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Graduação em BiotecnologiaDisciplina de Técnicas Instrumentais
Prof. Fabricio Rochedo Conceiçã[email protected]
11 de maio de 2012
Espectrofotometria
Espectrofotometria visível e ultravioleta
• Método analítico baseado em medidas de absorção de radiação eletromagnética
• Permite identificar e quantificar compostos orgânicos e inorgânicos
• Região ultravioleta – 200 a 400 nm
• Região visível – 400 a 800 nm
Aplicações• Esta técnica é muito usada em laboratórios de
controle de qualidade (indústrias), pesquisa e de análises clínicas e toxicológicas
• Em biotecnologia: - Proteômica - Genômica - Transgenia - Expressão de proteínas recombinantes...
*** Análise de proteínas, DNA e RNA
Absorção de Radiação
• Vários fenômenos podem ocorrer com a radiação luminosa, como: reflexão, refração, espalhamento ou absorção
Absorção de Radiação
• Os comprimentos de onda que uma certa substância absorverá são característicos da sua estrutura, diferindo de substância para substância. Exemplos:
– DNA e RNA = 260 nm – Proteínas = 280 nm– Células bacterianas = 600 nm– Benzeno = 255 nm ...
Lei de Lambert-Beer
• Através dessa lei, intensidades da radiação incidente e emergente podem ser relacionadas com as concentrações do material presente na solução
– Efeitos de reflexão, refração e espalhamento não são considerados nessa lei.
– A radiação incidente deve ser monocromática
Lei de Lambert-Beer
• I0 = intensidade da luz incidente
• I1 = é a intensidade da luz uma vez tendo atravessado o meio
• l = é a distância que a luz atravessa
A = - log10 TA = - log10 T
T = I1 / I0T = I1 / I0
Transmitância• É a intensidade de luz remanescente após passar por
uma amostra de matéria.• 0 a 100%
Absorbância• É a capacidade do material em absorver radiações de
comprimento de onda específico. • 0 a 2
ENFIM, a lei de Lambert-Beer permite determinar a concentração de uma substância em função da absorção de luz
Espectrofotômetro
• É um instrumento que serve para medir a intensidade da luz em função de um comprimento de onda específico.
Diagrama de um espectrofotômetro
Fontes luminosas mais comuns
• Luz UV – Lâmpada de gás hidrogênio ou deutério– Mercúrio
• Luz Visível – Tungstênio
Cubetas
• Espectrofotometria de Luz Visível– Cubeta de Vidro ou Plástico
• Espectrofotometria de Luz Ultravioleta– Cubeta de Quartzo
Dicas• Localização do espectrofotômetro - Bancada estável e exclusiva (se possível) - Longe de fontes eletromagnéticas (rádio, microondas...)
• Ligar 30 mim antes do uso
• Cubetas (tipo e manuseio)
• Calibração
Obrigado!