guião do aluno versão a
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Guião do aluno
VERSÃO A
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ÍNDICE:
Introdução……………………………………………………………………...… 3
Parte I – Enquadramento teórico da actividade………………………… 4
Parte II – Problematização da actividade….………………………….…. 7
Parte III – Procedimentos protocolares............................................ 9
Parte IV – Análise e discussão dos resultados…………………………. 12
Parte V – Actividades complementares………………………………….. 12
Parte VI – Glossário…………………………………………………………… 22
Apêndices………………………………………………………………………… 24
Referências Bibliográficas………………………………………………..….. 27
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Introdução
O kit “BioExperimentando” é uma actividade prática, de laboratório, que se baseia numa simulação de
uma triagem genética numa família que possui uma doença hereditária fictícia. Nesta actividade pretende-se que
se integre a compreensão de processos genéticos, com as técnicas associadas, e as respectivas questões éticas.
Os alunos terão que determinar a probabilidade de um determinado casal ter um filho doente, através da análise
das amostras de DNA, após restrição e separação electroforética.
O kit BioExperimentando vai permitir que o aluno:
estude a transmissão de determinada característica hereditária, através de técnicas de
Engenharia Genética;
analise e interprete casos de mutação, sua génese e consequências;
explore procedimentos laboratoriais de manipulação do DNA;
compreenda a importância e modo de funcionamento das enzimas de restrição;
manipule o material de laboratório de forma autónoma e responsável;
desperte a curiosidade relativa à metodologia desta investigação;
compreenda a utilidade de algumas técnicas utilizadas em Engenharia Genética no quotidiano
dos cidadãos;
use o pensamento crítico para resolver problemas;
discuta algumas questões éticas inerentes à manipulação do DNA.
Este kit foi concebido para alunos do Ensino Secundário do Curso de Ciências e Tecnologias do 12ºano,
no âmbito da disciplina de Biologia.
Kit BioExperimentando
Etapas de implementação Vantagens da utilização Ajuda a ensinar
Restrição das amostras
de DNA
Introdução aos perfis
de DNA e análise de
RFLP
Electroforese em gel de
agarose
Análise e interpretação
de resultados
Uso de enzimas de restrição
reais e realização de
electroforese com
fragmentos de DNA real.
A actividade pode ser
realizada em duas sessões
de 45 minutos.
Material suficiente para 8
grupos de trabalho.
Estrutura do DNA
Hereditariedade clássica Mendeliana
(autossómica ou ligada ao sexo)
Análise de restrição do DNA
Preparar um gel de agarose para electroforese
Determinar o tamanho molecular.
Simulação de perfis de DNA
Análise de mapas de restrição
Questões éticas inerentes aos testes genéticos.
Medidas de segurança
Não é permitido comer, beber ou fumar no laboratório/área de trabalho.
É recomendado a utilização de luvas e de uma bata de algodão.
Os alunos devem lavar as mãos com água e sabão antes e depois da actividade.
Se alguma solução entrar em contacto com os olhos, estes devem ser imediatamente lavados com água.
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Parte I – Enquadramento teórico da actividade
A análise de DNA humano tem aplicações em duas grandes áreas:
1. Cuidados de saúde – inclui o diagnóstico de doenças hereditárias, mutações cromossómicas e cancro.
2. Sistema judicial – identificação de suspeitos em casos criminais (homicídio, rapto, roubo…) e análise de
relações familiares em casos de disputa da paternidade e de imigração.
Na presente actividade simula-se o diagnóstico de uma doença fictícia, que afecta vários membros de uma
família. São vários os conceitos e técnicas inerentes à implementação e compreensão da actividade:
Enzimas de restrição
As endonucleases (endo = dentro, nuclease = enzima que corta ácidos nucleicos) ou enzimas de restrição
são enzimas que reconhecem sequências específicas de bases no DNA e são capazes de hidrolisar as cadeias de
DNA.
Uma enzima de restrição liga-se a uma molécula de DNA e desliza ao longo da hélice até reconhecer
sequências especificas de pares de bases que indicam que esta deve parar de deslizar. A enzima corta então
quimicamente o DNA naquele local, chamado local de restrição. Se um local de restrição específico ocorrer em
mais do que um local numa molécula de DNA, a enzima de restrição irá cortar em cada um desses locais,
resultando múltiplos fragmentos. O tamanho de cada fragmento vai depender da localização dos locais de
restrição na molécula de DNA.
Quando as enzimas de restrição são usadas para cortar cadeias de plasmídios circulares de DNA, tal como
acontece neste kit, fragmentos de diferentes tamanhos são produzidos. O DNA que se cortou pode ser observado
usando um processo conhecido como electroforese em gel de agarose.
O gel de agarose
O gel de agarose prepara-se dissolvendo uma suspensão de agarose numa solução tampão e deixando
arrefecer num recipiente apropriado. A agarose deve ser previamente pesada para a concentração pretendida do
gel e deve ser dissolvida na solução tampão com a ajuda de uma fonte de calor (em banho–maria ou no
microondas). Assim que a solução levantar fervura deve ser retirada da fonte de calor, pois se deixarmos ferver a
malha do gel pode ficar laxa, o que poderá trazer implicações na electroforese e nos resultados que deveremos
obter.
A solução deve ser vertida num molde apropriado (figura 1) quando atinge uma temperatura de cerca
de 50ºC (ou seja, quando pudermos pegar no recipiente directamente com a mão sem nos queimarmos).
Antes de vertermos a solução de agarose no molde, devemos colocar as borrachas adaptadoras e um pente junto
da extremidade orientada para o pólo negativo da tina de electroforese (uma vez que o DNA irá migrar para o
pólo positivo) para obtermos um gel com uma fileira de poços. Após solidificação do gel, vertemos tampão de
electroforese sobre o gel, e cuidadosamente retiramos o pente, tendo o cuidado de não danificar os poços (nunca
retirar o pente sem o gel estar submerso em tampão de
electroforese!). Posteriormente vertemos um pouco mais de
tampão de electroforese sobre os poços para eliminar
eventuais resíduos de agarose que não tenha sido
polimerizada.
Figura 1 – Gel de agarose
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Electroforese
A electroforese consiste em fazer migrar biomoléculas por uma matriz, sob a influência de um campo
eléctrico, permitindo separá-las segundo os seus tamanhos. Esta técnica permite analisar fragmentos de DNA e
determinar o seu tamanho.
O DNA antes de ser carregado nos poços tem que ser tratado com tampão de amostra que tem várias
funções: dá cor à amostra (azul de bromofenol ou xilenocianol), confere densidade (tem sacarose ou glicerol) e
mantém o pH alcalino. Os fragmentos de DNA são então descarregados em poços, no gel de agarose, que é
colocado numa tina cheia de tampão de electroforese (TAE ou TBE). O tampão de electroforese fornece
condutibilidade eléctrica e mantém o pH que é necessário para a manutenção da carga e estabilidade das
moléculas. O carregamento dos poços é um procedimento que deve ser feito com muito cuidado para não
danificar os poços do gel (figura 2). O conteúdo deve ser expelido da pipeta devagar e continuamente,
carregando no êmbolo da pipeta até ao primeiro ponto de resistência. Quando é sentida esta primeira resistência,
deve-se aguardar uns breves segundos antes de retirar, lentamente, a ponta da pipeta do poço.
Após o carregamento dos poços, ligam-se os eléctrodos à fonte de alimentação, determinando
previamente a voltagem e o tempo de electroforese (figura 3).
A corrente eléctrica é passada entre os eléctrodos que estão nos terminais da tina de electroforese.
Desde que os fragmentos de DNA estejam carregados negativamente, eles vão avançar para o pólo positivo
(cátodo) quando estiverem sujeitos a um campo eléctrico. No decorrer da electroforese, verifica-se junto à
extremidade que contém o eléctrodo negativo a libertação de H2. Na extremidade que contém o pólo positivo
observa-se a libertação de O2. Se não estiver a ocorrer a electroforese não há formação destes gases, pelo que a
observação da libertação destes gases sob a forma de “bolhinhas” é um bom indicador da ocorrência ou não
deste processo.
A matriz do gel de agarose funciona como uma malha molecular através da qual cada fragmento
pequeno de DNA se move mais facilmente do que os fragmentos maiores. No entanto, a razão entre o que cada
fragmento de DNA migra através do gel é inversamente proporcional ao seu tamanho em pares de bases. Após
um determinado período de tempo, os fragmentos menores de DNA vão migrar até mais longe do que os
maiores. Fragmentos do mesmo tamanho ficam juntos, e migram numa única banda de DNA. Estas bandas irão
ser vistas posteriormente no gel após o DNA ser corado.
Figura 2 – Carregamento dos poços
Figura 3 – A electroforese
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Visualização do DNA
O DNA é incolor, por isso os fragmentos no gel não podem ser vistos durante a electroforese. Corando
as bandas de DNA é possível a sua localização no gel. Habitualmente nas escolas utiliza-se o corante Azure A:
100% inócuo, e com um grau de eficácia muito elevado, já que permite uma boa visualização do DNA, num
espaço de tempo reduzido (figura 4).
Testes genéticos
Um teste genético é o mais recente e sofisticado procedimento utilizado para identificar alterações
genéticas, e envolve a análise directa do DNA.
As finalidades dos testes genéticos podem ser o diagnóstico, o rastreio ou a monitorização. Os testes
genéticos podem ser utilizados para diagnosticar uma doença genética, para determinar se um indivíduo é
portador de uma doença associada a uma mutação, para prever o desenvolvimento de uma doença genética,
para determinar a susceptibilidade de um indivíduo para uma determinada doença, ou ainda para aplicações na
ciência forense.
Actualmente são realizados centenas de testes genéticos e muitos outros estão em desenvolvimento.
Quando o gel é imerso no corante Azure A, as moléculas do
corante atacam o DNA que se encontram na malha do gel de
agarose. Quando as bandas ficam visíveis, é possível comparar
os padrões de restrição do DNA em diferentes amostras de
DNA.
Dada a relação qualidade/preço/segurança, o corante
seleccionado para esta actividade é o Azure A. No caso da
escola possuir transiluminador UV sugere-se a utilização do
corante GelRed. No caso da escola possuir uma fonte de luz
azul, pode optar-se pela utilização do GelGreen.
Figura 4 – Corante para o visualização do
DNA - Azure A
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Parte II – Problematização da actividade
O problema apresentado à turma é o seguinte:
D. Maria Sr Joaquim
Ana André
Paulo
Vera
José Rosa Manuel Agostinho Elisabete Helena Joana António
Marta Diana Serafim Josefina Rui Tiago Rita
Carlos Pedro
Filho A Filho B
Figura 5 – Árvore genealógica da família Antunes
Transmissão da doença “Raritose” A família Antunes é afectada há quatro gerações sucessivas pela doença “Raritose”. A Ana, bisneta da D. Maria e do Sr Joaquim, casou com o André, e pretendem ter um filho. Tendo o André conhecimento de que a família de Ana tem problemas com essa doença, este sugere a Ana que façam um teste genético para averiguar a probabilidade dos seus eventuais filhos serem doentes ou portadores da doença. A árvore genealógica desta família encontra-se disponível na figura 6.
Questão- problema: Será possível pela análise do DNA descobrirmos se os filhos de Ana e André serão doentes?
Mulher
Homem
Sexo Indefinido
Legenda
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Para simplificação de identificação, a cada membro da família será atribuído um número, como mostra a figura 6.
Parte III – Procedimentos protocolares
Trabalho laboratorial:
- Material/Métodos
- Notas para o professor
- Informação adicional
Pipetagem
Electroforese
Parte IV – Análise e discussão dos resultados
Membros da família Antunes:
No sentido de dar resposta à questão formulada anteriormente, foram recolhidas amostras de cada um
dos membros da família Antunes. De referir que cada amostra de DNA recolhida contém parte do gene
responsável pela doença, amplificado previamente por PCR (Reacção de Polimerização em Cadeia). Existem
apenas dois alelos diferentes para o locus que está ser investigado. Um indivíduo que seja homozigótico para o
alelo dominante (genótipo RR) terá apenas DNA do tipo R. Um indivíduo que seja homozigótico para o alelo
responsável pela doença (genótipo rr) terá apenas DNA do tipo r. Por sua vez, um indivíduo que seja
heterozigótico (genótipo Rr), terá DNA dos dois tipos. A amplificação da região de interesse do DNA origina
fragmentos de mesmo tamanho para ambos os alelos, neste caso, 6500 pb.
1
2
20 21
5
23
3 4 8 7 6 9 10 11
18 17 16 15 14 13 12
19 22
Filho A Filho B
Figura 6 – Árvore genealógica da família Antunes
1 – D. Maria
2 – Sr. Joaquim 3 – José 4 – Rosa
5 – Paulo 6 – Elisabete 7 – Agostinho 8 – Manuel
9 – Helena
10 – Joana 11 – António 12 – Rita
13 – Tiago 14 – Rui 15 – Josefina 16 - Serafim
17 – Diana
18 – Marta 19 – Carlos 20 – Ana
21 – André 22 – Pedro 23 – Vera
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O objectivo é detectar que formas de DNA estão presentes em cada amostra, e para isso sujeitam-se as
amostras a restrição com a enzima BamHI e analisar os fragmentos de DNA resultantes, no gel de electroforese.
A diferença na sequência de DNA dos alelos R e r é tal que, no alelo r existe uma sequência de bases que pode
ser reconhecida e cortada pela enzima de restrição BamHI. O alelo R não possui local de restrição para a enzima
BamHI e assim não vai ser cortada pela enzima.
Um marcador de DNA, que consiste num conjunto de fragmentos de tamanhos conhecidos, é sujeito a
electroforese juntamente com as amostras, para se poder confirmar que os fragmentos mais pequenos obtidos,
quando combinados, formam o fragmento maior (4000 + 2500 = 6500 bp).
Parte III – Procedimentos protocolares
Segue-se o trabalho de laboratório que implica o cumprimento de todas as regras de segurança já
mencionadas na introdução deste guião. De referir que quando se manuseia DNA, deve ter-se sempre em
atenção que todo o material que entre em contacto com o DNA deve ser esterilizado, com particular atenção às
pontas das micropipetas. Estas nunca devem ser tocadas com as mãos ou entrar em contacto com material não
esterilizado, para que não haja contaminação do DNA.
1. Distribuição das amostras de DNA
a) No topo de cada um dos tubos que contêm enzima liofilizada, proceder à identificação dos mesmos com
os números de 1 a 23 (utilizar caneta de tinta permanente).
b) Colocar 20 µL de cada amostra de DNA (amostra A, B e C) no respectivo tubo (ver figura 7) que continha
já enzima de restrição liofilizada ( 9 tubos recebem a amostra de DNA A, 11 tubos recebem a amostra de DNA B,
e 3 tubos recebem a amostra de DNA C).
c) Proceder à mistura da solução de DNA com a enzima, fazendo leves batimentos com os dedos no fundo
do tubo.
2. Restrição enzimática
a) Com os tubos dispostos num suporte adequado, incubar as amostras de DNA numa estufa a 37ºC,
durante cerca de 40 minutos.
3. Preparação do gel de agarose
a) Pesar 0,4 g de agarose num matraz, adicionar 50 mL de tampão TAE (1x).
b) Tapar o matraz com película aderente, e furar a película antes de o levar ao microondas (não utilizar
parafilme).
Tubos que recebem a amostra de DNA A: tubos 3, 9, 10, 12, 14, 17, 18, 19, 22 Tubos que recebem a amostra de DNA B: tubos 1, 2, 4, 5, 6, 8, 13, 16, 20, 21, 23
Tubos que recebem a amostra de DNA C: tubos 7, 11, 15
Figura 7 – Distribuição das diferentes amostras de DNA
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c) Proceder à sua dissolução no microondas durante 3 minutos (ter atenção para a solução não levantar
fervura, uma vez que se ferver, a malha do gel vai ficar laxa, havendo implicações na electroforese).
d) Retirar o matraz do microondas com o auxílio de uma pega, e agitar suavemente, certificando de que toda
a agarose se encontrava totalmente dissolvida.
e) Deixar arrefecer até à temperatura aproximada de 60ºC.
f) Colocar o pente junto ao eléctrodo negativo da tina de electroforese.
g) Verter continuamente o volume de agarose derretida na tina de electroforese, (evitando assim a criação
de bolhas de ar) de modo a encher a cavidade central, e a circundar os dentes do pente.
h) Aguardar a polimerização da agarose durante cerca de 20 minutos.
4. Carregamento do gel
a) Após a solidificação do gel de agarose, cobrir toda a
sua superfície com TAE.
b) Remover cuidadosamente o pente do gel bem como
as placas laterais.
c) Adicionar 2 µL de tampão de amostra a cada um dos
tubos que contem as amostras de DNA.
d) Agitar suavemente no sentido de misturar o tampão de
amostra com a solução de DNA.
e) Pipetar 5 µL do marcador de DNA e adicionar µL de tampão de amostra.
f) Carregar 5 µL da solução anterior no primeiro poço do gel.
g) Pipetar 20 µL de cada amostra de DNA, pela ordem numérica dos tubos, e carregar nos poços do gel
(figura 8).
5. A electroforese
Procedimento:
a) Verificar se os eléctrodos estão bem colocados (ver figura 3).
b) Regular a voltagem para os 120 volts.
c) Submeter o DNA a electroforese durante 20 minutos.
d) Interromper a electroforese quando o azul do tampão
alcançar o fim do gel.
Figura 9- Electroforese
Figura 8 – Carregamento do gel de agarose
Para recordar…
1. A tina de electroforese cria um campo eléctrico com pólos positivo e negativo nas extremidades opostas
do gel. As moléculas de DNA são carregadas negativamente. Indique, justificando, para que pólo eléctrico da tina espera que o DNA migre. 2. Refira a cor que representa o pólo negativo.
3. Após as amostras de DNA serem carregadas nos poços, elas são forçadas a moverem-se através do gel. Explique quais os fragmentos (maiores ou menores) espera que se movam para a extremidade do gel mais
rapidamente.
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6. Coloração do DNA
a) Remover a solução tampão TAE da tina, reservando-a para posteriores utilizações (tem que se ter o
cuidado de segurar o gel, e assim evitar que este se parta).
b) Verter cerca de 10mL de corante do DNA, Azure A, na superfície do gel.
c) Deixar actuar cerca de 4 minutos.
d) Retirar o corante da superfície do gel e guarda-lo para posterior reutilização, anotando no frasco o nº de
vezes que este já tinha sido utilizado.
e) Retirar o corante da superfície do gel, lavando-o com 5ml de etanol a 70%, durante uns segundos.
f) Eliminar o álcool e lavar o gel com água corrente, durante 3 ou 4 minutos, não deixando água no gel, para
que não seja removido do gel a totalidade do corante.
g) Aguardar até que as bandas se tornem visíveis.
h) Observar os resultados.
i) Registar o número de bandas na respectiva árvore genealógica.
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Parte IV – Análise e discussão dos resultados
1. Elabore um desenho do gel resultante do trabalho laboratorial, com os poços devidamente
assinalados (apêndice I).
2. Na árvore genealógica fornecida (apêndice II), registe o número de bandas obtido em cada indivíduo (para cada amostra de DNA poderá visualizar uma, duas ou três bandas).
3. Indique, justificando, qual o modo de transmissão da doença.
4. Identifique os indivíduos que são portadores da doença.
5. Refira os indivíduos que podem ter falecido devido à doença “Raritose”.
6. Indique o genótipo e o fenótipo dos indivíduos 1, 15 e 22.
7. Comente a seguinte afirmação: A probabilidade de o André e a Ana terem um filho doente é igual
à probabilidade de terem um filho portador. (Sugestão: Faça um xadrez mendeliano).
8. A Ana e o André optaram na realidade pela realização de um teste genético, antes de terem filhos, para saberem se há a possibilidade de terem um filho doente. Alguns membros da família apoiam a decisão tomada pelo casal, mas há outros membros que se opõem. Enumera dois argumentos que
possam ter sido referidos a favor da realização do teste genético e dois argumentos que possam ter sido referidos contra.
9. Complete o “V de Gowin” relativo à actividade experimental desenvolvida (apêndice III).
10. Elabore uma resposta para a questão-problema formulada inicialmente “Será possível pela análise do DNA descobrirmos se os filhos de Ana e André serão doentes?”
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Parte V – Actividades complementares
Actividade complementar 1 – Mapeamento de plasmídios
Plasmídios e enzimas de restrição
O mapeamento de plasmídios revolucionou a biologia molecular e abriu o caminho para a indústria da
biotecnologia. Esta técnica permite aos biólogos moleculares avaliar rapidamente o sucesso de experiências de
clonagem assim como identificar facilmente plasmídios e tratamentos associados em diferentes organismos.
Embora os verdadeiros perfis de DNA sejam conseguidos a partir do DNA genómico, a actividade que se segue
utiliza DNA plasmídico para simular como os verdadeiros perfis de DNA são analisados.
Após o corte dos plasmídios pelas enzimas de restrição, estes podem ser ligados a um fragmento de
DNA proveniente de um outro organismo que tenha sido cortado com a mesma enzima de restrição. O plasmídio
resultante que possui DNA híbrido pode ser incorporado em células bacterianas (transformação). O plasmídio
híbrido replica-se na bactéria da mesma forma que o plasmídio original, incluindo o fragmento de DNA estranho
que foi introduzido. Assim, cada plasmídio híbrido contém uma cópia do DNA estranho incorporado. Diz-se que o
fragmento de DNA foi “clonado” e o plasmídio de DNA que o transporta é designado “vector”.
Os plasmídios podem ser descritos em termos de localização dos locais de restrição usando simples
procedimentos e lógica. O procedimento geral é digerir um plasmídio com duas enzimas de restrição
separadamente e com as duas em simultâneo (digestão dupla). Os tamanhos dos fragmentos de DNA resultantes
são determinados usando a lógica para determinar a localização relativa dos locais de restrição.
Uma vez que os plasmídios são circulares, o número de fragmentos representam o número de cortes ou
locais de restrição.
Ler um mapa de um plasmídio
Um mapa de um plasmídio contém informações relativas ao tamanho do plasmídio, aos genes presentes,
à origem do local de replicação, e aos locais de restrição para as enzimas de restrição. Os plasmídios utilizados
nesta actividade laboratorial foram o plasmídio pUC 18, o plasmídio pCR2.1.TOPO, e o plasmídio pCard (resulta
da adição de um insert de 1500bp no plasmídio pCR 2.1 TOPO). Foi utilizada a enzima de restrição BamHI,
embora outras enzimas pudessem ter sido utilizadas para cortar estes plasmídios (exemplo da enzima HindIII).
Os locais de restrição são marcados no mapa com um número que indica o local de restrição. Uma vez que o
plasmídio é circular, existe um local zero arbitrário. Todos os locais de restrição são indicados com um número
entre zero e o número total de pares de base do plasmídio. O tamanho dos fragmentos pode ser calculado pela
simples subtracção (e nalguns casos adição) entre pontos do plasmídio.
Plasmídios utilizados neste kit
O mapa de um plasmídio mostra as posições (numeradas pelos pares de bases do DNA) dos locais onde
o plasmídio pode ser cortado por determinadas enzimas de restrição. O nome do plasmídio e o seu tamanho em
pares de base de DNA é mostrado dentro do círculo, assim como a Origem de Replicação (Ori). Dois dos
plasmídios utilizados neste kit são plasmídios comerciais: o pUC18 e o pCR2.1 (figura 10 e 11).
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Figura 10 – Plasmídio pUC 18 Fonte da imagem: http://www.taq-dna.com/puc18-dna-_149.html
Figura 11: Plasmídio pCR2.1 Fonte da imagem: http://www.imagenes-bio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml
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Questões:
1. A partir do mapa do plasmídio pCR2.1 enumere as enzimas de restrição que podem cortar o plasmídio.
2. Qual dos plasmídios, pUC 18 ou pCR2.1, é o maior e qual é o seu tamanho?
3. Utilizando o plasmídio pUC18 como exemplo, procure os locais de restrição para a enzima AvaII. Quantos
locais de restrição existem? Se a enzima AvaII for usada para restrição deste plasmídio, quantos fragmentos
iremos obter?
4. Determine o tamanho dos fragmentos obtidos da restrição do plasmídio pUC18 com a enzima AvaII. Confirme
que a soma dos fragmentos obtidos é igual ao tamanho total do plasmídio.
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Actividade complementar 2 – Restrição e análise do gel, virtual, utilizando o software pDrwa32
Para se realizar restrições virtuais em plasmídios, e visualizar o padrão de restrição obtido num gel virtual, pode-se utilizar um software gratuito: o “pDRAW32 DNA analysis software”, AcaClone software.
1. Proceda à instalação do “software pDRAW32 DNA analysis”, acedendo ao site http://www.acaclone.com/
e seguindo todas as instruções.
Figura 1: Instalação do programa “Pdraw32 DNA analysis software”
2. Abra o programa já instalado “pDRAW32 DNA analysis”. De seguida, clique em “File” (ficheiro), New
(novo) e “Enter new sequence” (introduzir nova sequência).
Figura 2: Menus de abertura do programa pDRAW32
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3. Acedendo ao site https://www.lablife.org/ escolha a sequência do plasmídio que pretende analisar
(sugere-se que escolha a sequência do plasmídio pCR2.1). De seguida cole a sequência seleccionada no
local indicado no programa pDRAW.
Figura 3: Selecção da sequência de nucleotídios do plasmídio pCR2.1
4. Clique em “Edit” (editar), e seleccione a opção “Edit Sequence”.
Figura 4: Sequência do plasmídio pCR2.1 linearizada, mostrando também os locais de restrição de dezenas de enzimas de
restrição. Está indicado também o comprimento da sequência do DNA.
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5. Clique em “Edit”, seleccione “DNA name, properties and annotations”, e registe os dados como se indica
no exemplo abaixo:
Figura 5: Designação do nome correcto do plasmídio (pCR2.1), e indicação da forma que se pretende visualizar o DNA (forma
circular)
6. Clique em “Preview, e aparecerá no ecrã o plasmídio pretendido – pCR2.1, com todos os locais de
restrição enzimática.
Figura 6: Mapa do plasmídio pCR2.1, circular, com locais de restrição das respectivas enzimas
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7. Clique em “Settings” (opções), e seleccione “Enzime selection” (selecção das enzimas).
Figura 7: Menu de opção para selecção das enzimas
8. Introduza a informação que deseja relativamente às enzimas que pretende utilizar para a restrição do
plasmídio.
Figura 8: Selecção das enzimas e das características pretendidas
Nota: no exemplo apresentado foram seleccionadas algumas características, podendo no entanto serem
seleccionadas outras.
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9. Após ter clicado em “Apply”, vai aparecer no ecrã o plasmídio pCR2.1 apenas com os locais de restrição
para as enzimas que apresentam as características anteriormente definidas.
Figura 9: Mapa do plasmídio pCR2.1 com os locais de restrição das enzimas anteriormente definidas
10. Uma vez que aparecem ainda muitos locais de restrição para as enzimas anteriormente seleccionadas, a
melhor opção será seleccionar as enzimas que só cortam duas vezes o plasmídio.
Figura 10: Mapa do plasmídio pCR2.1 com os locais de restrição das enzimas que cortam apenas duas vezes
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11. Obtido o mapa virtual do plasmídio pCR2.1. com os respectivos locais de restrição para enzimas que só
cortam duas vezes, pode-se agora realizar a restrição virtual e respectiva electroforese em gel virtual. Clique em “View – agarose gel electrophoresis”.
Figura 11: Mapa de restrição do plasmídio pCR2.1, em gel virtual
Discussão: Que conclusões se podem retirar, após observação do padrão de restrição do plasmídio pCR2.1, com enzimas que
apenas cortam duas vezes?
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Parte VI - Glossário
Glossário
Ácido desoxirribonucleico – vulgarmente conhecido por DNA, é um polímero orgânico complexo formado por duas cadeias de nucleótidos emparelhadas entre si, com uma disposição antiparalela. Cada nucleótido que constitui o DNA é composto por um açúcar, a desoxirribose, um grupo fosfato e uma das quatro bases azotadas (timina, adenina, guanina e citosina).
Ácido ribonucleico – vulgarmente conhecido por RNA, é um polímero orgânico formado por uma cadeia simples de nucleótidos. Cada nucleótido que constitui o RNA é composto por um açúcar, a ribose, um grupo fosfato e uma das quatro bases azotadas (adenina, guanina, citosina e uracilo).
Adenina – base azotada púrica presente nos nucleótidos que constituem o DNA e o RNA. Agarose – polímero constituído por unidades de galactose. Após dissolução em água a ferver, seguido de arrefecimento, toma
uma consistência gelatinosa. Alelos – formas diferentes de um determinado gene.
Base Azotada – moléculas que entram na constituição dos ácidos nucleicos. No DNA podemos encontrar quatro bases azotadas: a adenina, timina, citosina e guanina. A adenina e a timina são bases complementares, emparelhando entre si. De igual modo a citosina e a guanina emparelham por complementaridade.
No RNA encontram-se também quatro bases azotadas: guanina, citosina, adenina e uracilo em vez da timina. As bases emparelham do mesmo modo que no DNA à excepção da adenina que vai emparelhar com o uracilo.
Cariótipo – conjunto dos cromossomas presentes nas células de cada ser vivo. Centrómero – parte central dos cromossomas. O centrómero é importante no processo de mitose e de meiose para a separação dos cromossomas.
Citosina – base azotada pirimídica presente nos nucleótidos que constituem o DNA e o RNA. Co-dominância – situação em que há expressão individual dos dois alelos de um locus, num heterozigótico.
Cromatídio – componente de um cromossoma contendo uma molécula de DNA.
Cromatina – denso material do núcleo constituído principalmente por DNA e proteínas. Cromossoma – estrutura filamentosa constituída por DNA associado a proteínas estruturais (histónicas e não histónicas). Os cromossomas encontram-se no núcleo das células eucarióticas.
Cromossoma homólogo – cada um dos cromossomas de um par de cromossomas idênticos, que apresenta os mesmos loci genéticos. Cada cromossoma de um desses pares é homólogo do outro e emparelha com ele durante a meiose.
DNA – ver ácido desoxirribonucleico. DNA fingerprinting – técnica de separação de segmentos de DNA que permite a identificação genética dos indivíduos.
DNA polimerase – enzima presente nas células procarióticas e eucarióticas, responsável pela polimerização das novas cadeias de DNA.
Dominante – refere-se a um carácter que se exprime quando há heterozigotia para o gene que o determina. A expressão ocorre na presença de uma cópia normal do alelo.
Enzimas de restrição - enzimas responsáveis por cortar o DNA. Estas enzimas são produzidas por bactérias e recebem o nome da espécie da bactéria de onde foram extraídas. Enzimas de restrição diferentes reconhecem e cortam DNA em diferentes sequências de bases.
Electroforese – é uma técnica que permite a separação de moléculas (DNA, proteínas…) de acordo com o tamanho, carga e forma que apresentam, quando sujeitas a uma corrente eléctrica. As moléculas vão movimentar-se no meio de suporte (gel de agarose ou de poliacrilamida, por exemplo) a velocidades diferentes consoante as características que apresentam (tamanho,
carga e forma). Engenharia genética – manipulação do material genético.
Feniltiocarbamida – a feniltiocarbamida (PTC) é uma proteína, descoberta na década 30, Fenótipo – características observáveis num organismo. O fenótipo resulta da combinação de factores genéticos e ambientais.
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Gene – é a unidade básica da hereditariedade. Corresponde a uma sequência nucleotídica de DNA que codifica uma determinada sequência polipeptídica, responsável por determinada característica ou função no organismo. Cada gene encontra-se num local específico de um cromossoma (locus) e pode apresentar várias variantes (alelos) que determinam uma forma particular dessa característica (exemplo: a característica “cor dos olhos” pode ter vários alelos: alelo que determina a cor azul,
alelo que determina a cor castanha, etc). Genética – ciência que estuda os genes e a hereditariedade.
Genoma - conjunto de todos os genes de um organismo. Genótipo – constituição génica de um indivíduo no que diz respeito aos alelos de um locus. Guanina - base azotada púrica presente nos nucleótidos que constituem o DNA e o RNA Hereditariedade – mecanismo através do qual as características genéticas passam dos progenitores para os descendentes.
Heterozigótico – um indivíduo diz-se heterozigótico quando possui dois alelos diferentes para o mesmo gene.
Histona – proteínas básicas, associadas ao DNA nos cromossomas. Têm baixo peso molecular, e são ricas nos aminoácidos lisina ou arginina. Homozigótico – um indivíduo diz-se homozigótico quando possui alelos iguais para o mesmo gene.
Locus – localização de um gene num cromossoma.
Primer – pequena sequência específica de oligonucleótidos que se liga ao DNA alvo, para permitir o início da síntese da cadeia complementar pela DNA polimerase. Reacção de polimerização em cadeia (PCR) - reacção que permite a amplificação de porções específicas de DNA que
estejam presentes numa mistura complexa de DNA, desde que sejam conhecidas as suas extremidades. Recessivo – gene ou carácter que só se manifesta em homozigotia ou em hemizigotia (presença de um único alelo no
genoma). RNA – ver ácido ribonucleico.
SNP (Single nucleotide polymorphism) – variação numa sequência de DNA que envolve uma alteração num único nucleótido.
Southern blot – método descrito por E.Southern em que fragmentos de restrição são separados num gel de electroforese e transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon. Esta membrana é posteriormente tratada com uma sonda (fragmento de DNA ou RNA com uma sequência de bases conhecida, e complementar ao DNA contido na membrana) que vai hibridar com o fragmento de DNA que se pretende identificar. A sonda de DNA é marcada radioactivamente para permitir a sua
detecção. Taq polimerase – é uma DNA polimerase termoestável, utilizada na amplificação de fragmentos de DNA através da técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido identificada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticus. A Taq polimerase suporta as
elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a 94ºC). Teste genético – teste que permite detectar a presença, ausência ou alteração, num gene particular, cromossoma ou num
produto genético. Timina – base azotada pirimídica presente nos nucleótidos que constituem o DNA (ausente no RNA).
Uracilo – base azotada pirimídica encontrada nos nucleótidos do RNA.
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Apêndices: Apêndice I – Registo das bandas de DNA resultantes no gel de agarose
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Apêndice II – Árvore genealógica
Mulher
Homem
Sexo Indefinido
Legenda
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Apêndice III– “V de Gowin”
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Referências Bibliográficas
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(2) Ministério da Educação, Direcção-Geral de Inovação e de Desenvolvimento Curricular http://eec.dgidc.min-edu.pt/programas/biologia_12.pdf
Para mais informações consultar:
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Regateiro F (2003) Manual de Genética Médica - Imprensa da Universidade de Coimbra.
Sambrook J., Fritsch E. F., e Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory.
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Biotium www.biotium.com
Carolina http://www.carolina.com
BioRad http://www.bio-rad.co.jp/LifeScience/pdf/
Biotecnologia – conceitos e técnicas
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Learn.Genetics - Science Learning Center http://learn.genetics.utah.edu/
Roy J. Carver Biotechnology Center http://www.biotech.uiuc.edu/
Orientações curriculares do Ministério da Educação
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Bio-Rad Laboratories http://www3.bio-rad.com
Testes genéticos Understanding Gene Testing http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/gene19.php
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Microbiologia QIAGEN News
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Plasmídios
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Source BioScience ImaGenes
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