guía de trabajos prácticos microbiología, parasitología e...

Guía de Trabajos Prácticos

Microbiología, Parasitología e Inmunología

Carreras: Licenciatura en Enfermería Licenciatura en Obstetricia

Microbiología Ambiental y Parasitología

Carrera: Tecnicatura Superior en Gestión Ambiental

Integrantes: Prof. Adjunta: Dra María Cecilia Villa

Prof. Adjunta: Mg. Silvia Dávila

Auxiliar de Docencia: Lic José Soria

UNViMe

2014

Guía TP Microbiología(Lic Enf, Lic Obst, TSGA)

2

2014

Trabajo Práctico Nº 1 Parte A: LA SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Objetivo

- Adquirir conciencia de los riesgos potenciales durante el trabajo en el Laboratorio de Microbiología

- Reconocer las vías de infección más comunes en el laboratorio - Identificar los distintos niveles de bioseguridad en Microbiología y los

requerimientos de protección personal, del medio ambiente y de las muestras en cada uno de ellos.

Introduccion

Las personas que trabajan en un laboratorio QUÍMICO están expuestas a una serie

de riesgos potencialmente graves. Comúnmente están en contacto con sustancias y

vapores tóxicos y explosivos, carcinógenos, sustancias cáusticas, altos voltajes,

radiaciones, etc. En un laboratorio de Microbiología hay que agregar otro riesgo: la

INFECCION por microorganismos.

La infección difiere de la mayoría de los otros riesgos en que los efectos no están

limitados a quien trabaja individualmente ni a sus compañeros de trabajo, sino que la

infección también puede ser transmitida fuera del laboratorio, a su familia, contactos

humanos casuales, animales domésticos o de experimentación, etc. No debe olvidarse

que pueden diseminarse agentes no patógenos para los seres humanos, pero capaces de

contaminar medios de cultivo, reactivos o que afectan la vida de las plantas.

Vías de infección más comunes en el laboratorio

- tracto digestivo: ingestión o transferencia de microorganismos desde dedos contaminados.

- mucosas: nasal, conjuntiva, aerosoles y manos contaminadas - piel – vía percutánea: inyección, cortes o escoriaciones. - respiratoria: es la más importante. El 80% de las infecciones contraídas en el

laboratorio son de origen aéreo por inhalación de aerosoles que transportan microorganismos o virus.

Importancia de la vía respiratoria

Se deben tener en cuenta 3 factores principales.


3

2014

- La facilidad con que se producen pequeñas gotas y partículas. - Las pequeñas partículas (entre 1-4 µm) no son retenidas en el tracto

respiratorio y llegan a pulmón. - La capacidad de la mayoría de los microorganismos patógenos para invadir

tejido pulmonar.

La infectividad de un microorganismo depende de:

- el tamaño de la dosis

- la susceptibilidad individual - la virulencia del agente (varía con el microorganismo y la cepa) - el sitio de invasión

Situaciones de riesgo más comunes en el Laboratorio

Mecanismo de producción de aerosoles

La producción de aerosoles es generada por 2 mecanismos:

- atomización de suspensiones líquidas - molido muy fino de material sólido infectado

Muchas técnicas de laboratorio producen distintos aerosoles mediante burbujeo,

salpicadura, espuma, quemado del ansa, y dos mecanismos adicionales: vibración de alta

frecuencia y fuerza centrífuga. Los aerosoles también se producen cuando se manipulan

cultivos secos, liofilizados o secados con acetona (ej. cuando se destapan tubos o

ampollas).

Técnicas comunes de laboratorio Además de la producción de aerosoles hay que tener en cuenta el riesgo que se genera como consecuencia de la deposición de material infectado sobre distintas superficies, como la mesada de trabajo, elementos personales como cuadernos, lapiceras, y las propias manos, a partir de las cuales los microorganismos pueden ser transferidos a la piel, boca y ojos. Es recomendable el uso de guantes descartables, barbijo y gafas.

Pipetas y pipeteo

Las pipetas se preparan para conservar su esterilidad hasta que son utilizadas. Una

práctica casi universal es colocar un tapón de algodón en la parte superior para prevenir la

entrada de polvo. Sin embargo, el tapón protege relativamente a quien usa la pipeta ya


4

2014

que es fácilmente penetrado por microorganismos presentes en suspensiones líquidas. Las

pipetas contaminadas se descartan siempre en un frasco con lavandina.

El pipeteo oral debe ser evitado en Microbiología. Se recomienda el uso de propipeta.

El ansa

Mediante el flameado (quemado directo a la llama) del ansa o agujas contaminadas se

puede producir diseminación de organismos, particularmente cuando se trabaja con

inóculos semi-sólidos (ej. suspensiones de esporas, colonias de Mycobacterium o esputo).

También puede ocurrir con pequeños volúmenes de líquido.

El mismo riesgo se corre cuando se introduce el ansa caliente en un líquido, o se hace

contacto con la superficie de agar de un cultivo.

El ansa fría, una vez cargada, puede contaminar cuando se producen vibraciones o rápidos

movimientos de aire que causen desprendimiento de pequeñas gotas. Por esta razón, no

agite ni sacuda el ansa mientras trabaja.

Las placas de agar

La principal fuente de infección resulta cuando cae al suelo y se rompe una placa de Petri

con cultivo. El mismo riesgo se corre cuando se utilizan tubos o botellas con agar. En esos

casos, neutralice la contaminación con lavandina diluida y después de unos minutos

comience el operativo de limpieza usando guantes. Confine los restos de vidrio en un

recipiente que luego será esterilizado.

Tapones y tapas

La remoción de tapones de algodón, tapas a rosca o tapones de goma u otro tipo de tapa

en tubos con caldo de cultivo, tubos de centrífuga, etc., puede crear aerosoles de varias

maneras, sobre todo si los cultivos han sido agitados y hay material particulado. Oriente la

boca del tubo hacia el mechero en el momento de abrir!

Hay que tener presente que los tapones de medios líquidos (sobre todo si se agitan

previamente) pueden estar humedecidos con material infectivo. Si es necesario agitar el

tubo, hacerlo con suavidad para evitar este inconveniente.


5

2014

Precauciones

Las medidas preventivas a tomar caen en 6 categorías:

- protección física del trabajador (guardapolvo, guantes, barbijo, gafas, uso de propipeta, etc.)

- técnicas cuidadosas: buen manejo de la técnica aséptica - métodos de confinamiento del agente (cámaras de bioseguridad, flujo laminar

vertical, ambientes aislados con presurización positiva o negativa, recipientes con desinfectante para descartar material contaminado, envases bien tapados, sin filtraciones).

- barreras intangibles (desinfección del aire: uso de lámparas UV, áreas estériles) - desinfección en general (empleo de etanol al 70%, alcohol iodado, lavandina

diluida u otros productos según el caso: piel, superficies inertes, instrumentos metálicos, etc).

- medidas inmunológicas (vacunación del personal cuando sea posible)

Requerimientos recomendados para distintos niveles de bioseguridad en Microbiología

Nivel Prácticas y técnicas Equipamiento Alcance

1 Prácticas microbiológicas standard

Ninguno Agentes bien caracterizados que presentan riesgo mínimo para el personal y el medio ambiente Ej. Bacillus subtilis

2 Personal con entrenanamiento específico. Acceso restringido absoluto

GBS clase I ó II Agentes de moderada peligrosidad para el personal y el medioambiente. Ej. Salmonella, sangre, fluidos corporales, tejido humano y animal

3 Acceso más restringido. Registro de visitas y accidentes. Barreras de contención física: máscaras, guantes, rotores sellados, filtros HEPA

GBS clase II Agentes con potencial de transmisión aérea que pueden causar infección seria potencialmente letal. Alto riesgo personal, bajo riesgo comunitario Ej. Mycobacterium, Coxiella

4 Barreras de aire con el exterior. Cambio de ropa y ducha. Intercambio de ropa sucia a limpia por tuberías.

GBS tipo III Traje presurizado

Agentes exóticos productores de enfermedades letales para los que no existen vacunas ni terapia. Ej: virus Ebola


6

2014

GBS: gabinete de bioseguridad.

Dirección de aire “limpio” Dirección de aire “contaminado”

REGLAS A TENER A CUENTA EN CADA SESIÓN DE TRABAJOS PRÁCTICOS

1. Reportar los accidentes al docente a cargo del Trabajo Práctico, no importa lo insignificante que puedan parecer. Se debe reportar toda enfermedad o lastimadura tan rápido como sea posible. La pérdida de tiempo en la identificación de una infección de laboratorio puede tener graves consecuencias.

2. Tratar a todos los microorganismos como patógenos potenciales para el ser humano, o contaminantes para los cultivos vecinos. Rotular todo el material infectivo para prevenir confusiones. Los números en código no son adecuados.

3. Usar ropa y elementos de seguridad (ej. guardapolvo, guantes, máscara, etc). 4. Manejar los materiales cuyo potencial patógeno se desconoce (ej. esputo, suero,

material fecal, microorganismos no identificados) como si fueran infectivos, ya que probablemente lo son.

5. El laboratorio debe permanecer siempre limpio. La mesada debe estar libre de todo material que no sea esencial. La superficie debe limpiarse antes y después de cada sesión de laboratorio con una solución germicida. Todo el material contaminado, cultivos, pipetas, tapones, etc., deberá ser esterilizado antes de ser lavado.

6. Antes de dejar el laboratorio, sacarse el guardapolvo, lavarse cuidadosamente las manos con agua y jabón y desinfectarlas.

7. Tener un desinfectante listo para ser usado en suficiente volumen para llevar a cabo una descontaminación de emergencia en el caso de salpicaduras. Asegurarse que el desinfectante sea activo contra el organismo que está siendo manejado.


7

2014

8. Nunca comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio, o pipetear con la boca. Usar propipetas o pipetas automáticas. Siempre recordar que las manos o guantes pueden estar contaminados y ser capaces de transferir la infección al cuerpo.

9. Nunca llevar a cabo una acción apresuradamente, en particular aquéllas que pueden producir burbujeo, salpicaduras, volcaduras o contaminar superficies que es necesario mantener limpias (ej. las tapas de las botellas).

Bibliografía

- Ferrari S., Mattana C., Digenaro M.S. y Favier G. 2011. Manual de Seguridad en el Laboratorio de Microbiología. Nueva Editorial Universitaria. ISBN/ISSN 978-987-1595-68-6, UNSL, San Luis, Argentina.

- Microbiological safety cabinets. Reproducido de Collins C.H. Laboratory Acquired infections (2nd ed). Extraído del curso de posgrado Cultivo celulares y sus aplicaciones biotecnológicas. 1994. Laboratorio de Virología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA. Buenos Aires.


8

2014

Trabajo Práctico Nº 1 Parte B: ESTERILIZACION

OBJETIVOS

- Definir y diferenciar los conceptos de esterilización, desinfección y pasteurización

- Conocer diferentes métodos físicos y químicos de esterilización y desinfección utilizados en el Laboratorio de Microbiología y sus aplicaciones

- Adquirir conocimiento en la preparación de materiales y medios de cultivo a esterilizar y en el manejo de equipos usados en esterilización.

- Aplicar controles de esterilización y esterilidad a los procesos

INTRODUCCIÓN

A. CONCEPTOS

ESTERILIZACIÓN: Tratamiento mediante el que el objeto queda libre de todo organismo vivo.

Consigue eliminar a todos los microorganismos patógenos, saprofitos y formas de

resistencia. Éstas técnicas se usan exclusivamente sobre objetos inanimados, nunca en

seres vivos. Procedimiento mediante el cual la probabilidad de que el objeto tratado

contenga un solo superviviente sea infinitamente pequeña, produciendo ausencia absoluta

de toda forma viable de vida (la probabilidad de sobrevivencia de un microorganismo es

de 1 x 10-6, es decir 1 en un millón). El procedimiento físico o químico que se emplee

para la esterilización seguirá una cinética (curva de muerte) exponencial, que dependerá del

método, de el ente sobre el que se aplique y de la carga microbiana presente. Se aportarán

las condiciones necesarias para acabar con las formas de vida más resistentes, para tener

la seguridad de que se han destruido las más sensibles.

Muerte: Pérdida irreversible de cualquier capacidad para reproducirse

DESINFECCIÓN: Eliminación de todos los microorganismos patógenos, pero no

necesariamente de todas las formas microbianas. Uso de agentes químicos para eliminar la

infectividad potencial de un material mediante la destrucción de las formas vegetativas de

los agentes patógenos. No implica la eliminación total de los microorganismos, ya que las

esporas pueden sobrevivirAplicación sobre objetos inanimados. Proceso o técnica de


9

2014

destrucción de microorganismos patógenos y saprofitos productores de enfermedades

transmisibles y que pueden ser aplicado sobre seres animados u objetos inanimados, si se actúa

sobre:

Bacterias: bactericida

Hongos: fungicida

Virus: virucida

PASTEURIZACIÓN: es un proceso donde se aplican alternativamente altas y bajas

temperaturas para reducir en un 97-99% la población microbiana presente en leche y

otros alimentos. No es sinónimo de esterilización.

ANTISEPSIS: Se aplica sobre tejidos vivos, para inhibir o destruir microorganismos. Los

antisépticos son sustancias aplicada en la piel u otro tejido vivo que previene o detiene el

crecimiento o la acción de microorganismos por inhibición de su actividad o por su

destrucción. Son sustancias orgánicas o inorgánicas que sirven para la antisepsia cutánea y

para neutralizar la infección inhibiendo la proliferación de gérmenes. Es importante que

reúna las siguientes características:

Determinar características del agente tópico: no absorbible, reducción rápida de la

flora, espectro de actividad

Evaluar seguridad y eficacia en reducir el recuento de microorganismos

Aceptación por el personal que lo va a usar y que sea económico

B. TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN

Existen diversos métodos físicos de esterilización y de inhibición del crecimiento

microbiano, como pueden ser el calor, la filtración y la radiación, pero el más

ampliamente usado es el calor, ya sea húmedo ó seco, los cuales tienen diferente

penetrabilidad.

El calor, de cualquier forma, es utilizado extensamente como un agente letal

bacteriano y se puede aplicar a numerosos instrumentos, materiales y substancias, con el

propósito de matar a las bacterias que ellos contengan. Este proceso se llama


10

2014

“Esterilización” y al material, cultivo ó medio de cultivo sometido a éste, se le denomina

entonces “Estéril”, es decir, desprovisto de toda forma viviente.

Cuando se efectúa experimentalmente la esterilización de una población

microbiana, contenida en un medio de cultivo ó en todo el material utilizado en

microbiología es de suma importancia conocer los diversos métodos de esterilización los

cuales se dividen en:

I. Esterilización por agentes físicos:

a. Esterilización por calor b. Esterilización por radiación

II. Esterilización por agentes mecánicos: Esterilización por filtración:

a. Fluidos líquidos b. Fluidos gaseosos: aire

III. Esterilización por agentes químicos: óxido de etileno, glutaraldehido, formaldehido

IV. Esterilización en frío: gas plasma

I.a.- ESTERILIZACION POR CALOR:

Tyndalización: baño María a ebullición - calor húmedo vapor fluente

Autoclave a presión: 121°C durante 15-20 min.

- calor seco Aire caliente (estufa): 160-180°C durante 1.5-1 h respectivamente.

- calor directo Llama directa: al rojo, flameado.


11

2014

I.b- ESTERILIZACION POR RADIACION

a. luz ultravioleta b. radiaciones ionizantes

II.a- ESTERILIZACION POR FILTRACION DE FLUIDOS LIQUIDOS

Se aplica a aquellas sustancias que se alteran por contacto con el agua o por acción

del calor.

-membranas filtrantes Filtros standard

(actuales) Filtros especiales Ultrafiltros II.b- ESTERILIZACION POR FILTRACION DE FLUIDOS GASEOSOS

La elección del método de esterilización depende del tipo de material a esterilizar,

así como la finalidad que se persiga.

MÉTODOS FÍSICOS

I.a.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR

La esterilización por calor es uno de los métodos más comúnmente utilizados en el

laboratorio, es muy útil para la cristalería, los medios de cultivo y para la esterilización de

los medios después de su utilización y este puede ser:

a. Calor Húmedo

b. Calor Seco

c. Calor Directo

a. Calor Húmedo

Se utiliza para esterilizar medios de cultivo, la esterilización se hace por el vapor a

presión en una autoclave u olla de presión.


12

2014

Descripción del autoclave.

Es un cilindro de acero inoxidable que consta de los siguientes elementos (Fig. 1):

Descripción de la olla.

Es de forma cilíndrica de acero inoxidable y consta de los siguientes elementos:

1) Un cuerpo cilíndrico con topes herméticos; 2) Una tapa que contiene un indicador de

presión y temperatura, una válvula de seguridad y una espita de escape de vapor (Fig. 2).

Figura 2. El tipo olla de presión es el más común, es un aparato para agua hirviendo a

presión. Tiene una cámara vertical de metal provista de una tapa metálica fuerte que se

aprieta y cierra herméticamente mediante un aro de goma. Se disponen en la tapa una

espita para la salida del aire y el vapor, un indicador de presión y una válvula de seguridad.


13

2014

El agua del fondo de la autoclave se calienta mediante mecheros de gas exterior, un

calentador eléctrico de inmersión o un serpentín de vapor.

b. Calor Seco

La esterilización se hace por medio de un horno que permite alcanzar

temperaturas más elevadas (150- 180°C) que no pueden soportar los medios de cultivo y

el material de goma ó plástico, se utiliza más para la esterilización del material de vidrio

(matraces, probetas, etc.) y en los instrumentos.

Descripción del Horno pasteur o estufa punpinel (Fig. 3)

Es de forma rectangular, tiene doble pared que permite circular el calor producido por

unos picos de gas ó una resistencia eléctrica. Se utiliza para esterilizar material de vidrio,

porcelana y también para objetos metálicos. El material deberá introducirse en la estufa

una vez limpio y seco, una vez introducido hay que procurar que estos no toquen las

paredes de la estufa, porque alcanza temperaturas muy altas. Una vez introducido el

material, se cierra la estufa y se enciende, dejándolo calentar hasta 180 º, dejándolo a

estas temperaturas por espacios de tiempo variables, dependiendo del tipo de material

que se ha introducido. Una vez transcurrido el tiempo deseado se apagará y se dejará

enfriar totalmente antes de sacar el material.

c. Calor Directo

Se utiliza en asas bacteriológicas. La esterilización se efectúa directamente en la

flama del mechero (Fig.4).


14

2014

Figura 4. La esterilización adecuada del material es importante para obtener los

resultados esperados.

I.b.- ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN

a. Radiación ultravioleta.

Su efectividad como agente letal y mutágeno depende de la longitud de onda. La

longitud de onda más efectiva como bactericida se encuentra en el espectro de 240 a 280

nm, con un óptimo a 260 nm, que corresponde con la máxima absorción del DNA.

La radiación UV conduce a la formación de uniones covalentes entre residuos de

pirimidina adyacentes entre sí ubicados en la misma hebra, dando lugar a la formación de

dímeros de pirimidina. Éstos interfieren en el apareamiento normal de las bases y el

resultado final es la inhibición de la síntesis del DNA. Este tipo de radiación presenta

algunos inconvenientes para ser usada como agente esterilizante. Su energía es baja y su

capacidad de penetración es escasa. Por lo tanto su aplicación principal consiste en el

control de infecciones transmitidas por el aire, donde se la emplea para la desinfección de

áreas cerradas como las salas de hospitales, quirófanos y laboratorios.

b. Radiaciones ionizantes.

Es tipo de radiación es de alta penetración e incluye rayos x y γ. Su acción letal se

produce en forma indirecta. A medida que las radiaciones ionizantes atraviesan el H2O

provocan la ionización de sus moléculas.


15

2014

Las radiaciones ionizantes son adecuadas para la esterilización de material

quirúrgico, médico y de laboratorio descartable y en general en procesos de esterilización

en gran escala.

II.a. FILTRACIÓN DE FLUIDOS LIQUIDOS

Es el principal método para esterilizar líquidos que contienen componentes sensibles al

calor, tales como vitaminas, proteínas séricas, antibióticos y soluciones salinas definidas.

Consiste en hacer pasar líquidos por un material que posee poros más pequeños que las

bacterias e incluso más pequeños que los virus, con lo cual aquellos quedan libres de

microorganismos, según el tamaño de dichos poros.

Para cualquier tipo de filtro, hay dos sistemas de filtración: 1) al vacío por succión o 2)

mediante presión positiva.

Fig 5 Equipo de Filtración

II.a. FILTRACIÓN DE FLUIDOS GASEOSOS

Se aplica en la industria farmacéutica, en cirugía, etc., para disminuir al mínimo la

probabilidad de contaminación del aire. Se usan filtros HEPA y ULPA.


16

2014

Existen básicamente 2 tipos de áreas estériles:

La segunda corresponde a los ambientes de los GBS.

III.- MÉTODOS QUÍMICOS:

Por sus efectos en los microorganismos los agentes químicos pueden ser de dos

tipos básicos: bactericidas (matan al microorganismo) son esterilizantes y bacteriostáticos

(simplemente impiden el desarrollo del microorganismo).


17

2014

AGENTES QUÍMICOS BACTERICIDAS:

Oxido de etileno: Se emplea en forma gaseosa para esterilizar superficies

expuestas, materiales porosos, instrumentos, materiales plásticos, filtros.

Formaldehido: Es un agente alquilante que se combina con grupos –NH2, -

COOH y –SH en los ácidos nucleicos y proteínas.

Glutaraldehído

C. TÉCNICAS DE DESINFECCIÓN

Por lo general los agentes bacteriostáticos tienen un efecto reversible; es decir,

que al eliminar el agente, los microorganismos vuelven a su actividad normal y pueden

crecer si se les coloca en las condiciones que necesitan para su crecimiento.

AGENTES QUÍMICOS BACTERIOSTÁTICOS: MECANISMOS DE ACCIÓN

El cloro (hipoclorito de Na): es un agente altamente corrosivo; su actividad

se neutraliza con materia orgánica.

Acidos: por efecto de pH.

Alcalis: por efecto de pH.

Sales: por vestigios de metales pesados que las acompañan. Ej. sales de Hg,

Cu, Ag (sales de metales pesados) y otros metales suelen utilizarse como antisépticos.

Iones de metales pesados: envenenamiento de enzimas a nivel de grupo –

SH.

Jabones: desnaturalizantes de proteínas y disolución de lípidos.

Alcoholes alifáticos: desnaturalizantes de proteínas Ej. etanol, isopropanol.

Son más activos cuando están diluidos en agua (50-70% de alcohol en agua). Son solventes

de lípidos y desnaturalizan proteínas.

Eteres: desnaturalizantes de proteínas.


18

2014

Alcoholes aromáticos: Ej. fenoles y cresoles: disolventes de lípidos y

desnaturalizantes de proteínas.

Halógenos: desnaturalizantes de proteínas (sobre puentes disulfuro).

Colorantes: sensibilización fotodinámica (desnaturalización de proteínas)

Alquilantes: inactivan macromoléculas por puentes alquilantes entre =NH

y –NH2.

Detergentes sintéticos: desnaturalización de proteínas y disolución de

lípidos. Ej. Tensioactivos catiónicos: actúan afectando las membranas celulares mediante

interacciones de carga con los fosfolípidos. Se utilizan para limpieza de material

contaminado y superficies de trabajo.

Tensioactivos aniónicos: su acción se manifiesta a través de una

eliminación mecánica de los m.o., por lo tanto su acción no es desinfectante. Se utilizan

para el lavado del material ya decontaminado.

D. MANIPULACIÓN EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD

La muestra puede ser:

Muestra Contaminada (protección)

Muestra estéril (evitar su contaminación)

En ambos casos los mecanismos son los mismos, se trata de evitar el trasiego de

microorganismos entre el material y el medio ambiente o el manipulador.

Aspectos a tener en cuenta

1. Zona de trabajo limpia y en condiciones extremas estéril (Mecheros, Gabinetes de

seguridad biológica en los laboratorios de manejo de muestras de alta peligrosidad,

Campanas de extracción para drogas volátiles y tóxicas).

2. El material empleado para manipular la muestra debe de mantenerse estéril (flameado) o

desecharse en condiciones de seguridad tras su empleo.

3. El ambiente (aire) será estéril por UV, filtración., antes del manejo.

4. El manipulador utilizará métodos de barrera (gorros, mascarillas, guantes) para proteger la


19

2014

muestra de su flora

5. Terminado el proceso, todo el material empleado deberá de ser lavado y esterilizado si se

va a reutilizar o esterilizado y desechado en recipientes especiales.

Todo el proceso va a estar condicionado por el nivel de bioseguridad que queramos

alcanzar, dependiendo del material a emplear y del o de los microorganismos de los que nos

queramos proteger o proteger a la muestra.

ACTIVIDADES A REALIZAR

MATERIALES

Placas de Petri Frascos de vidrio

Tijera Pinza

Caja de metal Aceite

Pipetas de vidrio Gasa

Alcohol Hipoclorito de Sodio (lavandina)

Probeta Agua destilada

Medio de cultivo Ansa

Mechero de bunsen Placas de Petri con medio de cultivo

Cultivo de bacterias/hongos

1) Preparación del material a esterilizar:

Material de vidrio

Placas de petri: se envuelven individualmente con papel (Autoclave).

Tubos con o sin tapón de algodón: se arman grupos de 10 tubos, y se envuelven en

papel. (Autoclave).

Pipetas (de 0,1;0,2;0,25 y Huddleson : se introducen en tambores metálicos

(pipeteros) y se esterilizan en estufa o autoclave.


20

2014

Pipetas: (de 1, 2, 5, 10, 25 ml). Se introduce un trozo pequeño de algodón en la

boca de la pipeta, se envuelve en papel blanco o manteca, se indica su capacidad y con

una flecha la boca de la misma. Se preparan en haces de 10-15 pipetas del mismo

volumen envueltas en papel con la punta hacia arriba. (Autoclave).

Frascos vacíos con tapa a rosca de plástico: Se colocan tapados con la tapa semi

enroscada, con un capuchón de papel de aluminio o envueltos en papel madera.

(Autoclave).

Materiales metálicos: tijeras, espátulas, pinzas, etc. Se envuelven individualmente,

se colocan en cajas metálicas que cierren herméticamente. (Estufa/Autoclave)

Tips, tapones de goma, pipetas pasteur de vidrio, hisopos: Se colocan en frascos de

vidrio que en el fondo contengan un trozo de algodón, se cierra el frasco dejando la tapa

media floja. (Autoclave)

Aceites, vaselina, talco: se colocan en frascos individuales con tapón de algodón y

capuchón de papel. (Estufa)

Medios de cultivos: se colocan en frascos individuales con tapón de algodón y

capuchón de papel. (Autoclave)

Soluciones tampones, antibióticos: se filtran

NOTA: todo el material a esterilizar debe estar correctamente rotulado. En el rotulo se

debe indicar el tipo de material y la fecha de esterilización. El material que se ha

esterilizado en autoclave se lleva a estufa de 37ºC hasta que esté completamente seco.

Una vez que ha finalizado el proceso de esterilización, el material deberá ser guardado

correctamente (cajones, armarios, heladeras, etc.) a fin de evitar contaminaciones y

asegurar la duración del proceso de esterilización. El tiempo promedio que dura la

esterilización es de 1 a 3 meses, paso dicho tiempo el material deberá ser re esterilizado

por más que no haya sido utilizado.

2) Preparación de alcohol al 70 % (Cambio de su pH) y lavandina 10% (formación de

hipoclorito de sodio) para su uso como desinfectante.


21

2014

3) Análisis de la importancia de la esterilización del ansa: Técnica de esterilización con

calor directo. Estas se deben esterilizar antes y después de llevar a cabo la siembra de

cualquier tipo de bacteria.

a. Poner el ansa directamente en la parte azul de la flama durante algunos segundos.

b. Cuando el metal se torna de color rojo, se retira y se enfría en las paredes superiores

del recipiente de cultivo.

4) Armado de equipo de filtración para esterilizar líquidos.

5) Análizar el siguiente temario:

a. Preparación del autoclave: instrucciones, condiciones operativas y precauciones

con respecto al material a esterilizar.

b. Controles físicos, químicos o biológicos de esterilización en autoclave durante el

proceso.

c. Control de esterilidad sobre los medios de cultivo esterilizados en autoclave: para

ello tomar no menos del 10% de los tubos o recipientes con medio de cultivo y colocar en

estufa de incubación a 37°C durante 24 h.

Funcionamiento de una olla a presión tanto en esterilización como en tyndalización.

BIBLIOGRAFÍA

-Velázquez L. Esterilización y desinfección. 2012. Apunte de Teoría. Microbiología General,

FQBF, Universidad Nacional de San Luis. De lectura obligatoria para este Trabajo Práctico.

-Madigan, Martincko. 2009. Brock, Biología de los microorganismos. 10ª. Edición. Pearson-

Prentice Hall.

-www.google.com (imagen)


22

2014

Trabajo Práctico Nº2 Parte A: MEDIOS DE CULTIVO.

OBJETIVOS

- Fundamentar la composición de diferentes medios de cultivo conociendo los requerimientos energéticos, nutricionales y ambientales de los principales grupos de microorganismos. - Preparar medios de cultivo duso cotidiano en Microbiología. - Reconocer la presencia de los gérmenes en todos los hábitats naturales, en los animales

y los seres humanos. - Conocer los distintos instrumentos, materiales y medios de cultivo que se utilizan más

frecuentemente en el Laboratorio de Microbiología durante la siembra y transplante de microorganismos

- Adquirir conocimiento y destreza en el manejo de la técnica aséptica

INTRODUCCIÓN

Definición: un MEDIO DE CULTIVO es una preparación nutritiva, natural o artificial,

sólida, semisólida o líquida, que suministra al microorganismo cada una de las sustancias

fundamentales, una fuente de energía y las condiciones ambientales adecuadas para su

crecimiento y multiplicación, aproximándose lo más posible a las condiciones de su

hábitat natural o nicho ecológico.

MATERIALES Y MÉTODOS

-Medios de cultivo deshidratados: agar nutritivo, agar Mueller Hintlton, agar sangre, caldo

nutritivo y agar sulfuro-indol-movilidad (SIM)

-Agua destilada

-Cintas indicadoras de pH

-pHmetro

-Placas de Petri, Erlenmeyers, probetas, pipetas de 5, 10 y 25 ml, varillas de vidrio, tubos

de ensayo y de hemólisis.

-Algodón


23

2014

Medios de cultivo a preparar en este Trabajo Práctico

1. Caldo nutritivo

Extracto de carne .................................................................... 0.15 g

Peptona................................................................................... 0.25 g

NaCl ......................................................................................... 0.25 g

Utilizando un erlenmeyer, disolver cada uno de los componentes ya pesados, en 50 ml

de agua destilada. Homogeneizar. Ajustar el pH a 7 (6.8-7.2). Envasar todo el volumen

en un recipiente limpio. Tapar con papel. Rotular. Esterilizar en autoclave 15 min a

121°C.

2. Agar nutritivo

Extracto de carne .................................................................... 0.45 g

Peptona .................................................................................. 0.75 g

NaCl ......................................................................................... 0.75 g

Agar .............................................................................................. 3 g

Agua destilada ....................................................................... 150 ml

Esta fórmula nutritiva se proveerá como un polvo con el peso adecuado que se

rehidratará en 150 ml de agua destilada utilizando un erlenmeyer. Tapar con papel.

Rotular. Fundir a ebullición en una olla. Retirar y dejar enfriar a 55-60°C.

Homogeneizar bien. Ajustar el pH a 7-7.2 empleando cinta indicadora de pH de uso

externo. Neutralizar con ácido o base según corresponda.

Envasar en tubos en cantidades de 15 ml si se desea obtener agar derecho (para volcar

en placa de Petri en prácticos posteriores), o en cantidades de 7 ml si se desea obtener

agar inclinado o en pico de flauta. Luego de tapar con algodón, tapa a rosca o tapón

plástico, esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min. Antes de solidificar, los tubos

que contienen 7 ml se inclinan sobre una tabla para que solidifique en pico de flauta.

Los que contienen 15 ml se dejan solidificar en posición vertical.


24

2014

3. Agar sulfuro-indol-movilidad (SIM)

Peptona de caseína...................................................................... 1 g

Peptona de carne.................................................................... 0.33 g

Citrato de amonio y hierro (III) .............................................. 0.01 g

Tiosulfato de sodio ................................................................. 0.01 g

Agar ......................................................................................... 0.15 g

Agua destilada ......................................................................... 50 ml

Esta fórmula nutritiva se proveerá como un polvo deshidratado con el peso adecuado

que se rehidratará en 50 ml de agua destilada utilizando un erlenmeyer. Tapar con

papel. Rotular. Fundir a ebullición en una olla. Retirar y dejar enfriar a 55-60°C.

Homogeneizar bien. Ajustar el pH a 7-7.2.

Envasar en tubos de hemólisis en cantidad de 3 ml por tubo. Luego de tapar con

algodón, esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min. Dejar solidificar en posición

vertical.

4. Agar sangre

Material necesario: -1 tubo de agar nutritivo derecho -glóbulos rojos de carnero -1 placa de Petri Fundir el agar nutritivo en tubo y enfriarlo a 50- 55°C. En cámara de bioseguridad desenvolver una placa de Petri estéril y colocar 0.5 ml de sangre por cada 10 ml de medio de cultivo, de manera que se obtenga una concentración final de 5%. Volcar el agar fundido sobre la sangre. Homogeneizar haciendo movimientos circulares suaves. Secar. Sembrar. Incubar en un recipiente con CO2 (tarro con vela) a 37°C durante 24-48 h. Observar la hemólisis.


25

2014

Otros medios de cultivo de uso frecuente en Microbiología (ver en ANEXO I)

Ajuste de pH para medios preparados en el laboratorio

Se pueden utilizar ácidos tales como chlorídrico, acético, láctico o tartárico, y álcalis como

hidróxido de sodio 1 N.

El pH debe medirse antes de la esterilización de los medios.

Conservacion de los medios de cultivo

La estabilidad de los medios de cultivo es limitada. De no utilizarlos inmediatamente, se

conservarán a 4-10°C en refrigerador.

EXCEPCION: Los medios con tioglicolato se conservan mejor a temperatura ambiente.

Control de esterilidad

Se realizará para todos los medios recién esterilizados. A tal fin, se colocará un parte de

los tubos conteniendo los medios en estufa de 37°C durante 24 h, y se observará

desarrollo o ausencia de desarrollo de microorganismo sobrevivientes al proceso de

esterilización en autoclave.

BIBLIOGRAFÍA

- Escudero M.E. Medios de cultivo (parte 1). 2012. Explicación de Trabajo Práctico. Microbiología General, FQBF, Universidad Nacional de San Luis. De lectura obligatoria para este Trabajo Práctico. - Madigan, Martincko. 2009. Brock, Biología de los microorganismos. 10ª. Edición. Pearson-Prentice Hall. - Manuales de medios de cultivo, ver: - www.merck.com.ar - www.britanialab.com.ar

http://www.merck.com.ar/

http://www.britanialab.com.ar/


26

2014

Trabajo Práctico Nº2 Parte B: SIEMBRAS Y TRANSPLANTES

INTRODUCCIÓN

Siembra: se entiende por siembra al acto de transferir o colocar un microorganismo en un

medio de cultivo adecuado. La transferencia se efectúa desde el hábitat natural (nicho

ecológico) al medio de cultivo.

Por ejemplo, se efectúan siembras desde distintos materiales biológicos (esputo, orina,

materia fecal, etc.) cuando existe sospecha de infección y se quiere aislar el agente causal.

También se pueden efectuar siembras desde los más diversos materiales, por ej. agua,

tierra, aire, etc. Con esto se demuestra la universalidad de los gérmenes.

Transplante o repique: es la transferencia de gérmenes desde un medio de cultivo a otro.

Se efectúan transplantes cuando se desea obtener un cultivo puro a partir de uno mixto,

mantener cepas, o efectuar estudios químicos, bioquímicos o culturales.

Con qué se siembra?

Ansa Recta en anillo

Pipetas Comunes (de 1, 2, 5, 10 y 25 ml) Pasteur rectas Pasteur a bolas

Micropipetas de diferentes volúmenes: 2, 10, 20, 100, 200 y 1000 µl

Espátula de Drigalski y “palo de hockey” para sembrar en superficies grandes (caja de Petri, botellas

de Roux, etc.)

Hisopo ídem anterior.


27

2014

En qué se siembra?

Medios líquidos

Medios sólidos 1,5 – 2 % de solidificante Agar inclinado o en pico de flauta

Agar en caja de Petri o botella de Roux

Medios semisólidos agar blando, 0.2-0.3% de solidificante

Cómo se siembra?

Medios sólidos

En placa de Petri Extensión espátula de Drigalski

Estrías ansa en anillo

ansa recta

Placa vertida inóculo más agar fundido y enfriado a 45-50°C

En superficie inclinada En estrías

Por contacto

En medio semisólido (agar derecho) por punción

En medios líquidos con ansa recta (preferentemente)


28

2014


- Elementos de siembra: un ansa rectas y un ansa en anillo, hisopos estériles, frascos con tips estériles, micropipetas.

- Material de vidrio preparado y esterilizado: placas de Petri, hisopos, frasco con tips, pipetas estériles, ansas, tubos de hemólisis estéril.

- Frascos de descarte con lavandina al 10% - Medios de cultivo: agar nutritivo derecho, agar nutritivo inclinado, agar SIM

(semisólido o blando), caldo nutritivo, agar sangre. - Botellas con SF: solución fisiólogica estéril (NaCl al 0.9% en agua destilada) - Recipiente para realizar microaerofilia - Alcohol 70% y algodón. Repasador. - Elementos de protección personal: guaradapolvo, guantes, barbijo.


29

2014

Algunos elementos de siembra utilizados en Microbiología

Ansas en anillo y un ansa recta Espátula de Drigalski

Micropipeta con tip estéril Pipeta Pasteur


30

2014

Técnica aséptica para siembras y transplantes

Las operaciones que se describen a continuación están dirigidas a personas diestras. Proceder de

modo similar pero con las manos opuestas en caso de personas zurdas. Observar Figura 5.3 para

entender la técnica.

1. Siembras en agar semisólido o blando por punción o picadura:

Esterilizar a la llama (al rojo) el alambre del ansa. Dejarlo enfriar 5 seg. Tomar el tubo del cual se va a extraer el inóculo con la mano izquierda, con el meñique de la mano derecha quitar el tapón del tubo, flamear la boca y mantenerlo oblicuo, casi horizontal, para reducir al mínimo el peligro de contaminación. Retirar con el ansa esterilizado una pequeña cantidad de cultivo (inóculo), flamear nuevamente la boca del tubo, taparlo y dejarlo en la gradilla. Tomar el tubo que se va a sembrar con la mano izquierda, quitarle el tapón con el meñique de la derecha, flamear la boca del tubo y con el ansa cargado de inóculo picar el medio hasta aproximarse al fondo del tubo. Retirar con cuidado el ansa, flamear la boca del tubo, taparlo y esterilizar el ansa


31

2014

antes de dejarla sobre la mesa. El tubo sembrado se marca para identificarlo colocando en el rótulo el medio, lo que se sembró y la fecha. Luego se lleva a incubar a temperatura adecuada durante el tiempo necesario.

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/guia.pdf

2. Siembras sobre medios inclinados (en pico de flauta)

Esterilizar a la llama el alambre del ansa. Dejarlo enfriar 5 seg. Tomar el tubo del cual se va a extraer el inóculo con la mano izquierda, con el meñique de la mano derecha quitar el tapón del tubo, flamear la boca y mantenerlo oblicuo, introducir el ansa estéril, retirar una pequeña cantidad de cultivo, flamear la boca del tubo, taparlo y dejarlo en la gradilla. Tomar el tubo que se va a sembrar con la mano izquierda, quitarle el tapón con el meñique de la derecha, flamear la boca del tubo, mantenerlo inclinado, introducir el ansa cargada al tubo y extender el inóculo sobre la superficie del medio trazando estrías a intervalos de pocos mm empezando por abajo, retirar el ansa, flamear la boca del tubo y taparlo. También esterilizar el ansa antes de dejarla sobre la mesa. Como en la siembra anterior, rotular el tubo y luego llevarlo a incubar.


32

2014

3. Siembra en placa de Petri

Preparación de placa de Petri. Fundir en baño de María hirviente un tubo de agar derecho. Enfriarlo a 45-50°C en un baño. Secarlo. Destaparlo. Flamear la boca del tubo y volcar el contenido en una caja de Petri estéril, rotar la caja sobre la mesa de manera que se forme una capa uniforme. Dejar solidificar. Secar en estufa a 37°C 5 min y luego sembrar.

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/guia.pdf

Siembra por estrías. En estos casos las células son separadas por agotamiento, al realizar estrías sobre la superficie del agar. El inóculo inicial tiende a diluirse progresivamente con cada estría sucesiva. Procedimiento: 1. Tomar una caja de Petri con el medio de cultivo adecuado ya solidificado y dividir la

base de la caja (con marcador indeleble del lado externo) en 3-4 sectores 2. Sembrar por orden en cada cuadrante en zigzag. 3. Una vez sembradas, las cajas se incuban invertidas


33

2014

4. Siembra en medios líquidos en general: (caldo, leche, agua peptonada, medio mineral de fosfato, etc.) Los medios transparentes se deben sembrar con ansa recta, tratando de transportar poco inóculo. Los demás se pueden sembrar con ansa, o bien con pipetas estériles.

Siembra en medios líquidos con ansa: Una vez que el ansa esterilizada fue cargada con el inóculo, tomar con la mano izquierda el tubo con medio líquido a sembrar, con el meñique de la mano destaparlo, flamear la boca del tubo y mantenerlo inclinado, introducir el ansa y descargar el inóculo. Retirar el ansa, flamear la boca del tubo, taparlo, esterilizar el ansa antes de dejarla sobre la mesa, rotular el tubo y llevarlo a incubar.

Siembras de medios líquidos con pipetas: Tomar la pipeta estéril (puede estar en tambores de aluminio o bien envuelta en papel), pasarla ligeramente por la llama. En la mano izquierda tenemos el tubo del cual vamos a extraer el inóculo, con el meñique de la derecha lo destapamos, flameamos y mantenemos inclinado, introducimos la pipeta, aspiramos el volumen deseado, flameamos el tubo, tapamos y dejamos en la gradilla con la mano izquierda. Tomamos el tubo con el medio de cultivo que vamos a sembrar, con el meñique derecho lo destapamos, flameamos e introduciendo la pipeta sin llegar hasta el líquido sembramos el volumen deseado (gotas, ml, etc.). Flamear la boca del tubo, taparlo y colocar la pipeta en recipientes que contengan mezcla sulfocrómica o solución desinfectante. Una vez hecho esto, el tubo se rotula y se incuba. Siembras de medios líquidos o sólidos con micropipeta Colocar el volumen deseado en el visor de la micropipeta (siempre dentro del rango de microlitros permitidos en cada una de ellas), y colocar un tip estéril en el extremo de la micropipeta. Ante un roce o toque con elemento extraño, descartar el tip y reemplazarlo por uno estéril. Tomar el tubo con la muestra líquida en la mano izquierda y sostener la micropipeta con la mano derecha. Acercar el tubo a la mano que sostiene la micropipeta y con el dedo meñique quitar y sostener el tapón del tubo y flamear. Con el pulgar de la derecha bajar el pistón de la micropipeta hasta el primer tope e introducir el tip en el líquido donde está la muestra o inóculo. Soltar suavemente el pistón para que el líquido ascienda, retirar la micropipeta, y tapar el tubo acercando al dedo que sostiene el tapón. Llevar la muestra a otro tubo con medio de cultivo, para lo cual, se destapa el tubo con la mano izquierda y se introduce el tip; con el pulgar de la derecha se baja el pistón suavemente hasta el 2do. tope para descargar la muestra. Soltar el pistón suavemente y tapar tubo.


34

2014

ACTIVIDADES A REALIZAR 1. Encender un mechero sin limpiar previamente la mesada con desinfectante.

2. Proveerse con un frasco de descarte conteniendo lavandina al 10%.

3. Pasar un hisopo sobre la mesada y sembrar una placa de agar nutritivo.

4. Descontaminar área de trabajo utilizando algodón embebido en alcohol iodado o

alcohol al 70%.

5. Pasar nuevamente un hisopo sobre la mesada y sembrar otra placa de agar nutritivo.

6. Preparar 3 placas de Petri con 15 ml de agar nutritivo derecho cada una.

7. Dejar solidificar sobre la mesada. Llevar a secar en estufa a 37°C por 5-10 min.

8. Sembrar desde las siguientes muestras:

-aire del medio ambiente, en: --placa de Petri (siembra espontánea): se deja abierta durante el TP.

-manos - tierra de jardín, en:

--caldo nutritivo con ansa en anillo, --agar nutritivo inclinado con ansa en anillo, --agar semisólido con ansa recta, --agar en placa de Petri, dividida en cuadrantes en la base, con ansa en anillo. Realizar aislamiento.

-fauces, en: --agar sangre, con hisopo en 1er. cuadrante, descartar hisopo en contenedor con lavandina, y continuar con ansa en anillo hasta 4to.cuadrante. Incubar en microaerofilia. 9. Incubar todos los medios de cultivo en estufa a 37°C durante 24 h.

10. Al concluir el trabajo, repetir descontaminación de mesada y de manos.

11. Clasificar residuos para desechar (recipiente negro: papel, recipiente rojo: algodón

contaminado, guantes descartables). BIBLIOGRAFÍA

- Madigan, Martincko. 2009. Brock, Biología de los microorganismos. 10ª. Edición. Pearson-Prentice Hall.

- www.google.com (imágenes)

http://www.google.com/


35

2014

TRABAJO PRÁCTICO N° 3: IDENTIFICACIÓN MICROBIANA

PARTE A: IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA

1.-PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Todas las actividades de la célula bacteriana se realizan a través de enzimas. Realizando una

serie de pruebas, denominadas pruebas bioquímicas, podemos establecer un patrón de actividad,

el cual nos refleja la composición enzimática del microorganismo, y además nos puede ayudar en

la identificación y diferenciación de un microorganismo dado entre otras especies estrechamente

relacionadas.

IMViC: conjunto de pruebas bioquímicas que comprende:

I = Prueba del Indol

M = Prueba de Rojo de Metilo

V = Prueba de Voges-Proskauer

C = Prueba de utilización de Citrato

Prueba del Indol Medio: agua peptonada

Peptona........................................1 g

NaCl.............................................0,5 g

A.D. c.s.p.....................................100 ml

Sembrar y a las 24 h reconocer la producción de indol añadiendo 1 ml de algunos de los siguientes

reactivos:

a) Reactivo de Kovacs:

Alcohol amílico............................150 ml

p-dimetilaminobenzaldehído.......2 g

HCl (c).........................................40 ml

b) Reactivo de Ehrlich:

Alcohol etílico 95 %.....................190 ml

p-dimetilaminobenzaldehído........2 g

HCl (c).........................................40 ml

Fundamento e interpretación: dentro de los aminoácidos que aportan las peptonas se encuentras

el triptófano, el cual puede ser hidrolizado por ciertas especies de microorganismos liberándose

entre los productos finales de esta reacción el indol, el cual se puede poner de manifiesto con

cualquiera de los reactivos mencionados anteriormente. En caso positivo se observa un anillo de

color rojo. En caso de emplear el reactivo de Ehrlich, previamente agregar al cultivo, un volumen

igual de éter para extraer el indol.


36

2014

Prueba de Voges-Proskauer (VP) y Rojo de Metilo (RM)

Para la realización de estas pruebas se utiliza el medio de Clark y Lubs, que es una solución de

peptona glucosada:

K2HPO4....................................5 g

Peptona....................................5 g

Glucosa....................................5 g

A.D. c.s.p.................................1000 ml

PH 7-7,2. Esterilizar la glucosa por separado. Sembrar. Incubar a 37°C durante 48-96 h.

a) VP: a una alícuota de cultivo adicionar 0,1 a 0,2 ml de KOH al 40 %, agitar y añadir 0,2 ml de solución de alfa naftol. Una reacción positiva se manifiesta por el desarrollo de color violeta-rojizo. Esta reacción depende de la producción a partir de glucosa de acetil-carbinol (acetoína), que es un precursor de 2,2-butilenglicol. En presencia de oxígeno atmosférico y álcali, la acetoína es oxidada en diacetilo, y este reacciona con el reactivo colorante alfa naftol para dar el color violáceo de la reacción. Reactivos: a) alfa naftol..............................5 g alcohol 95°...........................1000 ml b) KOH......................................40 g creatina................................0,3 g A.D......................................100 ml b) RM: a la otra porción de cultivo agregarle 2-3 gotas de la solución de rojo de metilo. La aparición de color rojo indica reacción positiva, mientras que color amarillo indica reacción negativa. La finalidad es comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa, y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. El rojo de metilo es un indicador de pH que vira al rojo cuando el pH del medio es igual a 4,2 o menor. Reactivo: Rojo de metilo.......................0,1 g Alcohol.................................300 ml A.D......................................200 ml

Prueba de utilización del citrato Medio citratado de Simmons: MgSo4................................0,2 g NaCl....................................5 g NH4H2PO4...........................1 g K2HPO4..............................1 g Citrato de Na.......................2 g Azul de bromotimol.............2 g A.D......................................1000 ml Agar....................................15 g


37

2014

Colocar en tubos de hemólisis 3 ml por tubo. Esterilizar. Inclinar. Inocular con ansa en estrías. Incubar 18 a 24 h a 37°C. El medio es de color verde, si el microorganismo usa el citrato como única fuente de carbono, el medio vira al azul por liberación de NaOH.

En la identificación de una especie microbiana se emplean, en primer lugar o en forma simultánea: la coloración de Gram que permite conocer formas y disposición celular y presencia de estructuras tales como esporas.

2.- COLORACIONES

OBJETIVOS

Conocer y llevar a cabo correctamente los pasos de cada técnica de coloración, desde la

preparación del frotis hasta el agregado de los colorantes.

Manipular adecuadamente el microscopio óptico, diferenciando sus distintas partes y

enfocando correctamente los preparados a visualizar.

Diferenciar bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) de bacterias no BAAR, en la coloración

de Ziehl Neelsen.

Distinguir esporas, cápsulas y flagelos, describiendo el campo visual observado al

microscopio.

INTRODUCCIÓN

La observación de los microorganismos se puede realizar:

Teñidos con colorantes

Vivos sin teñir o en fresco: se evalúa movilidad

Los microorganismos son químicamente muy diferentes del medio que los rodea. Esta

diferencia es la que permite distinguir las bacterias por tinción pues generalmente el colorante

reacciona con la célula bacteriana pero no con el medio externo.

Algunas de las ventajas que presenta la observación de los microorganismos coloreados son:

Proporciona el contraste suficiente entre el microorganismo y el medio que los rodea,

permitiendo diferenciar varios tipos morfológicos.

Permite el estudio de estructuras de la célula bacteriana.

Se puede obtener mayores amplificaciones con el empleo del objetivo de inmersión del

microscopio.


38

2014

¿Que es un colorante?

Los colorantes son, generalmente, sales en las que uno de sus iones tiene color. Una sal es

un compuesto formado por un ión cargado positivamente y un ión cargado negativamente. Ej. la

sal cloruro de metileno, donde el color del colorante reside en el ión azul de metileno (AM),

cargado positivamente.

ClAM CL- + AM+

Los colorantes se pueden dividir en 2 grupos: básicos y ácidos. Si el colorante reside en el

ión positivo, se dice que es un colorante básico. Si el color reside en el ión cargado negativamente,

se dice que es un colorante ácido.

PASOS A SEGUIR PARA REALIZAR UNA COLORACIÓN

1.- PREPARACIÓN DEL MATERIAL que se va a colorear se puede llevar a cabo realizando: frotis,

extendido o impronta.

- Frotis: se realiza colocando una ansada de cultivo líquido en le centro de un portaobjeto

bien limpio; si el examen se debe efectuar desde un cultivo sólido, colocar previamente sobre el

portaobjeto una gota de solución fisiológica y sobre ella emulsionar perfectamente el inóculo, de

manera de lograr una película delgada y uniforme.

- Extendido: se realiza en una técnica para colorear la cápsula en microorganismos que la

poseen. Coloca en un extremo del portaobjetos una gota de tinta china* y se emulsiona sobre

dicha gota la suspensión de gérmenes. Con el pulgar y el índice de la mano izquierda se sujeta el

portaobjetos desde un extremo y con el pulgar y el índice de la mano derecha se sujeta por el

extremo un segundo portaobjetos contra la superficie del primero, con un ángulo de 30-40°. La

gota quedará en el ángulo de los 2 portaobjetos. Se empuja lentamente el portaextensor en la

dirección opuesta a lo largo del otro, de manera que la gota fluya por detrás del borde del

primero. Un buen extendido tiene una parte gruesa y una más delgada, con una transición gradual

entre ambas. El aspecto debe ser liso y nivelado.

*Una vez realizado el extendido se deja secar, se fija y se le coloca un contracolorante (cristal

violeta). La bacteria se observa violeta, la cápsula clara y el medio circundante oscuro. El

extendido se puede realzar también en materiales con gran cantidad de células.

- Impronta: con un hisopo se presiona la zona que se desea estudiar (por ej. boca, encías,

garganta, etc.) y luego se presiona suavemente sobre el portaobjetos. Este método se emplea para

diferenciar distintas agrupaciones celulares (por ej. estreptococos de estafilococos) o agrupaciones

en empalizada del bacilo de la difteria.


39

2014

Preparación del frotis para colorear

2.- SECADO: cualquiera sea el método seguido en la preparación, el segundo paso a seguir es el

secado. Este se puede realizar secando el preparado al aire, a temperatura ambiente, o bien

manteniéndolo encima de la llama del mechero.

3.- FIJACIÓN: el calor es el agente fijador mas comúnmente empleado, también se pueden

emplear algunos agentes como el alcohol y varios compuestos químicos. Para fija el preparado

utilizando el calor, se lo toma desde un extremo, y se lo pasa tres veces rápidamente por la llama

del mechero. Dejarlo enfriar antes de proceder a la fijación. La capa de células debe estar siempre

hacia arriba cuando se fija el preparado. El propósito de la fijación es matar a los microorganismos,

coagular el protoplasma de la célula y adherirla al portaobjetos, si no se fijase la capa de células se

lavaría durante el proceso de tinción.

Nota: los portaobjetos utilizados para coloraciones deben estar perfectamente limpios y

desengrasados, para eso se los mantiene en alcohol de 95° hasta el momento de su uso. Deben ser

en lo posible nuevos y no presentar rayaduras que puedan confundir la observación.

MECANISMO DE COLORACIÓN

- Coloración directa: La mayor parte de las proteínas bacterianas tienen un punto

isoeléctrico entre pH 2 y pH 5, esto nos indica que, la célula bacteriana tiene una carga negativa

neta cuando el pH del medio está cercano a la neutralidad (pH 7), que es lo que generalmente

ocurre. La bacteria cargada negativamente se combina con el ión cargado positivamente (por ej. El

ión azul de metileno) con lo cual se tiñe la bacteria. Las diferencias en la carga da lugar a una

afinidad entre el colorante básico y la célula bacteriana. Los colorantes básicos más comúnmente

empleados son: fucsina, azul de metileno, cristal violeta y fucsina fenicada. Estos se diferencian en

la proporción y rapidez en que tiñen a la célula bacteriana.


40

2014

- Coloración indirecta: La eosina es un ejemplo de colorante ácido y se emplea como sal

soluble eosinato sódico que se ioniza en eosinato- + Na+. Como la capacidad colorante reside en el

ión cargado negativamente, este no tendrá afinidad por la célula bacteriana cargada también

negativamente. En lugar de ello, el colorante se deposita alrededor de la célula, quedando ésta

incolora y el medio que la rodea coloreado.

Otros preparados para la observación de microorganismos:

MOVILIDAD

1. Colocar en el centro de un portaobjeto limpio una ansada de cultivo joven (18 a 24 h) en

caldo nutritivo.

2. Cubrir la gota con un cubre objetos evitando formar burbujas de aire.

3. Colocar la preparación sobre la platina del microscopio, enfocar con objetivo de 40x

4. Observar si las bacterias presentan verdadero movimiento, diferenciándolo del browniano

por el agregado de una gotita de formol por capilaridad.

COLORACIÓN VITAL

1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución acuosa de cristal violeta 1/5000.

2. Con un ansa tomar una pequeña cantidad de cultivo y emulsionarlo perfectamente con la

gota del colorante.

3. Cubrir suavemente la gota con un cubreobjetos, evitando la formación de burbujas de

aire.

4. Examinar con el objetivo de inmersión. Las bacterias aparecen coloreadas sobre un fondo

claro.

COLORACIÓN SIMPLE O DIRECTA

1. Hacer el frotis. Secar. Fijar a la llama.

2. Cubrir el preparado con una solución diluida de fucsina 1/10 durante 1 min.

3. Lavar con agua corriente. Secar. Observar por inmersión.

COLORACIONES DIFERENCIALES

De acuerdo a la composición de la pared celular de las bacterias, la coloración de Gram permite

agruparlas en dos grandes grupos Gram positivas y Gram negativas. Además existen coloraciones

especiales para poner en evidencia:

la pared celular compleja de los bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR)

estructuras facultativas especiales que presentan algunos géneros bacterianos: capsula y flagelos

estructuras de resistencia que forman algunos géneros bacterianos: esporas


41

2014

Estudiar cada una de estas estructuras de la teoría y explicación de trabajos prácticos

correspondiente.

Los microorganismos difieren químicamente y físicamente entre sí y por eso reaccionan de

una manera distinta frente a un determinado proceso de tinción. Este es el fundamento de las

coloraciones diferenciales. Así se puede definir la tinción diferencial como un método para

distinguir tipos de bacterias. Ejemplos: coloración de Gram y de Ziehl-Neelsen.

COLORACIÓN DE GRAM.

Reactivos

a) Cristal Violeta o Violeta de Genciana

Cristal violeta....................... 10 g

Fenol al 50% en alcohol ......50 ml

Alcohol puro......................... 75 ml

Dejar madura en estufa a 37°C durante una semana y agregar luego:

Agua destilada......................1000 ml

Filtrar antes de usar.

b) Lugol

Yodo...................................5 g

KI........................................10 g

Agua destilada...................1000 ml

c) Fucsina de Ziehl

Fucsina básica....................10 g

Fenol 50% en alcohol..........100 ml

Alcohol.................................50 ml

Dejar de madurar en estufa a 37°C durante una semana y luego agregar:

Agua destilada.....................1000 ml

Filtrar antes de usar.

Fucsina de Ziehl diluída 1/10: de la fórmula anterior, hacer una dilución 1/10 en agua destilada.


42

2014

Técnica

1. Hacer el frotis. Secar a la llama. Fijarlo.

2. Cubrir la preparación con cristal violeta y dejar actuar 2 minutos.

3. Escurrir el colorante y tratar con lugol dos veces consecutivas durante 30 seg o una vez

durante un min. Volcar.

4. Decolorar con alcohol o alcohol-acetona.

5. Lavar con agua corriente y efectuar la coloración de fondo con la fucsina 1/10. dejar actuar 1

min.

6. Lavar. Secar. Observar por inmersión.

7. Las bacterias Gram positivas se observan violetas y las Gran negativas rojas.

Las 4 soluciones empleadas son:

a) Colorante básico: cristal violeta: el color reside en el ión cargado positivamente.

b) Mordiente: lugol: es una sustancia que aumenta la afinidad o atracción entre la célula y el

colorante, ayudando a que se fije el colorante a la célula.

c) Agente decolorante: alcohol o alcohol-acetona. Sustancia que retira el colorante de la célula

teñida.

d) Contraste: fucsina 1/10: es un colorante de color distinto al colorante utilizado en primer

lugar. La misión del contraste es dar a las células decolaradas un color diferente al de las

células que no se han decolorado.

Etapa de coloración Resultados

Gram + Gram -

Tinción inicial (cristal violeta) Se tiñen violeta Se tiñen violeta

Mordiente (lugol) Permanecen violeta Permanecen violeta

Decoloración ( ol o ol-acetona) Permanecen violeta Se decoloran

Contraste (fucsina 1/10) Permanecen violeta Se tiñen de rojo

COLORACION DE ZIEHL NEELSEN Para bacilos ácido-alcohol resistentes: BAAR

Reactivos:

Alcohol-ácido:

Solución al 5% de HCl o H2SO4 en alcohol de 96°.

Azul de metileno diluido:

Azul de metileno 0.3 g

Alcohol de 96° 30 ml


43

2014

Disolver.

Agua destilada 10 ml

Se emplea una dilución 1/10.

Fucsina de Ziehl (ver coloración de Gram)

Usar sin diluir.

Técnica:

Hacer el frotis, secarlo y fijarlo a la llama. Cubrir la preparación con fucsina fenicada y calentar,

para lo cual se pasa un hisopo encendido debajo del portaobjetos manteniendo la emisión de

vapores durante 10 minutos, sin ebullición y agregando reactivo si se evapora.

Decolorar con alcohol-ácido unos min. Repetir hasta obtener frotis libre de fucsina,

aproximadamente por 2 minutos.

Lavar con abundante agua y cubrir con azul de metileno diluido durante 5 minutos.

Lavar. Secar. Observar por inmersión.

Los gérmenes ácido-alcohol resistentes se ven rojos, y las demás bacterias, células epiteliales y

otras estructuras se ven azules.

METODO DE MOELLER

Para coloracion de esporas

Reactivos:

Acido crómico: solución acuosa al 5%.

Acido sulfúrico: solución acuosa al 5%.

Fucsina de Ziehl: concentrada

Azul de metileno: el mismo utilizado en Ziehl Neelsen.

Técnica:

Hacer el frotis. Secarlo.

Fijar con alcohol absoluto, escurrir el alcohol y arder el resto.Dejar enfriar.

Lavar. Tratar con ácido crómico 5 minutos. Lavar.

Cubrir con fucsina fenicada de Ziehl y calentar con hisopo encendido manteniendo la emisión de

vapores 10 minutos. Dejar enfriar.

Decolorar con ácido sulfúrico al 5% durante 1 ó 2 minutos. Descartar reactivo. Repetir.

Completar la decoloración con alcohol durante 1 ó 2 minutos.

Lavar y efectuar coloración de fondo con azul de metileno diluido durante 1 min.

Lavar, secar. Observar con mayor aumento usando aceite de inmersión.

Las esporas se ven rojas, y las bacterias y otras estructuras se ven azules.


44

2014

C.- METODO DE WIRTZ CONKLIN

Para coloracion de esporas

Reactivos:

Verde de malaquita: solución acuosa al 5%

Fucsina de Ziehl: diluida 1:10 (la misma de Gram)

Técnica:

Hacer el frotis. Secarlo.

Cubrir con solución acuosa al 5% de verde malaquita y calentar con hisopo encendido

manteniendo la emisión de vapores durante 10 minutos. Dejar enfriar.

Lavar exhaustivamente para eliminar el colorante en exceso y efectuar coloración de fondo con

fucsina 1:10 durante 1 min.

Lavar, secar. Observar con mayor aumento usando aceite de inmersión.

Las esporas se ven verdes, y las bacterias y otras estructuras se ven rojas.

TECNICA DE BURRI

Para observación de cápsula

Técnica:

Colocar en el extremo de un portaobjetos una gota de tinta china comercial.

Emulsionar sobre esa gota una suspensión de gérmenes capsulados.

Con otro portaobjetos, efectuar un extendido fino. Secar y fijar a la llama cuidadosamente.

Cubrir con solución de cristal violeta durante 2 min.

Lavar cuidadosamente con agua corriente. Secar y observar.

Las cápsulas se verán refringentes sobre el fondo oscuro y el cuerpo bacteriano se tiñe de violeta.

IMPREGNACION ARGENTICA DE FONTANA TRIBONDEAU

Para espiroquetas y espirilos

Reactivos:

Líquido de Rouge

Acido acético 0.1 ml

Formol 40% 2 ml



45

2014

Mordiente

Acido tánico 5 g

Agua destilada c.s.p. 100 ml

Solución de Fontana

A.- Nitrato de plata 5 g


B. –Amoníaco 5 ml

Agua destilada c.s.p. 100 ml

En el momento de usar, colocar en un tubo de ensayo la solución A y agregar gota a gota la

solución B hasta opalescencia debida al óxido de plata.

Técnica:

cubrir con líquido de Rouge el frotis, previamente seco pero sin fijar a la llama. Lavar.

Fijar colocando alcohol etílico, dejar escurrir, arder el resto.

Cubrir con el mordiente y calentar hasta emisión de vapores durante 30 seg.

Lavar con abundante agua y luego volver a lavar con agua destilada (para evitar la precipitación de

AgCl).

Impregnar con solución de Fontana en frío, hasta que tome color castaño oscuro. Se remueve el

líquido y se calienta hasta emisión de vapores, volcar a los 30 seg. Se colorea la preparación de

castaño con reflejos metálicos. Lavar con agua destilada. Secar. Observar.

Las espiroquetas y espirilos se ven de color marrón oscuro, sobre fondo pardo claro.

COLORACION ARGENTICA DE FLAGELOS

Reactivos:

Solución I: mordiente

Solución acuosa saturada de

sulfato de potasio y aluminio (14 g/100 ml A.D.) 25 ml

Acido tánico al 10% (p/v) 50 ml

Solución de FeCl3 al 5% (p/v) 5 ml

Mezclar y conservar en frasco oscuro a temperatura ambiente. La solución es estable durante

varios meses.

Solución II: colorante argéntico

Preparar 100 ml de solución de nitrato de plata al 5% (p/v).

Adicionar hidróxido de amonioi concentrado (2-5 ml) gota a gota a 80 ml de solución de nitrato de

plata al 5% hasta que el precipitado marrón formado se redisuelva.


46

2014

Adicionar algo del remanente de la solución de nitrato de plata al 5%, gota a gota a la solución,

hasta ligera opalescencia persistente.

Conservar la solución en frasco oscuro a temperatura ambiente. La solución es estable durante

varios meses.

Técnica:

Limpiar los portaobjetos con alcohol-acetona, rotularlos y flamearlos en la parte azul de la llama

para eliminar los residuos.

Utilizar un cultivo joven (si es caldo: cuando presente turbidez aparente, si es de agar inclinado, un

desarrollo de 18-24 h). Los cultivos obtenidos a 25°C generalmente producen los mejores

resultados.

Tratar el cultivo con 1 ml de formalina al 1% en solución fisiológica durante una noche (12 h). Si se

utiliza un cultivo inclinado, tratar cuidadosamente las células con la solución de formalina y dejar

reposar toda la noche. Conservar en heladera hasta el momento de ser utilizada.

Centrifugar cuidadosamente (1000 x g durante 15 min) para obtener el pellet, lavar con buffer

isotónico, volver a centrifugar y resuspender en buffer.

Colocar una ansada abundante o dejar deslizar una gota con pipeta Pasteur hasta el otro extremo

del portaobjetos. Secar al aire. No fijar por calor.

Cubrir el portaobjetos con la solución I durante 4 min. Lavar con agua destilada.

Cubrir el portaobjetos con la solución II y calentar con hisopo hasta emisión de vapores. Dejar 4

min para que se coloree. Lavar con agua destilada e inclinar para secar al aire.

Observar con objetivo de inmersión.

Los flagelos ven de color marrón claro, sobre fondo marron oscuro (celula vegetativa bacteriana).


Cepas a utilizar desde cultivos frescos:

Klebsiella pneumoniae (para técnica de Burri)

Bacillus subtilis (tinción de Moeller y Wirtz Conklin)

Frotis de Mycobacterium smegmatis (para colorear por Ziehl Neelsen)

Frotis de Clostridium chauvoei teñidos por impregnación argéntica

Portaobjetos y cubreobjetos

Goteros con solución fisiológica.

Microscopios ópticos provistos con objetivos de 4, 10, 40 y 100x.

Aceite de inmersión.

Reactivos de coloración para Ziehl Neelsen (para bacterias ácido alcohol resistentes BAAR):


47

2014


Cada equipo de alumnos:

- realizará coloración de Ziehl Neelsen utilizando un frotis de esputo contaminado con M.

Smegmatis, suministrado por el docente. Observará BAAR, células y estructuras no BAAR.

- preparará un extendido de K. Pneumoniae según el procedimiento detallado en tinción negativa

de Burri y observará la cápsula bacteriana.

- observará el aspecto característico de las esporas y de las formas vegetativas de bacterias en

frotis teñidos.

- observará el resultado de la coloración argéntica aplicada a células de C. Chauvoei, un anaerobio

flagelado, en preparados ya teñidos suministrados por su JTP

- realizará dibujos y anotará en el informe todo lo observado.

Bibliografía:

Madigan, M.T; Martinko, J.M; Stahl, D. A; Clark, D. P. Brock. Biology of microorganisms. 13th ed.

Ed Pearson Educación, NSA. 2011.

Madigan, M.T; Martinko, J.M; Dunlap, P.V; Clark, D. P. Brock. Biología de los Microorganismos. 12ª

ed. Ed Pearson Educación, NSA. 2009.

Tortora, G, J., Funke, B.R., Case, C. L. Introducción a la Microbiología. 9ª ed. Editorial Médica

Panamericana, Buenos Aires, 2007.

3.- MANEJO DEL MANUAL BERGEY

El primer Manual Bergey de Bacteriología Determinativa fue publicado en 1923, bajo el

auspicio de la Sociedad Americana de Bacteriólogos, siendo su presidente David Bergey.

Actualmente la sociedad encargada de la publicación del manual, es una organización sin fines de

lucro, siendo los ingresos que percibe usados solamente con el propósito de preparar, editar y

publicar sucesivas ediciones del manual y publicaciones suplementarias.

El último manual publicado en el 2000, corresponde a la 2° edición y consta de 5 volúmenes,

a diferencia de los anteriores que presentaban un solo. A grandes rasgos los 5 subvolúmenes se

dividen en:

1. Archaea, Cyanobacteria, Fotótrofos y Géneros ramificados.

2. Proteobacteria.

3. Bajo contenido en G+C. Gram positivas.

4. Alto contenido en G+C. Gram positivas.

5. Plantomicetes, Espiroquetales, Fibrobacter, Bacteroides y Fusobacteria.

El objetivo del Manual dividido en subvolúmenes es que cada parte puede ser actualizada y

publicada mucho más rápidamente que si se tratase del manual completo. Permite además, que el

microbiólogo acceda al subvolumen de su interés exclusivamente.


48

2014

La última edición amplía el objetivo original e incluye más información de importancia para

la bacteriología sistemática, ya que trata la ecología, enriquecimiento, aislamiento y descripción de

especies y sus características determinantes, mantenimiento y preservación.

Uso del Manual

El principal objetivo del manual es asistir a la identificación de las bacterias, pero además el

otro objetivo es indicar las relaciones que existen entre las distintas clases de bacterias. Los

métodos de biología molecular hacen posible intentar una clasificación de las bacterias basadas en

sus relaciones mutuas.

Secciones

Es manual presenta varias secciones basadas en unos pocos criterios determinados. Cada

sección tiene un nombre corriente (o vernáculo). Todos los géneros aceptados han sido ubicados

en lo que parece ser la sección mas apropiada. Sin embargo, algunos géneros presentan

dificultades. Ej. Género Gardnerella, Butyrivibrio, etc.

Artículos

Cada artículo que trata de un género bacteriano es presentado siempre que se pueda en la

secuencia que sigue.

a) Nombre del género: el nombre aceptado está en negrita, seguido de la autoridad científica

que le dio nombre, el año en que fue descripto por primera vez y la página en la que apareció

publicado el taxón. El superíndice AL indica que el nombre está incluido en el Approved List of

Bacterial Names publicado en enero de 1980. el superíndice VP indica que el nombre fue

válidamente publicado con posterioridad a la fecha en el internacional Journal of Systematic

Bacteriology. Si el nombre no lleva ningún superíndice, no se cumple con las condiciones

señaladas anteriormente.

b) Nombre de autor (s): La persona (s) que prepararon el artículo para el Manual. La dirección de

los autores se encuentra en la lista de contribuidores.

c) Sinónimos: en algunos casos se da una lista de los sinónimos que han sido dado anteriormente

para el mismo género.

d) Etimología del nombre del Género: a veces es difícil saber por qué un nombre particular fue

elegido o el objetivo que se buscó. Aquellos autores que proponen nuevos nombres deben

necesariamente consultar a autoridades en la lengua griega o latina antes de publicar, para

asegurarse que sean gramaticalmente correctos y también para asegurarse que el nombre

signifique lo que realmente quiere significar. En el caso particular del género Escherichia coli

se presenta en el manual de la siguiente manera:


49

2014

Genus 1 Escherichia Castellani and Chaimers 1919,941 AL FRITIS ORSKOV

Esch..er.ichi.a.M.L.fem.n. Escherichi llamada así por Theodor Escherich, quién aisló la especie

tipo del género.

e) Descripción resumida: Es un breve resumen de los hechos salientes del género. Las

características más importantes se dan en negrita.

f) Posterior descripción informativa: esta parte está elaborada teniendo en cuenta las distintas

características del género, particularmente aquellas de importancia. La información se

presenta en la siguiente secuencia: características morfológicas, morfología de la colonia y

pigmentación, condiciones de crecimiento y nutrición, fisiología y metabolismo, genética,

plásmidos y bacteriófagos, estructura antigénica, patogenicidad, ecología.

g) Enriquecimiento y aislamiento: se presentan unos pocos medios seleccionados junto con sus

formulaciones.

h) Métodos de mantenimiento: se presentan los métodos usados para mantener y preservar los

cultivos.

i) Métodos para determinar características especiales: esta parte provee la metodología

necesaria para examinar las características poco comunes o pruebas bioquímicas de especial

importancia.

j) Diferenciación de un género de otro: aquellas características que son especialmente útiles

para distinguir un género de otro similar o relacionado son indicados aquí, usualmente en

forma de tablas.

k) Comentarios taxonómicos: aquí se resumen todas las informaciones disponibles acerca de la

ubicación taxonómica del género e indica la justificación para considerar al género como un

taxón diferente. Hacen especial énfasis en los métodos de biología molecular para estimar la

relación con otras taxas, cuando existe una controversia taxonómica, se plantean los

problemas y se exponen los puntos de vista alternativos.

l) Bibliografía relacionada: una lista de referencias, usualmente de naturaleza relacionada es

dada para permitir al lector tener acceso a fuentes adicionales de información sobre el

género.

m) Diferenciación de las especies del genero: se dan aquellas características que son importantes

para distinguir las especies un de otras. Normalmente la información se presenta en tablas.

n) Listas de las especies del género: se cita cada una de las especies seguido en varios casos de

una breve lista de sinónimos. También se indica la etimología. La información descriptiva de

las especies se presenta usualmente en forma de tablas, pero la información especial es dada


50

2014

en el texto. El tipo de cepa de cada especie es indicado junto con la colección en la cual puede

ser encontrada. La dirección de varias colecciones de cultivos se da en el capitulo “Lista de

colecciones de cultivos”

o) Especies de afiliación incierta: la lista de especies puede ser seguida en algunos casos por

listado adicional de especies bajo el encabezamiento “Especies Incertae sedis”. La ubicación

taxonómica o el lugar de tales especies es cuestionable y las razones de la incertidumbre en

cuanto a su ubicación también se exponen.

p) Literatura citada: todas las referencias citadas en el artículo son listadas alfabéticamente al

final del volumen.

Tablas

En cada artículo que trata de un género hay generalmente 3 clases de tablas:

a) aquellas que diferencian al género de aquellos géneros similares o relacionados.

b) aquellas que diferencian las especies de un género

c) aquellas que proveen información adicional acerca de las especies, no siendo esta información

útil para la diferenciación.

El significado de los símbolos es el siguiente

+ 90% o más de las cepas son positivas

d 11-89 % de las cepas son positivas

- 90% o más de las cepas son negativas

D diferentes reacciones ocurren en diferentes taxas (especies de un género o de familia)

v cepa inestable (NO equivale a d)

Las excepciones al uso de los símbolos, así como el significado de símbolos adicionales, son

claramente indicadas al pie de las tablas.

Uso del manual para un propósito determinado

La mejor forma de entrar al Manual es estudiando los títulos de las distintas secciones que

se encuentran en la lista de contenidos. Estos títulos proveen una elemental, aunque no perfecta

clave, para la identificación de los distintos tipos de bacterias.

Cada sección contiene las claves o tablas para la diferenciación de las varias taxas que

contiene. Las sugerencias de cómo realizar la identificación pueden encontrarse en el artículo

sobre “Identificación de bacterias”

Para la identificación de especies, es importante leer tanto la descripción del género como

de las especies, ya que las características listadas en la descripción del genero no son repetidas en


51

2014

la descripción de la especie. Cada nombre de bacteria citado en el Manual es listado en el Index. El

index es útil para la ubicación de los nombres de taxas poco familiares o para descubrir que ha

ocurrido con un taxón particular.

PARTE B: IDENTIFICACIÓN GENOTIPICA

La biología molecular es una disciplina relativamente joven, originada en los años 30s y los

40s, e institucionalizada en los años 50s y los 60s. El período clásico de ésta comenzó en 1953 con

el descubrimiento de la doble hélice del ADN por James Watson y Francis Crick. La relación

científica de Watson y Crick unificó varios acercamientos disciplinarios: Watson, estudiante de

Luria y el grupo fago, reconocieron la necesidad de utilizar la cristalografía para aclarar la

estructura del ADN, por lo que hicieron un uso amplio de datos a partir del trabajo de

cristalografía con rayos X en ADN realizado por Maurice Wilkins y Rosalind Franklin en el King´s

College, de Londres (Darden y Tabery, 2005).

Con la estructura del ADN a disposición, la biología molecular cambió su enfoque por lo

que la estructura de la doble hélice ayudó a la elucidación de los mecanismos de replicación y

función genética, las claves para entender el papel de los genes en la herencia. Esta investigación

subsecuente fue guiada por la noción de que el gen era una molécula informativa. La secuencia

linear de las bases de los ácidos nucleicos a lo largo de una hebra de ADN proporcionó la

información codificada para dirigir el orden linear de aminoácidos en las proteínas (Darden y

Tabery, 2005).

Técnicas moleculares

Las técnicas moleculares actuales han sido desarrolladas, en solo pocos años de

investigación académica básica en muchos campos de la ciencia, de tal manera que en los últimos

años, éstas técnicas han surgido como los métodos para el análisis y tipificación de los

aislamientos bacterianos.

Ellas son la huella dactilar de plásmidos o PF, el análisis de endonucleasas de restricción

de ADN de plásmidos o REA; el análisis de endonucleasas de restricción de ADN cromosómico

utilizando enzimas de corte y electroforesis convencional; el Polimorfismo de largos fragmentos de

restricción o RFLP utilizando análisis de pruebas de ADN; La electroforesis en gel de campos

pulsantes o PFGE; y el AP-PCR y otras técnicas relacionadas con la tipificación basada en la

amplificación de ácidos nucleicos (Tenover et al., 1997).

La caracterización molecular de microorganismos en un ambiente natural puede realizarse

mediante la detección de genes específicos que permitan su identificación y tipificación. La

principal ventaja de estas técnicas es la de no requerir el aislamiento de los microorganismos ni su

identificación por microscopía con tinciones específicas. Las técnicas moleculares permiten evaluar

la biodiversidad de un hábitat amplificando genes específicos.


52

2014

Algunos métodos de clasificación incluyen las especies genómicas, un grupo de

microorganismos con altos valores de homología ADN-ADN, y las genoespecies, un grupo de

organismos capaces de cambios genéticos.

Actualmente es aceptado por los taxonomistas microbianos que la hibridización de ácidos

nucleicos y los estudios de secuenciación proveen los mejores y más racionales métodos

disponibles para designar especies y determinar la relación entre microorganismos diferentes.

Wayne y col. (1987), definen molecularmente especie indicando que una especie podría

generalmente incluir cepas con 70% o más de homología ADN-ADN y con 5ºC o menos de

diferencia en la temperatura de melting.

La identificación a nivel de especies es el propósito primario de todo esquema de

clasificación microbiano, la separación y reconocimiento exacto de subtipos dentro de una especie

es importante en todas las ramas de la microbiología, y particularmente en la microbiología

médica. Además, en muchos casos, el control de enfermedades no podría ser posible sin el uso de

métodos de tipificación para ayudar a definir las fuentes de infección, mecanismos de transmisión

y velocidad de diseminación de la infección en una población susceptible. Otras áreas en las cuales

la exactitud de la tipificación microbiana es importante incluye estudios ecológicos que involucran

el monitoreo de nuevos microorganismos en nuevos hábitats naturales, y programas industriales

en la búsqueda de nuevos productos microbianos.

La secuencia completa del ADN constituiría el método de referencia fundamental para

reconocer los subtipos dentro de las especies.

La tipificación puede proporcionar información sobre la distribución de tipos microbianos

en poblaciones humanas y animales, lo cual puede ser aplicado en programas de vigilancia a nivel

local, regional, nacional o global. De especial interés pueden ser el monitoreo de marcadores

asociados con la patogenicidad, inmunogenicidad o resistencia a medicamentos, como se

demuestra por ejemplo en la vigilancia del cólera con la emergencia de una nueva cepa epidémica

en Asia.

En síntesis, esta aplicación puede incluir análisis periódicos para la detección de grupos de

patógenos con tipos similares y de origen común en espacio y tiempo, para mejorar las

advertencias anticipadas de brotes potenciales.

Asimismo, puede ayudar en la planeación de servicios de salud e intervenciones

preventivas como desarrollo de vacunas y programas de inmunización.

Estas técnicas también pueden ser usadas en estudios clínicos para la delineación de

patrones de colonización y para la identificación de fuentes de transmisión de microorganismos

infecciosos, lo cual puede contribuir a un entendimiento de la epidemiología y patogénesis


53

2014

ayudando con ello al desarrollo de estrategias de prevención de enfermedades (Struelens y

MESGEM, 1996).

Las tinciones fluorescentes se emplean para la enumeración de microorganismos en

muestras clínicas, del ambiente y de alimentos. La tinción con DAPI (4`,6-diamido-2-fenilindol) no

reacciona con materia inerte y se puede aplicar para muestras de agua y suelo; proporciona una

estimación razonable del número de células presentes. Para muestras acuáticas, las células se

tiñen en la superficie de un filtro después de haber filtrado un volumen determinado de líquido.

Estas técnicas sencillas tienen la ventaja de no ser específicas (tiñen todos los microorganismos de

una muestra), pero el inconveniente que presentan es que no diferencian entre células vivas y

muertas. La tinción con colorantes fluorescentes que diferencian entre células vivas y muertas

como es el caso de Live/Dead BactoLigth Kit) proporcionan información no sólo del número de

microorganismos de una muestra sino también de la viabilidad de la misma. Ver fundamento al

final.

Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)

La Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) es una técnica que se

utiliza comúnmente en los laboratorios de investigación médicos y biológicos para amplificar

(crear copias múltiples de) el ADN, sin utilizar un organismo vivo, tal como la E. coli o una levadura.

Asimismo, se emplea en una variedad de tareas, tales como la detección de enfermedades

hereditarias, la identificación de huellas digitales genéticas, diagnóstico clínico, análisis forense del

ADN, detección de patógenos en el hombre, animales, plantas, y alimentos, e investigación en

biología molecular (Saunders et al., 2001).

La PCR fue inventada a principios de los 80´s por Kary Mullis, al cual le fue otorgado el

premio Nobel en química en octubre de 1993 por este logro, siete años después de haber

publicado sus primeras ideas. La idea de Mullis fue la de desarrollar un proceso a través del cual el

ADN se pudiera multiplicar artificialmente a través de ciclos repetidos duplicados llevados a cabo

por una enzima llamada ADN-Polimerasa.

La ADN-Polimerasa se produce naturalmente en los organismos vivos, donde funciona

para duplicar el ADN cuando las células se dividen. Trabaja uniéndose a una sola hebra de ADN y

creando una hebra complementaria.

El proceso original de PCR actualmente ha sido mejorado mediante el uso de la ADN-

Polimerasa que procede de una bacteria termofílica que vive a temperaturas arriba de 110°C (en

aguas termales). La ADN-Polimerasa o Taq polimerasa tomada de estos organismos es

termoestable (estable en las altas temperaturas).

Actualmente la Taq polimerasa se utiliza frecuentemente en la práctica de PCR. Una

desventaja de la Taq es que incurre a veces en equivocaciones al copiar el ADN, conduciendo a

mutaciones (errores) en la secuencia del ADN (Saunders et al., 2001).


54

2014

La PCR que ha sido utilizada por varios años para la detección directa de muchos tipos de

agentes infecciosos en muestras clínicas, ha sido adaptada para ser usada como una herramienta

de tipificación. La ventaja de la PCR es su habilidad para producir literalmente millones de copias

de un segmento de ADN particular con alta fidelidad en un tiempo de 3 a 4 horas (Tenover et al.,

1997).

El procedimiento requiere un molde de ADN que puede estar presente en la muestra en

pequeñas cantidades; dos oligonucleótidos (primers) que flanquean las secuencias del molde de

ADN que va a ser amplificado; y una DNA-polimerasa estable al calentamiento.

Un ensayo típico de PCR requiere aproximadamente de 2,5-3 horas para completar 30

ciclos, donde cada ciclo consiste de una fase de desnaturalización, en donde la doble hebra de

ADN es fundida en hebras únicas; una fase de alineación, en donde los primers se unen a las

secuencias blanco en las hebras separadas; y una fase de extensión, en donde la síntesis de ADN

procede de los primers a partir de cada hebra de la plantilla de ADN, generando dos nuevas copias

de la doble hebra de la plantilla original. Después de cada 30 ciclos, una sola copia inicial de la

plantilla de ADN teóricamente puede ser amplificado a 1 billón de copias (Tenover et al., 1997;

Saunders et al., 2003).

El uso válido de esta técnica es crítico para mantener la calidad de muchas bases de datos

de ADN producidas. Diversos factores pueden influenciar la validez de los resultados obtenidos por

PCR, incluyendo la presencia de componentes inhibitorios, la calidad del ADN, y la carencia de

optimización con respecto a componentes de la reacción y las condiciones de los ciclos termales.

Todos estos factores pueden comprometer la especificidad y sensibilidad de la reacción,

pudiendo llevar a resultados falsos-negativos, falsos-positivos, o no reproducibles. Pero menos

conocido, sin embargo, es la variación de los resultados en la PCR atribuidos al subóptimo

funcionamiento de los termocicladores, siendo este el aspecto particular de la técnica que

constituye las bases de los estudios interlaboratorios (Saunders et al., 2003).

Esquema:

Fusión

95°C

Hibridización

50-60ºC

Extensión de

La cadena

72ºC


55

2014

Segundo ciclo se repiten las temperaturas: 95ºC, 50-60ºC y 72ºC y así se obtienen múltiples copias, repitiendo los ciclos según el protocolo estandarizado.

Huella Dactilar de Plasmidos (PF)

La huella dactilar de plasmidos fue la primera técnica molecular utilizada como una

herramienta de tipificación. Los plasmidos son elementos de ADN extracromosómico que están

presentes en muchos aislamientos clínicos y pueden ser identificados por simples procedimientos

de lisis de células seguidos de electroforesis en gel de los lisados. El número y tamaño de los

plasmidos presentes es utilizado como base para la identificación de cepas. Esta técnica de

tipificación de cepas ha sido utilizada con éxito en el análisis de brotes de infecciones

nosocomiales y en infecciones adquiridas en comunidad causadas por una variedad de especies de

bacterias gram-negativas (Tenover et al., 1997).

En general esta técnica es más utilizada para estudios epidemiológicos que están limitados

tanto temporalmente como geográficamente y puede complementar otras técnicas como la PFGE,

para proporcionar una base para diferenciar aislamientos que están relacionados genotípicamente

pero que están separados epidemiológicamente por periodos moderados de tiempo, como a

varios meses (Tenover et al., 1997).

Análisis del Polimorfismo de Largos Fragmentos de Restricción (RFLP)

Una de las técnicas nuevas y más promisorias es el RFLP desarrollado por Keygene BV,

Wageningen, de Nueva Zelanda. Este método combina una aplicabilidad universal con alto poder

de discriminación y reproducibilidad. Un gran número de reportes describen el uso de esta

técnica para plantas y mapeo genético animal, diagnósticos clínicos, estudios filogenéticos, y

tipificación de bacterias (Savelkoul et al., 1999).

Está basada en la detección de fragmentos de restricción genómica por amplificación con

reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y puede ser utilizada para ADNs de cualquier origen o

complejidad. La técnica comprende tres pasos: 1) la restricción del ADN y la ligazón de

adaptadores oligonucleótidos, 2) la amplificación selectiva de juegos de fragmentos de restricción,

y 3) análisis del gel de los fragmentos amplificados (Vos et al., 1995; Savelkoul et al., 1999;

Struelens, 2001).

El ADN es cortado con enzimas de restricción, y los adaptadores de la doble hebra están

ligados al final de los fragmentos del ADN para generar la plantilla de ADN para amplificación. La


56

2014

secuencia de los adaptadores y el sitio de restricción adyacente sirve como sitios de unión de los

primer para la subsecuente amplificación de los fragmentos de restricción (Vos et al., 1995).

Para el análisis de RFLP solamente se necesita una pequeña cantidad de ADN genomico

purificado; este es digerido como ya se menciono con dos enzimas de restricción , una con una

frecuencia media de corte (como la EcoRI) y una segunda con una alta frecuencia de corte (como

la MseI o TaqI) (Savelkoul et al., 1999).

Tiene un alto poder discriminatorio que se ajusta fácilmente y un muy buen nivel del

patrón de reproducibilidad para un amplio rango de bacterias patógenas tanto Gram positivas

como negativas (Struelens, 2001).

Ejemplo: Diagnóstico de Papiloma virus

Diagnóstico de cepas resistentes

Corte con enzima BsaI Corte con enzima MboII

Técnica de electroforesis en gel de campos pulsantes (PFGE)

La electroforesis en gel de campos pulsantes (PFGE por sus siglas en inglés) fue descrita en

1984 como una herramienta para examinar el ADN cromosómico de organismos eucariotas. Ha


57

2014

sido uno de los progresos más útiles de la epidemiología molecular en las décadas pasadas;

emerge en los 90´s como una técnica de la huella dactilar considerada el estándar de oro para la

tipificación molecular de microorganismos, ya que ha demostrado que es altamente efectiva para

muchas especies bacterianas tanto gram-positivas como los estafilococos, enterococos, y

mycobacterias y gram-negativas como la E. coli, otras Enterobacteriaceae, y pseudomonas

(Maslow et al, 1993; Goering, 1993; Tenover et al., 1994; Struelens y MESGEM, 1996; Tenover et

al., 1997; Goering, 2000; Struelens, 2001; Warner y Onderdonk, 2003).

En general, la PFGE es una de las técnicas de tipificación más reproducibles y altamente

discriminatorias en comparación con otras técnicas moleculares (Maslow et al, 1993; Goering,

1993; Tenover et al., 1994; Struelens and MESGEM, 1996; Tenover et al., 1997; Warner and

Onderdonk, 2003).

En esta técnica, el genoma bacteriano, que típicamente es de 2.000 a 5.000 pares de kb en

tamaño, es digerido con una enzima de restricción que es relativamente de pocos sitios de

reconocimiento y que genera aproximadamente de 10 a 30 fragmentos de restricción que van de

10 a 800 kb. Todos estos fragmentos pueden ser separados como un patrón de distintas bandas

por PFGE, usando una cámara diseñada especialmente que cambia de posiciones en el gel de

agarosa entre tres juegos de electrodos que forman un hexágono alrededor del gel (Tenover et

al., 1997; Warner y Onderdonk, 2003).

La preparación del ADN genómico y la macrorestricción son llevados a cabo en bacterias

que se ensamblan en los pozos de agarosa. Utilizando unidades de electroforesis programables

especiales, los cambios de orientación periódica de los campos eléctricos o electroforesis en gel de

campos pulsantes, permiten la separación y determinación del tamaño de los fragmentos de

macrorestricción.

La PFGE escanea más del 90% del cromosoma para reordenar fragmentos de gran tamaño

tales como duplicaciones, cancelaciones, o inserciones de secuencias que se detectan como un

cambio en el tamaño o número del fragmento (Struelens, 2001).

Los patrones de restricción del ADN de los aislamientos en estudio son comparados unos

con otros para determinar sus relaciones. Algunos resultados con esta técnica pueden llevar a

conclusiones diferentes entre laboratorios, como por ejemplo, que los aislamientos puedan ser

designados como relacionados con brotes o no relacionados con brotes de alguna enfermedad

(Tenover et al., 1995).

Las principales dificultades asociadas con esta técnica son las relacionadas a las demandas

técnicas del procedimiento y costos iniciales del equipo. La preparación de ADN genomico

apropiado requiere de 1 a 3 días, dependiendo de los organismos a examinar, y los costos del

equipo requerido (incluyendo el aparato de electroforesis y el transiluminador) varia entre 10, 000

y 20,000 dólares. Sin embargo, el método es operacional en el laboratorio, y puede ser aplicado a

un amplio rango de especies con solo un mínimo de modificaciones (Tenover et al., 1997).


58

2014

Reacción en Cadena de la Polimerasa con Primers Arbitrarios (AP-PCR)

Esta técnica simple y rápida ha sido sucesivamente aplicada para la delineación de cepas

genotípicas y análisis de poblaciones genéticas de un amplio rango de patógenos microbianos,

incluyendo bacterias, hongos y protozoarios (Struelens, 1998).

La discriminación es buena y puede correlacionarse con otras técnicas de genotipificación.

El poder discriminatorio es variable de acuerdo al número y secuencia de los primers arbitrarios y

a las condiciones de amplificación. Aunque requiere de varios factores técnicos para ser

estrictamente estandarizado para una reproducibilidad óptima.

La tipificación con esta técnica, y con métodos similares como el RAPD y el rep-PCR, están

basados en la amplificación por PCR de baja astringencia utilizando un primer simple de secuencia

arbitraria, típicamente de 10 pares de bases. Después de varios ciclos adicionales, se obtiene una

cepa específica de segmentos de ADN amplificados de varios tamaños (Struelens, 1998).

Los productos resultantes del PCR pueden representar una variedad de fragmentos de

ADN de diferentes tamaños que son visualizados a través de electroforesis en gel de agarosa.

RAPD-PCR

Electroforesis de geles con gradiente denaturante (DDGE)

El uso de las técnicas microbiológicas tradicionales no es eficiente para evaluar

comunidades bacterianas en muestras ambientales ya que la proporción de células bacterianas

cultivables en medios convencionales esta en el orden de 0.1% al 10% de la población total. Por

este motivo, los métodos moleculares están reemplazando a los métodos tradicionales para el

estudio y análisis de comunidades bacterianas.

La electroforesis de geles con gradiente denaturante (DGGE) es una técnica molecular

introducida en la ecología microbiana por Muyzer (1993) y ha sido adaptada como una

herramienta para determinar la diversidad microbiana en muestras ambientales (Schaefer, 2001).


59

2014

El DGGE se basa en el análisis de la información genética de la bacteria. El DNA es extraído de las

muestras y amplificado por PCR con primers 16S rDNA bacteriano.

OBJETIVOS DEL TRABAJO PRÁCTICO:

Identificación de microorganismos a través de pruebas bioquímicas que reflejan su

metabolismo.

Individualizar las características macroscópicas de cultivos de bacterias y hongos

(miceliares y levaduriformes).

Estudiar las características microscópicas (morfología) de bacterias y hongos (miceliares

y levaduriformes).

Utilizar técnicas de tinción con colorantes fluorescentes para análisis de poblaciones

(Live/ Dead).

1) Observación macroscópica del crecimiento de bacterias y levaduras en un medio de cultivo

líquido

1- A partir de cultivos en caldo tripteína soja (TSB) y un caldo TSB sin inocular.

Observar y comparar las características del desarrollo microbiano en medio líquido: turbidez

uniforme, formación de película, sedimento.

2- A partir de cajas sembradas observe las características macroscópicas de las colonias

desarrolladas en base a forma, tamaño, consistencia, color, etc.

Forma: puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa.

Tamaño: grande (más de 3 mm), mediana (2-3 mm), pequeña (1-2 mm)

Color

Borde: entero, ondulado, lobulado, filamentoso, ondeado

Elevación: plano, elevado, convexo, pulvinado, umbonado

Superficie: suave, brillante, rugosa, plegada, seca, polvorienta

2) Realizar preparaciones en fresco y tinciones simples y diferenciales de bacterias y hongos

levaduriformes


60

2014

A partir de una muestra líquida se realizarán las siguientes preparaciones para observar la

presencia de microorganismos (bacterias y/o levaduras) en:

1-preparaciones en fresco (40x)

2-extendidos teñidos con Azul de Metileno (100x)

3-extendidos teñidos con colorantes de Gram (100x)


61

2014

Caracteristica macroscópica de una colonia

3) Manejo del Manual Bergey

4) Análisis de poblaciones por microscopía de fluorescencia.

1. Tomar 1 mL de muestra de un crecimiento bacteriano, centrifugar a 9000g durante 10 min.

2. Lavar el pellet con SF, centrifugar y resuspender en 120-200 microlitros de SF según volumen de

pellet obtenido.

3. Se toman 80 microlitros y se colocan en un Eppendorf cubierto con papel de alumnio y se

agrega la mezcla de colorantes fluorescentes: (65 microlitros de SYTO 9 que tiñe las células viables

de verde, y 35 microlitros de Ioduro de Propidium que tiñe las células muertas de color rojo).

4. Se incuba a temperatura ambiente y en oscuridad durante 15-20 min.

5. Se observa en microscopio de fluorescencia.

Esta técnica también permite observar los cambios morfológicos observados durante cultivos

prolongados, es decir se puede realizar un seguimiento de las características de la población. Entre

los cambios morfológicos observados se encuentran las formas cocoides consideradas formas de

resistencia en ambientes adversos y con importancia epidemiológica desde el punto de vista de

transmisión de enfermedades.

Fundamento del Kit:

El kit Live/Dead BactoLigth brinda información acerca de la viabilidad de las células (actividad

metabólica) en un medio determinado. Contiene dos colorantes de ácidos nucleicos: SYTO 9 el

cual penetra las membranas libremente y el ioduro de propidio, el cual se encuentra altamente

cargado y no penetra normalmente células, salvo que las membranas se encuentren dañadas.

Permite observar las células viables de color verde, las muertas de color rojo y las formas de

muerte parcial de color naranja o amarillo.


62

2014

Trabajo Práctico Nº4: OBTENCIÓN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS CLÍNICAS DESTINADAS AL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. (Lic en Enfermería y Lic en Obstetricia) INTRODUCCIÓN La actividad que desarrolla el laboratorio de microbiología está orientada esencialmente al diagnóstico microbiológico de las enfermedades infecciosas. Una parte importante de esa actividad consiste en el aislamiento, la identificación y la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos de los microorganismos causales de estas enfermedades. Otra parte importante de la actividad de un laboratorio de microbiología consiste en la detección de anticuerpos, antígenos y ácidos nucleicos en diversas muestras (sangre, líquidos estériles, orina, etc.). El organismo está constituido por áreas colonizables por diferentes tipos de microorganismos que constituyen la flora normal, y por áreas normalmente estériles. Dentro de las primeras encontramos: cavidad oral, piel, mucosas, uretra, vagina e intestino. Los sitios normalmente estériles son: sangre, vejiga, líquido cefalorraquídeo y líquidos de punción (pleural). Toma de muestra La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso que se pretende diagnosticar. Es necesario que la toma se efectúe en el sitio exacto de la lesión y lo más pronto posible. La recogida de la muestra deberá realizarse en condiciones de máxima asepsia, evitando contaminaciones ambientales del personal y del propio enfermo a la muestra y viceversa. Se debe recoger una cantidad de muestra adecuada para un análisis completo. En ocasiones una escasa cantidad de muestra puede ser la causa de falsos negativos. La muestra se debe recoger, siempre que sea posible, antes de iniciar cualquier terapia antimicrobiana. Cuando esto no es posible, se obtendrán justo antes de la administración de la dosis del antimicrobiano, o tras 48 horas de la retirada del mismo. La muestra debe transportarse en envases adecuados, con cierres a prueba de fugas. El envío al laboratorio de microbiología debe ser lo más rápido posible con objeto de asegurar la supervivencia de microorganismos de difícil crecimiento y de evitar el sobrecrecimiento de la flora normal.


63

2014


64

2014

MUESTRAS Como reglas generales cabe indicar las siguientes:


65

2014

1. Antes de recoger la muestra, considerar el riesgo/beneficio de la recogida de la muestra para el paciente. 2. La muestra debe transportarse en envases adecuados con cierres a prueba de fugas. La recogida de la muestra deberá realizarse en condiciones de máxima asepsia, evitando contaminaciones ambientales del personal y del propio enfermo a la muestra y viceversa. 3. La muestra debe etiquetarse con el nombre del paciente, el servicio solicitante, el tipo de muestra y la fecha de recogida. En determinados casos será importante precisar la hora de recogida. 4. Se recomienda que cada muestra se introduzca en una bolsa de plástico que a su vez se introducirá en otra donde se incluya el volante. Así se evita que los posibles derrames de la muestra invaliden el volante de petición. 5. Se debe recoger una cantidad de muestra adecuada a la petición. En ocasiones una escasa cantidad de muestra puede ser la causa de falsos negativos. 6. El material destinado a cultivo no debe estar en contacto con sustancias desinfectantes o anestésicas, siempre que sea posible. 7. La muestra se debe recoger, siempre que sea posible, antes de iniciar cualquier terapia antimicrobiana. 8. Se debe evitar, siempre que sea posible, el contacto de la muestra con microbiota normal del paciente, con el objeto de asegurar que la muestra refleje lo mejor posible el lugar de la infección. 9. El envío al laboratorio de microbiología debe ser lo más rápido posible con objeto de asegurar la supervivencia de microorganismos de difícil crecimiento y de evitar el sobrecrecimiento de la microbiota normal, acortar el tiempo de contacto con anestésicos locales o con otras sustancias con acción antimicrobiana utilizadas en la recogida de la muestra.


66

2014

HEMOCULTIVO Obtención de la muestra Retirar los tapones externos de las botellas. Desinfectar los tapones de goma con la solución yodada, dejándolos secar al menos un minuto. Localizar por palpación la vena que se va a puncionar. Debe utilizarse una vena distinta para cada extracción. Desinfectar con alcohol una zona de piel de unos 5 cm de diámetro. Se comenzará por el centro y se irán haciendo círculos concéntricos hacia el exterior. Repetir el paso anterior pero con la solución yodada, dejándola secar durante un minuto. Extraer la sangre sin tocar en ningún momento el campo desinfectado. Si fuera necesario palpar nuevamente la vena se utilizarán guantes de goma estériles. Introducir la sangre en las botellas, en primer lugar la anaerobia, evitando que entre aire en la botella, con la jeringa en posición vertical. Mover las botellas para que la sangre y el medio de cultivo se mezclen. Rotular cada botella con el nombre del enfermo, día, hora de la toma y número de muestra enviada (1 ó 2). No tapar el código de barras de la botella. Volumen de la muestra En adultos, introducir en cada botella no menos de 10 ml de sangre ni más de 20 ml. En caso de neonatos y niños pequeños, es suficiente una cantidad de 01 a 5 ml, por cultivo. Relación sangre – caldo de cultivo: 1/5 a 1/10. Número de muestras Dos extracciones (dos botellas de hemocultivos por extracción: aerobia y anaerobia) por paciente, previas al tratamiento antimicrobiano, utilizando lugares de venopunción diferentes. Cuando comienzan los escalofríos y está subiendo la fiebre, antes del pico febril. El intervalo entre las extracciones debe ser de 15 minutos, pero si la fiebre es continua, este intervalo puede acortarse hasta 5 minutos. ORINA Muestras aceptadas: Chorro medio Al acecho Punción proximal de sonda Punción suprapúbica Muestras rechazadas: Bolsa colectora Punta de sonda vesical Chorro medio: Adultos ambulatorios hospitalizados sin sonda y niños que controlan esfínteres


67

2014

Instrucciones a seguir: En caso de ser mujer colocarse tampón vaginal Higienizarse con jabón nuevo no antiséptico ni desinfectante Enjuagarse con agua recién hervida y enfriada No secarse Eliminar el primer chorro de orina para arrastrar la flora uretral Recolectar el chorro medio en frasco estéril de boca ancha y tapa a rosca Una vez obtenida la muestra si no se procesa inmediatamente debe ser conservada en la heladera no más de 4 hs El paciente debe tener un tiempo de retención mínima de 3 hs Se deben conocer datos del paciente tales como: Edad Sexo Enfermedad de base Uso previo de antibióticos Instrumentación urológica y/o cirugía previa Antecedentes de infección urinaria Al acecho: población pediátrica que no controla esfínteres. Higienizar al niño como se describió anteriormente y recoger la muestra en frasco estéril de boca ancha y tapa a rosca Punción proximal de sonda: pacientes sondados se debe punzar a 10 cm. de la unión sonda-meato urinario con jeringa estéril y previa limpieza de la sonda con iodo povidona. Recordar el clampeo (compresión) de la misma durante 1 a 3 hs. Punción suprapúbica COPROCULTIVO Obtención de la muestra Niños menores de un año: HISOPADO RECTAL: Se introduce el hisopo estéril en el ano y se rota presionando la ampolla rectal para favorecer la excreción fecal. El mismo se coloca en un medio de transporte para su posterior procesamiento. Muestras rechazadas: pañales. Niños mayores de un año y adultos: Se recolecta la muestra recién emitida en un recipiente estéril de boca ancha. LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO El líquido cefalorraquídeo (LCR) rodea completamente al encéfalo y médula espinal. El mismo se recoge insertando ascépticamente una aguja a nive3l de las vértebras lumbares. La muestra obtenida se coloca en 3 o 4 tubos estériles y se rotula con el nombre del paciente.


68

2014

ESPUTO La muestra se obtiene por expectoración espontánea o inducida con vapores de cloruro de sodio. El paciente debe efectuar un cepillado de dientes y gargarismos con solución de bicarbonato de sodio, para disminuir la contaminación con flora normal de la boca. Son de elección los primeros esputos de la mañana, los cuales deben recogerse en un frasco estéril. LAVADO BRONQUIAL Se realiza con el broncoscopio y su principal utilidad reside en la búsqueda de microbacterias responsables de la tuberculosis. EXUDADO DE FAUCES Se debe ejercer presión con un baja lenguas e hisopar enérgicamente la zona afectada (placas purulentas, ulceraciones, zonas de enrojecimiento) evitando tocar con el hisopo la lengua, paredes de la boca y saliva que contienen flora habitual de la boca. Introducir luego el hisopo en un medio de transporte y remitirlo al laboratorio dentro de las 10 hs. de realizado. EXUDADO URETRAL Uretritis aguda: Debe haber una retención urinaria de aproximadamente 3 hs. Se toma el material con ansa o hisopo estéril que se introduce unos 2 cm dentro de la uretra y se hacer girar suavemente. Uretritis crónica: Si no hay exudación, se recoge la orina de forma estéril sin eliminar el primer chorro de la micción. Si hay exudación, se recolecta el material antes de la primera micción. EXUDADO VAGINAL No practicar higiene vaginal durante 12 hs. o más antes del examen. Siempre que sea posible es conveniente colocar el espéculo. Se toma la muestra a partir del fondo del saco vaginal y cuello de útero con hisopo estéril. OBSERVACIÓN IMPORTANTE Todas las muestras obtenidas para diagnóstico microbiológico deberán remitirse en forma inmediata al laboratorio para su procesamiento.


69

2014

Trabajo Práctico Nº4: Análisis Bacteriológico del Agua (TSGA)

OBJETIVOS

- Determinar la calidad microbiológica de agua potable por recuento de aerobios

mesófilos, investigación de coliformes totales y fecales, y determinación de la

presencia de Pseudomonas aeruginosa.

- Comparar los resultados obtenidos con los valores admitidos por el Código

Alimentario Argentino (CAA), y establecer la aptitud de la muestra analizada.

INTRODUCCIÓN

Se considera agua potable de suministro público y agua potable de uso domiciliario

la que es apta para la alimentación y uso doméstico: no deberá contener sustancias o

cuerpos extraños de origen biológico, orgánico, inorgánico o radiactivo en tenores tales

que la hagan peligrosa para la salud. Deberá presentar sabor agradable, y ser

prácticamente incolora, inodora, límpida y transparente. El agua potable de uso

domiciliario es la que proviene de un suministro público, pozo u otra fuente, ubicada en

los depósitos o reservorios domiciliarios (CAA, Cap. XII, art. 982).

Según el CAA, las características microbiológicas a estudiar son:

- bacterias aerobias mesófilas, cuyo recuento refiere a la calidad general del agua potable,

- bacterias coliformes totales (Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella y Escherichia coli) que

son consideradas indicadores de contaminación fecal. Las tres primeras pueden tener

origen ambiental. Sin embargo,

- E. coli, considerada dentro de coliformes fecales, proviene del hábitat intestinal humano

o animal, y su presencia en agua es inadmisible.

- Pseudomonas aeruginosa es un patógeno sensible a la cloración, que debería estar

ausente si el agua de bebida es adecuadamente clorada.


1. RECOLECCIÓN DE MUESTRAS

1.1. Toma de muestra: en botellas o frascos estériles


70

2014

1.2. Neutralización de cloro en muestras cloradas: usar tiosulfato de sodio en las

siguientes proporciones:

-agua de bebida: 0.1 ml de Na2S2O3 al 3% en 120 ml de muestra dará una concentración

final de 18 mg/L y neutralizará 5 mg/L de cloro residual.

-agua de efluentes cloacales clorados: 0.1 ml de Na2S2O3 al 10% en 120 ml de volumen de

muestra neutralizará 15 mg/L de cloro residual.

La muestra se debe mantener refrigerada y se debe procesar dentro de las 6 h después de

la recolección.

2. RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS MESÓFILAS

Procedimiento

Preparar varias diluciones de la muestra (1/10, 1/100, etc). Colocar 1 ml de la

muestra sin diluir, y de cada una de las diluciones en placas de Petri vacías y estériles, por

duplicado. Verter 10 a 12 ml de agar triptona-glucosa-extracto de levadura (también

llamado agar de recuento –PCA), fundido y enfriado a 50-55°C, en cada placa. Imprimir

suaves movimientos de rotación para mezclar. Dejar solidificar. Incubar a 35°C durante 24

h.

Se consideran para el recuento aquellas cajas que contengan entre 30 y 300 colonias.


71

2014

El recuento bacteriano resulta del:

promedio del número de colonias en 2 cajas pertenecientes a la misma dilución,

multiplicado por la inversa de la dilución usada, expresado en ufc/ml.

Incluir en el informe el método usado, temperatura, tiempo de incubación y el medio de

cultivo.

Medio de cultivo: agar triptona-glucosa-extracto de levadura o agar de recuento (PCA)

Triptona 5 g

Extracto de levadura 2.5 g

Glucosa 1 g

Agar 15 g

A.D. 1000 ml

pH: 7.0 + 0.2

Autoclavar a 121°C durante 15 min.

Valor máximo admitido por el Código Alimentario Argentino: 500 ufc/ ml.

3. INVESTIGACIÓN DE COLIFORMES TOTALES (GÉNEROS: ENTEROBACTER, CITROBACTER,

KLEBSIELLA Y ESCHERICHIA)

3.1. ANÁLISIS PRESUNTIVO

- Investigación de COLIFORMES TOTALES

Procedimiento

Técnica del número más probable (NMP) por fermentación de tubos múltiples

Agitar la muestra vigorosamente alrededor de 25 veces.


72

2014

-inocular series de 5 tubos de caldo Mac Conkey con distintos volúmenes de la muestra

[10 ml para tubos con doble concentración de caldo (D.C.), 1 ml y 0.1 ml para tubos con

simple concentración de caldo (S.C.)].

Incubar a 35 + 0.5°C.

Hacer una primera lectura a las 24 + 2 h para observar producción de gas y viraje del

indicador por desarrollo con producción de acidez. Esto constituye una reacción

presuntiva positiva. Si fuera negativo, reincubar y reexaminar al final de 48 + 3 h.

Interpretación

Producción de gas y viraje de color violeta a amarillo en 48 h + 3 h constituye un test

presuntivo positivo. Continuar con fase confirmativa.

Medio de cultivo: caldo Mac Conkey

Bilis fresca de buey……………… 5 g

Peptona ……………………… ….20 g


73

2014

Lactosa…………….. ..10 g

Púrpura de bromocresol………0.01 g

A.D…………………………….1000 ml

pH =7.3 + 0.2

Envasar en tubos con campanita de Durham y esterilizar.

3.2. ANALISIS CONFIRMATIVO

3.2.1.- Confirmación de COLIFORMES TOTALES

Procedimiento

De los tubos de Mac Conkey que presentan gas y viraje de color a las 48 h, sembrar con

ansa en anillo en caldo BRILA. Incubar 24 h a 35-37°C.

Interpretación:

La producción de gas confirma la presencia de coliformes totales.

Calcular NMP (número más probable en 100 ml) desde la Tabla de NMP.


74

2014

Medio de cultivo: Caldo bilis-lactosa-verde brillante (BRILA)

Peptona 10 g

Lactosa 10 g

Oxgall...........................................20 g

Verde brillante...................... 0.0133 g

A.D. .......................................1000 ml

pH = 7.2 + 0.2

Repartir 10 ml en tubos con campana de Durham y esterilizar.

El NMP para combinaciones que no aparecen en la Tabla, o para otras combinaciones de

tubos o diluciones, se puede estimar por la fórmula simple de Thomas:

N° de tubos positivos x 100

NMP/100 mL = ------------------------------------------------------------

mL de muestra en x mL de muestra en

tubos negativos todos los tubos

El Código Alimentario Argentino admite hasta 3 coliformes totales en 100 ml de

muestra.


75

2014

3.2.2.- Confirmación de COLIFORMES FECALES (Escherichia coli)

Procedimiento

De cada uno de los tubos positivos de caldo Mac Conkey en la fase presuntiva, transferir

cultivo con ansa estéril de 3-3.5 mm de diámetro a caldo EC. Incubar en baño de agua a

44.5 + 0.2 °C por 24 + 2 h.


76

2014

Interpretación:

La ausencia de gas dentro de las 24 h de incubación indica AUSENCIA de coliformes

fecales. El análisis de coliformes fecales finaliza aquí.

La producción de gas dentro de las 24 h o menos indica PRESENCIA de coliformes fecales

(se debe continuar para confirmar E. coli).

Medio de cultivo: caldo EC

Triptosa 20 g

Lactosa 5 g

Sales biliares (mezcla) o

sales biliares N°3 1.5 g

K2HPO4 4 g

KH2PO4 1.5 g

NaCl 5 g

A.D. 1000 ml

pH = 6.9 + 0.2

Envasar con campanita de Durham y esterilizar.


77

2014

3.2.2.1. Confirmación de Escherichia coli

Procedimiento

Desde cada uno de los tubos de caldo EC positivos, sembrar en agar eosina-azul de

metileno (EMB) y observar el desarrollo de colonias características de Escherichia coli.

Hacer Gram y pruebas bioquímicas principales.

Interpretación:

El desarrollo de colonias oscuras con brillo verde-metálico en EMB, la observación de

bacilos y cocobacilos Gram negativos al microscopio óptico, e IMViC ++ - - confirman la

presencia de E. coli.

Computar los tubos EC donde se confirmó la presencia de E. coli y con la nueva

combinación de tubos positivos, calcular el NMP de coliformes fecales desde la Tabla de

NMP.

El Código Alimentario Argentino recomienda ausencia de E. coli en 100 ml de muestra.


78

2014

Medio de cultivo: Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)

Peptona……………………..10.0 g

Lactosa……………………….5.0 g

Sacarosa……………………. 5.0 g

Fosfato dipotásico…………. 2.0 g

Agar………………………… 13.5 g

Eosina………………………. 0.4 g

Azul de metileno………….0.065 g

pH final: 7.2 ± 0.2

Disolver. Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y

distribuir agitando suavemente.

4. Investigación de Pseudomonas aeruginosa

4.1. Test presuntivo

Procedimiento:

Medir 100 ml de muestra en recipiente estéril y sembrar en 100 ml de caldo asparagina

doble concentración. Incubar hasta 5 días a 25°C. Observar bajo luz U.V.

Medio de cultivo: caldo asparagina (fórmula simple)

Asparagina 3 g

K2HPO4 1 g

MgSO4.7H2O 0.5 g

A.D. 1000 ml

pH = 6.9 a 7.2


79

2014

Interpretación:

El desarrollo de fluorescencia verdosa por producción de pigmento se considera test

presuntivo positivo.

4.2. Tests confirmativos

Desde caldo asparagina positivo sembrar para las siguientes pruebas:

4.2.1. Digestión de caseína y producción de pigmento verde característico

Hacer una sola estría (de 2 a 4 cm de longitud) desde caldo asparagina sobre agar leche e

incubar a 35 + 1°C por 24-48 h.


80

2014

Interpretación

P. aeruginosa hidroliza la caseína y produce un pigmento difusible verde o amarillento.

Medio de cultivo: - Agar leche

A- Leche descremada 100 g

A.D. 500 ml

B- Caldo nutritivo 12.5 g

NaCl 2.5 g

Agar 15 g

A.D. 500 ml

Esterilizar por separado las mezclas a y B, enfriar rápidamente a 55°C, combinar

asépticamente las mezclas y verter en cajas de Petri.

4.2.2. Producción de pigmento verde característico

Sembrar con ansa desde caldo asparagina en agar King Ward Raney A, e incubar como se

explicó para agar leche.


81

2014

Interpretación:

P. aeruginosa produce un pigmento fluorescente que se hace evidente bajo luz UV. El

pigmento se puede extraer con cloroformo en medio alcalino (NH4OH) y se observa de

color azul.

Medio de cultivo: Agar King Ward Raney “A”.

Peptona...........................................2 g

Agar ................................................1.5 g

Glicerol ...........................................1 g o 1 ml

K2SO4 anhidro.................................1 g

MgCl2...............................................0.14 g

Agua destilada.................................100 ml

pH: 7.2

4.2.3. Otros ensayos

Realizar Gram y prueba de oxidasa a colonias seleccionadas desde agar leche o King “A”.

- Prueba de la oxidasa


82

2014

Se basa en que ciertos microorganismos contienen citocromo-oxidasas, estas

enzimas oxidan la dimetilparafenilendiamina en presencia de O2 y citocromo y llevan alfa-

naftol a indofenol de color azul.

Técnica: se emplean discos comerciales impregnados en los reactivos, que se

introducen en una suspensión de la cepa a ensayar.

Interpretación

P. aeruginosa es un bacilo gram negativo, que da positiva la prueba de la oxidasa.

El Código Alimentario Argentino recomienda ausencia de P. aeruginosa en 100 ml de

muestra.


1. Se procederá a realizar toma de muestra desde grifo de pileta del Laboratorio y se

sembrará para las 3 determinaciones: recuento de aerobios mesófilos, coliformes totales

e investigación de P. aeruginosa.

2. En medios de cultivo sembrados con una muestra de agua artificialmente contaminada,

se realizará observación del desarrollo, y lectura e interpretación de los resultados

obtenidos. Se informarán los resultados obtenidos.

3. Tomando como referencia los valores máximos admitidos por el CAA, se establecerá la

calidad del agua analizada.

BIBLIOGRAFÍA

- http://www.anmat.gov.ar/alimentos/codigoa/CAPITULO_XII.pdf

- American Public Health Association (APHA). 1994. Standard Methods for the Examination

of Water and Wastewater. USA.

http://www.anmat.gov.ar/alimentos/codigoa/CAPITULO_XII.pdf

guía de trabajos prácticos microbiología, parasitología e...

Documents