Granulocyttfunksjons undersøkelser

Haakon SjursenUniversitetet i Bergen/ Haukeland Universitetssjukehus

2013

H.Sjursen 1

Celler i blodCelle type Celler/mm3 FunksjonErythrocytter 4.8 – 5.4 x 106 Transport av O2 og CO2

Granulocytter 5000 - 9000 (ca 1 per 1000 røde)

Nøytrofile 70% Fagocytose

Basofile 1% Histaminproduksjon

Eosinofile 4% Toksiner mot parasitterNoe Fagocytose

Monocytter/Makrofager

5% Fagocytose

Lymfocytter 20% B celler: Antistoff produksjonT celler: Cellemediært immunitet

Plater 300 000 Blod koagulasjon

H.Sjursen 2

Den nøytrofile granulocytt

• Immunforsvarets raskeste

• Produksjon > 1 x 1011 /døgn

• ca. 1500 kg per 80 åring

• Rask turnover: ~ 10 t i blod

• Evt. 1–2 døgn i vev

• Endestadiecelle: effektorcelle

• Cytokinprodusent

H.Sjursen 3

3 linjer i forsvaret mot infeksjon

H.Sjursen 4

(Innate immune defence)

Andre linje forsvar - Fagocytose

Fagocytose Gresk: fago = spise og cyto = celle

– Fagocytose utføres av nøytrofile og monocytter/makrofager

– Nøytrofile dominerer tidlig i infeksjonen

– Makrofager er monocytter som forlater blodbanen og utvikles

til makrofager som vandrer i vev

– Histiocytter er makrofager lokalt i lever, nervesystem, lunger,

lymfeknuter, beinmarg o.a. vev H.Sjursen 5

• Marginasjon – «Rolling» langs endotelveggen

• Adhesjon• Migrasjon• Diapedese (emigrasjon)• Kjemotakse• Fagocytose• Intracellulært drap

• NB: kan ha nedsatt funksjon tross normale granulocytter:• Ved antistoffmangel eller komplementmangel

Den nøytrofile granulocytt

H.Sjursen 6

Marginasjon - Adhesjon - Migrasjon - Diapedese

H.Sjursen 7

H.Sjursen 8

A neutrophil adheres to the endothelium in a venule (1). It extends its pseudopodium between the endothelial cells and migrates towards the basement membrane (2). After the neutrophil has crossed into the tissue, the endothelium reseals behind (3). The entire process is referred to as diapedesis. (Courtesy of Dr I Jovis)

Kjemotakse: Fagocyttene trekkes til Infeksjonsfokus

H.Sjursen 9

Klassisk og alternativ komplement pathways trigger spalting av C3

H.Sjursen 10

Membran Attack Complex (MAC) forårsaker cytolyse

H.Sjursen 11

H.Sjursen 12

H.Sjursen 13

H.Sjursen 14

Reseptorer og signal interaksjoner ved fagocytose av mikrober

(Underhill DM, Ozinsky A, Annu Rev Immunol 2002, 20, 825

H.Sjursen 15

Mange reseptorer er involvert. Svikt i én reseptorgruppe kan delvis kompenseres om andre reseptorer er normale

Stadier i fagocytose -11. Adheranse: Fagocyttens plasmamembran

fester seg til bakterieno Hemmes av kapsel (pneumokokker) og M

protein (GAS)o Opsonisering: Coating prosess med

opsoniner som letter festeo Opsoniner: Antistoff og komplement

2. Internalisering: Plasmamembranen på fagocytten danner pseudopoder som omgir mikroben

3. Mikroben omsluttes av en sekk kalt fagosom

4. Intraacellulært drap: Fagosomet fusjonerer med lysosomet og danner fagolysosomet

H.Sjursen 16

Phagocytose

H.Sjursen 17

Stadier i fagocytose -25. Lysosomale enzymer dreper bakterien innen 10 sec – 20 min.

– O2 uavhengig

• Lysozym: Ødelegger peptidoglykan i bakteriens cellevegg

• Lipaser

• Lactoferrin

• Proteaser

• RNAser og DNAser

6. Etter nedbryting dannes residual legemet med ufordøyelig materialer som blir utskilt fra cellen

H.Sjursen 18

Oxidativ burstO2 - avhengig

a) Myeloperoxidase (MPO)b) MPO- uavhengig1. H2O2

2. Superoxid anion O2¯3. Hydroxyl radikal OH ¯ 4. Singlet oxygen O2* 5. Ascorbat-peroxid-metall ion 6. Aminosyre oksidasjon

2O2 + NADPH 2O2¯ + H+ + NADP +

2O2¯ + 2H+ H2O2 + O2

H.Sjursen 19

H.Sjursen 20

H.Sjursen 21

Elektronmikroskopi av en granulocytt som har internalisert Staphylococcus aureus (S)

Intracellulær lokalisering av bakterier

Fagosom

Lysosom

ChlamydiaeLegionellaMycoplasma

ListeriaIngen fusjon med lysosomet

Fagolysosom

S.aureausBrucellaSalmonellaCoxiella burneti

pH=5.0

3

4

2

1

Fusjon

pH=7.4

B

B

B

B

BB

Cytoplasma

Intracellulær lokalisering av antibiotika

Fagolysosomvolum 1 to 5% av cellevolumetpH=5.0

Macrolider (x10-50)Aminoglycosider (x2-4)TetracyklinerFluoroquinoloner

CytoplasmaFagosompH=7.2

Fluoroquinoloner (x2-8)beta-lactamer (x0.2-0.6)Rifampicin (x2)Aminoglycosides (slow)

Intracellulær antibiotika aktivitet

Fagolysosom pH 5.0

Macrolider AminoglycosiderLav eller 0

Cytoplasma PH 7.2Fagosom pH 7.2

Fluoroquinolonerbeta-lactamer*Rifampicin AminoglycosiderMacrolider

God Fluoroquinoloner, Doxycyclin God

* Husk:Mycoplasma, Chlamydia, Legionella har ikke cellevegg: β-lactamer virker ikke!

Chlamydia Legionella Mycoplasma

Listeria

S aureusBrucellaSalmonellaCoxiella

Fagocyttfunksjons undersøkelser• Måles ved Fagocytose laboratoriet ved Institutt for Indremedisin,

Universitetet i Bergen• Nasjonal referanse laboratorium• Hva måles:

– Kjemotakse– Fagocytose– Intracellulært drap– Reseptor ekspressjon: Fc- , komplement reseptorer o.a.

• Hvorfor: Fordi det finnes medfødte og erværvede defekter i alle disse funksjonene

H.Sjursen 25

Kjemotakse defekter

• Komplement mangel/defekter

• Inhibitorer (SLE o.a. autoimmune sykdomer

• Cellulær svikt: Chédiak-Higashi syndrom

• Immunglobulinmangel (IgA, IgG 1-4)

• Hyperimmunoglobulinemi E (Job’s syndrom)

• Hypofosfatemi

• Opsonindefekter

• Mannan bindende protein (Lectin) mangel

H.Sjursen 26

• Normalt: →1.8 mm/t

• Nedsatt ved:

Noen infeksjoner

Brannskader

Malignitet

Underernæring

Revmatoid arthritt

Diabetes mellitus

Nøytrofile defekterDefekt i nøytrofil- avhengig immunforsvar

Kvantitativ Nøytropeni – den vanligste

– Ervervet • Medikament indusert• Autoimmun• Cancer• Leukemi

– Hereditær• Familiær benign

(etnisk) nøytropeni• Infantil genetisk

agranulocytose (Severe congenital neutropenia)• Cyklisk nøytropeni

H.Sjursen 27

Kvantitative Granulocyttfunksjons defekter

• Leukemi, aplastisk anemi, nøytropeni, brannskader, sepsis, diabetes, underernæring, AIDS, nyfødte

• Hyppigere og alvorligere infeksjoner

• Ofte med spesielle mikrober

• Rammer ofte mononukleære fagocytter tilsvarende

• Funksjonsdefekten fører til lite kliniske funn tross fulminant infeksjon

• Sjelden sepsis og meningitt

H.Sjursen 28

Kvalitative nøytrofile defekter

H.Sjursen 29

• Adhesjonsdefekter

– Leukocytt adhesions mangel (LAD)

• Type 1 Integrin mangel

• Type 2 E-selectin ligand mangel

Defekter i intracellulært srap• Abnormalt respiratory burst

• Kronisk granulomatøs sykdom

(CGD)

• Glukose-6-fosfat mangel

• Granula abnormaliteter

– Myeloperoxidase mangel

– Spesifikke granula mangler

– Chédiak-Higashi syndromH.Sjursen 30

H.Sjursen 31

Nøytrofil og lymfocytt fra en pasient med Chediak-Higashi syndrom. Store dysmorfe granula (se pil)

Kronisk granulomatøs sykdom (CGD)

• 1: 250 – 500 000 (?)

• 70% x-bundet recessiv

• Mutasjoner i gener for 4 plasmamembran proteiner

• Svært nedsatt H2O

2produksjon

• Excessiv inflammasjon med granulomer

• DHR-test (Dihydro-rhodamin for intracellulært drap)

H.Sjursen 32

Kronisk granulomatøs sykdom (CGD)

• Alvorlige infeksjoner i hud, øre, lunger, lever, bein– Gingivitt, aphter

– Infeksjoner med katalase-produserende mikrober:• Staphylococcus aureus• Bacillus cepacia• Aspergillus

Behandling: antibiotika og IFN-γ profylakse

H.Sjursen 33

Behandling av granulocytt defekter

• Antibiotika profylakse

• Granulocytt transfusjon (CGD)

• Beinmargs transplantasjon

• Gen terapi (CGD)

• Stamcelle transplantasjon

– CD34

H.Sjursen 34

Granulocyttfunksjonsundersøkelser

• Kjemotakse• Fagocytose (og drap)• Oxidative burst (DHR-test)• Reseptorundersøkelser• Fc-reseptorer (CD16, 32, 64)• C-reseptorer (CD11/CD18, CD35)• IFNγR1• Toll-like reseptorer (2 og 4)

H.Sjursen 35

Kjemotakse

H.Sjursen 36

H.Sjursen 37

Transwell kjemotaksi plate Granulocytter: porestr. 3 µmMonocytter: porestr. 5 µm

ELISA plate Incubator/ Shaker (Labsystems i EMS) til kjemotaksi, fagocytose, ic. drap

H.Sjursen 38

96 brønners celle cultur plate i polypropylen m rund bunn til flowcytometer

Flowcytometer (Cytomics FC 500 MPL (Multi-plate loader)

H.Sjursen 39

• Væskestrømscytometri• Fagocytose og oxidativ burst• S. aureus og opsonisert zymosan

• Fc- og Komplement reseptormåling

H.Sjursen 40

H.Sjursen 41

Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS)

H.Sjursen 42

Med to lasere

H.Sjursen 43

Med 3 lasere5 Color FACSort optical layout

Med 3 lasereMed 3 lasere

Med 3 lasere Gir 5 farger

H.Sjursen 44

FCM sorting av 3 ulike alger

H.Sjursen 45

Flow cytometer output of BacLight® stained marine bacteria. BacLight® is a dual nucleic acid stain that causes live bacteria to fluoresce green and dead bacteria to fluoresce red when excited with the 488 nm argon laser of the flow cytometer

H.Sjursen 46

Ly

Mo

Granulocytter

Celle-debris RBC

H.Sjursen 47

granMo

Ly

Flowcytogram for Oxidativ burst

Samme prinsipp for fagocytose og receptormåling med flere fluoriserende fargerH.Sjursen 48

OX.BURST S.aureus S.aureus S.aureus ZYM ZYM ZYM ZYM ZYM ZYM

SERUM: UTEN PHS PHS PHS PHS KTR KTR PAS PAS

Granulocytter % Med Fl1 Med Fl1 Med Fl1

Med Fl1 Med Fl1 Med Fl1

Med Fl1 Med Fl1

Med Fl1

       % av KTR  

% av KTR  

% av KTR  

% av KTR

KTR 100,0 0,4 62,6 100,0 117,5 100,0 112,0 100,0 116,5 100,0

PAS 1 100,0 0,4 1,8 2,9 7,6 6,5 5,7 5,1 8,7 7,5

OXIDATIVT BURST – INTRACELLULÆRT DRAP

H.Sjursen 49

Fagocytose av Staph.aureus-RGX

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

PHS KTR PAS

Opsoniserende serum

Fago

cyto

se (f

luor

esce

nce)

KTR-GRANPAS-GRAN

Oksidativ burst av Staph.aureus

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

PHS KTR

Opsoniserende serum

Oks

idat

iv b

urst

(flu

ores

cenc

e)

KTR-GRANPAS-GRAN

H.Sjursen 50

Reseptor undersøkelser

Merkes med: – isoktr-FITC – isoktr-PE: Phycoerythrin– isoktr-PC5: Phycoeryhrin – Cyanin 5

CD11b-PE: C-receptor IIICD18-FITC:CD35-FITC: C-receptor ICD16-PC5: Fc-receptor III

CD32-PE: Fc-receptor IICD64-FITC: Fc-receptor I

H.Sjursen 51

Leukocytt adhesjonsdefekt (LAD)• LAD1: CD18-defekt, CR3 (komplement reseptor III mangel)

• LAD2: CD15 selectin-mangel

• Nøytrofili

• Defekt adheranse, aggregering, kjemotakse og fagocytose

• Redusert inflammasjon tross fulminant infeksjon (rtg. thorax neg.)

• Infeksjoner i hud/mucosa, gingivitt/periodontitt

• S. aureus og gramnegative stavbakterier

• Prognose relatert til reseptor nivå

H.Sjursen 52

LAD hos pasient, arvet fra mor

Naess A, Sjursen H, Leegaard J: Leukocyte adhesion deficiency in a Norwegian boy. Scand J Infect Dis; 1999;31(6):600-2 H.Sjursen 53

*CD64, FcR I kompensatorisk økning

*

H.Sjursen 54

Rekvirering av analyser

• Undersøkelsene gjøres ved:Infeksjonsmedisinsk forskningslaboratorium, Klinisk Institutt 2,Det medisinsk-odontologiske fakultet, Universitetet i Bergen

• Forhåndsavtale nødvendig: • Kontakt Overingeniør Steinar Sørnes Tlf. 55973067• eller Haakon Sjursen Tlf. 55972924

Takk for oppmerksomheten!

H.Sjursen 55