-Pipetas graduadas: 1 ml al 0.01

10 ml al 0.15 ml al 0.1

3.- Micropipetas de 0.1 ml4.- Fiola de 100 ml6.- Muestra de sangre  venosa desfibrinada ó hematíes lavados.7.- Agua destilada8.- Tubos de vidrio 13x 100 mm sin reborde

Método1.-  Preparar  soluciones  seriadas,  en tubos  de  prueba  marcados  del 1  al  19,  según  la  tabla  adjunta,haciendo las diluciones con agua destilada según lo indicado:

Marcar 19 tubos de prueba y repartir así:

N°

Tubo

Solución

NaCl

1%

Ml

Agua

Destilada

ml

Mezclar

Por

inversión

%  NaCl de la sol.

resultante

El alumno calculará la Osmolaridad

correspondiente a cada uno de los tubos( expresaren unidades    mOsm/Kg H20)

1 1.0 9 Sí 0.10 %2 2.0 8 Sí 0.20 %3 2.5 7.5 Si 0.25 %4 3.0 7.0 Si 0.30 %5 3.5 6.5 Si 0.35 %6 3.75 6.25 Si 0.375 %7 4.0 6.0 Si 0.40 %8 4.25 5.75 Si 0.425 %9 4.50 5.5 Si 0.45 %

10 4.75 5.25 Si 0.475 %11 5.0 5.0 Si 0.50 %12 5.5 4.5 Si 0.55 %13 6.0 4.0 Si 0.60 %14 6.5 3.5 Si 0.70 %15 7.0 3.0 Si 0.70 %16 7.5 2.5 Si 0.75 %17 8.0 2.0 Si 0.80 %18 8.5 1.5 Si 0.85 %19 ------ 10.0 --- 0       % Control de hemolisis total para comparación visual.

NOTA: EL NUMERO 19 ES CONTROL DE HEMOLISIS TOTAL (100% HEMOLISIS)

2.-  Una vez hecha la distribución anterior, mezclar bien, por inversión cada uno delos   tubos. NO OLVIDAR ESTE PASO.

3.- Recién ahora, después de haber mezclado, añadir 0.1 ml de sangre venosa desfibrinada cada uno de lostubos.4.- Tapar los tubos y mezclar nuevamente por inversión suave.5.- Dejar en reposo 10 minutos a temperatura ambiente y luego volver a mezclar

por inversión suave.6.- Centrifugar a 2000 rpm. Durante 10 minutos.

Examinar  por  simple  inspección  visual  en  cual  de  los  tubos  se  inicia  la  hemólisis  (hemólisis  leve),generalmente a partir del tubo Nº 8, de 0.425 % NaCl (lo que se manifiesta por el color ligeramente rojizodel líquido) y luego examinar en qué otro tubo  la hemólisis es intensa (aproximadamente en 0.36 % NaCl).En el Tubo Nº 19 se producirá hemólisis total y corresponde al 100% de Hemólisis. (Destrucción total delos hematíes y no deja nada de sedimento).

Valores Normales:

Hemólisis inicial (leve) (empieza Hemólisis): 0.44  % + --   0.02Hemólisis Total  (Hemólisis completa): 0.32  % + --   0.02

CAUSAS   DE   AUMENTO   DE   LA   FRAGILIDAD   OSMÓTICA   GLOBULAR: (Los hematíes son más frágiles que lo normal, tienen  poca resistencia ante ligeras

hipotonías,  y se  hemolizan  muy fácilmente)-Anemia Hereditaria Esferocítica, en la Enfermedad Hemolítica

del recién nacido por incompatibilidad ABO-Después de alguna injuria térmica (quemaduras)-Anemias Hemolíticas sintomáticas en algunos casos de:Linfoma Maligno, Leucemias, Cáncer, Cirrosis, etc.

CAUSAS DE DISMINUCIÓN DE LA FRAGILIDAD OSMÓTICA(Los hematíes  son mas  resistentes que lo normal  a la hipotonía):

En la primera Infancia, tempranamente en la infancia.En algunas Anemias por deficiencia de HierroTalasemia mayor ( ó anemia de Cooley, ó anemia del Mediterráneo )Anemia Drepanocitica ( Hoz, Sickle cell anemia)Anemia Megaloblástica NutricionalPost Esplenectomía y algunas hepatopatías con ictericia

FRAGILIDAD   EN   MEDIO   ACIDO: - En la Hemoglobinuria paroxística nocturna, que cursa con anemia

hemolítica, usualmente la fragilidad  globular realizada  en sol. salinasolamente, es  NORMAL,   PERO    la fragilidadglobular realizada  en   MEDIO      ÁCIDO(      pH      ácido)      SÍ      ESTA   AUMENTADA .

La     FRAGILIDAD   MECANICA   está  aumentada  en  la  Ovalocitosis  hereditaria  (ó  Eliptocitosis),  en  loscasos que evolucionan  con   anemia hemolítica.

Referencias Bibliográficas

S.,  Mellor Leslie  ,J.  Inwood,  Linch  R.  Medical  Laboratory  Technology.W.B.Saunders  Co.Phila.USA.1996.

Clinical  Diagnosis by Lab Methods. Todd. Stanford, W.B Saunders Co. Phila. USA. 2002Hematology Physiologic  Basis for Clinical Practice .Reich P.MD. Little Brown Co. Boston USA.2004.Clinical Laboratory Diagnosis  Levonson and Mac Fate.Lea Febiger. 1999.Wintrobe  Clinical Hematology Lea Febiger. 1998.Diagnótico Hematológico  .Laboratorio y Clínica. Ciscar y Farrera. Edit.Jims 1998.

INTERCAMBIO DE LÍQUIDOS ELECTROLITOS Y OTROS SOLUTOS ATRAVÉS DE MEMBRANAS

IntroducciónExiste  un  intercambio  continuo  de  sustancias  entre  el  medio  ambiente  y  el  organismo,  a  través  de  losepitelios dérmicos, digestivos y respiratorios.Dentro del mismo organismo existe un intercambio entre los espacios intracelulares y extracelular.Algunas sustancias pueden atravesar la  membrana celular  por difusión pasiva .Otras requieren consumirenergía para moverse a través de las membranas contra sus gradientes de concentración .Estos fenómenosde difusión pasiva y transporte activo permiten la creación de una composición orgánica diferenciada.La  piel  del  sapo  no  solamente  separa  al  espacio  extracelular  del  medio  ambiente,  sino  que  permite  elpasaje  de  muchas  sustancias,  incluyendo  el  agua,  el  sodio,  el  cloro  y  la  glucosa.   La  dirección  delintercambio depende del tipo de transporte involucrado y de la gradiente de concentración de los solutos.Cuando  cambia  la  composición  del  líquido  extracelular  los  riñones  excretan  las  sustancias  presentes  enexcesos o reabsorben las necesarias para lograr preservar la homeostasis.

Material17 saposBeakersAgua destiladaSolución de NaCI 7.5%Solución de dextrosa al 15 %BalanzaUrinómetroTubos de ensayoPipetas de PasteurGoterosPinzas mosquito

MétodoExperimento  Nº 1:   Preparación      del      animal      Durante  la  noche previa al experimento  se debe  mantener  a los sapos en  un ambiente  húmedo  para queestén adecuadamente hidratados.Antes  de  la  pruebas  se  vacía la  vejiga  de  todos  los  animales  y  se  liga  la  cloaca  para  analizar  la  orinaformada  en  condiciones  experimentales.  Si  se  coloca  un  sapo  en  una  solución  de  dextrosa  y  luego  seencuentra dextrosa en la orina, puede deducirse que fue absorbida a través de la piel hasta alcanzar   unaconcentración   suficiente  en  liquido   extracelular  que  obligase   a  los  riñones  a  excretar  el  exceso  en  laorina. Los sapos son colocados en soluciones  de diferente tonicidad  y se les inyecta distintas solucionespara producir cambios en la composición  de los líquidos corporales.Los animales son pesados antes de realizar la prueba y después de haber vaciado sus vejigas. Los cambiosde  agua  corporal  se  determinaran  pesando  a  los  sapos  antes  y  después  de  la  exposición  a  distintascondiciones  experimentales.Para cerrar la papila cloacal se la toma con las pinzas mosquito y se liga con firmeza, sin llegar a cortar lapiel , pero lo suficientemente fuerte para prevenir el escape de orina .Después de esto   se pesa al sapo y seregistra su peso.Experimento Nº2Se inyecta a los sapos 4ml de una solución en el saco linfático dorsal. Esta solución puede ser hipotónica,hipertónicas  o  isotónicas;  de  cloruro  de  sodio  o  dextrosa  , también  inyectaremos  en  algunos  casos  aguadestilada .Se vuelve a pesar para confirmar que todo el líquido inyectado se encuentre en el animal.Se colocan   150  ml   de  líquido  en un beaker  de 250  ml  y se pone al sapo  dentro  de  él. El líquido  debecubrir la mitad inferior del animal pero el punto de inyección debe permanecer por encima del nivel .Setapa  el  beaker Se  pesa  el  sapo  a  intervalos  de  30  minutos hasta  por  8  horas.  Se  registra  los  cambios

obtenidos:

Saco LinfáticoBaño (Inyectar 4ml)

Experimento Nº 3Después de   2 horas, se saca el sapo del beaker y se retira la ligadura de la cloaca .Se vacía comprimiendoel abdomen y se  recolecta la orina.Se pesa nuevamente al sapo .La diferencia entre este peso y el obtenido  inmediatamente antes de quitar laligadura es igual al peso de la orina recolectada.   La      diferencia      entre      el      peso    después de recolectar la orinadel animal y el peso inicial antes de sumergido equivale al peso ganado o perdido durante el experimento.Se debe tomar en cuenta el peso después de inyectar los 4ml.de solución en los sacos dorsales .Se calculael  porcentaje  de  variación  de  peso  con  respecto  a  la  medida  inicial  y  se  registra  la  cantidad  de  orinaformada  durante el experimento.

Experimento Nº 4: Análisis de glucosa en orina del sapo.La glucosa se determinara en la orina del sapo mediante el método de la glucocinta (Urine Strip WinerLab).

Introducción

Los  tejidos  neural  y  muscular  tienen  la  propiedad  de  excitabilidad  y  responden  a  estímulos,  es  decirvariaciones   del   medio   químicas   o   físicas,   tales   como   alteraciones   de   la   temperatura,   deformaciónmecánica, etc.En  los  fenómenos  estímulo  respuesta,  la  respuesta  depende  de  las  características  del  estímulo  y  de  lascondiciones  del tejido  estudiado.  La  descripción  correcta de  la  relación  entre  estímulo  y  respuestarequiere el control de la duración , intensidad  y  frecuencia del estímulo.Las relaciones estimulo-respuesta se desarrollan en función al tiempo y al espacio.

MaterialSapos grandes Tabla de fijación para batracios

Alambre de cobreEstimulador eléctrico Alambre de zincEquipo de disecciónMétodoExperimento N° 1Se anestesia al sapo por destrucción del cerebro y la médula espinal.Con unas tijeras se hace un ojal en la piel de la región anterior homóloga al tronco. Se continúa la incisiónde la piel en cinturón. Una vez completado el cinturón, se desprende la piel de un tirón hacia abajo. En laregión dorsal se debe tener cuidado por la adherencia de la piel al urostilo.

Bañoexterno

Sacolinfático(inyectar4 ml).

Peso         delsapo            alinicio       delexperimento

Glucosabasal(inicial)

Peso al finaldelexperimento

Glucosa  posexperimento(final)

1 NaCl0.68%

Agua

2 agua NaCl0.68%

3 Dextrosa3.87%

Agua

4 Dextrosa7.74%

Dextrosa3.87%

Se  levanta  el  urostilo  con  la  pinza  de   disección  y  se  seccionan   los  elementos  paravertebralmente  y endirección  cefálica,  fracturando  el  proceso  del  iliaco  paralelo  al  urostilo  que  se  articula con  el  procesotransverso de la novena vértebra. Inmediatamente se observan  dos formaciones blancas que se introducenpor tres raíces más arriba en la columna vertebral. Estas estructuras son los nervios ciáticos. Por debajo seobserva la aorta dorsal con sus bifurcaciones.Con  las  tijeras  se  secciona  transversalmente  el  urostilo, evitando  traccionar  o  lesionar  los  dos  nerviosciáticos.Se pasa un hilo por debajo de cada uno de los nervios ciáticos y se realiza una ligadura lo más proximalposible a la columna vertebral. En este momento se observa una reacción muscular.Se secciona el nervio proximalmente a la médula, entre la   columna vertebral y la ligadura. Con la ayudadel  hilo  se  puede  efectuar  la  disección  del  nervio  ciático,  no  siendo  necesario  manipularlo  con  ningúninstrumento.Para poder liberar el nervio, es necesario cortar el músculo piriforme, después   se lo aísla por disecciónroma  entre  el  semimembranoso  por  dentro  y  el  bíceps  por  fuera.  A  todo  lo  largo del  nervio  se  iráseccionando  sus  colaterales  y  se  lo  aislará  hasta  la  rodilla,  comprobando  que  exista  conexión  funcionalentre el nervio  y el  músculo  gastrocnemio. Una  vez que el nervio  ha sido  aislado, se debe evitar  que seseque humedeciéndolo constantemente en solución fisiológica.

Experimento  N° 2: Experimento de GalvaniSe  fabrica  un  asa  con  alambre  de  cobre  y alambre  de  zinc.  Con  el  alambre  de  cobre  se  toca  la  piel  delanimal y con el zinc el nervio.

Experimento N° 3Se   toma   la   pata   del   animal   y  se   pasa   un  hilo   por   debajo   de   la   aponeurosis  plantar,   amarrándolafuertemente. La ligadura queda ubicada proximalmente y se realiza la disección  de la aponeurosis, que enel sapo se continúa hacia la pierna por el tendón de Aquiles que tiene un sesamoideo.Se libera el tendón de Aquiles por disección roma y se separa el gastronemio hasta llegar a su inserciónsuperior. Con un golpe de tijera se secciona la tibia por debajo de la rodilla y el fémur un poco por encimade esta. Se libera el fragmento de fémur del exceso del tejido muscular y se le hace una fuerte ligadura.Con cuidado se coloca el electrodo sobre el nervio y se procede a estimular la preparación neuromuscular.Con  el  estimulador  eléctrico  se  realiza  el  estímulo  de  menor  intensidad  y  se  incrementa  gradualmente

hasta obtener una contracción muscular este es el nivel de umbral que genera la respuesta de contracción.Con   el   estímulo   eléctrico   de   esta   misma   intensidad   se   continuara   la   estimulación   durante   todo   elexperimento (estimulo superior al umbral).Humedecer constantemente la preparación con un gotero.

Experimento N° 4: fenómeno de la escaleraSe  realizan  descargas  simples  para  buscar  el  umbral  de  estimulación  y  después  se  disminuye  el  voltajepara obtener el estímulo subliminal.Luego  de  repetir  la  estimulación  por  un  tiempo  se  observará  que  las  contracciones  son  cada  vez  másamplias, de mayor intensidad hasta alcanzar un valor máximo. Este incremento progresivo de la amplitudes lo que se denomina el fenómeno de la escalera.

Experimento N° 5: tetaniaSe realizaran estimulaciones intensas, muy rápidas y/o continuas y se obtendrá una serie de contraccionessucesivas de modo que las estimulaciones no permitan que termine la sacudida anterior y continuaremosasí hasta obtener una contracción sostenida, permanente, intensa y que es lo que denominamos tetania.

Experimento N° 6: Relación longitud -  tensiónEmplearemos  la  fuerza  muscular  que  ejerce  el  musculo  gastronemio  cuando  se  anudan  ambos  extremosdel musculo antes disecado en una balanza con pesas graduadas en gramos. Un extremo del musculo seráanuda en la parte inferior del platillo de la balanza y el otro extremo se anudara en el brazo de la nuez delsoporte de fierro, estando el fiel de la balanza en cero se desplazara la nuez hacia debajo de modo que elmusculo  no  quede  ni  mu  flojo  ni  muy  tenso  de  tal  forma  que  pueda  responder  al  estímulo  con  unacontracción.  A continuación se estimula para que el músculo se contraiga sin vencer ninguna resistencia(pesa  deslizante  en  cero)  al  obtenerse  respuesta  de  contracción  el  fiel  de  la  balanza  se  deslizara  haciaarriba.  Ahora  incrementamos  gradualmente  de  dos  en  dos  gramos  y  al  mismo  tiempo  la  longitud  elmusculo bajando la nuez de la balanza y repetimos el  estímulo y el fiel de la balanza volverá a moversehacia arriba, llegara el momento  en que el estímulo a  medida que aumentamos el peso y la longitud delmusculo el fiel de la balanza no se desplazara. Esta es la longitud a la cual corresponde la máxima tensión

capaz de ser  ejercida por el musculo.  El alumno  realizara  una  gráfica  que ilustre la relación longitud  vstensión.

Discusión:

1. IntroducciónLa placa mioneural media la transmisión de la señal de la fibra nerviosa motora a la célula muscular. Salvoen el caso de las fibras musculares intrafusales, existe una sola placa terminal por cada fibra muscular. Amedida  que  el  axón  del  nervio  se  acerca  a su  fin  emite  varias  ramas,  cada  una  de  las  cuales  inerva  unafibra muscular. Estás ramas terminales son de poco diámetro y carecen de mielina, por lo que la velocidadde  conducción  en  ellas  es  baja.  La  placa  mioneural  es  una  discontinuidad  entre  la  células  nerviosa  y  lamuscular donde la transmisión del impulso de despolarización queda a cargo de un mediador químico, laacetilcolina.

La terminal presináptica posee vesículas sinápticas, las cuales han sido sintetizadas en el soma neural, ypresenta canales de membrana de sodio y calcio dependientes del voltaje.

La generación del potencial de acción da lugar  a la apertura de los canales de calcio  y se incrementa laconcentración citosólica de calcio. Este incremento promueve la fusión de las vesículas sinápticas con lamembrana citoplasmática del rafe sináptico, liberando acetilcolina. La acetilcolina actúa sobre receptoresnicotínico  presentes  en  el  miocito  y  produce  despolarización  de  la  membrana  celular  muscular.  Estefenómeno es denominado potencial de la placa terminal.

Este potencial de acción excita a las  miofibrillas   para que se contraigan. Para el control de la actividadmuscular  existe  además  una  vía inhibitoria recurrente,  es  decir,  un  mecanismo  de  retroalimentaciónnegativa   que mejora la resolución espacial  de la acción neural. Esta vía inhibitoria provee un mecanismopara evitar la contracción muscular persistente.

El axón de la motoneurona A sale de la sustancia gris a nivel de la medula espinal, pero emite antes unarama  colateral,  la  rama  recurrente.  Esta  rama  se  desprende  a  partir  del  primer  nódulo de  Ranvier,permanece dentro de la materia gris ventral y pasa medialmente y dorsalmente. Está rama forma sinapsiscon interneuronas que se encuentran en la región ventromedial del asta anterior y son denominadas célulasde Renshaw. Sus axones se proyectan hacia las motoneuronas α, tanto hacia aquella en la cual se originó laprimera   sinapsis   desde   el   hasta   dorsal,   representada   como   la   motoneurona   A,   y   a   sus   vecinas,representadas  como  motoneuronas  B,  terminan  en  sinapsis  inhibitorias.  La  transmisión  de  este  sistemainhibitorio está a cargo de la glicina.

Nota: en la presente práctica emplearemos ya sea dextrotubocurarina o succinilcolina.

MaterialSapos grandes SuccinilcolinaMiógrafoEstimulador eléctrico VecuronioEquipo de disección NeostigminaTabla de fijación para batracios Atropina

MétodoExperimento N° 1Se l anestesia a un sapo  por destrucción del encéfalo. Se diseca y se expone el nervio  ciático  en la caraposterior de ambos muslos, evitando lesionar la arteria femoral que corre paralela al nervio.

En una de las extremidades, se separa el nervio de la arteria y se procede a ligar alrededor del músculo yde la arteria, dejando libre al nervio.

Se  aplica  estímulos  de  baja  intensidad  a  los  nervios  ciáticos  y  se  va  incrementando  su  intensidad  hastaobtener la contracción muscular.

Luego se estimula directamente al músculo gastrocnemio a través de una incisión hecha en la piel.

Experimento N° 2Se  administra  1  mL  de  succinilcolina  en  el  saco  linfático  dorsal  del  sapo.  Luego  de  unos  minutos  seprocede a estimular con el carrete de inducción ambos ciáticos.

Experimento N° 3Se administra 1  mL de vecuronio en el saco linfático dorsal del sapo. Luego de unos minutos procede aestimular con el carrete de inducción ambos ciáticos.

Experimento N° 4Se administra 1 mL de solución de atropina y neostigmina en el saco linfático dorsal del sapo. Luego deunos minutos se procede a estimular con el carrete de inducción ambos ciáticos.

DiscusiónLa   succinilcolina   es   un   bloqueador   muscular   despolarizante.   Inicialmente   simula   el   efecto   de   laacetilcolina, produciendo apertura de los canales iónicos y despolarización persistente. Inicialmente puedeproducir  excitación,  la  que  se  manifiesta  por  fasciculaciones  transitorias.  Esta  fase  es  seguida  por  elbloqueo de la transmisión neuromuscular y parálisis flácida.

La  estricnina  actúa  a  nivel  de  la  medula  espinal,  bloqueando  la  sinapsis  inhibitoria  de  las  células  deRenshaw  sobre  las  motoneuronas  α,  en  las  que  ejerce  el  rol  de  antagonista  competitivo  selectivo  quebloquea los efectos inhibitorios de la glicina.

La estricnina produce aumento de los impulsos nerviosos sucesivos, creando contracciones similares a lastetánicas.  Origina  una  contracción  muscular  sostenida  de  extensores  y  flexores  y  espasmo  muscularpersistente.

PRÁCTICA DE SHOCK ESPINAL PARA ESTUDIAR LOSREFLEJOS EN EL SAPO

Leyes Pfluger, Turck, Sumacion Espacial, Sumacion Temporal  y efecto de la ablación medular.-MaterialSapoBeakers, estilete de acero,Carrete de RunckfordAcido sulfúrico diluído 0.1 %; 0.2%; 0.3 %; 0.4%; 0.5 %; 1% sol. acuosas.Suero fisiológicoEquipo de disección, guantes  látex descartablesSol.Ringer para batracio.

MétodoExperimento N° 1: PREPARACIÓN DEL SAPO ESPINALObservar  la  postura,  los  movimientos  espontáneos  y  respuesta  a  los  diversos  estímulos,  movimientosrespiratorios, reflejos del salto, respuesta a la rotación y posición de espalda del sapo normal.Se fija al animal con la mono izquierda y se determina lasa siguientes líneas: una línea transversal a niveldel límite posterior de la membrana timpánica ( A-B), Una segunda línea entre el ojo y la membranatimpánica (X-Z). Se toma una tijera y se introduce uno de sus extremos en la boca del animal y se lodecapita con un solo golpe, procurando que en este momento el sapo se encuentre con el dorso haciaabajo, a lo largo de la línea X-Z Realizar hemostasia por compresión y realizar las mismas observacionesque en el sapo normal. Este es el sapo descerebrado. En este caso, el sapo puede realizar movimientoscomplejos tales como saltar y si se coloca de espalda puede regresar a la posición normal.

En otro sapo hacer las observaciones del tono y la respuesta a la estimulación eléctrica y luego realice el

corte a lo largo de la línea A-B. Inmediatamente se observa el tono y la actitud postural del animal y se

efectúa el pinzamiento de uno de sus dedos. Se objetivará la depresión motora que constituye uno de loscomponentes del shock espinal, ademasno se encuentra los resultados del sapo descerebrado.

Se espera unos minutos y se observa nuevamente el tono  y la actitud postural del animal y se efectúa el

pinzamiento de uno de sus dedos. Se objetivará las respuestas motoras.

Experimento N° 2: leyes de Pfluger

Se  pasa  un  hilo  a  través  de  un  orificio  hecho  en  el  piso  de  la  boca  y  se  cuelga  al  sapo  espinal  de  unestativo.A   continuación   se   efectúa   una   secuencia   de   estímulos   graduados,   los   que   producen   respuestasdeterminadas:

a)   Ley de  UNILATERALIDAD.-  Se  pellizca  suavemente  un  dedo  y se  produce  contracción  de  lamisma pata solamente.

b) Ley  de  SIMETRÍA.-  Se  pellizca  con  mayor  intensidad  el  dedo  y  se  produce  contracción  de  lamisma pata y de la pata opuesta.

c)   Ley de IRRADIACIÓN.- Se pellizca fuertemente un dedo y se produce contracción de la mismapata, de la pata opuesta y finalmente de las extremidades anteriores.

d) Ley de GENERALIZACIÓN.- Se pellizca muy fuertemente un dedo y el animal se contrae y semueve enérgicamente.

Experimento N° 3: experiencia de Turck

Se emplea la preparación de sapo espinal. Se la cuelga de un estativo y se espera que esté en reposo.Se  prepara  varios  beakers  con  concentraciones  crecientes  de  ÁCIDO  SULFÚRICO  desde  0.1,  0.2,  0.3,0.4, 0.5 y 1%. Se sumerge la pata del animal en cada una de las distintas soluciones, empezando por la demenor concentración; se espera y se registra el tiempo  necesario para la respuesta. Una vez que se haya

producido  la  respuesta,  se  lava  la  pata  del  animal  en  suero  fisiológico  antes  de  pasar  a  la  soluciónsiguiente.Se observa y se registra las características y tipo de respuesta en cada caso.

Experimento N° 4: sumación temporalSe  sumerge  la  pata  del  animal  en  una  solución  de  ácido  sulfúrico  al  0.1%  varias  veces.  Se  observa  elincremento progresivo de la respuesta.

Experimento N° 5: sumación espacial

Se sumerge en una solución de ácido sulfúrico al 0.1% primero la punta del dedo, luego el dedo completo,la pata y la rodilla. Se observa la mayor intensidad de las respuestas.

Experimento N° 6Se introduce un estilete dentro del canal vertebral y se destruye la médula. Después se repite las mismasestimulaciones hechas previamente.-

REFLEJOS OSTEOTENDINOSOS EN EL HOMBRE

IntroducciónLos  mecanismos  reflejos  están  constituidos  por  un  órgano  receptor,  un  órgano  efector  y  una  red  decomunicaciones entre ambos. La acción refleja se inicia por un estímulo de entrada y tiene como resultadouna respuesta de salida. La acción refleja abarca el reflejo axónico sencillo hasta los reflejos complejos enlos que existe intervención cerebral.

El  sistema  nervioso  comprende  un  gran  número  de  arcos  reflejos.  Cualquier  estímulo  produce  unarespuesta.  El  estímulo  puede  originarse  en  los  órganos  internos  y  afectar  la  parte  visceral  del  sistemanervioso. El sistema puede originarse en el exterior y afectar la parte somática del sistema nervioso. Un

mismo arco reflejo puede afectar tanto partes viscerales como somáticas.

Los  reflejos  viscerales  no  suelen  alcanzar  la  conciencia,  mientras  que  los  reflejos  somáticos  pueden  serpercibidos concientemente. Muchos reflejos pueden considerarse como parte de un programa, puesto quela respuesta adecuada parece estar prevista dentro del sistema nervioso.

Los reflejos espinales, que requieren transmisión del estímulo desde la periferia  hasta la médula y de allíregresar al órgano efector, son de este tipo. Los reflejos espinales no requieren de intervención del sistemanervioso central y funcionan igualmente bien en un animal cuya médula se ha seccionado por encima de lalocalización de las neuronas de los nervios correspondientes.

Las  inserciones  tendinosas  de  los  músculos  poseen  receptores  sensitivos  especiales  que  responden  a  aladistensión  y envían  la  información  al  sistema  nervioso  central  sobre  la posición  de  un músculo  o  de unmiembro. Cuando estos receptores tendinosos son estimulados por una distensión rápida y brusca, mandanimpulsos a la médula espinal y, a través de una sinapsis a la motoneurona anterior que inerva el músculo.Esta neurona manda impulsos al músculo y produce una sacudida rápida.

La respuesta de los reflejos espinales  puede incrementarse  elevando  el  nivel de excitación de la  médulaespinal. Esta facilitación puede conseguirse haciendo que el sujeto enganche sus manos y tire con fuerza.

MaterialSujeto de prueba Martillo de reflejos

MétodoExperimento N° 1: reflejo rotulianoSe sienta al sujeto en una posición cómoda y cruza las piernas. La pierna superior debe estar relajada. Porpalpación, se localiza el tendón rotuliano  y se da un golpe seco con el martillo de reflejos. La respuestaadecuada es la contracción del cuadriceps, lo que produce extensión de la pierna.

Experimento N° 2: reflejo aquilianoEl sujeto se pone de rodillas sobre una silla y deja colgar fuera los pies sin contracción de los músculos delas pantorrillas. Se busca el tendón de Aquiles y se estimula. La respuesta apropiada es la contracción delos músculos gemelos y del sóleo, lo que produce extensión del pie.

Experimento N° 3: reflejo bicipitalEl sujeto flexiona su antebrazo sobre el brazo, mientras el examinador soporta el antebrazo. Se busca eltendón del bíceps con el pulgar de la mano que sostiene el antebrazo, se deja el pulgar sobre el tendón y seda un golpe sobre el pulgar. la respuesta apropiada es la contracción del bíceps, lo que produce flexión delantebrazo.

Experimento N° 4: reflejo tricipitalEl sujeto  flexiona su antebrazo  sobre el brazo, mientras el  examinador soporta el antebrazo. Se palpa eltendón del  tríceps, inmediatamente por encima  de su  inserción en el  codo,  y se  golpea  el tendón  con  elmartillo. La respuesta apropiada es la contracción del tríceps, lo que produce extensión del pie.

Experimento N° 5: reflejos radial y cubitalSe  golpea  los  tendones  insertados  sobre  los  extremos  inferiores  de  ambos  huesos,  por  encima  de  lamuñeca.  El  examinador  sostiene  el  brazo  del  sujeto.  La  respuesta  adecuada  para  el  reflejo  cubital  es  lapronación de la mano y para el reflejo radial la flexión del antebrazo.

Discusión

EVALUACIÓN DE LA PERCEPCIÓN SENSORIAL Y SENSACIONESNOCICEPTIVAS: EVALUACION DEL UMBRAL DEL DOLOR.

IntroducciónLa estimulación de un receptor táctil de la piel es transmitida por la vía del asta posterior (sensitiva) hastala corteza somestésica. En esta la excitación del receptor activa un determinado número de neuronas queconstituye su campo cortical. Sin embargo, no todas las neuronas de este campo se estimulan en la mismamagnitud,  sino  que  las  que  corresponden  al  centro  del  campo  descargan  de  forma  máxima  y  las  de  laperiferia en menor magnitud. Este contraste es el que permite localizar el punto exacto de estimulación.

Las capacidades táctiles se determinan en muchas ocasiones por la posibilidad de discriminar dos puntosde estimulación sobre la piel.

Las  diferencias  en  las  capacidades  de  discriminación  en  las  diferentes  zonas  del  cuerpo  se  deben  alnúmero  de receptores que  exista en esa zona  y a la  representación  cortical que  éstos  poseen.  Los dedosestán profusamente poblados de receptores y el área de corteza a que llega la información proveniente deellos  es  amplia,  de  ahí  su  mayor  posibilidad  de  discriminación.  Otras  zonas  del  cuerpo  tienen  menordensidad de receptores siendo éste uno de los factores que conlleva a que la información que llega al áreade la corteza sea reducida y, por lo tanto, sea menor su posibilidad de discriminación.

Cuando se estimulan dos puntos cercanos de la piel, cada uno excitará de forma máxima al centro de sucampo  cortical;  pero  como  los  campos  se  superponen  parcialmente,  la  resultante  será  una  excitaciónmayor, aunque se mantienen los máximos de excitación separados.

El ser humano puede percibir diferentes grados de calor y frío, que pasan del frío glacial, al frío, al fresco,a la temperatura indiferente, a lo tibio, caliente y quemante.

Objetivos1.   Discriminar procesos y modalidades de percepción sensorial en el ser humano de tal manera que

pueda sistematizarlos.2.   Comprobar  la distribución anatómica de los receptores cutáneos  y la importancia  fisiológica de

dicha distribución.3.   Comprobar la influencia de las bajas temperaturas en la sensibilidad.4.   Comprender  los  mecanismos  que  explican  dichas  funciones,  estas  observaciones  deberán  ser

correlacionadas con sus conocimientos neuroanatómicos y neurofisiológicos.

EXPERIMENTO 1: IDENTIFICACIÓN DE CAMPO RECEPTIVO SENSORIAL

Materiales- Sello especial- Hoja de papel- Pelo de cerda (pelo de Von Frey)- Sujeto experimental (alumno 1)- Sujeto experimentador (alumno 2)

Procedimiento1.   Por medio de un sello especial marcar un área en la piel de un compañero: cara, dorso del cuello,

antebrazo, dorso de la mano.

2.   Sellar en una hoja de papel un área similar y proporcional

3.   Luego  el sujeto  experimental deberá cerrar los ojos y se le aplica por medio  de un instrumentosensibilizador  llamado  pelo  de  Von  Frey,  una  ligera  presión  en  cada  uno  de  los  cuadrantes  del

área delimitada por el sello.

4.   El sujeto experimental deberá reportar las modalidades de sensaciones que percibe en la piel decada cuadrante (tacto, dolor, temperatura, otros).

5.   Marcar con notación diferente, en un esquema, los puntos correspondientes.

6.   Anotar cuantos puntos diferentes hay para cada una de las sensaciones investigadas.

Resultados

EXPERIMENTO 2: DISCRIMINACIÓN DE DOS PUNTOS

Materiales- Compás de doble punto.- Regla.- Sujeto experimental (alumno 1).- Sujeto experimentador (alumno 2).

ProcedimientosPara la realización de estos experimentos los estudiantes se dividirán por parejas, actuando cada uno comosujeto experimental y como experimentador.

1.   Indique a su compañero que cierre los ojos y se concentre en las sensaciones que va a percibir.2.   Aplique los dos extremos del compás de forma tal que lleguen simultáneamente al área de piel

estimulada. Se deberá estimular las siguientes zonas: Yema de los dedos, antebrazo, cara y nuca.3.   En cada paso la separación de las puntas del compás se aplicarán de forma tal que la diferencia

entre  ellas  sea  diferente  y,  alternante,  manteniéndose  constante  para  cada zona  corporal esto  es0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 y 3 cm.

4.   Durante la aplicación de las agujas, pregunte al compañero cuantos puntos discrimina y anote surespuesta.

5.   Analice el comportamiento de los receptores.

Resultados

Area de la Piel

Estimulada

Distancia de separación de las puntas del compás ( cm )

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Yema de los dedosAntebrazo

CaraDorso del CuelloDorso de mano

SENSACIONES NOCICEPTIVAS: EVALUACIÓN

DEL UMBRAL DEL DOLOR

Introducción

El  dolor  es  un  mecanismo  de  protección  y  por  tanto  puede  definirse  como  una  respuesta  de  defensa

corporal,  el  cual  aparece  siempre  que  un  tejido  está  siendo  lesionado  y obliga  al  individuo  a  reaccionarpara suprimir el estímulo nocivo.

Si  colocamos  inadvertidamente  el  brazo  sobre  una  plancha  caliente  sentimos  dolor  e  inmediatamente

retiramos el brazo para evitar un mayor daño tisular.

La  respuesta  al  dolor  puede  expresarse  en  términos  conductuales,  tales  como  el  retiro  de  la  fuente  del

estímulo o la fuga; puede haber una respuesta verbal, como  el quejido y la expresión del dolor; y puedehaber una respuesta fisiológica como cambios en la presión sanguínea, sudoración y taquicardia.

El dolor es una respuesta  sensorial  medible,  su  magnitud  varía con la  intensidad  del estímulo. Todo  ser

viviente presenta una tolerancia al dolor hasta determinado nivel, denominado umbral, en que el dolor esinsoportable.  El  dolor  puede  también  ser  socialmente  determinado,  se  dice  que  hay  grupos  étnicos  mássensibles al dolor que otro, y el sexo femenino es más resistente al dolor que el sexo masculino.

El  dolor  se  ha  clasificado  en  dos  tipos  fundamentales:  1)  Dolor  Rápido,  que  aparece  en  menos  de  una

décima de segundo, no se percibe en los tejidos más profundos del cuerpo, se transmite a través de fibrasde  tipo  A  y  la  señal  dolorosa  llega  al  sistema  nervioso  central  vía  el  haz  neoespinotalámico.  2)  DolorLento,  aparece  después  de  un  segundo  o  más  y  aumenta  lentamente  en  el  curso  de  varios  segundos  ominutos,  suele  ir  acompañado  de  destrucción  tisular,  se  percibe  en  la  piel  como  en  cualquier  órgano  otejido profundo, se transmite  a través de fibras tipo  C y las señales dolorosas llegan al sistema nerviosocentral vía el haz palioespinotalámico.

El dolor como todo tipo de sensibilidad tiene receptores y vías neurales específicas.

Los  receptores  para  el  dolor  son  terminaciones  libres  y  se  diferencian  por  el  tipo  de  estímulo  al  cual

responden y básicamente son de tres clases:

1) Los  mecanociceptores responden a estímulos mecánicos muy intensos de la piel como  apretar,

pellizcar,  pinchar,  etc.  También  pueden  responder  a  estímulos  térmicos  repetitivos,  entre  45°  y55°C.

2) Los termociceptores responden a bajas temperaturas,  menos de 10°C, y altas temperaturas, porencima de 42-45°C, y asimismo responden a estímulos mecánicos intensos.

3) Los nociceptores polimodales responden a estímulos dolorosos mecánicos, térmicos y químicos.

El  estímulo  doloroso  (E)  actúa  sobre  un  terminal  nervioso  que  lleva  su  axón  hacia  la  neurona  sensorial

primaria  (1)  en  las  astas  posteriores  de  la  médula  espinal.  El  mediador  excitatorio  de  esta  informacióndolorosa es la sustancia P, aunque también pueden participar otras sustancias como el ácido glutámico, lasomatostatina y el polipéptido intestinal vasoactivo (VIP).

Los  axones  de  las  segundas  neuronas  del  sistema  de  transmisión  del  dolor  (2)  ascienden  en  dos  tractosdiferenciables tanto anatómica como funcionalmente;   el tracto Páleo-espino-talámico con proyeccionesamplias  y  difusas;  y  el  tracto  Neo-espino-talámico  con  proyecciones  menores  y  circunscritas.  La  víaneuronal del neo-espino-talámico es responsable de la localización certera en la superficie corporal de losdolores agudos, siendo pequeño el número de las fibras que la componen. Los axones del Páleo-espino-

talámico  se  enlazan  sinápticamente  con  neuronas  del  tronco  encefálico  en  especial  con  la  informaciónreticular tegmental y los cuadrigéminos (Tracto espino-tectal), mientras que otras de sus fibras alcanzandirectamente a los  núcleos talámicos intramamilares. Hasta  este nivel no  hay participación de la cortezacerebral en las sensaciones del dolor.

En el tálamo existen neuronas que vienen a denominarse de tercer orden (3) que provienen de los núcleosintramamilares  del  tálamo  y  que  se  proyectan  enviando  sus  axones  al  frontal  superior  de  la  corteza

cerebral.  Igualmente  existen  neuronas  de  tercer  orden  en  el  núcleo  ventro-basal  y  grupo  posterior  deltálamo  que  proyectan  sus  axones  al  parietal  posterior  en  la  corteza  cerebral.  Es  aquí,  donde  ocurre  lamodulación del dolor, y donde socioculturalmente puede variar la expresión del dolor

EXPERIMENTO N° 1: SENSACIONES TÉRMICAS Y UMBRAL DEL DOLOR

Materiales: Hervidor eléctrico con agua ,termómetro y gotero.

Procedimiento1.   Introducir el termómetro en el hervidor eléctrico y registrar la temperatura del agua.2.   Aumentar la temperatura del agua, conectando el hervidor en el suministro eléctrico.3.   Cada minuto registrar la temperatura del agua y cargar el gotero y dejar caer unas dos o tres gotas

en  el  dorso  de  la   mano  hasta  que  el   sujeto  de  experimentación  perciba  un  cambio  en  latemperatura del agua en relacion a la temperatura inicial del primer minuto.

4.   Continuar con el paso tres hasta el momento en que al dejar caer una gota en la palma de la manosienta dolor. 5.- Construir una curva tiempo vs. Temperatura y determine el umbral del dolor.

Resultados

EXPERIMENTO N° 2: ISQUEMIA LOCAL Y DOLOR

Materiales- Tensiómetro.- Cronómetro.- Sujeto Experimental (alumno 1).- Sujeto Experimentador (alumno 2).

Procedimiento1.   El sujeto de experimentación deberá sentarse cómodamente, colocando el brazo sobre la mesa de

modo que quede a nivel del corazón.2.   Coloque el manguito del esfigmomanómetro, completamente desinflado, alrededor del brazo de

manera que su borde inferior quede 2-4 cm sobre el pliegue del codo.3.   Aumentar la presión del sistema, con la pera insufladora, hasta alcanzar una presión de 200 mm

Hg.4.   Solicitar al sujeto de experimentación que abra y cierre rítmicamente ambas manos.5.   Registrar el tiempo en que el sujeto empieza a reportar que siente dolor y el momento en que el

dolor se torna insoportable.6.   Disminuir rápidamente la presión del sistema, abriendo la válvula de la pera insufladora.7.   Monitorear el tiempo en que desaparece el dolor.8.   Realizar el experimento tanto en la mano derecha como en la mano izquierda.

Resultados

TIEMPO (MIN) TEMPERATURA °C DOLOR

UMBRAL DEL DOLOR

ISQUEMA LOCAL Y DOLOR

PRUEBAS CEREBELOSAS

Marco Teórico.

Anatomía.

Rol Fisiológico.

Evaluación de la Fisiología Cerebelosa.

Síntomas y Signos de la alteración Cerebelosa.

DOLOR TIEMPO (MIN) TEMPERATURA (°C)

Insoportable

BRAZO

Derecho Izquierdo

Inicia el dolorDolor insoportableDesaparece el dolor

BRAZO

Derecho Izquierdo

Inicia el dolorDolor insoportableDesaparece el dolor

FUNCIÓN DEL CEREBELO

la  principal  función  del  cerebelo  es  la      coordinación      del      movimiento,      es   decir,   permitir   que   el   movimiento   se   realice   con   facilidad   y   precisión.

los núcleos profundos tienen una actividad continua en situación basal, ytienen conexiones excitadoras con el origen de las vías motoras (corteza motoraa través del tálamo, núcleo rojo, núcleos vestibulares y formación reticular, queson el origen respectivamente de las vías motoras corticoespinal, rubroespinal,vestibuloespinales y reticuloespinales). así, los núcleos del cerebelo mantienenuna   activación   tónica   de   las   vías   motoras   que   facilita   la   realización   delmovimiento.

Las  células  de  Purkinje  inhiben  a  los  núcleos  profundos,  con  lo  quepueden  inhibir  unos  componentes  del  movimiento  y  otros  no,  y  así  DARFORMA AL MOVIMIENTO.

EL  CEREBELO  REGULA  EL  TONO  MUSCULAR,  modificando  laactividad de las motoneuronas gamma, de manera QUE AUMENTA EL TONOPARA MANTENER LA POSTURA, O LO INHIBE PARA FACILITAR  LAREALIZACIÓN DE LOS MOVIMIENTOS VOLUNTARIOS.

También  contribuye  a  la  COORDINACIÓN  DE  LOS  MOVIMIENTOS

POLIARTICULARES.  Las  fibras  paralelas  recorren  una  larga  distancia  en  lacorteza del cerebelo, y en su recorrido pueden actuar sobre células de Purkinjecorrespondientes   a   VARIAS   ARTICULACIONES,   COORDINANDO   SUACTIVIDAD.

EL   CEREBELO PARTICIPA   EN EL APRENDIZAJE DE LOSMOVIMIENTOS. MIENTRAS SE ESTÁ APRENDIENDO UNMOVIMIENTO NUEVO SE PRODUCEN FRECUENTES ESPIGAScomplejas en las células de Purkinje. Esto produce depresión a largo plazo, porlo que una vez que el movimiento se ha aprendido disminuye la frecuencia delas  espigas  simples.  Puesto  que  las  células  de  Purkinje  inhiben  a  los  núcleosprofundos, la disminución de las espigas simples produce una mayor actividadde los núcleos profundos y de las vías motoras.

REGIONES FUNCIONALES DE CEREBELO

El cerebelo se divide en tres regiones funcionales. La estructura microscópica essemejante en las tres, por lo que las diferencias entre ellas se deben a que tienen distintasconexiones  aferentes  y  eferentes,  y  realizan  el  mismo  tipo  de  procesamiento  pero  condistinta información.

Vestibulocerebelo

El vestíbulocerebelo corresponde anatómicamente con el nódulo-flóculo.

Colabora con los núcleos vestibulares en las funciones de mantenimientodel equilibrio y de ajuste del reflejo vestibuloocular.

Las   lesiones   del   vestibulocerebelo   en   un   lado   producen   síntomasparecidos  a  las  lesiones  de  los  núcleos  vestibulares  en  el  lado  cotralateral.  Larazón  de  esto  es  que,  puesto  que  la  corteza  del  vestibulocerebelo  inhibe  a  losnúcleos   vestibulares   ipsolaterales,   la   lesión   del   vestibulocerebelo   producehiperactividad  vestibular  ipsoateral,  que  equivale  a  una  lesión  de  los  núcleosvestibulares contralaterales.

Espinocerebelo.

Incluye  al  vermis  cerebeloso y  la  zona  intermedia  de  los  hemisferioscerebelosos. El vermis junto con el núcleo fastigio se asocia a los movimientosaxiales   (del   tronco   y   raíz   de   los   miembros )   y  la   zona   intermedia   de   loshemisferios cerebelosos  se  asocia  a  los  movimientos  la  parte  distal  de  lasextremidades. Por5 eso las lesiones del ,los hemisferios cerebelosos se asociancon alteraciones de los movimientos de las extremidades partes distales.   Y laslesiones de la línea media   (VERMIS) producen inestabilidad en la marcha. Poreso debe ampliar la base de sustentación.

El espinocerebelo se encarga de controlar la ejecución de losmovimientos.  Recibe  información  por  las  vías  espinocerebelosas  de  cómo  seestán  realizando  los  movimientos,  y  si  detecta  que  el  movimiento  comienza  aapartarse  del  objetivo  deseado,  envía  señales  correctoras.  El  núcleo  fastigioenvía las   señales   correctoras   al   origen   de   las vías que   controlan   los

movimientos axiales, que son la vestibuloespinal y reticuloespinal, y  el núcleointerpuesto  envía  señales  correctoras  al  origen  de  las  vías  que  controlan  losmovimientos distales, que son la vía corticoespinal lateral y rubroespinal.

El   espinocerebelo   coordina   la   actividad   de   músculos   agonistas   yantagonistas  durante  los  movimientos.  Regula  la  relajación  del  antagonistadurante realización del movimiento, y también la contracción del antagonista alfinal  del  movimiento  para  frenarlo  cuando  llega  al  objetivo.  Cuando  se  alteraproduce el temblor intencional( no puede ensartar  la aguja con un hilo).

   Cuando se altera la parte lateral (hemisferio neocerebeloso se produce la ataxia,disimetría,  disdiadococinesia  (juego  sucesivo  de  palma-  dorso  de  las  manosmuy dificultoso) .

Cerebrocerebelo.

Comprende  la  parte  lateral  de  los  hemisferios  cerebelosos  y  el  núcleodentado.

Participa  en  la      preparación      del      movimiento   .  Recibe  información  de  lacorteza,  a  través  de  los  núcleos  del  puente,  sobre  el  movimiento  que  se  desearealizar, elabora el plan motor (determina qué músculos hay que contraer, y enqué secuencia, para realizar ese movimiento) y envía ese plan motor a la cortezamotora, a través del tálamo, para que se ejecute.:Cuando se retrasa esta acciónde descompone el movimiento en sus partes ( movimientos roboticos)

El  cerebrocerebelo   es  necesario   para   el   aprendizaje   de   movimientoscomplejos (p. ej. aprender a tocar el piano).

El   cerebrocerebelo   también   interviene   en   funciones   cognitivas   norelacionadas directamente con el movimiento.

Para evaluar la FUNCIÓN CEREBELOSA se estudia la Taxia es decir se explora laTaxia durante la ejecución de los movimientos ( Taxia dinámica) ó se evalúan en laposición de reposo( Taxia estática).

Evaluación   de   la   Taxia   DINÁMICA : Se examina por medio de pruebas que consistenen establecer una meta  u objetivo a los movimientos de la persona. Si estas pruebas sealteran se dice que existe ataxia dinámica, por ejemplo tenemos:

La Prueba del talón rodilla para miembros inferiores:  estando la persona echada tocarácon el talón de un pié la rodilla del la otra pierna, lo debe hacer en forma precisa, exacta,enseguida se le pide que descienda el talón bordeando la tibia de la pierna opuesta y nodebe zigzaguea hasta llegar al dedo gordo del otro pié. Si tiembla, duda ó zigzaguea eltalón , es anormal.

Para Miembros superiores: Prueba de Indice-Nariz ó de índice- oreja .

Con  los dedos de la mano contraídos se le pide que con el índice extendido  se toque lapunta de la nariz  y luego el lóbulo de la oreja con los ojos abiertos y luego cerrados.Debe hacerlo en forma precisa sin oscilaciones irregulares o bruscas  y sin exceder ladistancia.

También índice del mismo paciente o con el del examinador.

Para el Tronco: Se invita a la persona a efectuar cambios de postura: incorporarse,sentarse o caminar: En caso de ataxia dinámica se producirán movimientos oscilantes deltronco.

Evaluación   ce   la   TAXIA   ESTATICA : Signo de ROMBERG:

La investigaremos con un voluntario de pié, con los pies juntos y las palmas de lasmanos adosadas al cuerpo(en actitud de “firme”).

Se observará si la persona mantiene la postura erecta  o si, por el contrario aparecenoscilaciones  y la persona busca apoyo para no caerse. Luego le pediremos que cierre losojos: si la persona oscila mucho  y tiende a caer decimos que es ROMBERG POSITIVO(anormal). Debemos permanecer cerca de la persona examinada o para sostenerlo encaso de caída.

A veces esta maniobra no es suficiente para  detectar el signo de Romberg y y entoncesse buscará lo que se denomina   ROMBERG      Sensibilizado     que consiste en poner de pié ala persona  con un pié delante del otro , o sobre un solo pié ; o bien  “haciendo uncuatro” ( el paciente levanta un pié  hasta la altura de la rodilla,   con      los      ojos      cerrados   . Siexiste Romberg positivo aparecerán oscilaciones y tendencia a la caída.

Significado Fisiológico: Este signo revela un trastorno del sistema  propioceptivo, undéficit en las vías de conducción aferentes de la sensibilidad profunda o laberínticacorregido por la visión. Por ello se pone de manifiesto cuando se le pide cerrar los ojos.El mismo significado fisiológico tienen  las alteraciones de la taxia dinámica cuando sele pide al paciente que cierre los ojos.  Revelan también alteración  de los cordonesposteriores de la médula, sistema laberíntico y degeneraciones espinocerebelosas. Elsigno de Romberg positivo pone de manifiesto la  presencia de ataxia estática.

Evaluar Disimetría

Evaluar Disdiadococinesia

Evaluar Temblor intencional

LESIONES DEL CEREBELO

Los síntomas de las lesiones cerebelosas se pueden comprender fácilmente si se conocenlas funciones del cerebelo:

    Ataxia. Significa falta de coordinación de los movimientos

    Dismetría. Consiste en que el movimiento pasa de largo del objetivo,porque los músculos antagonistas no se activan a tiempo para frenarlo

    Temblor intencional. el temblor cerebeloso o intencional se acentúa conlos movimientos voluntarios. Se produce porque se contraen a la vez losmúsculos agonistas y antagonistas al realizar el movimiento

    Disdiadococinesia. Dificultad para los movimientos alternantes yrepetitivos, como golpear rítmicamente con el dorso y la palma de la mano. Sedebe a la falta de coordinación en la activación alternante de agonistas yantagonistas.

    Disartria. Dificultad en el habla, por falta de coordinación en losmúsculos de la articulación de las palabras.

    Hipotonía. Por alteración en la regulación del tono muscular.

    Descomposición de los movimientos. Cuando un movimiento implica avarias articulaciones de un miembro, primero se mueve una articulación y luegootra.

    Alteración del equilibrio y nistagmus si la lesión afecta alvestibulocerebelo

FISIOLOGIA DEL VIII PAR CRANEAL VESTIBULO COCLEAR

En esta practica evaluaremos solamente la función de la rama coclear del VIII Par craneal (mediante testWeber, Rinne y Schwabach) y evaluar hipoacusia solamente, pues la rama vestibular será evaluada demodo diferencial conjuntamente con el estudio del cerebelo en su oportunidad.

Exploración de la rama coclear del Nervio acústico VIII par;nervio vestíbulo coclear)· El nervio coclear conduce los estímulos auditivos inducidos por las vibraciones

sonoras ,recogidas por el receptor: órgano de Corti ,de los estímulos auditivos.· No  nos  olvidemos  que  el  nervio  vestibular  conduce los  estímulos  específicos  del  sentido  del

equilibrio  que  traduce  las  sensaciones  de  posición o  movimientos  del  cuerpo  en  relación alespacio.

· Para la evaluación fisiológica de la percepción del sonido evaluaremos la transmisión aérea y latransmisión ósea.

· La  hipoacusia  POR  ALTERACIÓN  EN  LA  TRANSMISION Ó  CONDUCCION  AÉREA(HIPOACUSIA DE CONDUCCIÓN) : en AFECCIONES DEL OIDO EXTERNO O MEDIO óacumulo de cerumen o perforación timpánica.

· Y  LAS  AFECCIONES DE  HIPOACUSIA  POR  ALTERACIONES  EN  LA  CONDUCCIÓNÓSEA EN  LOS  TRANSTORNOR  DEL  NERVIO AUDITIVO)RAMA  COCLEAR Ó  DELLABERINTO(Hipoacusia sensorial, nerviosa o de Percepción .

Evaluación fisiológica de la audición.· El estudio de la transmisión ósea   se efectúa  por medio de tres pruebas CLÁSICAS QUE SON

Weber, Rinne y Schwabach. El objeto de ellas es comprobar si la eventual hipoacusia se debe:· a que  existe una pérdida de la conducción aérea(hipoacusia de conducción ósi se trata de una perturbación   de la transmisión   ósea como ocurre   en la afecciones del laberinto ,nervio ó vias auditivas nerviosas(hipoacusia sensorial nerviosa ó de percepción).

· Las  pruebas  de  audición constituyen  lo  que  se  llama:  Acumetría  Puede  ser  Fónica oInstrumental.

AUDIOMETRIA INSTRUMENTAL: Se realiza mediante los DIAPASONES, que soninstrumentos metálicos vibrantes de acero o de magnesio cuyas ramas son de forma de «U» alargada ycon un mango corto que sirve para cogerlos. Las frecuencias del juego completo de diapasones vandesde  64  Hertz  hasta  los  4000  Hertz.  Con  ellos  se  puede  hacer  el  diagnóstico  cualitativo  de  lashipoacusias  y  decir  si  se  trata  de  una  hipoacusia  conductiva  o  de  transmisión,  una  hipoacusianeurosensorial o de una mixta, lo cual se averigua mediante las siguientes pruebas:

PRUEBAS DE AUDICION

TEST DE WEBER  COMPARATIVO: ambos oídosEs una prueba de lateralización y generalmente se utiliza cuando la audición por vía aérea es diferente enlos dos oídos.En el oído normal y en el paciente con hipoacusia simétrica, no hay lateralización del sonido.La prueba se realiza pellizcando las ramas de un diapasón de 500, 250 o 128 Hertzios y no golpeándolaspara no originar armónicos, se coloca el mango del diapasón en la frente o en los incisivos superiores y sele pregunta al paciente de qué lado oye mejor el sonido.-  Si el paciente afirma sentir el sonido más fuerte hacia el oído hipoacúsico quiere decir que se trata deuna sordera de tipo conductivo o de transmisión.-  Si el sonido del diapasón colocado en la frente o en los incisivos superiores lateraliza hacia el oído sano,ello indica que el oído contralateral presenta una hipoacusia de tipo neurosensorial.

TEST DE WEBER COMPARATIVO

Con  el  diapasón  vibrando  en  medio  del  cráneo  (vertéx),  se  escucha  bien

en  ambos  lados  el  sonido  no  se  lateraliza,  el  sonido  es  igual  en  amboslados.El  test  compara  las  vías  óseas  en  ambos  oídos.  Se  puede  colocar  eldiapasón en la frente ó en incisivos superiores.

RESULTADOSi el sonido se lateraliza hacia el lado sano, entonces es hipoacusia Neuro sensorial Derecha. Sise lateraliza hacia el oído que escucha mejor, el oído Derecho enfermo ó peor prácticamente noescuchara.Si  el  oído  Derecho  (enfermo)  escucha   mejor,  el  sonido  lateraliza  hacia  la  izquierda,  seráhipoacusia de transmisión o de conducción.

TEST DE RINNE· Compara la calidad de la Percepción Auditiva por medio de 2 Vías:

· AEREA OSEA· Transmisión Apófisis mastoides· Conducción· (Investigamos un solo oído cada vez ; es monoaural)· PARA   COMPARAR   AEREA   Y   OSEA   SE   TOMA   EL   TIEMPO   DE   DURACION   DEL

SONIDO   CON   CRONÓMETRO   DESDE   EL   INSTANTE   EN   QUE   COLOCAMOS   ELMANFGO DEL DIAPASON VIBRANTE   EN HUESO MASTOIDES (INICIO) HASTA QUEDES APARECE EL SONIDO

Metodo para exploración de Rinne

TEST DE RINNE EN UN SOLO OIDO

Vía ósea1.   Diapasón vibrando sobre apófisis

mastoides.

Vía aérea2.   De inmediato acercar el diapasón a la oreja

del mismo lado.3.   Preguntar al paciente ¿Cuándo escucho

mejor?, ¿Dónde con mayor intensidad?

RESULTADOSi  se  escucha  mejor  por  vía  ósea,  Hipoacusia  deTransmisión ó conducción RINNE NEGATIVO.

Si   se   escucha   mejor   por   Vía   aérea   es   normal   óHipoacusia   de   percepción   neurosensorial.   RINNEPOSITIVO.

TEST DE RINNE:Tiene por objeto comparar la audición de un sonido transmitido por vía ósea(mastoidces), con la audicióndel mismo sonido transmitido por vía aérea (  delante oreja )  tomando los tiempos de duración  del sonidoen  segundos  con  el  diapason  en  mastoides  y luego  con  el   mismo  estímulo   tomar  tiempo  delante  de laoreja.

Al poner un diapasón vibrante en la mastoides de un individuo sano, éste oirá el sonido generado hasta quela magnitud de la vibración  no se se escuche pues se hace insuficiente para vencer la impedancia acústicaque  le  ofrecen  los  tejidos  que  se  interponen  en  su  transmisión  hasta  la  cóclea,  el  sonido  en  regiónmastoidea normalmente se percibe durante 20 segundos.Una vez que el diapasón deja de ser audible por vía ósea si se lo coloca INMEDIATAMENTE   frente al

conducto  auditivo  externo  (sin tocar la oreja)  reaparece la sensación auditiva por vía aérea 40  segundosmás, ya que la impedancia a vencer por esta vía es mucho menor que por vía ósea. En este caso que es elnormal se dice que el RINNE es POSITIVO.

En las hipoacusias conductivas la percepción se mantiene durante un tiempo mayor por vía ósea que porvía aérea, por ejemplo 35 segundos por vía ósea y 20 segundos por vía aérea, esto constituye el RINNENEGATIVO.

En las hipoacusias neurosensoriales se hayan disminuidas ambas fases, las proporciones se mantienen perolos tiempos están disminuidos y se habla de RINNE POSITIVO ACORTADO. Los valores podrían ser 10segundos por vía ósea y 20 segundos por vía aérea.

TEST DE SCHWABACH

Consiste en  comparar  el tiempo  de audición de  un diapasón  vibrante  colocado  en el  vértex del pacientecon el tiempo que oye un sujeto normal. Se aplica el diapasón vibrante en el vértex del paciente hasta quedeja de oírlo.Si  el  examinador  o  testigo  normal  oye,  se  habla  de  SCHWABACH  CORTO  y  orienta  a  una  sordera

neurosensorial;en el caso contrario SCHWABACH LARGO orienta hacia una lesión de tipo conductivo, por ejemplo una

otoesclerosis.Si los tiempos son semejantes se dice que el SCHAWABACH es normal.

RESULTADOS COMPARATIVOS ENTRE LA ACUMETRÍA FÓNICA (VOZ) Y LAACUMETRÍA INSTRUMENTAL ENTRE UNA PERSONA NORMAL Y UNA CONHIPOACUSIA NEUROSENSORIAL:

Instrumental

· Resumen :· En la hipoacusia de conducción (Trastorno de la conducción aérea , afecciones del oído   externo

y/o medio) tenemos:· El Weber se lateraliza  hacia el oído afectado ó  el oído peor· El Rinne es negativo en el oído afectado· El Schwabach es normal o más prolongado en el lado afectado· En la hipoacusia de percepción   o nerviosa(trastorno de la transmisión ósea , afecciones del oído

interno laberinto u nervio auditivo) tenemos:· Weber lateralizado hacia el lado sano· Rinne es positivo en el oído afectado· El Schwabach s acorta en el oído afectado.

Sistema Nervioso AutonómicoEFECTOS SIMPÁTICOS Y PARASIMPÁTICOS

IntroducciónEl  sistema   nervioso   autónomo   comprende   dos  grandes   divisiones  antagónicas:   sistema   simpático   yparasimpático, relacionados a respuesta de stress y antiestrés.Se emplea el sapo para observar los efectos simpáticos y parasimpáticos en la actividad cardiaca.

MaterialSapos grandes AlgodónConejos Jeringas descartablesAdrenalina Suero fisiológicoAcetilcolina Electrocardiógrafo con juego de agujas  de metalAtropina AtenololTabla de fijación para batraciosPilocarpina Solución de Ringer para batraciosEquipo de disección

FONICA NORMAL NEUROSENSORIALVoz cuchicheada 6 metros 0.2 metros

Voz alta 40 metros 1 metro

Conducción ósea 20 segundos 10 segundosConducción aérea 40 segundos 20 segundosWeber Sin lateralización Lateralizacion (al mejor oído)Rinne Positivo (normal) Positivo (corto)Schwabach Igual al examinador Menor que el examinador normal

Método

Experimento N° 1Anestesiar  al  sapo  por  destrucción  del  cerebro  y  la  medula  espinal.  Colocar  al  animal  en  la  tabla  defijación. Abrir el peto esternal y exponer el corazón. Humedecer periódicamente con la solución de Ringerpara  batracios.  Conectar  el  electrocardiógrafo  por  medio  de  las  agujas  de  metal  y  obtener  un  trazadoelectrocardiográfico  basal.  Instilar  una  gota  de  solución  de  Acetilcolina  al  1/5000  y  obtener  un  nuevotrazado  electrocardiográfico.  Lavar  la  preparación  con  la  solución  de  Ringer  y  dejarla  reposar  por  almenos 2 minutos.

Experimento N° 2Emplear la preparación descrita en el experimento anterior. Instilar dos gotas de solución de Adrenalina al1/2000 y obtener un trazado electrocardiográfico. Lavar la preparación con la solución de Ringer y dejarlareposar por al menos 2 minutos.

Experimento N° 3Emplear  la  preparación  descrita  en  el  experimento  anterior.  Instilar  una  gota  de  solución  de  Atenolol  yobtener un trazado electrocardiográfico. Lavar la preparación con la solución de Ringer y dejarla reposarpor al menos 2 minutos. A continuación instilar dos gotas de solución de Adrenalina al 1/2000 y obtenerun  nuevo  trazado  electrocardiográfico.  Lavar  la preparación con  la  solución de  Ringer  y dejarla reposarpor al menos 2 minutos.

Experimento N° 4Emplear  la preparación descrita en  el experimento  anterior. Instilar una  gota de  solución  de  Atropina al0.1% y obtener un trazado electrocardiográfico. Lavar la preparación con la solución de Ringer y dejarlareposar  por al menos 2  minutos. A continuación instilar dos gotas de solución de  Acetilcolina 1/5000  yobtener  un  nuevo  trazado  electrocardiográfico. Lavar  la  preparación con la solución de  Ringer  y dejarlareposar por al menos 2 minutos.

Experimento N° 5Instilar 1 gota de Pilocarpina en el ojo derecho de un conejo  y una gota de solución de Adrenalina en elojo izquierdo.

Discusión

FISIOLOGÍACARDIOVASCULAR

Corazón “in situ”: Propiedades del Corazón

1.- FundamentoEl  miocardio  tiene  propiedades  tales  como:  automatismo,  excitabilidad,  conductibilidad  y  contractilidadque le permite al corazón trabajar como bomba, de una manera adecuada a las necesidades del organismo.Tiene inervación autónoma y sistema de conducción eléctrica organizada.La actividad eléctrica que genera puede ser captada por electrodos  colocados en la superficie corporal ygraficarse en ondas por medio del Electrocardiógrafo. Existe una correlación entre la actividad eléctrica yel ciclo cardiaco.

2.-Objetivosa.   Reconocer la anatomía del corazón y vasosb.   Reconocer las fases del ciclo cardiaco-características del músculo cardiacoc.   Detectar la actividad eléctrica  del corazón (Electrocardiograma)d.   Relacionar la actividad eléctrica y el ciclo cardiacoe.   Demostrar  los  efectos  de  estímulos  físicos  y  químicos  (adrenérgicos  y  colinérgicos)  sobre  el

corazónf. Conocer el efecto vagal

3.-Materiales-  Animal para experimentar- sapo - Tablilla de fijación-  Electrocardiógrafo - Tubos de ensayo (03)-  Quimógrafo - Agua caliente (40°), fría (80°)-  Miógrafo para cardiografía por suspensión - Sol. Ringer.-  Carrete de estimulación eléctrica - Adrenalina 1/2000-  Equipo de disección y 2 pares de guantes) - Acetilcolina 1/5000-  Sol. CIK  1% -  Sol. C12Ca 1%-  Propranolol 1/1000 - Atenolol 1/1000

4.-Experimentos4.1 N° 1: Exposición del corazón-anatomía- ciclo cardiaco- Anestesiar al sapo por destrucción del cerebro y médula espinal- Colocar al sapo en la tablilla en decúbito dorsal-fijarlo con alfileres- Cortar la piel del tórax (tijera) y ampliar el   corte desde el piso de la boca hasta la porción media

del abdomen- Humedecer permanentemente las vísceras y tejidos con Sol. Ringer- Reconocer la punta del esternón y cortar por su lado izquierdo- Con tijera cortar el esternón en su línea media- Exponer al corazón e identificar el pericardio, cortarlo y observar las partes del corazón y vasos-

reconocer las fases del ciclo cardiaco- Colocar el Electrocardiógrafo y tomar un basal; relacionarlo con el ciclo cardiaco4.2 N° 2. Experimento de Gaskel- Estímulo físico (temperatura) al corazón

- Colocar  la  tablilla  con  el  sapo  en  forma  vertical,  (la  cabeza  hacia  abajo);  identificar  la  paredposterior del corazón.

- Observar los latidos por minutos (Seno Venoso, Aurículas y  Ventrículo)- Con tubo de ensayo (agua fría)  tocar el Seno venoso y observar los latidos- Esperar que regrese al basal  y proceder de igual manera con el tubo de ensayo con agua caliente;

observar latidos- Interpretar los eventos que acontecen4.3 N° 3. Cardiografía directa por suspensión- Efecto Vagal  y FarmacológicoFase A: Disecar el nervio vago derecho:- Cortar piel y subcutáneo hasta llegar al ángulo externo del maxilar- Identificar y cortar y transversalmente al músculo cutáneo pectoral derecho- Colocar el brazo derecho a 45° con respecto al eje del cuerpo- Observar  debajo  de  la  mandíbula  a  dos  nervios  :glosofaríngeo(lateral)  y  el  hipogloso  (medial),

individualizarlos y seguir sus recorridos   hasta la línea media , en donde cambian de dirección yse dirigen al piso de la boca

- Entre  los  dos  nervios,  reconocer   la  arteria  carótida  primitiva  (en  el  ángulo  externo  de  lamandíbula). Desplazarla hacia arriba e identificar por debajo al nervio vago derecho.

- Pasar por debajo del nervio vago un hilo mojado con  sol. RingerFase B:  Proceder a los siguientes experimentos:4.3.A: Cardiografía directa- Efectos del vago en el corazón- Colocar  el  clamp  del  Cardiógrafo  en  al  punta  del  ventrículo  ;  Aproximar  el Quimógrafo  a  la

palanca y obtener un trazado- Determinar el ritmo, frecuencia y amplitud del trazado ; relacionarlo con el ciclo cardiaco- Dibujar un gráfico, señalando sus características- Desconectar  Electrocardiógrafo.Estimular  al  nervio  vago  (  usar  los  electrodos  del  carrete  de

inducción ), observar los cambios en el latido (Durante/estimulación desconectar /Electrocardiógrafo)

- Estimular con una aguja a las aurículas y al ventrículo  y reconocer la contracción   prematura –morfología  y la pausa compensadora.

4.3.B  Efecto de la Acetilcolina y Adrenalina- Instilar una gota de acetilcolina  1/5000; observar efectos. Lavar c/Sol. Ringer- Instilar una gota de adrenalina  1/2000; observar efectos. Lavar- Instilar 1 gota de sol CIK 1%; observar efectos. Lavar- Instilar 1 gota de sol C12Ca  1%; observar efectos. Lavar4.3.C  Ligadura de Stannius- Conducción eléctrica – automatismo

- En el  surco en el Seno venoso y las aurículas colocar un hilo humedecido con sol. Ringer y ligar.Observar efectos en el ECG. Analizar

- Una segunda ligadura entre las aurículas y  el ventrículo ; ligar y observar ECG- Observar la frecuencia  de contracción de aurícula y  el ventrículo (Bloqueo aurículo- ventricular)

5. Graficar, analizar e interpretar los experimentos realizados

ACTIVIDAD  ELÉCTRICA  DEL  CORAZON  Y EFECTO DE LOSELECTROLITOS

1. FundamentoLos  potenciales  de  membrana  de  la  célula  cardiaca  tienen  relación  directa  con  la  concentración  de  losiones dentro y fuera de la célula. El potencial de acción es consecuencia de la entrada y salida de los iones,de la célula. Algunos iones INTERVIENEN en la despolarización y otros en la repolarización  celular.La perfusión del corazón con soluciones que tienen mayor concentración de iones van aalterar los potenciales de la célula y se expresaran en la contracción del miocardio.

2. Objetivosa.   Reconocer y analizar los cambios de la actividad cardíaca cuando se le expone a soluciones con

Potasio, Calcio y Magnesiob.   Esquematizar los lugares de acción de dichos cationes en el potencial de Acciónc.   El alumno será competente para entender los conceptos :-   Relaciones espaciales de las Cavidades cardiacas:  (aplicación en el ECG, auscultación cardiaca)-   Diferenciar entre el músculo auricular y ventricular: relación  con presiones que manejan.-   Sistema de conducción: automatismo, conducción, velocidad de conducción, excitabilidad- Diferencias  del  potencial  de  acción  entre  N.  Sinusal  y  fibra  ventricular:  Canales  iónicos  en  ladespolarización  y  repolarización,  efectos  y  su  fundamento  de  administración  de  Potasio,  calcio-cambios en el ECG. ¿Por que el N. sinusal comanda el inicio de la despolarización cardiaca?-   Periodo refractario absoluto y relativo :consecuencias ante estímulos-   Innervación cardiaca: efectos en las propiedades del músculo cardiaco

- Irrigación  cardiaca:  a.  coronarias  y  venas  cardiacas-  relación  de  la  sístole  y  diástole  con  lairrigación coronaria.

3. MATERIAL- Animal de experimento: sapo - Sol. Ringer (Sol A)- Tablilla de fijación  y alfileres - Sol. Ringer con C1Ca (1 gr/lt)(Sol.B)- Catéteres EV - Sol. Ringer con CIK (0.3 g/lt)(Sol.C)- Frascos de perfusión de 125 ml - Sol. Ringer con C1Mg (1g/lt)(Sol.D)- Anzuelos - Quimógrafo- Cera - equipo de disección

4. EXPERIMENTOS:

4.1. Experimento N° 1: Preparación- Anestesiar al sapo por destrucción del cerebro y médula espinal- Fijar al animal a la tablilla, con alfileres- Exponer al corazón a través de una incisión media toraco –abdominal- Cortar el pericardio, insertar el anzuelo,  con un hilo, a la punta del corazón- Levantar el corazón para exponer la vena cava y canularla- Conectarla a un sistema de perfusión graduando la altura de los frascos- Se conecta los frascos de perfusión a través de tubos en Y a una vía común que se  inserta en la

vena cava- Cada una de los frascos posee una llave para abrir o cerrar el flujo- Frasco A: Sol. Ringer- Frasco B: Sol Ringer con CLCa- Frasco C: Sol. Ringer con CIK

- Frasco D: Sol. Ringer con CIMg- Evitar que quede aire en el sistema de perfusión llenar un lado del sistema con sol. Ringer- Se inicia la perfusión hasta que el corazón se contraiga

4.2. Experimento 2: Exponer al corazón al Cloruro de Calcio- Prefundir al corazón con la sol. B.- Registrar la actividad cardiaca y las características de las contracciones

4.3. Experimento 3: Exponer al corazón al Cloruro de Magnesio- Prefundir al corazón con la sol. D.- Registrar la actividad cardiaca y las características de las contracciones

4.4. Experimento 4: Exponer al corazón al cloruro de Potasio- Prefundir al corazón con la sol. C.- Registrar la actividad cardiaca  y las características de las contracciones

5. Graficar y analizar los efectos de los iones Potasio, Calcio y Magnesio

ELECTROCARDIOGRAFIA EN EL SER HUMANO EN REPOSO

1. IntroducciónEl corazón tiene la capacidad de generar su propio potencial de acción , el que es transmitido a través delsistema de conducción a las aurículas y los ventrículos. Es transmitido a través del volumen conductor a lasuperficie del cuerpo. Donde es captado por los electrodos del electrocardiógrafo.La  electrocardiografía  puede  realizarse  en  reposo  (electrocardiografía  clínica  de  reposo)  o  en  actividad(prueba de esfuerzo).En la presente práctica se realizara la electrocardiografía de reposo.

1. A Objetivos y competencias  que obtendrá el alumno: Electrocardiografía1. Relacionar la actividad eléctrica del corazón con las ondas e intervalos del ECG2. Conceptos de derivaciones periféricas y precordiales3. Relación entre la ubicación de una derivación y las ondas del ECG.4. ¿Por que hay diferencias entre la morfología  de ondas en cara diafragmática y cara lateral?5. Derivaciones de la cara  inferior y posterior del corazón6. Derivaciones de la cara lateral del corazón: morfología del QRS7. Derivaciones de la cara anterior del corazón8. Derivaciones de la cara  anteroseptal del corazón9. Eje eléctrico del QRS: importancia y relación con la masa ventricular10. Concepto de ritmo sinusal y noción elemental arritmias y bloqueos.

2. MaterialSujetos de prueba varones y mujeres, Electrocardiógrafo, leptosómicos y pícnicos

3. Método3.1. Experimento N°. 1Colocar  al  sujeto   en  decúbito  dorsal  y aplicar  los  electrodos  de  acuerdo  a  la  convención  internacional.Estandarizar  el  aparato  aplicando  1  mV  ,  debiendo  defleccionar  la  aguja  inscriptora  10mm  amplitud;  lavelocidad de registro del aparato deberá ser 25 mm/seg. Realizar 6 trazados de derivaciones de miembrosy 6 trazados de  de derivaciones precordiales.Informar de acuerdo al siguiente protocolo:

Nombre: Fecha:Edad: Talla:Peso: Tipo constitucional:

Informe electrocardiográfico:Ritmo: Frecuencia cardiaca:Intervalo PR: Complejo QRS: Intervalo Q-T: Q-Tc:Eje QRSMorfología de PMorfología de QRS:Morfología  de T:Conclusiones:Comentario:

4. Discusión

PRESIÓN SANGUÍNEA EN EL HOMBRE ADULTO

1.-FUNDAMENTOEl volumen sistólico produce en la circulación periférica cambios en el flujo y presiones intravasculares;presión arterial, presión venosa. Estas presiones están relacionadas   con la longitud y radio del vaso y conla  viscosidad  de  la  sangre;  factores  que  producen  resistencia  al  flujo.  La  presión  arterial  tiene  un  picomayor   denominado   presión   sistólica   y  un   nivel  inferior   denominado   presión  diastólica.   La   presiónpromedio  se denomina presión arterial  media.  La presión arterial puede determinarse en  forma indirectapor medios de un aparato Esfigmomanómetro de mercurio o aneroide.

1. OBJETIVOSa.   Determinar la presión arterial sistólica, diastólica, en forma indirectab.   Determinar  los  cambios  de  la  presión  arterial  cuando  se  expone  factores,  físicos  (temperatura),

cambios de posición y de actividad físicac.   Calcular la presión arterial media-El alumno tendrá competencia para saber:

-  ¿Cuales son los factores mecánicos y humorales que determinan la presión arterial?- Relacionar presión hidrostática y oncótica con la PA- Mencionar tres sustancias que sean vasoconstrictoras y tres que sean vasodilatoras –¿cómo actúan? ¿Cómo se regulan?

- Relacione los cambios de PA y FC en relación con el ejercicio y la postura corporal-  ¿Qué importancia tiene la PAM? ¿Cómo la determina?-  Relacionar gasto cardiaco, resistencia vascular, vol. Sistólico, frecuencia cardiaca,

Inotropismo, precarga, volumen sanguíneo, capacidad venosa, presión venosa central,regulación de agua y sodio por el riñón

2. MATERIAL- Sujeto de prueba: alumnos- Tensiometro de mercurio o anaeroide- Estetoscopio- Beakers- Agua fría (5° C)

3. EXPERIMENTOExperimento 1: Determinar la presión arterial

- Sujeto de prueba en posición sentada, brazo descubierto a la altura del corazón- Esperar 5 minutos- Colocar el brazalete por encima del pliegue del codo- Colocar la campana del estetoscopio sobre la arterial humeral- Inflar el manguito hasta que desaparezca el pulso arterial- Desinflar el manguito lentamente y

- Registrar la presión sistólica con el primer ruido de Korotkoff- Registrar la presión diastólica con el quinto ruido de Korotkoff- Recordar: 1mmHg = 0.13 Kpa = 13.6 cm. H2O

Experimento 2: Efecto del ejercicio físico sobre la presión arterial- Realizar un ejercicio físico intenso ( 20 abdominales o 20 cuclillas)- Tomar la presión inmediatamente, a los dos y cinco minutos- Registrar la frecuencia cardiaca en el basal y post ejercicio- Interpretar los cambios

Experimento 3: Efecto de la posición del cuerpo sobre la presión arterial- Registrar la presión arterial y frecuencia cardiaca en la posición de decúbito dorsal, sentado y de

pie; previo descanso entre cada posición- Interpretar los resultados

Experimento 4: Efectos del frió sobre la presión arterial- Sumergir la mano en agua fría (5° C) por 30 a 60 segundos, hasta cubrir la muñeca- Determinar la PA- La prueba se considera positiva si la PAS sube más de 20mmHg y la PAD más de 15 mmHg.

- Bibliografía

Mc Graw Hill: Practicas de Fisiología. InteramericanaWilliam Ganong. Fisiología MédicaArthur Guyton y may John. Tratado de Fisiología Médica

ESPIROMETRÍA: VOLÚMENES Y CAPACIDADES PULMONARES.TESTS DE FUNCIÓN VENTILATORIA.

1. Introducción

La medición de los volúmenes pulmonares  se  realiza  por medio de la Espirometría. Este procedimientopermite determinar todos lo volúmenes pulmonares, excepto el volumen residual, cuya medición se realizapor métodos indirectos. Emplearemos el Espirómetro Pneumotacómetro Fleich Datospir 120En esta práctica el alumno adquirirá competencia para entender:

1.   Cantidad de Aire inspirado y expirado normalmente: Volumen Tidal2.   Volúmenes  pulmonares:  V.  espiratorio  forzado(VEF);  V.  Inspiratorio  Forzado(VIF)  ;  Volumen

residual (VR)3.   Capacidades Pulmonares (relación de dos ó   más volúmenes): Capacidad  Vital (CV); Capacidad

funcional residual (CFR); Capacidad pulmonar Total (CPT)4.   Espacio Muerto (EM): relación con el VT5.   Espacio Muerto fisiológico (EMF): ejemplos6.   Volumen alveolar (VA) - Relación entre VA, EM y VT7.   Ventilación: (volumen de aire por minuto): tipos8.   Ventilación alveolar: FR x VA9.   Ventilación Pulmonar: FR x VT10.  Volumen Espiratorio Forzado al primer segundo (VEF1) (80% de la CV)11.  Diferencias procesos Obstructivos de Restrictivos pulmonares.

2. Equipo

Pinza NasalDispositivo bucal descartable para espirar e inspirar

EQUIPO ESPIRÓMETRO NEUMOTACÓMETRO FLEICH DATOSPIR

3. Método

3.1. Obtención del Espirograma

Sentar  al sujeto  de prueba,  colocarle la pinza nasal  y la pieza bucal unida al  neumotacómetro. Constatarque no haya fugas de aire por la boca, borde de los labios, ni nariz.Permitir que el sujeto de prueba respire un momento con la pieza bucal, para que se acostumbre a ella. Unavez  que  la  frecuencia  respiratoria  se  ha  vuelto  constante  y  la  profundidad  de  la  respiración  uniforme,conectar al espirómetro para obtener   un trazado Usualmente se consigue en unos minutos). A continuaciónsolicitar al sujeto que realice las siguientes maniobras según instrucciones del profesolr de Practicas.:

a)   Al   final   de   una   inspiración   normal   (FIN)   realizar   una   espiración   máxima   y   luego   respirarnormalmente. .

b) Al   final   de   una   espiración   normal   (FEN)   realizar   una   inspiración   máxima   y  luego   respirarnormalmente.

c)   Al   final   de   una   inspiración   normal   (FIN)   realizar   una   espiración   máxima   seguida   de   unainspiración máxima, luego respirar normalmente.

Mediciones de la capacidad ventilatoria.

CAPACIDAD VITAL FORZADA (CVF)Es la máxima espiración forzada y rápida realizada después de una inspiración profunda.

VOLUMEN ESPIRATORIO FORZADO DEL PRIMER SEGUNDO (VEF1)

Es  el volumen  de  aire  espirado  durante  el  primer  segundo  de  la  espiración  de  una  CVF.  Los  valoresnormales son: 83% para el primer segundo, 94% para el segundo segundo y 97% para el tercer segundo.

FLUJO ESPIRATORIO FORZADO DE 25% AL 75% (FEF 25-75%)Es  la  medición  del  flujo  espiratorio  considerando  el  50%  del  medio  de  la  CVF.  De  esta  medición  seobtiene el flujo espiratoria máximo medio, cuyo valor normal para un sujeto joven es de 150L/minuto.

MÁXIMA  VENTILACIÓN  VOLUNTARIA  (MVV)  o  máxima  capacidad  ventilatoria  omáxima capacidad respiratoria

Es el máximo volumen de aire que pueden movilizar voluntariamente los pulmones en un minuto.Velocidad del flujo medio respiratorio máximo (MMEFR) o velocidad del flujo espiratorio forzado(FEF 25-75%)Es la relación del medio de la CVF y el TEM. Es el test más sensible para el diagnóstico de la enfermedadobstructiva.Se discutirán los trazados obtenidos con los respectivos profesores de Prácticas en cada mesa.

OXIMETRIA: SATURACION ARTERIAL DE OXIGENO

Introducción

En los seres humanos como en todos los mamíferos, la hemoglobina, constituye el principal componentedel  eritrocito  y  normalmente  es  responsable  del  transporte  del  99.2%  de  oxigeno  presente  en  la  sangre.También  juega  un  papel  importante  en  el  transporte  de  di6xido  de  carbono  (C02)  y  del  ion  hidr6geno(H+).

La hemoglobina es una proteína conjugada con un peso molecular de 68000.Está formada por cuatro subunidades de peso molecular cercano a 17000. Cada subunidad está constituidapor  un  grupo  “heme” y  una  cadena  polipeptídica.  La  molécula  de  hemoglobina,  por  lo tanto,  estáintegrada  por  cuatro  grupos  "heme"  y cuatro  cadenas  polipeptídicas,  que  en  su  conjunto  constituye  laglobina.

La  globina  constituye  el  96%  de  la  molécula  de  hemoglobina  y  está  compuesta  por  cuatro  cadenaspolipeptídicas que aparecen como dos pares no idénticos. La hemoglobina A, la principal hemoglobina enlos adultos, consta de dos cadenas α   y dos cadenas β siendo su estructura   α2 y β2 , y   representa el 90%del total de la hemoglobina. Una segunda especie de hemoglobina es la HbA2, y representa  el 2.5% deltotal, y contiene dos cadenas alfa y dos cadenas delta (α2  y   δ2 ) Además de estas dos hemoglobinas, otrasseis  formas  adicionales  se  encuentran  en  pequeñas  cantidades  y  cuyo  significado  fisiológico  aun  faltaprecisar.

Además de la heterogeneidad  presente a nivel  individual,  se observa  una heterogeneidad  de lahemoglobina  durante  el  ciclo  vital.  Durante  la  vida  embrionaria  aparece  la  hemoglobina  embrionaria  (HbE ), en la cual las 2 cadenas a están combinadas con las  2 cadenas epsilon (a2E"z); rnientras que durantela vida fetal, la principal proteína transportadora es la hemoglobina Fetal (HbF) donde las cadenas alfaestán combinadas con cadenas gamma (α2  γ2)

Un  tercer   tipo   de   heterogeneidad   de   la  hemoglobina,   resulta   de   mutaciones   de   genes  quecontrolan  la   secuencia  de  aminoacidos  en  las  cadenas   alfa   y  beta,  dando   lugar  a   la  aparición  dehemoglobinas anormales.

El grupo "heme" constituye el 4% de la molécula de hemoglobina; y es una rnetaloporfirina queresulta de la combinación de un metal, el hierro, con una porfirina. EI hierro puede  estar en el estado deoxidación ferroso (+2) o en el ferrico (+3), y las formas correspondientes de hernoglobina se denominanferrohemoglobina y ferrihemoglobina   o metahemglobina,   respectivamente; y solamente laferrohemoglobina puede captar oxigeno.

La hemoglobjna presenta las siguientes caracteristicas:

1) Cada atomo de, hierro de los grupos "hemo" reacciona directamente con el oxigeno molecular(Oz) y logra fijar una molécula de oxigeno por cada átomo de hierro, de lo que podemos deducir que unamolecula de hemoglobina puede transportar cuatro moleculas de oxigeno.

Para que esta reacción ocurra, el  hierro debe encontrarse en la forma divalente  (Fe2+o ferroso).Este  estado  no  se  modifica  cuando  el  hierro  reacciona  con  la  hemoglobina:  existe  oxigenación  y  nooxidación de la hemoglobina. Cuando el átomo de hierro es oxidado a su forma trivalente (férrico), comoocurre en la metahemoglobina, no reacciona con el oxigeno, perdiendo la hemoglobina la capacidad detransportarlo.  En  condiciones  normales  in  vivo,  el  sistema  metahemoglobina  reductasa  del  eritrocitomantiene al hierro de la molécula en estado ferroso.

2) La  hemoglobina  también se combina con el  monóxido de Carbono (CO2), unión  que  serealiza,  al  igual  que  con  el  oxígeno,  con  el  hierro.  Cada  átomo  de  hierro  puede  fijar  una  molécula  de

monóxido. EI producto resultante recibe el nombre de "carboxihemoglobina".

Cada átomo de hierro puede fijar una molécula de monóxido de carbono, compuesto producidopor la combustión incompleta del carbono (braseros, estufas, gas de alumbrado, motores a explosión). Elmonóxido  de  carbono  se  combina  más  fácilmente  con  la  hemoglobina,  unas  200  a  300  veces,  que  eloxigeno.   El   peligro   de   la   intoxicación   con   monóxido   de   carbono   radica   en   el   hecho   de   que   lacarboxihemoglobina  no  tranporta  oxigeno.  Si  un  30%  del  total  de  la  hemoglobina  circulante  estaocupada con monóxido de carbono aparecen las cefaleas y vómitos; si lo esta un 50 %, la vida peligra; silo está un 60-70 %, se produce la muerte por asfixia.

3)  El  hierro  de  la  hemoglobina  sufre  constantemente  procesos  de  oxidación,  formándose  lametahemoglobina. Ocurre en un 3% del total de la hemoglobina por día. La conversión de una fracciónde hemoglobina en metahemoglobina tiene un efecto similar al de la carboxihemoglobina, es decir, pierdela  capacidad  de  transportar  oxigeno.  En  condiciones  normales  "in  vivo"  la  metahemoglobina  esreducida a hemoglobina por acción de la diaforasa del eritrocito, enzima que permite acoplar la NADH2

generada por la gliceraldehido-fosfato-deshidrogenasa en la reacción de Embden-Meyerhoff

Entre los factores que ocasionan una acumulación excesiva de metahemoglobina se encuentra: a)La metahemoglobinemia hereditaria, por disminución de la actividad de la diaforasa o bien por síntesisde hemoglobinas anormales, y b) La metahemog!obinemia adquirida., que ocurre como resultado de lai

ingesta de fármacos oxidantes (nitritos, nitratos, derivados de la anilina) y desaparece cuando se suspendela administración de las drogas.

4) La hemoglobina se combina con el dióxido de carbono, produciéndose lacarboxihemoglobina. Esta combinación se efectúa con la globina de la molécula, mediante la formaciónde  compuestos  carbamínicos,  reacción  que  aumenta  considerablemente  cuando  desciende  la  saturacióncon oxígeno.

5)  La  combinación  de  la  deoxihemoglobina  (Hb)   con  el  oxígeno  da  lugar  a  la  formación  deoxihemoglobina  (HbO2).  Esta  combinación  es  reversible  y la  proporción  de  desoxihemoglobina  que  setransforma  en  oxihemoglobina  al  ponerla  en  contacto  con  el  oxigeno  depende  de  la  presión  parcial  deoxigeno   (PO2)   del   medio   que   rodea   a   la   molécula.   Cuando   toda   la   hemoglobina   está   comooxihemoglobina, se dice que el contenido de oxigeno de la hemoglobina ha alcanzado la "capacidad deoxigeno" del compuesto, pero cuando el contenido de oxigeno de la sangre es  menor que la capacidad deoxigeno, el contenido de oxígeno se expresa en términos de porcentaje de saturación (SO2).

La  saturación  arterial  de  oxígeno  (SaO2),  es  la  cantidad  de  oxígeno  unida  a  las  moléculas  dehemoglobina  en  relación  a  la  cantidad  total  de  moléculas  presente  en  la  sangre  arterial.  Contenido/capacidad x 100

La  medición  de  la  saturación  arterial  de  oxígeno  requería  de  métodos  invasivos,  punciónvascular arterial, que hacían difícil su utilización en estudios dinámicos y en estudios poblacionales. Estalimitación  se  ha  superado  en  la actualidad  gracias  al  advenimiento  de  métodos  no  invasivos,  como  laoxirnetría de pulso.

La oximetría permite medir la cantidad de hemoglobina que es capaz de unirse reversiblementeal oxígeno [hemoglobina funcional u oxihemoglobina (HbO2)], en relación a la totalidad de hemoglobinapresente en sangre (oxihemoglobina, deoxihemoglobina, carboxihemoglobina y metahemoglobina). En lamayoría  de  circunstancias clínicas  la carboxihemoglobina  y la  metahemoglobina,  forrnas disfuncionalesde la hemoglobina, constituyen tan sólo una fracción insignificante de la hemoglobina total. De tal formaque la medición de la saturación arterial de oxígeno puede ser representada por la siguiente fórmula:

[HbO2 ]

Saturación (%) = ---------------------------- x 100

[HbO2] + [ Hb ]

La   oximetría   de   pulso   mide   la   fracción   de   luz   transmitida   a   través   de   los   tejidos.   Laoxihemogobina  absorbe  más  luz  cerca  del  infra-rojo  (vg.  900  nm);  mientras  que  la  deoxihemoglobinaabsorbe  más  luz  roja  (vg.  660  nm).  Por  lo  tanto,  la  absorción  de  luz  por  la  oxihemoglobina  y  ladeaxihemoglobina es diferente en estas dos longuitudes de ondas.

Los oxímetros de pulso (figura 1) basicamente están constituidos por dos diodos que emiten luzen forma intermitente, y una célula fotosensitiva, capaz de medir por separado y en forma secuencial laluz transmitida a través de la piel, en el orden de mil veces por segundo. Primero se ilumina el diodo queemite luz roja y luego el diodo que emite luz cerca  del infra-rojo y la luz transmitida por los tejidos, enambas longitudes de onda, son cuantificadas  y cornparadas por la célula fotosensitiva para determinar elporcentaje de la saturación arterial de oxígeno.

La saturación arterial de oxígeno normalmente varía entre 95 a 100% en sujetos de nivel del mary entre 84 a 92% en sujetos adultos, nativos-residentes en las grandes alturas. En recién nacidos varía entre85 a 90%. Valores que se modifican con el ejercicio físico y la altitud de residencia.

Experimento N° 1:MEDIDA DE LA SATURACIÓN ARTERIAL DE OXIGENOMateriales:- Oxímetro de pulso- Sensores de Oxígeno (Fig. 2)- Algodón- Alcohol

Saturación (%) Fr. Cardiaca

1ra. Medición

2da. Medición

3ra. Medición

Promedio

Procedimiento:1.   Encender el oxímetro de pulso.2.   Limpiar y secar el dedo índice, con algodón y alcohol.3.   Colocar el sensor de oxígeno en el dedo índice.4.   Leer y registrar la saturación arterial de oxígeno y la frecuencia cardiaca, tres veces.

Resultados:

5.   Determinar si la saturación arterial de oxígeno varía en los diferentes dedos de la mano derecha eizquierda

6.   Determinar si la postura modifica la saturación arterial de oxígeno.

Experimento N° 2: EFECTO DEL EJERCICIO FISICO SOBRE LA SATURACIÓN ARTERIALDE OXIGENO

Materiales:- Oxímetro de pulso- Sensor de oxígeno- Algodón- Alcohol- Sujeto experimental (alumno 1)- Sujeto experimentador (alumno 2)

Procedimiento:

1.   Con el sujeto experimental cómodamente sentado, monitorizar registrar la saturación arterial deoxígeno  y  la  frecuencia  cardiaca,  hasta  lograr  valores  constantes  con  un      +     5%  de  variación(Medición Pre-Ejercicio).

2.   Desconectar el oxímetro y solicitar al sujeto experimental que abra y cierre rítmicamente ambasmanos durante 10 minutos.

3.   Al   final   del   ejercicio   motorizar   la   saturación   arterial   de   oxígeno   y  la   frecuencia   cardiaca(Medición Post-Ejercicio)

4.   Cada dos minutos monitorizar la saturación arterial y la frecuencia cardiaca hasta obtener valoressimilares a las condiciones basales (Pre-Ejercicio) (1ra.-10ma. Medición).

Saturación (%) Fr. Cardiaca

Posición Decúbito

Posición Sentado

Posición de Pie

Saturación (%) Fr. Cardiaca

Derecha Izquierda Derecha Izquierda

Dedo Pulgar

Dedo Índice

Dedo Cardinal

Dedo Anular

Dedo Meñique

Resultados:

Experimento N° 3: ISQUEMIA Y SATURACIÓN ARTERIAL DE OXIGENO

Materiales:- Tensiómetro- Cronómetro.- Oxímetro de pulso.- Sensor de oxígeno.

Procedimiento:1.   El  sujeto  experimental  deberá  sentarse  cómodamente,  colocando  los  brazos  sobre  la  mesa  de

modo que quede a nivel del corazón, medir la saturación arterial de oxigeno en el dedo índice deambas manos (1ra. Medición).

2.   Coloque el manguito del tensiómetro, completamente desinflado, alrededor del brazo derecho, demanera que su borde inferior quede de 2-4 cm. sobre el pliegue del codo.

3.   Aumentar la presión del sistema, con la pera insuflora, hasta alcanzar una presión de 200 mmHg.4.   Solicitar  al  sujeto  experimental  que  abra  y  cierre  rítmicamente  la  mano  derecha  hasta  que  el

sujeto empiece a reportar dolor e inmediatamente medir la saturación arterial en el dedo índice dela mano derecha y luego en el dedo índice de la mano izquierda (2da. Medición).

5.   Solicitar al sujeto experimental que siga abriendo y cerrando rítmicamente la mano derecha hastael momento en que el dolor sea insoportable y medir nuevamente la saturación arterial en ambasmanos (3ra. Medición).

6.   Disminuir rápidamente la presión del sistema abriendo la válvula de la pera isuflora y retirar eltensiómetro.

7.   Medir y registrar la saturación arterial y la frecuencia cardiaca, cada dos minutos durante 10 min.hasta obtener valores similares al de las condiciones basales. (4ta.-6ta. Medición).

Resultados:

SATURACIÓN ARTERIAL DE OXIGENO

Saturación (%) Fr. Cardiaca

Pre-Ejercicio

Post-Ejercicio

Tiempo (min.) de Recuperación

Saturación (%) Fr. Cardiaca

BRAZO DERECHO:Basal

Iniciar Dolor

Dolor Soportable

Tiempo (min.) de Recuperación

BRAZO IZQUIERDO:Basal

Inicia Dolor

Dolor Soportable

Tiempo (min.) de Recuperación

Saturación (%) Frecuencia Cardiaca

Índice Derecho Índice Izquierdo Índice Derecho Índice Izquierdo

1ra. Medición

2da. Medición

3ra. Medición

4ta. Medición

5ta. Medición

6ta. Medición

Tiempo (min.) saturación (%) Fr. Cardiaca

Pre-Ejercicio

Post-Ejercicio

1ra. Medición

2da. Medición

3ra. Medición

4ta. Medición

5ta. Medición

6ta. Medición

7ma. Medición

8va. Medición

9na. Medición

10ma. Medición

INFORME DE PRACTICA

Nombre:...........................................................................................................................  Fecha:....../....../......-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

ANTECEDENTES PERSONALES:-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Nombre:................................................................................. Sexo:..................   Edad:.............  añosPeso:........... Kg  Talla:.............  mts Peso Ideal:..............  KgLugar de Nacimiento:..............................................................    T. Resd. Lima:......................Actividad Física: 1) Sedentaria: ..........

2) Ocasional: ..........3) Frecuente: ..........

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

EJERCICIO FÍSICO  Y SATURACIÓN ARTERIAL DE OXIGENO:

ISQUEMIA LOCAL Y SATURACIÓN ARTERIAL DE OXIGENO:

FISIOLOGIA DE LA SANGRE

HEMATOCRITOEs la relación porcentual entre la cantidad de glóbulos rojos y el plasma sanguíneo en relación a la sangre total. Estadeterminación es muy útil para del diagnóstico diferencial de anemias porque ayuda a determinar su intensidad y tipo.Reactivos , Material de Vidrio y EquiposAnticoagulante  de  Wintrobe:  Oxalato  de  potasio  0.8  gm   y oxalato  de  amonio  1.2  gm  y  agua  dest.  csp.  100  ml.)Colocar 0.5 ml en cada frasquito   de vidrio y desecarlos   en estufa a 56 ºC. Cada frasco así preparado servirá paraanticoagular 5 ml de sangre.Sangre venosa anticoagulada .Pipetas Pasteur y  Tubo de WintrobeTubos capilares para microhematocrito con y sin heparina.Jeringas y agujas descartables.Desinfectante para piel..Guantes descartablesCentrífuga ClínicaCentrífuga para MicrohematocritoExisten 2 métodos:  Macro y Micrométodo para determinar el Hematocrito.Procedimiento: Macrométodo de Wintrobe.Usando la pipeta Pasteur llenar con sangre el tubo de Wintrobe hasta la marca 100.Evitar formación de burbujas.Centrifugar el tubo (contrapesado), a 3000 rpm. durante 30 minutos.Lectura  en  la  escala  ascendente en  el  límite  del  paquete  globular,  excluyendo  los  glóbulos  blancos  yplaquetas.Expresar el Hematocrito en valor porcentual.Valores Normales:

Hematocrito ValoresReferenciales

%

Recién Nacidos 60

Infantes 35 a 44

Varones Adultos 41 a 52

Mujeres Adultos 38 a 46

------------------------------Procedimiento: Método MICROHEMATOCRITO.Llenar el tubo capilar con la muestra de sangre. Sellar el extremo inferior con plastilina.Centrifugar a 12,000 rpm  en la centrífuga para microhematocrito, durante 10 min. Lectura en la  tabla Ad-hoc para este efecto. Expresar el valor porcentual.

------------------------------

HEMOGLOBINAEs una molécula de estructura cuaternaria, tetramérica proteica, es el pigmento rojo portador del Oxígenode los hematíes. Está formada por un núcleo Hem y una proteína llamada Globina.

MEDICION DE LA HEMOGLOBINA:Materiales:Jeringa y agujas descartables.Desinfectante.Algodón.

Ligadura.Alcohol.

Anticoagulante de Wintrobe.Pipeta de Sahlí de 0.02 mlTubos de prueba.Solución de HCl  0.1 NEspectrofotómetro.

ProcedimientoObtener  3  ml  sangre venosa  con anticoagulante. Medir 0.02  ml sangre con la pipeta de Sahlí (0.02  ml).Limpiar la parte externa de la punta de la pipeta para eliminar la sangre adherida al exterior de la pipeta.Vaciar en contenido de la pipeta en un tubo conteniendo 5.0 ml de la Sol. de HCl 0.1 NMezclar, por inversión, suavemente, sin agitar. Reposo 10 min. Lectura en el Espectrofotómetro, en Long.Onda de 540 nm. Colocar el espectrofotómetro en 0.00 Abs. ; leer luego la muestra problema. Anotar lalectura de Absorbancia.

CALCULOS:Absorbancia del Problema X Factor de Calibración = gm Hb %

Valores Referenciales:

Índices Hematológicos o Constantes Corpusculares

Los índices hematológicos, son elementos de juicio muy importantes para clasificar las anemias, enrelación a su contenido de hemoglobina, volumen globular y valor porcentual de la concentración dehemoglobina en cada uno de los glóbulos en promedio.VOLUMEN GLOBULAR MEDIO

Volumen Globular Medio =   Hcrito   x   10 = micras cúbicas

Hemoglobina ValoresReferenciales

gm %Recien Nacidos 17 a 25

Infantes 10 a 15

Hombre Adulto l4a17

Mujer     Adulto 12 a 16

Hombre de Altura 16.4 a 18.8

GRValores Normales:

Al nacer : 105 micras cúbicasInfancia: 83 a 87 micras cúbicas

Adulto: 83 a 95 micras cúbicas

HEMOGLOBINA MEDIA GLOBULAR

Hemoglobina media globular =      Hb      x     10     = Micro microgramosGR

Valores Normales: 27 a 32 Micro microgramos

CONCENTRACIÓN DE HEMOGLOBINA GLOBULAR MEDIA

C Hb Glob Media = Hb gr% X 100Hto

Valores Normales: 32 a 36%

Referencias Bibliográficas:Clinical Hematology Wintrobe ",. Lea Febiger. Phila USA 9ª Edition. 1993Medical Laboratory Technology. Lynch.Raphael Saunders USA 1989.Manual of Clinical Hematology. Joseph Mazza. Little Brown 1998.

VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULARLa Velocidad de Sedimentación globular consiste en determinar la rapidez de caída ó sedimentación de losglóbulos  rojos  de  la  sangre  cuando  está  anticoagulada,  esto  se  realiza  en  un  tubo  de  caracteristicasespeciales llamado tubo de Wintrobe.Materiales:Tubo de WintrobeAlgodón, alcohol, ligadura, agujas y jeringas descartables. Anticoagulante de Wintrobe.Pipetas Pasteur.Guantes de  látex  descartables.Gradilla tipo soporte vertical para el tubo Wintrobe, perpendicular a la mesa (plomada).ProcedimientoLlenar el tubo con sangre venosa anticoagulada hasta la marca 0 de lectura de la Velocidad., empleando lapipeta  Pasteur.  Luego  dejar  en  reposo  vertical,  perpendicular,  durante  60  min.  Lectura  en  la  escala  devalores descendentes para Velocidad de Sedimentación.

Los Valores Referenciales de   Velocidad      de      Sedimentación   , según el método   Wintrobe    son:Hombres: 0 a 6.5 mm a la horaMujeres: 0 a 15 mm a la hora

Gráfica de Wintrobe y Landeberg para “corregir” la Velocidad de Sedimentación cuando existe Anemia óPolicitemia.  La  V.  S.  tiende  a  ser  más  rapida  en  la  anemia  intensa,  y  disminuir  en  la  Policitemia.  Enpresencia  de  una  de  estas  anomalias  debe  hacerse  la  “corrección”  de  los  resultados  obtenidos  con  lagráfica diseñada por el mismo Wintrobe. Se corrgirá  la VS. en función del Hematocrito del paciente.

Valores Referenciales de Glóbulos Rojos:Recién Nacidos: 6 000.000 pmm3Niños: 4 000.000 a 5 500.000 pmm3Hombres adultos: 4 500.000 a 6 000.000 pmm3Mujeres adultas: 5 200.000 a 5 400.000 pmm3

HEMOSTASIA Y COAGULACIÓN DE LA  SANGRE

HEMOSTASIA:  significa  prevención  de  la  pérdida  de  sangre.  Cuando  se  lesiona  o  rompe  un  vaso  lahemostasia   se   consigue  mediante:

A) ESPASMO o CONSTRICCION VASCULARB) FORMACION DE UN TAPON PLAQUETARIOC) COAGULACION SANGUINEA: FORMACION DE UN COAGULO DE FIBRINA

DEBIDO A LA COAGULACION DE LA SANGRED)   PROLIFERACIÓN FINAL DE TEJIDO FIBROSO DENTRO DEL COÁGULO SANGUÍNEO

PARA CERRAR DE FORMA DEFINITIVA EL AGUJERO DEL VASO.

A)   ESPASMO O CONSTRICCION VASCULAR: Ante un corte o lesión de un vaso inmediatamentese  produce  el  espasmo  vascular  que  es  el  resultado  de  un  reflejo  miógeno  local  y  factores  humoraleslocales  de  los  tejidos  traumatizados  y  de  las  plaquetas.  Los  reflejos  nerviosos  se  inician  por  impulsosdolorosos o de otro tipo originados en el vaso traumatizado o en los tejidos vecinos. La lesión directa de lapared  vascular  genera  la  contracción  miógena  refleja  de  la  pared  vascular  además  la  adrenalina  ejerceacción vasoconstrictora.En los vasos de menor calibre las plaquetas se acupan de la mayor parte de la vasoconstricción al liberar elvasoconstrictor Tromboxano A2.Cuanto  mayor es el vaso sanguíneo  mayor es el grado de espasmo, que en algunos casos puede impediruna pérdida mortal de sangre.

B)  FORMACION DE UN TAPON PLAQUETARIO:  Ante un vaso  dañado  las  plaquetas se hinchan,emiten pseudópodos y hacen pegajosas y se adhieren fuertemente al tejido colágeno expuesto y se unen alFactor von Villebrandt, aumenta el ADP y se forma Tromboxano A2.ADP Y Tromboxano activan las plaquetas y aumentan su "Adherencia" y se van "Agregando" en el sitiolesionado y se forma el "Tapón plaquetario".

C)  COAGULACION  SANGUINEA:  Formación  del  coágulo  de  fibrina  debido  a  la  coagulación  de  lasangre:

Teoría   básica: En la sangre hay sustancias que favorecen la coagulación:PROCOAGULANTESy sustancias que la inhiben: ANTICOAGULANTES.La coagulación de la sangre depende del equilibrio entre estos dos grupos de sustancias.En  el  torrente  sanguíneo  normalmente  predominan  los  anticoagulantes  de  forma  que  la  sangre  no  secoagula  mientras  esté  circulando  en  los  vasos.  Sin  embargo  cuando  se  rompe  un  vaso,  se  "activan"  losProcoagulantes del área de la lesión tisular y anulan a los anticoagulantes, con lo que se forma el coágulo.

MECANISMO GENERAL DE LA   COAGULACION    Ó CASCADA de la Coagulación.

La Coagulación se realiza en TRES ETAPAS:1.- Formación del Complejo Activador de la Protrombina2.-   Conversión   de   la   Protrombina   en   Trombina   (conversión   catalizada   por   el   Activador   de   la

Protrombina).3.- Conversión del Fibrinógeno en Fibrina (conversión catalizada por la Protrombina).

Los mecanismos de la coagulación   se      ponen      en      funcionamiento      por:   1.- Traumatismo pared vascular o tejidos adyacentes (endotelio)2.- Traumatismo de la sangre3.- Contacto de la sangre con las células endoteliales dañadas ó con colágeno y otros elementos

titulares en el exterior del vaso sanguíneo.

En todos los casos LO PRIMERO QUE SE FORMA ES EL "ACTIVADOR   DE   LA PROTROMBINA"  que  transforma  la  Protrombina  en  Trombina  e  inicia  los  pasos  posteriores  de  laCoagulación (Vía final común).Se considera que el   "Activador      de      la      Protrombina"      se      forma      por      las      dos      Vías,     aunque en realidad las dosvías interactúan constantemente:

LA   VÍA   EXTRÍNSECA:  Comienza con el traumatismo de la pared vascular y de los tejidos subyacentes

(lesión tisular) o un tejido extravascular sufre un traumatismo y entra en contacto con la sangre circulante.La   célula   endotelial   vascular   dañada   libera   un   Factor   Tisular   llamado   Tromboplastina   Tisular   III,fosfolípidos y un complejo lipoproteico y se desata así la vía Extrínseca. Así pues, el tejido lesionado haliberado esta serie de sustancias o complejo de factores (FACTOR TISULAR O  TROMBOPLASTINAIII  TISULAR)  que  trabaja  como  una  verdadera  enzima  activando  al      Factor      VII     -----  VIIa.  y  éste  enpresencia  del  Ca++  activan  al  Factor  X  ----  Xa,  éste  a  su  vez  activa  al  V  -----  Va  el  cual  genera  elCOMPLEJO ACTIVADOR DE LA PROTROMBINA. (Observar las retroalimentaciones enzimáticas enel cuadro de la cascada). Luego Fribrinógeno ---- Fribrina coágulo.

VÍA   INTRÍNSECA:  Comienza con el traumatismo de la propia sangre o con la exposición de la sangre alpropio  tejido  colágeno  expuesto  por  el  traumatismo  del  vaso  sanguíneo  lesionado,  hay  contacto  de  lasangre con epitelios distintos del vascular normal: Se Activa el Factor XII --- XIIa y se liberan fosfolípidosplaquetarios  que   contiene   el   Factor   Plaquetario  3.   Luego   se   activa   el   XI   ---  XIa   en  presencia   deCininógeno. Se activa luego el IX…..IXa, y el IXa junto con el VIII…..VIIIa activan al X ----- Xa.El Xa junto con el V y factores tisulares generan el COMPLEJO ACTIVADOR DE LAPROTROMBINA.  Y  sigue  luego  la  vía  final  común  de  conversión  de  la  Protrombina  en  Trombina  yFibrinógeno en Fibrina y el coágulo es consolidado por el factor XIII.

Nota:  El  Calcio  acelera  todas  las  reacciones  de  la  coagulación  excepto  en  los  primerospasos de la vía intrínseca. Por lo tanto en AUSENCIA de iones de calcio la sangre      no      se   coagulará por ninguna de las dos vías.

EVALUACION DE LA HEMOSTASIAY LA COAGULACION DE LA SANGRE

TIEMPO DE COAGULACIÓN

Se denomina así al tiempo que transcurre desde que la sangre es extraída hasta que pasa al estado  de gel.Esta prueba mide el tiempo tomado por la sangre para coagular en ausencia de factores provenientes de lostejidos (factor tisular). El trauma que significa la obtención de sangre venosa marca el inicio, y el intervalode   tiempo   entre   la   obtención  de   la   muestra   y   su   coagulación   es   lo   que   se   denomina   Tiempo   deCoagulación.  Esta  es  en  términos  generales  una      prueba      grosera     de  la  coagulación.  Sirve  para  detectargroseramente  alteraciones  de  la  coagulación  que  puedan  alargarla.  La  prolongación  del  Tiempo  deCoagulación puede deberse a varias causas;:

1.- Disminución de la Tromboplastina,2.- Disminución de la Protrombina,3.- Disminución del Fibriógeno ó4.- A la presencia en la sangre de algún anticoagulante.

METODO DE LEE – WHITEReactivos y Aparatos:Tubos de prueba de 8 mm diámetro, limpios y secosAgujas y jeringas para uso endovenosos descartables, estériles.Baño maría 37 °CReloj cronómetroProcedimiento:Obtener 3 ml de sangre venosa, anotando la hora exactamente (Para controlar el tiempo de inicio)Inmediatamente transferir 1.5 ml de sangre a cada uno de dos tubos y colocarlos en Baño María a 37°C.Luego de tres min. de reposo ir sacando cada uno de los tubos e ir inclinándolos suavemente en 90° cadaminuto, hasta que no se observe desplazamiento de sangre y pueda ser completamente invertido el tubo sincaerse la sangre. Anotar el tiempo.Valores referenciales:Con este método de Lee White los valores normales para hombres y mujeres varía entre: 5 a 8 min.Los valores referenciales dependen del diámetro del tubo empleado:

Usando tubos de diámetro interno de 11 mm: 9 a 15 min.Usando tubos de diámetro interno de 8 mm: 6 a 10 min.

Existen otros métodos para determinar el tiempo de Coagulación por ejemplo el método del portaobjetos:Valor normal de 2 a 8 minutos.Método del Tubo Capilar: Valor referencial de 3 a 7 min.

Tiempo de SangríaEl tiempo de sangría depende de la elasticidad de la pared vasos sanguíneos y de la cantidad y capacidadfuncional de las plaquetas.El  tiempo  de  sangría  es  el  tiempo  transcurrido  desde  el  momento  en  que  se  hace  una  punción  standardprofunda en la oreja o en el pulpejo del dedo y aquél en que la sangre deja de brotar de la herida.METODO DE DUKEReactivos y Aparatos:Cronómetro, lancetas descartables, desinfectante de  piel, papel de filtro.Procedimiento:Desinfectar  la  yema  de  un  dedo  (anular)  ó  el  lóbulo  de  una  oreja  y  punzar  con  la  lanceta  descartablestandard de manera que la sangre fluya libremente, gota a gota, sin necesidad de exprimir la piel. Anotar eltiempo  de  aparición  de  la  primera  gota  y,  luego  con  el  papel  de  filtro  ir  secando  cada  gota,  cada  30segundos   sin      tocar      la      piel   , hasta que deje de sangrar. Anotar el tiempo transcurrido.Valores Referenciales:1 a 3 MINUTOS.

Soluplastin pre incubado 37°C( incluye calcio) ml

0,2

Plasma pre incubado 37°C  ml

Simultáneamente,de inmediato iniciar cronómetro

0.1  y ! cronómetro!!

Simultáneo

Mezclar y esperar coágulo y   de      inmediato      frenar      cronómetro   Anotar tiempo en segundos.

TIEMPO DE PROTROMBINA Y TIEMPO DETROMBOPLASTINA PARCIAL

En la presente práctica evaluaremos las dos vías de la coagulación por separado:

Primero   determinaremos   la   VÍA   EXTRÍNSECA   de   forma   global   mediante   la   determinación   del

Tiempo de Protrombina  o  Tiempo  de  Quick,  que  determina  los  factores  involucrados  en  esta  víacomo son: Factor VII llamado Proconvertina, el Factor II ó Protrombina, el Factor V ó Proacelerina y elFactor  X  llamado  Factor  de  Stuart-Prower.  Cualquier  alteración  de  estos  factores  será  detectado  por  ladeterminación  del  Tiempo  de  Quick.  Esta  prueba  no  detecta   deficiencias  en  los  factores  de  la  víaintrínseca (VIII, IX, XI, XII).Para el TP usaremos un exceso de Tromboplastina Tisular o Factor III (de cerebro) y calcio. Puede usarseSimplastin de Warner Chilcota.   El      método      que      emplearemos      para      TP      es      el      de      la      Casa      Wiener      que      se   llama   Soluplastín  y que es una Tromboplastina tisular (de cerebro) de alta calidad e incluye cloruro decalcio y cloruro de sodio.Materiales:Soluplastin (Tromboplastina cálcica) Casa WienerLab. (Rosario.  Argentina)Tubos de ensayo de vidrio de 12 x 75 mm.CronómetroBaño María 37 °CAsa de alambre Níquel Cromo Nuevas (Bacteriológicas)Micropipetas 100 y 200 lambdas.

Muestra de plasma sanguíneo:En un tubo de ensayo contendiendo

0.5 mI de anticoagulante citrato trisódico 3.8 % u oxalato de sodioañadir

4.5 ml de sangre venosaMezclar suavemente, centrifugar y separar el plasma.

Procedimiento   para   TP: Usar tubos de 13 x 100 mm:

Pre incubar el plasma: en un tubo de ensayo,  marcado (Px) colocar 1 ml del plasma en BM 37 °C, por 3min. (El saldo del plasma refrigerarlo). (No pre incubar mas de 10 min.)

Pre  incubar  el  Soluplastin:  en  otros  dos  tubos  de  ensayo  colocar  0.2  ml  de  Soluplastin  en  cada  uno  ycolocar en BM a 37 °C por 3 min. (No pre incubar mas de 10 min.).

Pipetear  100  lambdas  del  plasma  Pre  incubado  y  añadir  rápidamente  al  tubo  conteniendo  los  0.2  ml  deSoluplastin, disparando simultáneamente el cronómetro.

Mantener  el  tubo  dentro  del  Baño  María  cerca  de  una  fuente  de  luz.  Previo  al  tiempo  estimado  decoagulación sacar  el  tubo  del  baño  e inclinar  suavemente  por una o  dos veces por segundo  y detener  el

cronómetro en el momento exacto de la aparición del coágulo, que se manifestara por la aparición de muydiscretos hilos de fibrina, en ese instante precisamente para el cronómetro.Repetir por triplicado esta prueba. Calcular el valor promedio en segundos.

Valores Referenciales:11- 12 sgs. + - 2 segs del control NormalEl control Normal estará entre 10 a 13 segundos +- 0.5 2DS.Con estos valores en segundos  a través de una curva de calibración podemos expresarlos en porcentaje deactividad protrombinica en relación a los valores normales: examinemos el siguiente cuadro que muestralos valores porcentuales:

El  tiempo  de  Protrombina  se  encuentra  alargado  por  defectos  de  Factor  I   (Fibrinógeno),  Factor  H(Protrombina), Factor V (Proacelerina ó F. Lábil), Factor VII (Factor Estable ó Proconvertina), y Factor X(Factor Stuart-Prower).El TP se encuentra prolongado en pacientes con dieta deficitaria en Vit K,  infantes prematuros,  infantesrecién  nacidos  de  madres  que  están  con  deficits  de  Vit  K  (es  la  enfermedad  hemorrágica  del  reciénnacido).En la mala absorción de las grasas, ictericia obstructiva, diarrea crónica, etc.El TP está prolongado también en el daño hepático severo (envenenamientos, hepatitis, cirrosis).Por Drogas (tipo coumarínico de la terapia anticoagulante)Presencia de anticoagulantes circulantes, hipofibrinogenemia adquirida o hereditaria.

En resumen, debo decirles que el Tiempo de Protrombina es primariamente usado con TRES fines:1.-  Para  la  evaluación  de  los  desórdenes  de  la  Coagulación:  para  investigar  la  anormalidad  de  los

factores  involucrados  en  la  vía  Extrínseca  V,  VII,  X,  Protrombina  y  Fibrinógeno.  Y  debe  serusada junto con el tiempo de Tromboplastina Parcial Activada.

2.-   Para   controlar   la   terapia   anticoagulante   oral   a   largo   plazo   con   coumadinas   y   derivadosindanedionas.

3.- Evaluación de la función hepática: el test del Tiempo de Protrombina es uno de los mas útiles paraevaluar la capacidad del hígado en la síntesis de los factores del complejo Protrombínico: II, VII,yX  .

Tiempo Protrombina

en segundos

Actividad Protrombínica

Valores porcentualesRespecto de lo Normal

11 - 12.5 100  %

13.5 60     %

15 50     %

17 40

19.5 30

22 25

24 – 36 20

37 – 40 10

55 – 65 5

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADO.(TTPA  Ó  APTT Ó PTT).

El TTPA es un método de investigación de la   VÍA      INTRÍNSECA    de forma global XII, XI, IX, X, VIII, V,II y I. En esta prueba APPT se usa un activador específico de la Vía Intrínseca (del Factor XII) y es unFosfolípido  CEFALINA  activado  con  caolín  ó  sílice  micronizado.   El  test  de  TTPA  consiste  en  larecalcificación  del  plasma  en  presencia  de  un  exceso  de  cefalina  fosfolípido,  (que  es  un  sustituto  de  lasplaquetas   y   factor   plaquetario)   preparado   a   partir  de   cerebro   de   conejo   y  de   un  activador   Kaolíntamponado. Esta prueba usa este activador específico de la vía intrínseca que es el  Factor plaquetario  -3sustituido  por  la  cefalina  fosfolípido  de  cerebro  de  conejo  y  que  tiene  además  un  activador  kaolín  enfinísimas partículas ó sílice micronizado (activador para el Factor XII) de la vía intrínseca solamente y untampon  de   piperazida   estanolsulfónico.   Además  este  reactivo   tiene   una   especial   reactividad   con  lapresencia de heparina lo cual lo hace especial para el monitoreo de la terapéutica con heparina.Emplearemos en esta practica el método de la casa WIENER LAB. Que usa cefalina fosfolípido y que sellama reactivo APTTEST

METODO DE CASA WIENER LAB.PTT   Ó   APT   TEST

A. REACTIVOS:   Cloruro de calcio, listo para usar (0.0125 mol/l y ClNa 0.1 mol/l)B. Reactivo de APTT: al vial del liofilizado, añadir el volumen de agua indicado  en el rasco

que   es   2.5   cc   de   agua   destilada,   tapar   y   mezclar   suave   por   inversión,   queda   así   listo   elhomogenizado.

C. Obtencipón de la muestra de sangre:A 4.5  cc  de  sangre  venosa  añadirle  0.5  cc  del  anticoagulante  oxlato  de  sodio.  Centrifugar  paraseparar el plasma.

D. Distribuir  los  reactivos  en  la  lsiguiente  forma  utilizando  tubos  de  vidrios  de  12  x  75  mm  dediámetro o 13 x 100 ml:

Mezclar e incubar por 3 minutos cada uno de los tubos a 37°C.

Al tubo N° 1 añadirle solución de cloruro de calcio pre incubado a 37 °C …. 100 ul.Inmediatamente  disparar  el  cronometro,  agitar  suavemente  y  mantenerlo  en  el  baño  maría  por  25segundos  solamente  y  luego  retirarlo  para  observar  la  formación  del  coagulo,  que  se  manifestara  por  laaparición   de   filamentos   de   fibrina   inmediatamente   detener   el   cronómetro,   este   es   el   tiempo   deTromboplastina Parcial, valores normales de 33 a 48 segundos.Al  tubo  N°2  que  es  el  control  normal  le  añadiremos  luego  Cloruro  de  calcio  100  ul  y  procederemosexactamente igual que el caso anterior y servirá como control normal, cuyos valores normales van desde33 a 48 segundos.

También  podemos  emplear  los  reactivos  de  cefalina  con  caolín  de  la  casa  francesa  que  vemos  acontinuación.Equipos, reactivos y materiales .-(idem que TP).-

TUBO 1 TUBO 2

Plasma desconocido 100 ul (LAMBDAS)

PLASMA                 CONTROLNORMAL O ESTANDAR

100 ul (LAMBDAS)

REACTIVO        DE        APTT(HOMOGENIZADO)

100 ul (LAMBDAS) 100 ul (LAMBDAS)

Procedimiento para APTT:Emplearemos CK Prest™ activado (Cefalina con Kaolin) (APTT) (Diagnostica Stago-Francia).

Reactivo N° 1: CefalinaReactivo N° 2: Kaolín tamponado :

Agitar el contenido del frasco N°2 y transferido completamente dentro del frasco N°1. Dejarque repose 30 min. para embeber el gel. Y después de la imbibición, agitar

suave y circunferencialmente para homogenizar la mixtura.

Solución de Cloruro de calcio  (C12Ca): 0.025 MCl2 Ca anh ……………………..1.38  gmAgua destil  ……………………………..500  ml

Pipetas automáticas de 100 lambdas

En un tubo ensayo 13 x 100mm que está previamente en el BM a 37 °C colocar:

Los valores referenciales varían de 30 a 45 segundos y deben reportarse  en relación a un control normalCuando el Tiempo Tromboplastina Parcial está prolongado, pero el Tiempo de Protrombina es Normal nosindica   un   a   alteración   de   alguno   de   los   factores   de   la   vía   intrínseca   de   tipo   congénito:   VIII,   IX(Hemofilias),  XI,  XII.  Si  todos  estos  factores  están  normales,  puede  haber  una  deficiencia  de  HMWKkininógeno  (Factor  Fritgerald).  También  se  encuentra  alargado  el  APPT  en  deficiencias  adquiridas  ócondiciones   anormales   como:   Enfermedades   hepáticas,   Coagulopatía   por   consumo,   anticoagulantescirculantes, en la terapia anticoagulante oral, o en la heparización. Ó en el tratamiento con inhibidores dela trombina como hirudina, argatroban., etc

Vía Intrínseca Vía Extrínseca

XII

Pre K

HMWK

FACTOR

TISULAR

Tiempo

Plasma paciente 0.1     ml

Plasma paciente duplicado 0.1      ml

Plasma paciente triplicado ó Control Normal 0.1      ml

React 1 Cefalina Bien Reconstituidoy resuspendido

0.1      ml

Mezclar y pre incubar 37°CExacto

3 minutos

Simultáneamente: Añadir Cl2Ca 0.025Mprecalentado e INICIAR CRONOMETRO

0.1         ml

Mezclar y esperar coágulo. Parar cronómetroinmediatamente   que   aparezca   el   coágulo

Anotar tiempo en segundos EXACTO

Protrombina

XIVII Tromboplastinas

Tisulares:SimplastinSoluplastin

IX

VIII

VÍA FINALCOMUN

XV

PF -3

Protrombina

Fibrionógeno

Trombina

Fibrina

XIII

Referencias Bibliográficas:Clinical  Hematology Wintrobe. EJ. Lea Feboger. Phila. London. 1998Technical Hematology Simmons. Lippincott. 1999.Laboratory   Methods by J. B. Henry.  Saunders  Co. 1999.The Principles and Practice of Blodd Grouping Addine G Mosby Co 1993Fisiología Médica W Ganong El Manual Moderno 2002An  Introduction to Inmunohematology  N Bryant W B Saunders Co. Pfila. London 1997

GRUPOS SANGUÍNEOS Y FACTOR  RH

Introducción:En 1900, Landsteiner descubrió que el suero de algunas personas aglutinaba los glóbulos rojos de otras yque  éste  fenómeno  podría  ser  usado  para  clasificar  a  las  personas  en  diferentes  fenotipos  de  grupossanguíneos. Se reconocen 4 fenotipos cimunes: O, A, B, y AB. También se han identificado  antígenos delos subgrupos del tipo A y B.Cada  tipo  de  glóbulo  rojo  transporta  un      Antígeno     determinado,  específico,  que  le  es  característico.  Elplasma de las personas tiene Aglutininas Naturales ó Anticuerpos diferentes al de su propio grupo, así porejemplo las personas del Grupo A tienen aglutininas Anti B. El plasma de las personas del Grupo B tieneAglutininas (Anticuerpos naturales) Anti A. El plasma de las personas del Grupo O tiene un título bajo deAglutininas Anti A y Anti B. (Es muy importante saber que algunas personas del Grupo O pueden tenerun título elevado de aglutinininas Anti A y Anti B y ser donantes peligrosos).Es   absolutamente   necesario   y   obligatorio   hacer   siempre   una   prueba   compatibilidad   mayor   y   menor   entre   el Donante   y   el   Receptor   antes   de   realizar   una   transfusión   de   sangre   cualquier   sea   el   tipo   de   sangre   y/o   Rh. El fenotipo ABO de una persona es determinado mediante reacciones de aglutinación de los hematíes con

antisueros monoclonales Anti A, Anti B, Anti AB y antisueros de los Subgrupos correspondientes.

Determinación del Grupo Sanguíneo:Este  procedimiento  se  basa   en  la  aglutinación  de  los  glóbulos  rojos  (que  transportan  un  Antígenoespecífico), que se produce cuando está en presencia de su correspondiente anticuerpo específico.Los   reactivos   usados   para   la   tipificación   de   los   grupos   del   Sistema   ABO   contienen   anticuerposmonoclonales IgM. Estos reactivos producirán aglutinación directa de los glóbulos rojos que transporten elantígeno específico correspondiente. La determinación del grupo sanguíneo puede hacerse por el métododel tubo de ensayo ó por el método en lámina portaobjeto.

MÉTODO EN LÁMINA PORTAOBJETO:

Materiales y Reactivos:Suero monoclonal Anti ASuero monoclonal Anti BSuero monoclonal Anti ABLámina excavada o lámina portaobjetosLancetas descartablesMuestra de sangreAlgodón y desinfectante

Procedimiento para Determinar el Grupo Sanguíneo1.-  Dividir  una  lamina  portaobjetos  en  3  secciones:  izquierda,  central  y  derecha  con  lápiz  de  ceramarcador.La muestra de sangre puede obtenerse de la yema del dedo o por venipuntura.Colocar una gota suero Anti A en el lado izquierdo y una gota del suero Anti B en el centro y una gota delsuero Anti – AB en la derecha de una lámina de vidrio plana.Colocar  una  gota  de  sangre  al  lado  de  cada  una  de  las  gotas  del  antisuero  correspondiente  sin  tocar  losreactivos  !!,  para  evitar  contaminación  cruzada,  y luego  mezclar  bien  usando  aplicadores  o  baguetasdistintas.

2.-  Hacer  girar  el  porta  objetos  con  la   mano   y  observar  si  existe   aglutinación macroscópica.  Laaglutinación  se  producirá  en  unos  pocos  segundos.  La  lectura  deberá  hacerse  antes  de  que  se  seque  lamezcla. El tiempo máximo habitual es de tres minutos.

INTERPRETACION DE LAS PRUEBAS CON ERITROCITOSEN LA DETERMINACION DEL GRUPO SANGUÍNEO

Grupo Sanguineo Suero Anti-A

Suero Anti-B

Suero Anti- AB

O - - -

A + - +

B - + +

AB + + +

+ : Indica aglutinación macroscópica- : Indica que no hay aglutinación

------------------------------

FACTOR RHO (D)Aparte de los Antígenos del sistema ABO, existe otro que es el sistema de Antigenos del Rh que son degran importancia fisiológica y clínica.El Factor Rh (Aglutinógeno o Antígeno) llamado así por que fue estudiado por primera vez en los monosdel género Rhesius, es en realidad, un sistema compuesto por mucho Antígenos: Ver Tabla

Fisher-Race WienerDce RhoDCe Rh1

DcE Rh2Dce rh (hr’)

dCe rh’dcE rh”

dCE Rhy

DCE Rhz

El  factor  D,  es  con  mucho,  el  más  antigénico  y  el  término  “Rh  Positivo”,  como  generalmente  se  usa,significa que el individuo tiene Aglutinógeno D.El individuo  Rh Negativo  no  tiene antígeno  D  y solo   forma la aglutinina Anti D cuando  se le inyectancélulas D positivas. El suero que se emplea rutinariamente para tipificar el Rh es un suero Anti D.El 85% de los caucásicos son Rh Positivos y el 15% restante  Rh Negativos. Las personas Rh negativas (DNegativas)   que   reciben   una   transfusión   de   sangre   Rh   Positiva   (aún   muchos   años   antes)   formanAnticuerpos Anti  Rh  y tienen  títulos  Anti  D apreciables  y dan reacciones transfusionales graves cuandoreciben una transfusión de sangre Rh (D) Positiva.Igualmente  sucede  cuando  una  madre  Rh  (D)  Negativa  concibe  un  hijo  D  positivo,  porque  pequeñascantidades  de  sangre  del  feto  se  filtran  a  la  circulación  materna  en  el  momento  del  parto  y  desarrollantítulos elevados de aglutininas Anti Rh durante el post parto.   Durante      el      embarazo      siguiente    las aglutininasdesarrolladas  contra  el  antígeno  RH  cruzan  la  placenta  y  llegan  al  feto  que  ha  heredado  el  antígeno  Rhpositivo del padre y se produce la reacción Antígeno-anticuerpo que produce hemólisis y la EnfermedadHemolítica del Recién Nacido (Eristroblastosis Fetal).

DETERMINACIÓN DEL FACTOR Rh.Materiales y Reactivos:Reactivo Antisuero Monoclonado Anti -  Rho  (Anti D)Lámina portaobjetoVarillas de vidrio ó aplicadoresLancetas descartablesDesinfectante y AlgodónLápiz de cera marcador.

Procedimiento:En una lámina portaobjetos se colocan 2 gotas de la sangre problema.Al costado de las gotas de sangre colocar una gota del Reactivo Suero Anti Rh. Mezclar bien. Observarinmediatamente para ver si existe o no aglutinación.

INTERPRETACIÓN:Sangre total paciente  + RESULTADOSuero Anti- Rh (D)

AGLUTINACIÓN Rh (D) POSITIVO

NO AGLUTINACIÓN Rh (D) NEGATIVO

INVESTIGACIÓN DE LA SENSIBILIZACIÓN DE LOS HEMATÍESCuando algún   anticuerpo    (por ej. Garnmaglobulina - IgG) se fija y recubre al   glóbulo      rojo    se dice que eleritrocito está   sensibilizado   . Los eritrocitos pueden sensibilizarse in vivo, y esto ocurre por ejemplo en laEritroblastosis   Fetal   (EF) ,  que  es  una  enfermedad  del  Feto  y  del  Recién  nacido  y  se  caracteriza  poraglutinación  y  fagocitosis  de  los  eritrocitos  del  feto,  que  se  produce  cuando  una  madre  siendo  RhNegativa y el esposo Rh Positivo, concibe un niño Rh positivo.El niño hereda el Rh Positivo del padre. Durante el embarazo la madre desarrolla Aglutininas Anti  - Rhpor la exposición al antígeno (Aglutinógeno Rh) del niño. A su vez, éstas aglutininas Anti Rh de la madredifunden por la placenta al feto y recubren los glóbulos rojos del feto. Los hematíes del niño están ahorasensibilizados  y  esto  produce  la  aglutinación  y  lisis  de  los  hematíes  del  propio  hijo.  Durante  el  primerembarazo puede no producirse daño, pero durante el segundo embarazo el 3 % presentarán E F; durante eltercer embarazo el 10 % presentarán EF, y así va aumentando la incidencia.

Se puede investigar la presencia de estos anticuerpos (IgG- anti Rh) que recubren a los hematíes del niñomediante el   Test      de      Coombs      Directo    (test de Antiglobulina directo) y que es el objeto de la presentepráctica.

TEST DE COOMBS DIRECTO:Esta Prueba se realiza en los hematíes del paciente.FundamentoEsta  prueba  se  fundamenta  en  la  aglutinación  de  los  eritrocitos  humanos  sensibilizados  por  anticuerposgamma-globulínicos que se produce cuando  se les coloca en presencia de un suero  antihumano  gamma-globulínico  preparado  en  conejos.  Este  suero  antiglobulínico  puede  ser  específico  para globulina  IgG,  ótambién puede ser un preparado monoclonalmente obtenido.Esta  Prueba  DIRECTAMENTE  demuestra  la  sensibilización  de  los  eritrocitos  que  se  ha  producido  invivo.Materiales y Reactivos:Centrífuga Clínica y Microscopio BinocularSuero Antiglobulínico de Coombs (Gamma IgG) (Monoclonal)Hematíes del paciente (Niño)Solución Salina 0.85 % Tubos de prueba de vidrio 13 x l00 mm y 12 x 75 mm; algodón, desinfectante depiel (Alcohol iodado), ligadura venosa, aguja y jeringas descartables. Varillas de vidrio ó mondadientes deplástico, pipetas Pasteur.

MUESTRAS YREACTIVOS

TUBO A TUBO B

Suero del PacienteReceptor

2 gotas 2 gotas

Hematíes del DadorSuspensión al 2 %

En salina

2 gotas 2 gotas

Albúmina Bovina22%

---------- 2 gotas

Centrifugar (serofugaa 1000 rpm) 1 minuto

sí sí

Procedimiento:Lavado   previo  de los glóbulos rojos:1.- Medir aproximadamente 0.4 ml de sangre y colocar en el fondo de un tubo de prueba de 13 x 100 mm,añadir luego 6 ml de solución salina 0.85 %. Mezclar suavemente por inversión.2.- Centrifugar a 3400 rpm. Por 30 segundos hasta que las células se empaqueten al fondo del tubo.3.- Decantar la solución salina completamente, limpiando la boca del tubo con papel servilleta.4.-      Repetir      el      lavado      dos      veces      mas   ,  añadiendo  una  pequeña  cantidad  de  solución  salina  al  comienzo  ymezclar para suspender bien los eritrocitos; y luego añadir una mayor cantidad de solución salina lavandohacia  abajo  la  pared  interna  del  tubo  de  prueba.  Después  del  tercer  lavado  el  sobrenadante  debe  estarcompletamente limpio de sangre, absolutamente límpido y transparente.5.- Ahora, calcular (aproximadamente) el volumen de los glóbulos rojos lavados, anotar este volumen, yañadir una cantidad de solución salina como para hacer una   suspensión      de      glóbulos      al      2%   6.-   En      otro      tubo      de      prueba      colocar      2     gotas      de      esta      suspensión      al      2     %      y     añadir      1     gota      de      1     suero      de   Coombs. 7.- Centrifugar a 5000 rpm. durante 15 segundos.8.- Muy suavemente, con gran cuidado, percuta con un dedo el fondo del tubo, lo suficiente para dislocarel fondo celular y observar la aglutinación tanto macroscópica como microscópicamente con objetivo enseco a 40 X.

Resultado:La   presencia      de      aglutinación    indica una Prueba de Coombs Directa POSITIVA, demostrando que loseritrocitos están sensibilizados.Ausencia de Aglutinación: Test de Coombs Directo: NEGATIVO.

Interpretación:Esta Prueba Coombs Directa es POSITIVA en los casos de:Eritroblastosis Fetal ,Anemias Hemolíticas Autoinmunes  y sirve también para el diagnóstico de

reacciones transfusionales debido a Incompatibilidad sanguínea.

TEST DE COOMBS INDIRECTODetecta los anticuerpos presentes en el suero del paciente (madre) y para ello deben sensibilizarse primero

in vitro algunos glóbulos rojos de otra persona de grupo conocido (Tipo O por ejemplo) y luego de habersensibilizado  los  glóbulos  rojos  escogidos  se  les  aplica  el  Coombs  Directo.  Para  sensibilizar  a  los  paraglóbulos  rojos  seleccionados (conocidos)  se  debe  primero  incubar  el  suero  del  paciente  (madre)  con  loseritrocitos seleccionados (grupo O por ejemplo) para que las células se sensibilicen (es decir, se recubrancon el anticuerpo sérico) si es que está presente, y, después averiguar si están sensibilizadas  aplicándolesel test de Coombs Directo, tal como hemos descrito líneas arriba..

TEST DE COMPATIBILIDAD CRUZADA

EXAMINAR ambos tubos por aglutinación ó hemólisis.Luego INCUBAR ambos tubos A y B, en BM a 37 °C por 15 minutosCENTRIFUGAR por 1 minuto a 1000 RPM.   Lectura      del      tubo      B    por aglutinación ó hemólisis.

Luego CONTINUAR con el tubo "A": Tres lavados en sol salina 0.9 %Añadir suero de Coombs 2 gotasCentrifugar a 1000 rpm  durante  1 minLectura por aglutinación ó hemólisis

Interpretación   de   Anticuerpos: TUBO "A": detecta incompatibilidad hacia:   Sistema      ABO    , MN, P, LewisTUBO "B": detecta incompatibilidad: Antic. Rh,  Duffy,  Kidd,  Cellano y  Antic.calientes.

PRÁCTICA SOBRE LA FISOLOGÍA DEL APARATO INMUNE

FUNDAMENTOS.-La  definición  contemporánea  del  término  inmunidad  incluye  todos  aquellos  mecanismos  que  le  dan  alanimal la capacidad de reconocer tanto los materiales extraños  a su  propio organismo para neutralizarlos,eliminarlos o metabolizarlos sin injuria a sus propios tejidos.Las respuestas inmunes pueden ser clasificadas en dos categorías:

a)   Respuestas inmunológicas específicas:Estas respuestas dependen de la exposición a una partícula o sustancia de configuración extraña,el subsecuente reconocimiento y la reacción hacia ella.

b) Respuestas inmunológicas no específicas:Se  producen  siguiendo  a  una  exposición  inicial  y  subsiguiente  exposición  a  una  configuraciónextraña.La   selección   en   diferenciar   lo   propio   de   lo   no   propio   no   depende   de   un   reconocimientoespecífico.

En la actualidad se consideran que las respuestas inmunológicas sirven a tres funciones:Defensa, sostenimiento de la homeostasis celular y vigilancia celular.

Función Naturaleza        delestímuloInmunológico

Ejemplo AberracionesHiper                                   Hipo

Defensa Exógeno MicroorganismosPolen

Alergia Deficienciainmune

Homeostasiscelular

EndógenaExógena

Remoción      de      célulasviejas o dañadas

Enfermedadautoinmune:Formación   de   autoanticuerposArtritisreumatoidea, lupus.

Vigilanciacelular

EndógenaExógena

Remoción      de      célulasmutantes.

Enfermedadmaligna

FILOGENIA   DE   LA   INMUNIDAD   NO   ESPECÍFICA.-

En los animales más primitivos, como en los unicelulares,  el mecanismo de resistencia es la fagocitosis lacual es esencialmente una función nutritiva: y en las formas evolutivas más elevadas involucra también unmecanismo      defensivo   .  A  medida  que  evolucionan  a  formas  más  complejas  aprenden  a  reconocer  loscuerpos  extraños.  En los  invertebrados  superiores  se  desarrollan  un  sistema  vascular  en  el  cual  lafagocitosis  se  desarrolla  además  por  medio  de  células  circulantes  y  en  el  ser  humano  por  fin  hay  cincocélulas circulantes (leucocitos), tres de los cuales son fagocitarias o fagocíticas (monolitos, polinucleares yeosinófilos).  Entonces  filogenéticamente  los  elementos  no  específicos  más  importantes,  fagocitosis  yrespuesta inmunitaria vienen desde la formamás  primitiva  de  vida.  Con  la  evolución,  estos  mecanismos  persistieron  y  fueron  suplementados  eimplementados por la adición de nuevos componentes  tales como lainmunidad  específica  y  los  sistemas  de  amplificación  de  esta  inmunidad,  por  ejemplo  el  complemento,coagulación, etc. Entonces, pues, en resumen, estos mecanismos antiguos no fueron reemplazados por laevolución de las especies   sino que   más bien continuaron y fueron reforzados adicionalmente con nuevasrespuestas (amplificadoras).

FILOGENIA   DE   LA   INMUNIDAD   ESPECÍFICA .-

La primera evidencia de la inmunidad específica apareció en los vertebrados primitivos   que presentan unsistema  linfoide  diseminado  (elasmobránquios)  que  generan  inmunoglobulinas  M.  posteriormente  en  los

Ig Función Estructura Cadenapesada

CadenaAdicional

ConcentraciónPlasmáticamg/dl

Ig G Fijación delComplemento

Monomérica Gama 1gama2Gama 3gama 4

700 - 1600

Ig A(secretora)

ProtecciónMucosas –   secreciones      externas lágrimas,secreción intestinal,

Monómero, dímero otrímero, con cadena J

Alfa 1Alfa 2:

J, CS 70 -400

anfibios apareció la inmunoglobulina G, en los conejos aparece la Ig A y en el hombre se añaden la Ig D yE.

Con la   evolución filogenético también aprendieron a desarrollar sustancias y sistemas de amplificación   yreforzamiento de la eficiencia de la resistencia como el sistema complemento.

ONTOGENIA DE LA RESPUESTA INMUNE EN EL HOMBRE.-La maduración del sistema inmune en el hombre comienza durante el segundo a tercer mes de la gestacióna partir de las células madres pluripotenciales o hemocitoblastos en la médula ósea se generan dos líneascelulares:Hematopoyética y linfopoyética, según el siguiente esquema

Invertebrados VertebradosAmebas En lampreas, ciclóstomos, peces de rio, etc. Anfibios Mamíferos Ser humanoFagocitosis Ig M Ig M

Ig GIg MIg GIG A

Ig MIg GIg AIg DIg E

Sistemas deamplificaciónbiológicas

Sistemas deamplificaciónbiológicas

ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LAS INMUNOGLOBULINAS

El rol fisiológico de la inmunidad tumoral o respuesta bursal en la defensa del huésped  es la síntesis deanticuerpos  (cuadro  anterior)  ayudando  a  prevenir  la  infección  y  esto  lo  hace  por  medio  de  varios

mecanismos:  opsonización,  antitoxicidad,  activación  del  complemento,  neutralización  de  los  antígenos,uniéndose al  antígeno  ( bacterias o  virus)  lo  neutralizan  impidiendo  su acción  ganándole la entrada a lacélula huésped.

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA.

En  la  presente  práctica tiene  por  objeto  determinar la  respuesta  bursal  en  personas  normales  y  enpacientes con inmunodeficiencia por desnutrición,  a través de la determinación cuantitativa de Ig A, Ig M,Ig G empleando anticuerpos específicos que formen inmunocomplejos insolubles, turbios, y su mediciónespectrofotométrica.

MATRIALES Y REACTIVOS.

Solución salina fisiológica 9/1000mlSolución anticoagulante: heparina sódica, frasco por 5 ml, 500 U.I./ml (LIQUEMINE).Jering descartabla por 5 ml y aguja de 20x1´´.Antisueros:  anti Ig A, anti Ig M, anti Ig G.Buffers Ig A, IgM, Ig G.Solución patrón de proteínas de concentración conocida.Suero sanguíneo o plasma heparinizado normalSuero sanguíneo o plasma heparinizado de paciente desnutrido.1 sapo grande  para punción intracardiacaEquipo de disección completo y estilete para obtener animal espinal..Espectrofotómetro  y microcubetas.Micropipetas automáticas de 0 á 200 y de 0 a mil microlitos o lambdas.Tubos de prueba 10x75 mmCronómetro

bronquialIg M Fijación del

complementoPentámero con cadenaJ

Mu J 40 -260

Ig D Reconocimiento deantígeno por las célulasB.

Monomérica Delta 3

Ig E Liberación dehistamina por losbasófilos (alérgias)  yde reaginas (protinespecíficas: sífilis,pian)

Monomérica Épsilon 0.05

PROCEDIMIENTO.-Se repartirá el trabajo en 5 mesas diferentes del siguiente modo:Mesa 1: determinara en un suero normal la Ig AMesa 2: determinará en un suero normal la IgMMesa 3. determinará en un suero normal la Ig GMesa 4: determinará en la sangre de un sapo la Ig A (punción intracardiaca con anticoagulante).Mesa 5: determinará  en el suero de un paciente desnutrido  la Ig G.

Distribuir las muestras y reactivos según los siguientes protocolos para cada inmunoglobulina.Nota: las muestras   problemas para el dosaje de cada inmunoglobulina deberán ser   diluídas    al 1/10 antesde empezar a trabajar:Suero problema:  ----------------------------- --------------  0.1 mlSolución salina fisiológica: (9 por mil) ------------------  0.9. ml

DOSAJE DE Ig ASuero diluído 1/10 : 50 ulBuffer IgA 900 ul

Homogenizar y leer la absorbancia en 340 nm (DO1) llevando el aparato a 0 con agua destilada y luegoagregar:Antisuero anti Ig A 80 ulMezclar e incubar a temperatura ambienteLeer la absorbancia nuevamente a 340 nm (DO2), llevando el aparato a 0 con agua destilada.

CÁLCULOS DE LOS RESULTADOS

Calcular la diferencia de absorbancia   DO2  - DO1 correspondiente a cada muestra analizada. Interpolar elvalor  de  esta  diferencia  en  la  curva  de  calibración  para  determinar  la  concentración  en  mg/100  mlcorrespondiente o multiplicar por el factor de calibración .

VALORES DE REFERENCIA NORMALES:70 – 400 mg/dl

DOSAJE DE LA Ig GSuero diluído 1/10 : 40 ulBuffer IgG 900 ulHomogenizar y leer la absorbancia en 340 nm (DO1) llevando el aparato a 0 con agua destilada y luegoagregar:Antisuero anti Ig G 160 ulMezclar e incubar a temperatura ambienteLeer la absorbancia nuevamente a 340 nm (DO2), llevando el aparato a 0 con agua destilada.

VALORES DE REFERENCIA NORMALES:700 – 1600 mg/dlDOSAJE DE LA Ig MSuero diluído 1/10 : 60 ulBuffer Ig M 900 ulHomogenizar y leer la absorbancia en 340 nm (DO1) llevando el aparato a 0 con agua destilada y luegoagregar:Antisuero anti Ig M 100 ulMezclar e incubar a temperatura ambienteLeer la absorbancia nuevamente a 340 nm (DO2), llevando el aparato a 0 con agua destilada.

VALORES DE REFERENCIA NORMALES:40 – 260 mg/dlDISCUSIÓN:Los alumnos compararán los resultados en las distintas mesas en relación a la respuesta bursal encontrada

para Ig A, Ig G e Ig M en las personas normales, desnutridos y en el sapo y explicarán las razones de lasdiferencias encontradas

FUNCIÓN GLOMERULAR

DEPURACIÓN DE CREATININA ENDOGENA.

Es una medida muy aproximada de la función glomerular.La filtración glomerular es un proceso mecánico que se produce como resultado de un juego de presiones:1. La presión hidrostática dentro del glomérulo es + 60 mmHg (70% de la presión aórtica)2. Se   oponen    a la filtración:

a. La presión oncótica proteica 32 mmHgb. La Presión Inters. caps. Bowman 18 mm Hg

- 50 mm HgPresión Neta de Filtración +10 mmHg

El   riñón   trata,   dentro   de   ciertos   límites,   de   mantener   una   presión   de   filtración   eficiente   mediantemecanismos de aumento del tono de la arteriola eferente.En 24 horas se filtran 180 litros de líquido por los glomérulos pero se excretan solamente 1 a 1.5 litros deorina en 24 horas, lo que quiere decir que los tubulis reabsorben 178.5 a 179 litros en 24 horas.No solamente hay reabsorción de agua a nivel tubular sino también de muchas otras sustancias del filtradoglomerular y que son útiles al organismo como glucosa, aminoácidos, sodio, potasio, cloro, etc.El filtrado glomerular tiene todos los constituyentes y en la misma proporción que en el plasma sanguíneoexceptuando las proteínas.La densidad del filtrado glomerular es 1010 y su pH es 7.40.Si este filtrado glomerular no fuese sometido a la acción tubular el organismo perdería grandes cantidadesde  agua,  sales,  elementos  útiles  como  glucosa,  aminoácidos,  etc.  Junto  con  los  productos  finales  delmetabolismo de las proteínas como la urea, creatinina, ácido úrico, y otros.

Concepto de Clearance:El concepto de CLEARANCE fue introducido por Van Slyke, la palabra clearance significa depuración olimpieza  y  se  entiende  por  Clearance  o  Depuración  renal  de  una  sustancia  al  número  de  centímetroscúbicos de plasma que son liberados de dicha sustancia en la unidad de tiempo (minuto), por el riñón. Siuna  sustancia  es  únicamente  filtrada  por  el  glomérulo,  y  no  reabsorbida,  ni  secretada  por  el  túbuli,  sudepuración medirá el número de ml que los glomérulos filtran en  un minuto. Es el caso de la Inulina, elmanitol,   thiosulfato,   etc., que solo se filtran por el glomérulo, pero no se reabsorben ni secretan por lostúbulis renales.La depuración de una sustancia se obtiene dividiendo la cantidad de dicha sustancia excretada en la orinaen la unidad de tiempo entre la cantidad que existe de dicha sustancia en un  ml de plasma.Llamemos V’ el Vol. Minuto de orina; (Vol. recolectado/tiempo de recolección en minutos (cc/min.))

U a la concertación de una sustancia “x” en orina mg/ml yP a la concentración de la sustancia x en 1 ml de plasma mg/ml

SI MULTIPLICAMOS U x V´ , NOS DARA LA CANTIDAD DE SUSTANCIA X EXCRETADA EN 1min. y LA FORMULA DE LA DEPURACIÓN SERÁ: C=UxV

PGeneralmente se recolecta orina durante 12 o 24 horas.Se escoge la CREATININA para medir la filtración glomerular porque el manejo renal de este metabolitoes muy parecido al de la Inulina y Manitol, por eso su Depuración es una medida muy aproximada de lafiltración glomerular, y se usa como índice de función glomerular.

EJEMPLO UN SUJETO TIENE 55 Kg. DE PESO Y MIDE 1.65 m, EL DOSAJE DE CREATININA ENLA SANGRE ES 0.9 mg/dl EN SUERO.

Es decir 0.009 mg/ml entonces P = 0.009 mg/mlEl volumen urinario fue de 1500 cc en 24 horas: 1500/1440 – 1.04 ml/min., es decir V = 1.04 ml/min.

La concentración de creatinina en la orina fue de 100 mg %, es decir 1.5 mg/ml.La depuración será:

C =   1.0x1.04    = 115 ml/min.0.009

Quiere decir que 115 cc de plasma a su paso por el glomérulo han sido liberados de toda su creatinina en 1minuto. PARA NUESTRO PACIENTE DE PESO: 55 Kg. Y TALLA: 1.65 m. le corresponde una ASC.de 1.60 m2 de acuerdo al Nomograma según la formula de Du Bois.

Depuración corregida = depuración sin corregir x 1.73 / ASC = ml/min./1.73 m2 de ASCASC

115 mlmin 1.60 m2X 1.73 m2

X= 115 x   1.73    = 124 ml/min./1.73 m2 ASC (DEPURACIÓN CORREGIDA)1.60

METODO PARA EL DOSAJE DE CREATININA EN SANGRE Y ORINA

En esta práctica emplearemos el Método espectrofotométrico colorimétrico de la casa comercial   WIENER   LAB. Que es el método de Jaffé modificado empleando picrato alcalino en medio taponado con glicina,previa   desproteinización   de   la   muestra   de   suero   con   ácido   pícrico   directamente   proporcional   a   laconcentración  de  creatinina  cuando  se  mide  en  510  mm  de  Longitud  de  onda.  Se  comparará  con  laabsorbancia de un patrón de creatinina de concentración conocida.

Equipos, Materiales y Reactivos01 Espectrofotómetro y 01 Centrifuga clínicaJeringa descartables de 10 ml con aguja 20 x 1”Algodón, alcohol yodado y ligadura09 tubos de ensayo de 13 x 100 mm en cada mesa01 tubo de ensayo de 12 x 75 mm   en cada mesa06 Pipetas de 1 ml graduadas al 1/100 en cada mesa03 Pipetas de 5 ml graduadas al 1/10 en cada mesaFrasco con agua destilada 100 ml en cada mesaPipetas Pasteur de Vidrio (capilares) con chupón jebe, para separar sobrenadante.Frascos de boca ancha de 1 litro de capacidad ó beakers de plástico de 1 litro para obtención de muestrasde orina.Reactivo N° 1: Ácido Pícrico 41.4 mMol / LtReactivo N° 2: Buffer de Glicina / Na OH 1 mol/Lt (pH = 12.4). Muy cáustico (alcalino): Precaución.Sol. Standard de Creatinina: 2 mg/dl

ProcedimientoRecolectar muestra de orina de 12 ó 24 horas para dosaje de creatinina urinaria. Si se recolecta en frascoestéril,  la  muestra  guardada  en  refrigeración  puede  durar  4  días.  Medir  exacto  el  volumen  y  tiempo  derecolección. AnotarEl mismo día de la recolección de orina obtener la muestra de sangre para el dosaje de Creatinina sérica.

1.- Primer paso.- DESPROTEINIZACION de la muestra de suero:En un tubo prueba 13 x 100 mm ó 12 x 75:Medir 0.7 ml de suero y añadir 3.5 ml Reactivo N° 1 (ácido pícrico)Mezclar por inversión y reposo 10 minutos.Centrifugar a 3000 RPM x 5 min.

Separar  el  sobrenadante  del  suero  con  la  pipeta  Pasteur  y  trasladarlo  a  otro  tubo  ymarcarlo:   Sobrenadante      suero      (SS).   

2.- Disponer los tubos de prueba 13 x 100 mm según la siguiente tabla y marcarlos según lo indicado:

Tubos Blanco Standard Sobrenad delSuero (SS)

Orina Dilución1/50

Sobrenadante Suero SS            ml 3Sol St.  : 2 mg/dl                ml 0.5Orina Dil 1/100                   ml 0.5Agua Destil.                         Ml 1.0 0.5 0.5React Nº 1 (Ac.Pícrico 41.4 mMol/l) ml 2 2 2React Nº 2 (Buffer Glicina alcalino pH 12.4)  ml 0.5 0.5 0.5 0.5

Mezclar por inversión. Reposar 15 min. a Temp. Ambiente.3.- Lecturas: Colocar el Espectrofotómetro en 510 mm de Long. Onda,  y  colocando el espectofotometroen 100% de T osea 0% de Absorbancia.Leer   la   Absorbancia   de   cada   uno   de   los tubos   anotando   las   absorbancias   de:   Blank,   estándar,sobrenadante del suero (SS) y de la orina diluida.

4.- Cálculos.

a.- Creatinina Sérica (Crs): mg/dl

Crs = Conc St X  Abs suero  = 2 X  Abs suero – Abs Blank  =  mg/dlAbs St – Abs blank Abs St – Abs Blank

b.- Creatinina en Orina (CrO):  mg/dl

Exactamente igual al anterior, sustituyendo las absorbancias del suero por las de la orina  y se multiplicaademas por 100 (factor de dilución de la orina).

c.- Calcular la Depuración Creatinina Endógena (Corregida por el ASC):

Según: Depuración  =  U x V   X   1.73 m2P ASC m2

Nota: No se olvide de usar siempre las mismas unidades de medida para los cálculosPor ejemplo:U = CrO en mg/mlV = Vol. Min ml/minP = Crs mg/ml

Valores ReferencialesDepuración de Creatinina endógena:

Hombres:   De 97 hasta 137 ml / min. / 1.73 m2 ASCPromedio 120 ml / min. / 1.73 m2 ASC (+/- 25)

Mujeres: De 88 hasta 128 ml / min. / 1.73 m2 ASCPromedio 85 ml / min. / 1.73 m2 ASC

Creatinina   Sérica    Adultos Varones: 0.8 a 1.2 mg / dlCreatinina en   Orina   : 1.0 a 1.6 gm en 24 hs (15 a 25 mg/Kg. peso Corporal/24 hs)

Depuración de Creatinina Aumentada:

Gestación, Ejercicio físico.Depuración de Creatinina Disminuida:

Insuficiencia renal glomerular ó Insuficiencia Cardiaca.Edad avanzada: Disminuye aprox. 1 ml / min. / año después de los 40 años.Medicamentos nefrotóxicosMala recolección urinaria

FUNCIONES DE CONCENTRACIÓN Y DILUCIÓNFundamentoEl riñón tiene una remarcable capacidad para regular el volumen urinario diario concentrado y diluyendola orina. Esta característica fisiológica es una de las más importantes del riñón normal, y se conoce desdehace más de 50 años. Se realiza según un mecanismo de flujo a contracorriente multiplicador.Adaptando  el  principio  fisicoquímico  del  flujo  térmico  a  contracorriente,  a  la  presión  osmótica  diremosque  en  el  asa  de  Henle  ocurre  un  fenómeno  similar,  lo  mismo  que  a  nivel  de  la  Vasa  Recta,  pero  conelectrolitos y que estudiamos con detalle en nuestras clases teóricas. Este mecanismo impide que se disipela  gradiente  de  Osmolaridad  llegando  a  tener  así  el  intersticio  medular  y  papila  hasta  1200  mOsm/Kg.agua.  (El  Plasma  tiene  280  a  290  mOsm/Kg.  agua).  El  trasporte  activo  de  Cloro  en  el  Asa  de  Henle  estambién responsable del sostenimiento de esta alta osmolaridad en el interticio medular renal.Esta práctica tiene por objeto aprender a medir estas capacidades de concentración y dilución de la orinapor el riñón a través de los parámetros fisiológicos siguientes:Densidad  Urinaria, relación  Uosm/Posm,  Cosm,  TcH2O  sometiendo  a  una  persona  sana  a  una  dietahidropónica  primero y luego a una sobrecarga acuosa.

Definiciones previas.-

Posm:  Es  la  concentración  osmolar  plasmática,  normalmente  puede  variar  desde  280  a  290  mOsm/Kgagua, es la concentración de solutos en el plasma.Uosm:  Es  la  concentración  Osmolar  urinaria  ó  concentración  de  solutos  en  la  Orina  u  osmolaridadUrinaria.  Generalmente  la  orina  es  tres  veces  más  concentrada  que  el  plasma.  El  riñón  reabsorbe  aguahasta  concentrar  el  filtrado  glomerular  unas  tres  veces  más  que  osmolaridad  plasmática.  Los  valoresnormales pueden variar desde 50 hasta casi 1200 mOsm/Kg. agua.Uosm x V: Es la excreción de solutos por minuto, es la cantidad de solutos osmóticos activos excretadospor minuto.Cosm: Depuración Osmolar: Uosm x V / PosmEs el volumen de plasma que es depurado de sus solutos en la unidad de tiempo.Representa  la  tasa  a  la  cual  las  sustancias  osmóticas  activas  son  aclaradas  ó  depuradas  del  plasma.  Ladepuración basal ó endógena en el hombre tiene un rango del 1 al 3 % del filtrado glomerular.

CH2O: Es depuración de agua libre de solutos que se elimina por la orina por minuto.Es igual al Volumen minuto menos la Dep Osmolar:CH2O = V – CosmLa  depuración  de  agua  libre  es  ese  núcleo  de  agua  en  la  orina  en  exceso  de  su  depuración  osmolar.Durante la diuresis de agua caracterizada por la excreción de gran volumen de orina diluida debido a lagran ingesta de agua, la diuresis se debe a la inhibición de la hormona antidiurética de la neurohipófisis.Durante  la  diuresis  de  agua  pura,  de  cualquier  duración  ó  magnitud,  la  orina  consiste  de  una  mezcla  deagua osmoticamente obligada que se excreta disolviendo los solutos que es igual a la depuración osmolar,mas  un  vol.  de  agua  osmóticamente  libre,  es  agua  libre  de  solutos,  literalmente  es  agua  químicamentepura, representada por  CH2O. El flujo urinario total en este caso es la suma de estos dos términos:V = Cosm + CH2O, de donde tenemos que:  CH2O = V – Cosm

Tc   H2O:   Durante   la   concentración   urinaria   (Antidiuresis)   la   orina   se   concentra   por   encima   de   laOsmolaridad   Plasmática   por   sustracción   dependiendo   de   la   de   agua   libre   de   solutos   del   filtradoglomerular,  es  agua  que  el  organismo  se  reinfunde.  En  este  caso  el  Vol.  min.  es  menor  que  la  dep.Osmolar.TcH2O = Cosm – V representa el volumen de agua reabsorbido a nivel tubular, esto concentra la orinatubular.

ProcedimientoPara esta práctica se seleccionó a una persona a quien el día anterior se le hizo un dosaje de OsmolaridadPlasmática y luego al día siguiente se le sometió a una prueba de hidropenia, es decir dieta seca, supresióntotal de líquidos pero con una dieta normal en proteínas, hasta conseguir en lo posible una disminución del3% del peso corporal.A  las  6  de  la  tarde  miccionó  (vejiga  vacía),  y  se  descartó  esta  orina  y  se  anotó  la  hora  exacta.  Luegoempezó a recolectar toda la orina emitida, en un mismo frasco hasta las 6 am del día siguiente.Dos  horas  mas  tarde,  8  am,  se  obtuvo  una  segunda  muestra  de  orina  en  recipiente  a  parte.  En  estemomento  se  obtuvo  una  muestra  para  determinar  Osmolaridad  Plasmática.  Aquí  termina  el  test  deConcentración.Inmediatamente se inició la Prueba de Dilución, para ello se le dio a beber 20 ml de agua x cada Kg.  depeso  corporal,  con  el  objeto  de  probar  su  capacidad  para  diluir  la  orina.  Se  recolectaron  las  muestrasemitidas,  cada  una  en  frascos  separados,  cada  20  ó  30  minutos,  según  el  protocolo  del  cuadro  adjunto,numerándose todas las muestras emitidas durante casi tres horas.Al  intermedio  y  al  final  de  las  recolecciones  se  obtuvieron  muestras  de  sangre  para  determinar  lasOsmolaridades plasmáticas, en el osmómetro. Para la práctica, a partir de estas muestras calcularemos lasOsmolaridades  Urinarias  a  partir  de  las  densidades  y  con  los  datos  obtenidos  de  Volúmenes  urinarios,tiempos  de  recolección,  Uosm,  y  Posm  se  determinarán,  para  cada  muestra,  los  valores  de  U/P,  Cosm,TcH2O, y CH2O.

Tabla-Protocolo de trabajo para las PRUEBAS de CONCENTRACIÓNY DILUCIÓN Urinaria

TiemposdeRecolecc.(minutos)

TiempoAcumulatmin

N°deMuestra

Vol.Orinaml

Vol.Minutml/min

PosmmOsmKgH2O

DensiDad

Urina

ria

UosmmOsm/KgH2O

U/P Cosm TcH2Oml/min

CH2Oml/min

Prueba

De

CONCENTRACIÓNSupreslíquidos

12 Hs 720 1a 432 298 ------2 Hs 840 2a 60 ------De

Inmedia

tose hizo:

Prueba

De

DILU

CION

Ingesta de20mlagua/KgPeso

Y seContiNuóRecolec-cion

30 30 3a 18 295 ------25 55 4a 200 ----20 75 5a 190 ----22 97 6a 209 294 ----20 117 7a 140 ----18 135 8a 126 ----15 150 9a 38 290 ----

A continuación graficar en papel milimetrado:Volumen Urinario (ordenada) vs Densidades (abscisa)Cosm ((Ordenada) vs Vol. minuto (Abscisa), y determinar TcH20 y C H2O Interpretar los resultados decada prueba.

REGULACION RENAL DEL EQUILBRIO ACIDO I BASICOAcidificación y/o alcalinizaci6n urinaria.

Introducción: Bases Fisiológicas:Existen  tres  grandes  procesos  de  regulaci6n  del  pH  en  los  líquidos  del  organismo:  el  mecanismo  deintercambio i6nico (entre las células y los líquidos), el mecanismo respiratorio y el mecanismo renal.Los   riñones   son  los  reguladores  mas  eficientes  del  equilibrio  ácido  básico,  en  vista  de  que      realizan      la      EXCRECION de los llamados ácidos fijos ó propiamente dichos, los   HIDROGENIONES      H+   ; mientraslos H+ se excretan, circulan en la sangre en equilibrio con los aniones correspondientes como el HC03- ,con lo cual impiden cambios importantes en el pH. La cantidad de Hidrogeniones producidos en el cursodel  metabolismo  es  de  hasta  100  mEq.  diarios  (  4.1  mEq/hora),  dependiendo  de  la  dieta.  El  Riñón  seencarga de excretarlos, al mismo tiempo que recobra el HC03- .La orina de un sujeto sano, con una dietanormal  mixta,  es  ácida  y  su  pH  habitual  es  de  6.0;  el  filtrado  glomerular  tiene  un  pH  de  7.40.  Estadisminución en el pH urinario, se debe a que están siendo eliminados los Hidrogeniones por el riñón. Lamagnitud  de  esta  eliminación  es  variable  de  acuerdo  con  las  exigencias  fisiológicas  del  momento  y  serefleja en el pH de la orina que puede variar de 4,0 hasta 8.0, según las necesidades del organismo. Cómose logra excretar una orina ácida ? Se logra por la adición de H+ secretados por las células de los túbulisrenales hacia la luz tubular lo cual permite la modificación de algunos ácidos que están disociados en elplasma, pero que se convierten en formas no disociadas, al aumentar la acidez del medio. Por ejemplo lasrelaciones entre el Na2HPO4 y el NaH2PO4 es de 4 a 1 en el plasma y en el filtrado glomerular donde elpH es 7.40. Si se baja el pH por la adición de H+ esta relación disminuye hasta 4/100 (predominancia delFosfato ácido), y el pH urinario baja a 5.4.Si la relación bajase hasta 1/99 (mayor predominancia aún del fosfato ácido) el pH llegará hasta 4.8.El  resultado  neto  de  la  producción  de  una  orina  ácida  es  la  ganancia  de  un  Na+  y  SE  RECUPERA  ELHCO3- La eliminación del H+ a cambio de un Na+ permite así retener el HC03- y tener reserva de HC03-

para situaciones de emergencia. Puede así entonces el riñón eliminar constantemente H+ sin vaciar el Na+extracelular ni perder su bicarbonato en condiciones normales.En  el  caso  opuesto  cuando  hay  alcalinidad  aumentada  se  produce  en  el  riñón  el  fenómeno  inverso:Disminuye la excreción tubular de H+, se reabsorbe menos bicarbonato, se excretará fosfato en la formaNa2HPO4 y se pierden 2 Na+ y el efecto neto será la perdida de 2 Na+ (base), disminución del HC03- delplasma  y  los  ácidos  orgánicos  serán  eliminados  a  un  pH  más  alto  en  equilibrio  con  más  Na+  que  sepierden. En resumen, pueden Ustedes pues darse cuenta que las diferentes funciones del mecanismo renalresponden a requerimientos específicos: en el caso  de la  acidosis, hay un incremento  de la excreción deácidos  y  una  conservación  de  base;  en  la  alcalosis,  hay  un  incremento  de  la  excreción  de  base  yconservación de ácidos y el pH de la orina cambiará correspondientemente y puede variar como les acabode  señalar  en  muestras  de  orina  random  desde  pH  4.5  hasta  8.2.  Esta  capacidad  de  excretar  cantidadesvariables de ácido  es de una  gran importancia  fisiológica  porque convierte al riñón en  el  mecanismo  dedefensa final contra cualquier cambia del pH corporal o de la composición anión-catión.

En la producción de orina ácida: Resultado neto: Ganancia de un sodio a cambio de excreción de de unH+. Se recupera el NaHCO3. Eliminación constante de H+ sin vaciar el Na+ del LEC.-

EI  otro  mecanismo  para  regular  del  pH  que  opera  en  el  riñón  es  la  EXCRECION  DEL  H+  EN  LAFORMA  DE  ION  AMONIO  NH4+  O  AMONIOGÉNESIS,  a  partir  del  NH3  de  la  glutamina  o  losaminoácidos. El NH3 por lo general no se encuentra en el filtrado glomerular y por lo tanto proviene de lascélulas  del  túbuli  renal.  Sin  embargo  su  excreción  no  es  rápida  sino  tardía  y  solo  empieza  a  funcionardespués  de  un  lapso  prolongado  de acidosis  .. En  la  figura  podemos  ver  como  se  conserva  el  sodio  pormedio  de  la  excreción  del  NH4+.  El  Na+  ingresa  a  favor  de  la  salida  de  un  H+,  el  cual  con  el  NH3proveniente de la desaminación de aminoácidos o  de la glutamina, se excreta como NH4+.AMONIOGÉNESIS:

El NH3 liberado por la Glutaminasa sirve para neutralizar las sustancias ácidas: NH3 + H+ NH4Se conserva sodio por medio de la excreción de NH4, el sodio ingresa en favor de la salida de H+EI NH3 neutraliza el H+ formando NH4; y el H+ con el NH3 se excretan como NH4. (ClNH4)

TEST DE SOBRE CARGA ÁCIDA CON CLORURO DE AMONIO (Durante tres días)

Un día antes de la prueba se recolecta orina de 24hs para acidez de titulación Basal. Luego se le prescribeuna dosis de 0.1 gm de Cloruro de amonio por Kg de peso corporal, durante tres días consecutivos y se varecolectando la orina de 24 horas cada día, durante tres días. En cada una de las muestras de orina semedirá el volumen y el pH, Acidez de titulación fosfática y acidez amoniacal. Se determinará el pHsanguíneo basal y al final del test.

Fundamento de la prueba de sobrecarga ácida de Cloruro de amonio para medir la capacidad deacidificación del túbuli urinario:El Cloruro de amonio ingerido extrae H+ de la célula.El Hígado depura el amonio que llega por la circulación portal y se produce la siguiente reacción quelibera H+:

2 NH4+ + CO2 ----------- CO(NH2) 2   + 2 H+  + H2O(La conversión de amoniaco en urea e

acidificante.)Acidificante

El H+ liberado se combina con el Na2HPO4 de la orina tubular:

Na2HPO4 + H+ NaH2PO4Sal más ácida  y baja el pH hastamenos de pH 5.4 en la orina.

PRUEBA DE ACIDIFICACIÓN URINARIA MODIFICADA. (Durante de 6 horas).Después de un desayuno normal se recogen 2 muestras de orina con una diferencia de una hora, luego sele administra al paciente cloruro amónico a la dosis de 0.1 gm / Kg. Peso corporal por la vía oral. Se daráen cápsulas de gelatina de 0.50 gm. De preferencia con tostadas y mermelada, recogiendo la orina durante

las 6 horas siguientes. Se extraen muestras de sangre antes y tres horas después de la administración delCloruro amónico. Con la carga administrada el pH urinario deberá descender por debajo de 5.4

En nuestra práctica solamente haremos una prueba de corta duración (2 horas) del siguiente modo:

Equipos, Materiales y ReactivospH Meter para determinación de pH sanguíneoPotenciómetro para determinar pH en soluciones.Cinta para determinación universal de pH06 Cilindros graduados de vidrio o plástico de 500 ml08 beakers de 50 ml02 Pipetas de 5 ml graduadas al 0.102 Pipetas de 1 ml graduadas al 1/10003 Buretas para titulación química

03 Ehrlemeyers de 500 ml con agua destiladaFenolsulfotaleína indicador (PSP) sol alcohólica 1 % o Rojo fenol.Sol. NaOH  0.1 Normal titulada,  Formol 40 %  50ml.

ProcedimientoColocar a una persona de prueba en reposo. Evacuar la vejiga por micción espontánea (con deseos deorinar) y será la muestra basal. (identificarla). Determinar el pH sanguíneo al inicio de esta prueba.Administraremos luego 400 ml de una solución de Cloruro de amonio al 0.5% en 15 minutos.Iniciar la recolección de orina cada 20 min., por micción espontánea, en muestras separadas durante doshoras.Medir el Volumen y pH en cada una de las muestras de orina emitidas.Determinaremos el pH sanguíneo basal y al final del test. Titularemos la acidez Fosfática y Amoniacalurinaria con sol. valorada NaOH 0.1 Normal y retitulación de la acidez amoniacal previo tratamiento conformol taponado:Colocar en beakers : 5 ml orina + 1  gota Roja fenol. Titular con NaOH 0.1N hasta rosado.Anotar gasto.Corresponde a la acidez del Fosfato ácido. Cada ml NaOH gastado 0.1 mEq H+Luego añadir 0.5 ml formol para extraer los H+ del Amonio y titular de nuevo la acidez amoniacal.Hacer la sumatoria de acidez fosfática + amoniacal, acidez total y luego calcular la (H+) urinaria en mMol/ litro. Calcular la Depuración de Hidrogeniones.

Emplearemos una persona normal como CONTROL a la cual le haremos la misma prueba anteriorsustituyendo el cloruro de amonio por una dosis de 25 ml de agua hervida y fría por kilo de peso corporalasí:Colocar a una persona de prueba en reposo. Evacuar la vejiga por micción espontánea (con deseos deorinar) y será la muestra basal. (identificarla). Determinar el pH sanguíneo al inicio de esta prueba.Administraremos luego 25 ml de agua x Kg peso corporal en 15 minutos.Iniciar la recolección de orina cada 20 min., por micción espontánea, en muestras separadas durante 2horas.Medir el Volumen y pH en cada una de las muestras de orina emitidas.Determinaremos el pH sanguíneo basal y al final del test. Titularemos la acidez Fosfática y Amoniacalurinaria exactamente igual como el caso anterior con sol. valorada  NaOH 0.1 Normal y retitulación de laacidez amoniacal previo tratamiento con formol taponado, todos los cálculos también se haránexactamente iguales al caso anterior.

CÁLCULOS:En la práctica anterior ya hemos aprendido como se calcula la Depuración de una sustancia, entonces sihemos recolectado un volumen de orina en un plazo de tiempo determinado podemos calcular el Volumenminuto y si conocemos las concentraciones de H+ urinarias y pH, y además se conocemos el pH

sanguíneo estamos en condiciones de poder calcular las respectivas depuraciones y evaluar la Depuracióndel ión Hidrógeno.CONCLUSIONES:En la condición Basal encontraremos que: Dep  H+  >  Vol minEn la Acidosis como la concentración de H+ urinaria es mucho mayor que la sanguíneatendremos: Dep H+  será  >  Vol. min.en la Alcalosis será la inversa:  Vol. min.  >  Dep H+Para estos cálculos recordar que: D=UxV/P

y pH = -log (H+)(H+) = antilog pH

-pH(H+) = 10

EXAMEN QUIMICO DE ORINAINVESTIGACIÓN   DE   ALBÚMINA: Excreción normal: Menos de 75 mg en 24hs.   No      detectable    por los métodos habituales rutinarios.Por métodos especiales se detectan cantidades menores y se llama microalbuminuria.Para detectar presencia de albúmina se emplea el método del   Ácido      Sulfosalicílico      al      3%    así:

Filtrar la orina a través de papel de filtro.Colocar 1 ml de orina filtrada en un tubo de ensayoAñadir 1 ml de ácido sulfosalicílico. Reposar 5 minutos.Si no se produce enturbiamiento no hay albúmina: NegativoSi aparece enturbiamiento indica presencia albúmina.El grado de turbiedad está en relación con la cantidad e albúmina presente.Hacer un control negativo sustituyendo el ácido sulfosalicílico con 1 ml deagua destilada y proceder exactamente igual. Comparar grados de turbidez.

Entre los métodos rutinarios cualitativos, el más simple:   test      de      calor      y     acidificación:   Filtrar la orina a través de papel de filtro.En tubo de ensayo hervir 3 ml orina filtrada, en mechero alcohol o Bunsen ó Baño María hirviente. Unprecipitado blanco ó floculante al hervir indica:

a)   Proteína ó fosfatos.b) Para diferenciar: Fosfatos: si al añadir ácido acético 5% desaparece la turbidez:

Fosfatos (Los fosfatos son solubles en medio ácido). Si hayefervescencia: carbonatos presentes.Proteínas: si al añadir ácido acético 5% la turbidez aumenta.

INVESTIGACIÓN DE GLUCOSAReacción de Benedict Cualitativa: Por reducción del cobre el solución alcalina y calor.Colocar 3 ml de Benedict Cualitativo en tubo de ensayo. Añadir 0.3 ml orinaHervir por 3 minutos en BM hirviente. Enfriar por reposo de 5 min.Positivo: Precipitado rojo ladrillo al fondo del tuboNegativo: Permanece azul o color verdoso sin precipitado.Dan resultado positivo: Glucosa, lactosa, levulosa, pentosas.

TEST PARA ÁCIDOS BILIARESLos ácidos biliares reducen la tensión superficial de los líquidos que las contienen:Colocar 3 ml de orina en un tubo 18 x 150 ml.Espolvoréese sobre la superficie peque cantidad de azufre pulverizado finamente (flor de azufre). Si elazufre cae al fondo enseguida, la orina tiene ácidos biliares en cantidad mayor de 0.01 % ó más.El cloroformo, alcohol, trementina, timol dan resultados falsos.

INVESTIGACIÓN DE CUERPO CETÓNICOSEn tubo ensayo colocar 3 ml orina, añadir 3 gotas ácido acético. Mezclar.Añadir 1 ml de agua oxigenada. Luego, añadir unos 500 mg de nitroprusiato en polvo y agitar suave paradisolver. Colocar en zona 1 ml de hidróxido de amonio. Anillo verde en la interfase: positivo a cuerposcetónicos.

Referencias   Bibliográficas: Libro:   Fisiología Renal, Autores Manuel y Carlos Ramírez Velasco

Editorial Escomel. Arequipa. Perú. 1a Ed. 1988.Libro:   Fisiología Medica Guyton 1996Physiology and Kidney Diseases, Brow, Londiniun EdCo.2002. First  Ed.

ROL FISIOLÓGICO DE LA PTIALINA (DIGESTIÓN DEL ALMIDÓN)

Fundamento Fisiológico

El alimento en la boca se mezcla con la saliva lo cual se favorece por la masticación que fragmenta laspartículas  grandes  de  alimentos  y  mezcla  a  éste  con  las  secreciones  de  las  glándulas  salivales.  En  lasglándulas salivales los gránulos secretorios (cimógeno) que contienen las enzimas salivales se descarganen los conductos a partir de las células acinosas.  Diariamente se secretan 1500 ml. de saliva y el pH es

Tubo No. 1 2 3 4

Sol. almidón 1 %                                           ml. 2,0 2,0 2,0 2,0

Tampón fosfato pH 6,8                               ml. 1,0 1,0 1,0 ----

HCI 0,3 N                                                          ml. ---- ---- ---- 3,4

CIN a 0,9%                                                      ml. 3,0 2,4 ---- ----

Agua destil.                                                      ml. ---- ---- 2,4 ---

Baño María 37 °C  x  5'(Pre-incubación,no añadir salivatodavía

si si si si

Después de los 5 minutos,recién añadir:

Sol. amilasa salival ( diluída 1/20)                                  ml.

----0,6 0,6 0,6

Baño María 37°C x 20' si si si si

ligeramente  menor  de  7.0,  pero  se  aproxima  a  8.0  durante  la  secreción  activa.  La  saliva  contiene  dosenzimas  digestivas:  la  lipasa  lingual,  secretada  por  la  glándula  de  la  lengua,  y  la  alfa  amilasa  salival(ptialina)   secretada   por   las   glándulas   salivales.   La   saliva   también   contiene   mucinas,   que   songlucoproteínas   lubricantes   del   alimento   y   protectoras   de   la   mucosa   oral.   Además   contiene   IgA,inmunoglobulina que viene a ser la primera defensa inmunitaria contra bacterias y virus. La alfa amilasasalival ataca al almidón. Sin embargo, el pH óptimo para esta enzima es de 6,7 y su acción es inhibida porel  jugo  gástrico  ácido  en  el  momento  del  ingreso  del  alimento  al  estómago.  El  activador  de  la  amilasasalival es el cloro; siendo su substrato el almidón hidroliza los enlaces alfa 1 - 4 para producir dextrinas,alfa-limitantes,   maltotriosas   y   maltosa,   siendo   esta   función   hidrolítica   la   acción   catalítica   queestudiaremos en la presente práctica. El almidón, polímero de la glucosa da color azul con la solución deyodo. El almidón está constituido por un 15% - 20% de amilosa y un 80% - 85% de amilopectinas.

ObjetivoEstudiar la acción de la amilasa sobre el almidón y determinar los substratos y productos de la actividadalfa-amilásica salival y el efecto del pH y activador enzimático sobre esta reacción enzimática ó digestiónhidrolítica.

ProcedimientoDigestión del substrato por la alfa-milasa salival:

Luego se determinarán los substratos remanentes y los productos de degradación intermedia del almidónen cada digerido:1.2.3 y 4, por separado, empleando soluciones de   Lugol    y   Benedict    cualitativo.

A. DETERMINACION DEL SUSTRATO

Mezclar, reposar 15': Observar los resultados

B. DETERMINACION DEL PRODUCTO

TUBOS N° 5 6 7 8

DIGERIDO DEL TUBO 1:ml 0.5 - - -

DIGERIDO DEL TUBO 2:ml - 0.5 - -

DIGERIDO DEL TUBO 3:ml - - 0.5 -

DIGERIDO DEL TUBO 4:ml - - - 0.5

HCl 0.05 N : mI 5 5 5 5

Sol. De Lugol: mI 0.5 0.5 0.5 0.5

TUBOS N° 9 10 11 12 13

DIGERIDO DEL TUBO l:ml 0.5 - - - -

DIGERIDO DEL TUBO 2:ml - 0.5 - - -

DIGERIDO DEL TUBO 3:ml - - 0.5 - -

DIGERIDO DEL TUBO 4:ml - - - 0.5 -

SOLUCION DE BENEDICT: mI 2 2 2 2 2

SOLUCION DE GLUCOSA 1 %: ml - - - - 0.5

Baño hirviente: 100° X 5'

Enfriar en agua helada y observar los resultados.

Conclusiones:Influencia del pH salival y gástrico en la digestión del almidón.Influencia del Cloro sobre la actividad de la amilasa salival.Verificar la ubicación de los puntos de hidrólisis del almidón por acción de la alfa amilasa salival

FUNCIÓN DE LAS CÉLULAS PARIETALES DEL ESTÓMAGO.ACIDEZ GÁSTRICA TOTAL ESTIMULADA Y DÉBITO

ACIDO/HORA.

El Gastroenterólogo A. W. Kay describió un método con el objeto de lograr una estimulación máxima  delas células apriétales del estómago.En el contexto de la fisiología gástrica, se considera condición basal aquella en la cual el paciente está encompleto  ayuno  después  de  haber  dormido  unas  6  horas  tranquilamente,  sin  estar  expuesto  a  ningúnestímulo visual, ni olfativo, ni auditivo.Bajo control fluoroscópico debe insertarse una sonda naso-gástrica de modo que la punta de la sonda seencuentre  en  la  parte  más  baja  del  cuerpo  del  estómago.  En  seguida  el  paciente  se  coloca  en  decúbitolateral izquierdo y escupe toda saliva que tenga durante toda la prueba. En estas condiciones la sonda seconecta a una bomba de succión continua eléctrica y el contenido del estómago es aspirado continuamentea presión negativa de 30 a 50 mmHg, se aspira primero todo el contenido gástrico de la noche anterior y sedescarta. Se recolecta luego J.G. durante los primeros 30 minutos y se mide el volumen y se conserva estaprimera  muestra  para  trabajarla,  es  la  muestra  llamada  BASAL.  El  flujo  Gástrico  debe  ser  chequeado  amenudo lo  mismo  que la succión. Luego debe inyectarse un antihistamínico como  Clorotrimetón 20  mgIntramuscular  (para disminuir  en lo  posible los efectos colaterales de una  fuerte dosis de Histamina querecibirá luego). Se usa como estimulante de la célula parietal.Fosfato  de  Histamina  a  una  dosis  de  0.04  mg  x  Kg.  de  peso,  vía  subcutánea,  ó  mejor  Pentagastrina:  6microgramos x Kg. peso.Se continúa recolectando las muestras de jugo gástrico durante los lapsos de tiempo de 15 min. cada uno yque son los siguientes:0 a 15 min.; 15 a 30 min.; 30 a 45 min. y 45 a 60 min.Se  medirá  la  acidez  de  titulación  e  cada  una  de  las  muestras  empleando  NaOH  0.1  Normal,  hasta  laneutralización, empleando indicador de Fenoltaleína solución alcohólica al 1%.

Procedimiento

Luego  se  titularán  cada  una  de  las  muestras  obtenidas  por  separado,  empleando  Solución  de  NaOH  0.1Normal, gota a gota, agitando suavemente después de la adición de cada gota de NaOH, hasta la apariciónde un color rosado muy tenue y persistente, color que indica la completa neutralización del ácido del JugoGástrico.

CALCULOS:Ejemplo: Se gastó 2.40 ml en la titulación de una de las muestras

Cada 1 ml de NaOH 0.1 N que se gaste en la titulación indica – 0.1 mEq. H+2.40 ml de NaOH 0.1 N  gastados indicarán ------------ X mEq. H+

2.4   x   0.1 =   0.24 mEq.H+1

Identificación de las Muestras I II III IV V

Descripción de los tiempos PrimeraMuestra(Basal)

InyectarAntihistamínico yluego Histamina ó

Pentagastrina

0 a 15min.

15 a 30min.

30 a 45min.

45 a 60min.

Tiempos de recolección 30 min. 15 min. 15 min. 15 min. 15 min.

Anotar los volúmenesRecolectados cada vez (ml)De cada una de las muestrasanteriores medir:

Jugo Gástrico (ml) 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml

Agregar:

Agua Destilada (ml) 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml

Indic. Fenoltaleína (gotas) II II II II II

Agitar suavemente sí sí sí sí sí

Anotar la cantidad gastada deNaOH 0.1 N en la titulación

Resultados según Cálculos(expresados en mEq/litro)

0.24………………….10 ml de Jugo Gástrico usadox ............................  1000

0.24   x   1000 = 24 mEq.H+ / lt de Jugo Gástrico10

En  este  caso  hemos  calculado  la  concentración  ácida  expresada  en  mEq.H+/cada  litro  de  jugo  gástrico,estas son unidades de expresión química en rigor. Pero en fisiología expresamos la acidez en débito acidoEs decir la cantidad de acidez generada en un tiempo determinado, por ejemplo cada 24 horas.En el ejemplo anterior encontramos 0.24 mEqH+ en el volumen de 10 ml de jugo gástrico usado, si en losprimeros 15 minutos se obtuvieron 30 cc de jugo gástrico tendremos:

En 10 ml jugo gástrico = 024 mEqH+En los 30 ml obtenidos en los primeros 15 minutos tendremos: X

X= 30 x 024 / 10 = 072 mEqH+ en 15 minutos.

Esto  se  llama  debito  acido.  Y  es  el  débito  acido  de  los  primeros  15  minutos,  asi  continuaremos  en  lamisma forma calculando el débito acido para los 30, 45 y 60 minutos. La sumatoria de estos 4 valores serápor consiguiente el débito acido/ hora o gasto acido de la célula parietal.

Valores Referenciales

Residuo Gástrico Después de 12 hs de ayuno: 20 a 100 ml (generalmente menos de 50 ml)

pH: 1.5 a 3.5Acidez sin Estímulo: 1 a 4 mEq H+ / litroAcidez post estímulo (Kay) ó Pentagastrina: 10 a 120 mEqH+ / litroDébito Ácido Basal/hora: Normal Hombres: 1 a 10.5 mEq/hora

Mujeres: 1 a 5.6 mEq/horaDébito Ácido Máximo/hora: Normal Hombres: 12 a 60 mEq/hora

Mujeres: 8 a 40 mEq/hora

MOTILIDAD INTESTINAL

1. IntroducciónEl esófago, el estómago y los intestinos tienen inervación parasimpática predominante. La acetilcolina esel neurotransmisor de este sistema y actúa como un agonista de la motilidad intestinal.

2. MaterialEquipo para órganos aisladosConejo Algodón embebido en aceiteQuimógrafo AcetilcolinaEquipo de disección PilocarpinaSolución de Ringer para mamiferos AdrenalinaSuero fisiológico AtropinaBañomaría a 40 °C TesmostatoBalón de oxígeno

3. Método3.1. Experimento No. 1Se sacrifica al animal y se realiza una laparotomía para resecar una segmento de intestino delgado de unos20  centímetros.  Se  marca  el  extremo  proximal.  Se  lava  la  pieza  operatorio  con  suero  fisiológico,  se  lesumerge en un baño de solución de Ringer a 40 °C y se fija a la palanca inscriptora de1 quimógrafo. Semantiene oxigenado e! medio por burbujeo constante.Se realiza el registro de la actividad intestinal basa1.

.3.2. Experimento No. 2Se añade unas gotas de acetilcolina en el bañornaría y se obtiene un nuevo registro en el quimógrafo.

3.3. Experimento No. 3Se añade unas gotas de pilocarpina en el bañomaría y se obtiene un nuevo registro en el quimógrafo.

3.4. Experimento No. 4Se añade unas gotas de adrenalina en el bañomaría y se obtiene un nuevo registro en el quimógrafo.

3.5. Experimento No. 5Se añade unas gotas de pilocarpina en el bañomaría y se obtiene un nuevo registro en el quimógrafo.

3.6. Experimento No. 6Se añade unas gotas de atropina en el bañomaría y se obtiene un nuevo registro en el quimógrafo.

3.7. Experimento No. 7Se suspende la oxigenación y se obtiene un nuevo registro en el quimógrafo.

3.8. Experimento No. 8Se introduce un pedazo de algodón embebido en aceite en el extremo proximal intestinal y se observa suprogresión.

4. Discusión

MOTILIDAD GASTRO-INTESTINAL

ObjetivoEl objeto de esta práctica es estudiar los movimientos peristálticos rítmicos del aparato gastrointestinal y elcontrol  que  el  Sistema  Nervioso  Autonómico  tanto  Simpático   como  Parasimpático  ejercen  sobre  lamotilidad gástrica e intestinal; además demostraremos la influencia de los neurotransmisores acetilcolina yadrenalina sobre las funciones de contracción y relajación de la musculatura lisa gastrointestinal.

IntroducciónLa actividad motora del estómago está gobernada fundamentalmente por dos tipos de inervación ó redesde fibras nerviosas: una intrínseca a la vía gastrointestinal y otra extrínseca.a.-La  inervación  intrínseca  del  estómago  comprende  dos  plexos  interconectados  el  plexo  Mientérico  deAuerbach y el plexo submucoso de Meissner dentro de la pared estomacal, como lo hacen a través de todala vía intestinal. Estos plexos son directamente responsables de la peristalsis y otras contracciones. Comoeste sistema es continuo entre el estómago y el duodeno, la peristalsis del antro influencia la peristalsis delbulbo duodenal.b.- La inervación extrínseca es autonómica dual y proviene del Sistema Nervioso Autónomo: la Simpáticade  actividad  noradrenérgica  inhibidora,  vía  plexo  celíaco;  y  la  Parasimpática  de  actividad  colinérgicaexcitatoria, vía del Nervio Vago.La inervación simpática inhibe la motilidad lisa, pero contrae los esfínteres; y la parasimpática estimula lacontracción de la fibra m. lisa pero relaja los esfínteres. Estos dos sistemas juntos modifican la actividadmotora coordinada que se origina independientemente en el sistema intrínseco.Existe además un   marcapaso      controlador    en la curvatura mayor del cuerpo del estómago dentro de la capamuscular longitudinal. Este marcapaso es responsable del ritmo y frecuencia de las contracciones gástricasy genera una onda excitatoria que tiene un ritmo eléctrico basal (REB) de una frecuencia de 3/min. y unavelocidad  de  1  cm./seg.  cuando  pasa  por  el  cuerpo  del  estómago,  y  aumenta  hasta  3-4  cm./seg.  cuandopasa por el antro.El sistema nervioso entérico se conecta con el SNC mediante fibras simpáticas y parasimpáticas, pero escapaz  de  funcionar  de  manera  autónoma  sin  estas  conexiones.  El  plexo  mientérico  inerva  las  capas  demúsculo liso circular y longitudinal y tiene a su cargo principalmente el control motor; en cambio el plexosubmucoso  inerva  el  epitelio  glandular,  las  células  intestinales  endocrinas  y  los  vasos  sanguíneos  de  lasubmucosa   y   además   está   involucrado   sobre   todo   en   el   control   de   la   secreción   intestinal.   Losneurotransmisores  en  el  sistema  nervioso  entérico  incluyen  la  acetilcolina,  noradrenalina,  serotonina,Gaba,  ATP,  Oxido  nítrico,  CO  y  numerosos  péptidos,  CCK,  endotelina  2,  SustanciaP,  Neuropéptido  Y,VIP, etc.El PERISTALTISMO es una respuesta refleja que se inicia cuando la pared del intestino se elonga por elcontenido en el lumen y se presenta en todas las partes de la vía gastrointestinal desde el esófago hasta elrecto. Esta elongación inicia una onda de contracción circular detrás del estímulo y una de relajación en el

frente de éste. Esta onda de contracción se mueve en dirección oral-caudal para impulsar hacia adelantelos contenidos del lumen a una velocidad variable entre 2 a 25 cm. /seg.Aunque  la  actividad  peristáltica  puede  aumentarse  o  disminuirse  mediante  la  actividad  autónoma  delintestino, su presencia es independiente de la inervación extrínseca.El  estiramiento  local  libera  serotonina  que  activa  las  neuronas  sensitivas  que  a  su  vez  activan  el  plexomientérico. Las neuronas colinérgicas que pasan en dirección retrógrada en este plexo mientérico activan alas  neuronas  liberadoras  de  la  sustancia  P,  así  como  de  acetilcolina  y  dan  lugar  a  la  contracción  delmúsculo liso. Al mismo tiempo,  las neuronas que pasan en dirección anterógrada activan a las neuronassecretoras de NO, VIP, Y ATP para producir la relajación que precede al estímulo.El REB  del músculo  liso  gastrointestinal trabaja a un potencial de membrana entre  -65  y - 45  mV. EsteREB se inicia en las células intersticiales de Cajal, que son células mesenquimatosas estrelladas similaresal músculo liso y actúan como marcapasos, estas células de Cajal envían múltiples prolongaciones hacia elmúsculo liso intestinal. .El REB por sí solo rara vez produce contracción muscular, pero los potenciales deespiga sobrepuestos a la mayor parte de las porciones despolarizadas de la ondas del REB incrementan latensión (contracción) muscular. Las despolarizaciones se deben al ingreso del Calcio y las

repolarizaciones  a  la  salida  del  K.  Muchos  polipéptidos  y  neurotransmisores  afectan  esta  onda  de  ritmoeléctrico basal por ejemplo la acetilcolina incrementa la cantidad de espigas y la tensión (contracción de laF  m  lisa)  en  tanto  que  la  adrenalina  disminuye  la  cantidad  de  espigas  y  la  tensión.  En  el  estómago      la   frecuencia del REB es de 4/min., en el duodeno 12/min., colon, 9/min., ciego 16/min. Por lo tanto el rolfisiológico  del  REB  es  coordinar  la  actividad  peristáltica  y  otras  actividades  motoras  gastrointestinales.Las  contracciones  se  producen  solamente  durante  la  parte  despolarizante  de  las  ondas.  Si  hacemos  unavagotomía el peristaltismo estomacal de hace irregular ó a veces caótico. La motilidad gastrointestinal y lasecreción es regulada también por polipéptidos biológicamente activos que son segregados por las célulasnerviosas y las células glandulares de la mucosa, algunas son paracrinas y otras endocrinas y se les llamahormonas   gastrointestinales ,  aunque  sus  efectos  fisiológicos  son  discretos,  sin  embargo  sus  alteracionespueden producir enfermedades del tránsito intestinal (ejemplo algunas diarreas motoras).Se agrupan en familias, y entre algunas ellas tenemos:Familia de la Gastrina: Gastrina y CCK (ó CCK-PZ: Colecistoquinina-pancreocimina)Familia de la Secretinas: GIP, Secretina, VIP, enterogastrona.Otros grupos: Motilina, Sustancia P, Serotonina.

Materiales, equipos, animales de experimentación y reactivos.- Para cada mesa de trabajos prácticos:

Materiales:01 sapo vivoTabla de corcho para soporte y fijación anfibioAlfileres para sujeción extremidades01 par guantes descantablesEquipo de disección quirúrgicoEstilete para sección medular y tijera, algodón04 jeringas descartables de 3 ml

Reactivos:Solución de Ringer para anfibio fresca a 30 °CCol. Azul de metilenoSol. Acetilcolina 1%Sol. Adrenalina 1%Sol. Atropina 1%Prostigmine (Neostigmina): 0.5  mg / 1ml ampolla

parasimpáticomimétrico.01 Aguja descartable de 18 G x 1 ½01 Aguja descart. doblada  en 90°3  hilos  blancos  de  15  cm.  largo  N°  50  para  las

ligadurasCánula de vidrio 2mm diám. ad-hoc

Procedimientol.- El alumno realizará la preparación de sapo espinal según lo aprendido para producir el shock espinal enel sapo (Ver práctica de reflejos en animal espinal) y realizará la hemostasia con algodón por compresión.2.- Disección: Sujetar luego el animal en posición decúbito dorsal en la tabla de fijación con los alfileres yrealizar un corte en toda la línea medio abdominal y seguir disecando por planos hasta llegar al peritoneo.3.-Abrir la cavidad abdominal en la misma forma y localizar el estómago cardias, estómago, píloro eintestinos. Observar de inmediato y muy cuidadosamente los movimientos peristálticos espontáneos delestómago e intestinos. Anote estas observaciones basales . Si estuviesen ausentes estimularlosmecánicamente.4.- Con un algodón mojado en Ringer-Batracio a 30° mantener en todo momento la preparación bienhúmeda con instilaciones abundantes de la sol. Ringer.5.- Aplicar sobre el estómago e intestino (en cada uno) 6 gotas de cada una de las siguientes soluciones enel orden: a, b, c, d, e siguiente:

a.- Acetilcolina: observar visualmente la respuesta, anotar y   lavar      con      Ringer   b.- Adrenalina: observar visualmente la respuesta, anotar y   lavar      con      Ringer   c.- Fisostigmina: observar visualmente la respuesta, anotar y   lavar      con      Ringer   d.- Atropina: observar visualmente la respuesta, anotar y   lavar      con      Ringer   e.- Al final, nuevamente Acetilcolina: observar visualmente la respuesta, anotar y   lavar      con      Ringer.   

Graduar las observaciones visuales de relajación o contracción con cruces, comparando con losmovimientos peristálticos espontáneos del inicio del experimento.

Conclusiones y Comentario

EFECTOS DE LA HORMONA TIROIDE EN RATONES

IntroducciónEI trabajo biológico tiene como  fuente de energía a los enlaces intramoleculares  y puede ser  medido en

condiciones  de  actividad  o  reposo.  A  esta  última  condición  se  le  denomina METABOLISMOBASAL, que puede ser medido directamente por el método calorimétrico o indirectamente por elconsumo de oxígeno.Las hormonas tiroideas incrementan el metabolismo basal, el consumo de oxígeno por los tejidos yla producción de calor por el organismo. Estas hormonas activan los procesos oxidativos celulares.En humanos, extirpación de la glándula tiroidea disminuye el consumo de oxígeno a cifras inferiores, del30 a 50% de lo normal. En los hipertiroideos aumenta el consumo de oxígeno.EI aumento o  disminución del metabolismo basal a partir de la determinación del consumo de oxígeno seempleó   como   un   método   diagnóstico   del   hipertiroidismo   y   del   hipotiroidismo.   En   los   sujetoshipertiroideos con sintomatología definida el metabolismo basal está incrementado en 40 a 60% y puedesuperar más del 100%. Al aumentar el metabolismo disminuyen las reservas de carbohidratos y se empleagrasas para cubrir las necesidades metabólicas. Este produce pérdida de peso y aumento de la temperaturacorporal.   Debido   a   que   los   mecanismos   de   disipación   de   calor   están   sobrecargados,   los   sujetoshipertiroideos  toleran  muy  mal  los  ambientes  cálidos.  Las  hormonas  tiroideas  aumentan  la  frecuenciacardiaca y la presión arterial sistólica.EI sujeto hipotiroideo presenta síntomas opuestos: metabolismo bajo, temperatura inferior a la normal,depósito de grasa y reacciones lentas.En la presente práctica se comparará los metabolismos de ratones hipotiroideos e hipertiroideos conratones eutiroideos ( normales).Diez  a  quince  días  antes  del  experimento  se  toma  ratones  machos  adultos  jóvenes,  de  la  misma  edad  ysimilar peso. Se los coloca en jaulas separadas, que se rotulan eutiroideo, hipertiroideo e hipotiroideo. Losratones serán pesados todos los días.EI ratón hipertiroideo recibe diariamente 15 ug. D levotiroxina. EI ratón hipotiroideo recibe diariamente1.25 g de metimazol.MaterialRatonesJaulasJaulas ó cámarasmetabó1icasCal sodada

MetimazolLevotiroxinaTermómetroPlastilina

MétodoExperimento N° 1

Se coloca en tres jaulas metabó1icas a un ratón eutiroideo, uno hipertiroideo y uno hipotiroideo.Las  jaulas  o  cámaras   metabó1icas  deben  contener  cal  sodada.  Se  recomienda  que  los  animales  recibanluz, ya que esta permite que se mantengan quietos, pues los ratones son muy susceptibles a los ruidos a losmovimientos bruscos.

Se coloca un termómetro dentro de cada jaula metabólica. Se espera cinco minutos para que se equilibre latemperatura dentro de la jaula y se registra.

Se humedece el interior de la pipeta colocada en la tapa de la jaula metab61ica con agua jabonosa.

Se coloca una película de espuma de jabón al final de la pipeta y se observara como, a que medida que elanimal  va  consumiendo  el  oxígeno,  la  película  de  jabón  va  moviendo  a  lo  largo  de  la  pipeta.  EI  CO2

producido será absorbido por la cal sodada.Con un cronómetro se determina el tiempo requerido para consumir 1 cm3 de oxigeno y se convierte lossegundos en fracción centesimal.A continuación se calcula en consumo de oxígeno por minuto del animal y se convierte litros por hora.Este volumen calculado se encuentra en condiciones ATPS y debe ser convertido en condiciones STPD deacuerdo a la siguiente fórmula:

o

Vo STPD = {[Vol ATPS x (Pb - PH2O / Ts)] / 760} x [273 / (273 + Ts)]

Donde:

Vol = L/hPb= presión barométrica.PH2O= presión de vapor de agua Ts= temperatura del apartoEI  valor  cal6rico  del  oxigeno  varia  según  el  cociente  respiratorio.  Con  una  dieta  promedio  el  cocienterespiratorio es 0.8 y el equivalente cal6ricodel Oxígeno   es 4.8 Kcal/l, por 1o que el número de caloríaspor hora será:

Cal/h = 4.8 cal/l x L/hDado que el número de calorías es proporcional al peso y a la superficie corporal, entonces:

S=K x W   2/3

oS = K x logW X 2/3

Donde:S = superficie corporalK = constante de von Muralt

Equivalentes calóricos a diferentesCocientes respiratorios (R)R no proteico Equivalente calórico en cal/L0.700.750.800.850.901.00

4.694.744.804.864.925.05

Animal Constante de von Muralt

HombreConejoCaballoRatón

12.311.28.511.4

EI resultado esta expresado en centímetros cuadrados y debe convertirse a metro cuadrados:

m2 = cm2/10000

EI metabolismo es igual:Metabolismo = (cal/h) / S en m2

oMetabolismo = cal/m2/h

Consideremos un ejemplo práctico:

MEDICIÓN DE LAS Kcal PRODUCIDAS EN UN RATÓN EN SUMETABOLISMO

Peso del ratón: 28 g1) Consumo de O2 en ml/min

Si el  ratón en 40  seg consumió 1ml de O2

en 60 seg cosumirá x ml de O2

xml O2

(   60   seg   )   (1 ml   de   O 2   ) 40 seg

1,5 ml de O2 / min

2) Consumo de O2, en ml/h , en condiciones ATPSEl ratón consume 1,5 ml de oxígeno en 1 minEl ratón consumirá x ml de  oxígeno en 60 min

Consumo de O2 en 1 hora = x ml O2 / h(1,5   ml   de   O 2   )   (   60   min)

1min90 ml de O2 / h     en

condiciones ATPS

3) Consumo de O2 en ml/h en condiciones STPDa) 90 ml/h = 0,09 L/hb) Encontrar  el  factor  de  conversión:  Si  la  presión  barométrica  fue  de  754  mm  de  Hg  y  la

temperatura fue de 37ºC encontramos en la tabla que el factor de conversión es  0,867.c)   Multiplicando el consumo de O2 en ml/h por el factor de conversión tendremos:

(0,09 L/h) (0,867)= 0,078 L de O2/h  como consumo en condiciones STPD.4) ¿Cuántas Kcal se habrán producido  cuando  el ratón en su  metabolismo  consumió  0,078  L/  de

oxígeno, en condiciones STPD?a)   Sabemos que en una dieta mixta el equivalente calórico  del O2 es de 4,825 Kcal/L de oxígeno.b) Entonces podemos calcular las Kcal/h  producidas por nuestro ratón, razonando así:

1 L de 02 ………………………….equivale a 4,835 Kcal0,078 L de O2 equivale a…………………x   KcalO sea:

x Kcal0,078   L   de   O 2   /   h   (   4,825   kcal )

1L de O2

0,367 kcal / h

c) Pero  para  poder  comparar  un  indivíduo  con  otro  debemos  referir  este  resultado  al  área  desuperficie corporal (ASC).i) Calculo del ASC: peso del ratón  de 28g de peso

ASC = 11,4( peso 2 / 3 )

según Mulralt la K=11.4

0,01m

ii) Aplicando la fórmula en nuestro ratón:

ASC   11,4(282/ 3 )   11,4(3 282 )   11,4(3 784)   11,4(9,22)   105,11cm2

iii) Convertir los cm2 a m2:

1 m2 tiene   100 cm(100 cm)= 10.000 cm2

Luego nuestro ratón tiene como ASC:

105 cm2

10.0000,01 m2     como ASC en m2

iv)   Entonces nuestro ratón produce 0,376 kcal/h/0,01 m2

5) ¿Cuántas Kcal por m2/h produce nuestro ratón?

Si el animalito produce  0,376 kcal por 0,01 m2

Entonces producirá x   Kcal por 1,00 m2

X Kcal/m2/h=(0,376 Kcal )   (1 m 2   )  

N 2 37,6 Kcal / mmm2 / h      (RESPUESTA)

ATPS: Ambient Temperature Pressure saturated (con vapor de agua)

STPD: standard temperatura and pressure dryEl  consume  de  Oxígeno  y  CO2  producido  son  estandarizados  a  la  temperatura  standard  (0ºC)  a  lapresión barométrica  a nivel del mar (760 mm de Hg) y a condición de gas seco.

Profesor Enrique Avila Zamora

Lima  13 de noviembre del 2010

GONADOTROFINA CORIONICA HUMANA

CORION PLACENTARIO  Embriol y Estructura Liso y Frondoso (Vellosidades) DIBUJO PRACTICAhCGH crv  2013: Fases : Fecundación Blastómero de dos células  a las 24 hs; luego 4 células a las 6 hs;

16 células  al 4º día ; Sigue la multiplic celular hasta MORULA; Luego Blastociste y Blastocele;

Luego  viene la IMPLANTACION  del blastocisto en mucosa uterina a los 6 días de la fecundación;Luego numerosas células del citotrofoblasto se convertirán en   sincitio trofoblasto  y éste en el Corion

Liso y otras corion frondoso o velocidades , es el Corion velloso.. Así la Placenta tendrá dos partes Fetal

(Corion  )  y Materna (mucosa uterina). Veamos pues las figuras para mejor repasar la embriología del

CORION , antes de entrar a la Fisiología de la hormona  hCGH: Son 4 figuras de la Embriología :

Fig N° 1

FIG N° 1

Fig N° 2

FIG N° 2

Figura N°3

Fig N°3

Fig N° 4

La Gonadotrofina aperece precozmente y  desde ya funciona:

El Corion Placentario secreta a partir del TERCER mes  la PROGESTERONA, hCG , Relaxina,

Somatotrofina o Lactógeno placentario humano (HPL)

Fig.

4

TOLERANCIA A LA GLUCOSA

IntroducciónLa  glicemia  en  condiciones  basales,  varía  entre  70  y  110  mg/dl,  (  0  3.8  a  5.6  mmol/L.  )En  la  diabetesmellitus se presenta elevación de la glicemia en ayunasEn la práctica vamos a estudiar la respuesta del organismo  a una carga de glucosa  es el llamado test deTolerancia a la glucosa..

MaterialSujeto de prueba en ayunas.Glucosa 75 gr. Anhidra disuelta en 300 ml de agua más zumo de tres limones.Glucómetro "Glucotrend" con las cintas reactivas.Balanza.Tallímetro.Tubos   de   prueba.Pipetas.1   fiola   de   100   ml.Matraz de 1000 ml.Reactivos para análisis de glucosa en orina:Sulfato de cobre (puro cristalizado) 17.3 gCitrato de sodio o potasio (cristalizado) 173.0 g Carbonatode sodio (cristalizado) 200.0 gAgua destilada, c.s.p. 1000.0 ml

Peso previo:Colocar el chip del glucómetro.Encender y ver el número de cinta reactiva que reconoce para su uso.Colocar la tira reactiva en el glucómetro para su reconocimiento.

Método

Experimento N° 1Pesar y tallar al alumno en estado de ayuno de 12 horas.Hacer una determinación de glicemia en ayunas y después administrar una solución de 75 gr de glucosa.Obtener  muestras  de  sangre  cada  30  minutos  por  2  horas  y  determinar  la  glicemia.  Simultánea  buscarpresencia de glucosa en orina.  Construir el gráfico correspondiente.

EXPERIMENTO N° 2: Test de BenedictEI test de Benedict puede detectar concentraciones tan pequeñas como 0.15 a 0.2 por ciento de glucosa. Lasolución de Benedict no es reducida por el ácido úrico, la creatinina, c1oroformo ó aldehídos.

DIABETES EXPERIMENTAL ALLOXANTICA

IntroducciónEn  la  práctica  la  Diabetes  Mellitus  se  presenta  en  dos  modalidades.  Insulina  Dependiente  (tipo  1)  eInsulina  No  Dependiente  (tipo  2).  Estudiaremos  la  Diabetes  de  Tipo  I  por  medio  de  la  destrucciónexperimental  de  las  células  beta  del  páncreas  por  medio  de  la  administración  intraperitoneal  de  unasustancia tóxica Alloxan en la rata , es la Diabetes experimental. Diferenciaremos la glucosuria diabéticade la glucosuria renal y para ello emplearemos además, en esta práctica  otra sustancia tóxica, el  Phlorizin(Floricina)  que  es  un  glucósido  que  provoca  glucosuria  en  el  mamífero  .  La  floricina  es  un  venenoenzimático que disminuye la cantidad de energía disponible para el transporte activo de la glucosa desde la

luz del túbuli   proximal al interior de la célula tubular y desde ésta a la sangre y disminuye la reabsorcióntubular de glucosa., es decir,   intoxica al túbulí   renal   produciendo   glucosuria      renal   , (que es una afeccióntubular en la cual aparece glucosa en la orina con niveles normales de glucosa en la sangre). Sabemos quelos  estudios  con  micropunción  han  demostrado  que  la  glucosa  es  reabsorbida  completamente  en  el  tuboproximal  y  su  depuración  es  cero.  La  administración  del  tóxico  floricina produce  aclaramiento  de  laglucosa y  esta  tasa  de  aclaramiento de  la  glucosa  va  aumentando  hasta  igualar  a  la  inulina,  estodemuestra  que  la  floricina  disminuye  la  reabsorción  tubular  de  glucosa y  puede  llegar  a  producir unbloqueo  completo  de  la  reabsorción  tubular  de  la  glucosa  y  así  se  explica  presencia  de  glucosuria  renalpor floricina. En la Diabetes Mellitus el orígen  de la glucosuria es diferente siendo el mecanismo primariola  hiperglicemia  y cuando  la  glucosa  en  el  plasma  va  incrementando  hasta   llegar  a  un  nivel  en  que  lascélulas tubulares proximales alcanzan su máxima capacidad  de reabsorción  de la glucosa; y  es cuando lacarga  de glucosa filtrada por los glomérulos rebasa la capacidad máxima de reabsorción de los túbulis queaparece glucosa en la orina. El valor medio de la TmG es de 375 mg/min/1.73 m2 para los hombres y 303mg/min/1.73 m2 para las mujeres.En la Diabetes Mellitus existe   un nivel elevado previo de glucosa   en la sangre antes de que aparezcaglucosuria.

Materiales y  Reactivos y Animales de experimentación.

3 Animales de experimentación: ratas de 200 a 300 gr. De peso, bien hidratadas en ayunas.3 Jaulas metabólicas.3 Jeringas de insulina3 Jeringa con aguja de 5 ml.Alloxan en solución 4% (4000 mg en 100 ml de suero fisiológico).1 glucómetro con cintas reactivas.Insulina cristalinaPhlorizin  (  Floricina  )  en  solución  al  4%  en  soluciónsalina.1 tijera.2 tubos de prueba.Reactivos de BenedictProcedimientoIdentificar tres ratas A, B, y C .Determinar la glicemia basal en las tres ratas previamente pesadas (la muestra de sangre se obtiene de lacola a través de un corte en el extremo).Administrar vía intraperitoneal:-   A la rata A (control) se administra vía intraperitoneal 1.5 ml de   Suero      fisiológico   .- A la  rata  B:  se  administra  vía  intraperitoneal      Alloxan     en  solución  al  4%  a  la  dosis  de  200  mg.  par

kilogramo de peso corporal.- A la rata C: se administra vía intraperitoneal   Phorizin    en solución al 4% a la dosis de 200  mg. por

kilogramo de peso corporal.En la rata B hacer control cada 5 minutos hasta que se haga diabética, y  luego cada 20 minutos.A la rata diabética administrar Insulina intraperitoneal a la dosis de 1 U! por cada 100 gramos depeso.

Discusión