GYÓGYSZERIPARI MIKROBIOLÓGIAPiacképes gyógyászati és élelmiszeripari termékek élelmiszeripari termékek előállítása a mikrovilágképviselőinek élettani tulajdonságait ismerőtulajdonságait ismerő

szakértők közreműködésével150 ábra (2012.09.15)

Az ipari-mikrobiológia, profitot termelő alkalmazott tudomány (1870)

“Il n y a pas des sciences appliquées.

If you take care of your microbial friends, they will take care of your future

“Il n y a pas des sciences appliquées. Mais il y a des applications de la science”

Louis Pasteur 1876

will take care of your futureDavid Perlman 1960

KÜZDELEM A MIKROBIÁLIS KÓROKOZÓK ELLEN

antibiotikumok felfedezéseMikroorganizmus által létrehozott hatásos anyag Mikroorganizmus által létrehozott hatásos anyag

a mikroorganizmusok szaporodásának akadályozására (antibiózis)

P. Vuillemin 1889 (a szimbiózis ellentéte)Roberts 1870 Penicillium glaucumtenyészete mellett nem nő a baktérium

2500 éves kínai feljegyzés szerint, szóján növekedő penész sikerrel alkalmazható a furunkulus ellen

Kemoterápia

Paul Ehrlich (1854-1915) 1906 Nobel-díj„Corpora non agunt nisi fixata”„Corpora non agunt nisi fixata”P. Ehrlich — O. Hata 606Salvarsan — arzén származékA lues feltételezett korokozója leküzdésére

Τρεπο νεµω (Treponema pallidumΤρεπο νεµω (forgó fonal)

mérete 0.2 µm x 5 µm!

SALVARZÁN gátolja a piruvát dehidrogenázkomplex működését, (liponsavval a hatás felfüggeszthető!) liponsav hiányt okozva akadályozza az acetil-S-CoA képződését piruvátból

A salvarzán hatásmódja

Prontosil — Mietzsch & Klarer Domagk 1935 — PAB analog

A tetrahidrofólsav képződést zavarjaa szulfonamid jelenléte, a dehidrofólsav reduktáz

működését pedig a trimetoprim

2,4-diamino-5(3,4,5-trimetoxi-benzil)-pirimidin

pyrimetamin, a 2,4-diamino-5(p-klórfenil)-6-etil-pirimidin.

A tetrahidrofólsav kiemelkedő élettani jelentőségét igazolja többek között a timin képzésben vagy a hem bioszintézisben játszott szerepe

A szulfonamidok baktérium-spektruma

Gram-pozitív és Gram-negatív mikroorganizmusokon kívül mikroorganizmusokon kívül azActinomyces, Toxoplasma és Coccidium fajok, valamint a Plasmodium malariaeellen is felhasználhatók, sőt néhány Rickettsia szaporodását is gátoljaRickettsia szaporodását is gátoljaGyenge hatású viszont azEscherichia, Pseudomonas, Proteus, Klebsiella, Brucella, Aerobacterfajokkal szemben.

PAB analógként a tetrahidrofólsav képződést akadályozza

Para-amino-szalicil savp-amino-benzoesav analógként a tetrahidrofólsav képződést zavarja

Izo-nikotinsav-hidrazid(piridoxálfoszfát) piridoxamin, nikotinsavamid analóg

A triptofán szintetáz aktív centrumában

működő működő piridoxál-foszfát

Schiff bázist alkotva a

szerinnel, képesreagálni az indol reagálni az indol glicerofoszfáttal. Az INH zavarja ezt a reakciót.

A hatóanyageloszlása a

szevezetbenszevezetben

A giráz működését zavarja

az RNS magra feltekeredett DNS fellazítását végző giráz működését gátolja

PEFLOXACIN 1-etil-6-fluoro-7-(4-metil-1-piperazinil)4-oxo-1,4-dihidro-3-kinolinkarbonsav

Nalidix sav

Girázgátló hatású antibiotikum!

Streptomyces spheroides, S. niveus, S. griseoflavus, S. griseus, valamint több nem azonosított Streptomyces törzs termékeként is leírták.

Benzoesav származékkal szubsztituált kumarin származék, amihez egy novióz kapcsolódik. Mindkét aromás komponense shikiminsavból, a cukor komponens kapcsolódik. Mindkét aromás komponense shikiminsavból, a cukor komponens

pedig UTP-glükózból képződik.

novióz kumarin származék benzoesav származék

A terápiás szélesség megállapítása

• Anyagfelhalmozódás szövetenként eltérő• Vér-agy gát működése• Placenta elkülönítő hatása• Anyaglebomlás útja (mellékhatások)• Anyaglebomlás útja (mellékhatások)• Köztestermékek biológiai hatása, • toxicitás • kiürülése• A hatóanyag távozás: Vizelet, fécesz, • A hatóanyag távozás: Vizelet, fécesz,

verejték, légzőszerv

Hatóanyag bevitel

• Infúzióval• Emésztő csatornán• Emésztő csatornán• Intravénásan • Intramuszkulárisan• Subcutan• Inhalálás útján• Hám felszínére juttatva (kenőcs, gél, tapasz)

Antibiotikumok „aranykora”Hatásmódszerint megkülönböztethetünk baktérium sejtfalszintézist gátló,

membránkárosító, fehérjeszintézist gátló, DNS képződést gátló,DNS képződést gátló,RNS szintézist gátló vegyületeket.

Kémiai szerkezetszerint megkülönböztethetők az azetidinon (ß-laktám) szerkezetűek aminoglikozidok,

tetraciklinek,makrolidok,

ansa-láncúak, oligopeptidek,oligopeptidek,antraciklinek,

poliéterek, spirolaktonok,

ciklopentano-perhidrofenantrén vázúak, poliének,

poliketid vázból épülők,antimetabolitok (anyagcsere köztestermékek, nukleotidok és aminosavak analógjai),

Különböz ő antibiotikumokat termel ő mikroorganizmusok rendszertani csoportjai

Antibiotikum Gombák Streptomyces Micromonospora Nocardia BaktériumokAminoglikozidok +++ +++ ++ +Anthraciklink +++ ++Ansaláncuak +++ ++ +++Bleomycinek +++ ++Chloramphenicol +++ ++ +++Cycloserin +++ ++βlaktámtípusúak +++ ++ +Makrolidok +++ ++ ++ +Makrolidok +++ ++ ++ +Tetraciklinek +++Poliének +++ ++ ++.Fungisztatikumok ++ +

Fonalas prokarióták által termelt hatóanyagok

Ipari szempontból Jelent ősebb törzsek neve A hatásos anyag neveStreptomyces rimosus Oxitetraciklin Streptomyces griseus Sztreptomicin (Actidion)Streptomyces aureofaciens Aureomicin Streptomyces venezuelae Klóramfenikol Streptomyces noursei Nisztatin (Actidion) Streptomyces kanamyceticus Kanamicin Streptomyces fradiae Neomicin (Actidion)Streptomyces fradiae Neomicin (Actidion)Streptomyces erythreus Eritromicin Streptomyces cinnamonensis Monensin

A Sermonti és Hopwood által részletesen vizsgált Streptomyces coelicolorgéntérképének felderítettsége. Mai típustörzse S. violaceoruber (ATCC 14980). A Streptomyces lividans vektorgazdaként került Hopwood laboratóriumába. Escherichia coli-ban és a Streptomyces lividans--ban is jól működő,bifunkcionális plazmidjaik megalkotása

Streptomyces lividans légmicéliumának átalakulása spóralánccá

A Streptomyces-plazmid restrikciós térképe. A restrikciós enzimek hasítóhelyeit. Ez a plazmid a Streptomyces coelicolor A3,

a Streptomyces lividans 66 és a Streptomyces parvulus ATCC 12434 törzsekben képes replikálódni.

A penicillin bomlékonysága

ASCOMYCETES (perfekt) DEUTEROMYCETES (imperfekt)

• A kutató munka igazolta a fonalas gombafajok genetikai állományában a penámváz

szintézisére szolgáló enzimek génjeinek jelenlétét

ASCOMYCETES (perfekt) DEUTEROMYCETES (imperfekt)Emericella nidulans Aspergillus nidulansEurotium Penicillium notatum (chrysogenSartorya EpidermophytonEupenicillium TrichophytonTalaromyces MicrosporumCarpenteles Malbranchea Carpenteles Malbranchea Thermoascus PolypaecilumGymnoascuArthrodermaNanizza

Aminosav-összetétel egyezése

A fonalas gombák DNS állományában a Cephalosporin v áz képzéséhez szükséges enzimek jelenlétét igazolták

Az N penicillin képződéséhez szűkséges; ACV tripeptid szintetáz (ACVs), ésizopenicillin N szintetáz (IPNs) enzimeken kívül; az izopenicillin epimeráz

továbbá a gyűrűtágító rendszer, az expandáz, dezacetoxicephalosporin C szintetáz valamint a befejező lépéseket katalizáló hidroxiláz, aciláz karbamoil

transzferáz, és a metiltranszferáz jelenléte is bizonyított.

ASCOMYCETES DEUTEROMYCETESEmericellopsis Cephalosporium acremonium

(Acremonium chrysogenum)Byssochlamys Paecilomyces persicinusArachnomyces ScopulariopsisAnixiopsis Diheterospora

Spiroidium

Penicillium notatum Penicillium chrysogenum

A két faj között észlelhető anatómiai eltérés

Az antibiotikum képződése a

Penicillum chrysogenumfiziológiailag aktív

csúcssejtjében folyik

A penám váz képződésének a szerveződése

Prökaróta és eukariótaIzopenicillin-N szintetáz kémia szerkezeztének(aminosav-szekvencia)

összehasonlításaösszehasonlításaAz aminosavak

bekeretezése hívja felaz olvasó figyelmét akis mértékben eltérő

szerkezetre!

Azetidinon származékok

képződésének a vázlata

penám és kefém

termékek képződése

ß-laktám antibiotikumok képződése különböző mikroszervezetek fiziológiailag aktív sejtjeiben

Penicillin -G Cephalosporin -C Cephamycin -CPenicillium chrysogenum Acremonium chrysogenum Streptomyces clavuligerus

Az építő elemek elemek (a három

aminosav)

szintézise

L α-aminoadipinfélaldehid a prokariótákban

a lizin metabolizmus köztes terméke

Lizin bioszintézis köztes terméke a gombákban

Folyamatábra

Magyarázó szöveg a penicillin gyártás folyamatábrájáh oz

(1) termel őképesség szempontjából "nemesített ipari törzs"(2) agar tenyészet, vagy rizs szemeken spórázó teny észet(3) termel őképesség szempontjából min ősített spóraszuszpenzió(4) oltóanyagtenyészt ő bioreaktor, kever ővel ellátott,

aerob inokulum -fermentor aerob inokulum -fermentor (5) pH szabályozott, kevert aerob termel ő fermentor

prekurzor [fenilecetsav] adagolással(6) a semleges fermentlé szúrése vákuum dobsz űrővel(7) hűthető tároló tartály(8,9,10) szeparátort igényl ő extrakciós lépések (11) penicillin-só kristályosító (12) szűrőcentrifuga (13) vákuum szárítószekrény (1 4) granuláló (13) vákuum szárítószekrény (1 4) granuláló (15) átkristályosító (16) szűrő (17) prokainsó képzés (18) penicillin-nátrium -só steril átkristályosítása(19) steril sz űrők (20) vákuum szárító (liofilez ő) (21) steril penicillin tároló (22) Kiszerelés gyógyszertári forgalmazhatóság célj ára.

Miért nem toxikus a penicillin?

A pentapeptid D-Ala—D-Ala

végződésének az összehasonlítása a G-PENICILLIN

szerkezetével

penicillináz

Az azetidinon származékok első kifejlesztői a létért való küzdelemben a pokarióták voltak

Streptomyces clavuligerus, Streptomyces clavuligerus, Nocardia lactamdurans, Lysobacter lochenigenus, Flavobacterium

A fonalas gombák a prokariótáktól vették át a génállományt

A Streptomyces clavuligerusCephamycin-C termelésére képes

Cephamicinképződés

izopenicillin N-ből

a prokariótákban

Streptomyces clavuligerus cefamycin melletta penicillinázt inaktíváló hatásos vegyületet is szintetizál

Nem csekély sikert könyvelhet a két, biológiai szempontból akltív vegyület forgalmazója

A ß-laktám szerkezet jelent őségealkalmas szubsztituens jelenlétében a

ß-laktám gyürű is elegendő a hatás kiváltásához

nocardicinek

monobactámok

G-penicillin kémiai szintézise 1949-bencsupán 1%-os hatásfokkal !!!

A penám és cefém váz felhasználása

A félszintézis jelentősége

A bakteriális spektrum szélesítéseA felszívódás javításaA felszívódás javítása

A saválló tulajdonság javításaPenicillináz rezisztencia fokozása

6-APSA penicillin félszintézis kindulási anyaga

A képződő penám váz könnyen

dimerizálódik, dimerizálódik, illetve a jelenlevő CO2 -dal reagálva

inaktíválódik

A penicillináz rezisztensmethicillin szerkezete

A vérszint alakulása

Ampicillin—D-fenilglicin származék előállítása

Oxacillin előállítása félszintézissel

cefoperazon

A Streptomyces orientalis törzs termékeként izolált

Vancomycina glikopeptid antibiotikum-csoport

gyógyszerkéntforgalomba került tagja

Az antibiotikum -csoport néhány

tagja

Rezisztenciát okoz a D -Ala végz ődés tejsavra való cserél ődése

Ezt az egyszerű szerkezetű, (D-4-amino-3-izoxazolidon) Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok növekedését gátló, főleg

antituberkulotikumként felhasználásra került antibiotikumot az ötvenes évek derekán, négy egymástól független kutatócsoport, négy

különböző Streptomyces törzs fermentlevében találta Harned: S. orchidaceus.

Shull: S.lavendulae. Harris: S. garyphalus.

Kuzikava: S. roseochromogenes

A foszfonomicin gátolja a PEP részvételét a bioszintézisben

A Merck kutatói több Streptomyces törzs (S. fradiae, S.viridochromogenes, S. wedmorensis)

tenyészlevében is megtalálták.

Membránt károsító cirkuláris peptidekcirkuláris peptidek

BacitracinGramicidin Scyclosporin-A cyclosporin-A

A Bacillus licheniformis tenyészlevében felszaporodó hatóanyag foszfatázgátlóként akadályozza a muraminsav-pentapeptid

távozását a prokarióta citoplazmájából

Tiotempláton szintetizálódik

Gramicidin S depsipeptid szerkezete (2 pentapeptid)

a termék polaritását a 2 ornitin egyirányba ható aminocsoportja képviseli

L Pro – L Val – L Orn – L Leu – D Phe

D Phe – L Leu – L Orn – L Val – L Pro

A Bacillus brevis termelte decapeptid, a GRAMICIDIN-S szintézise oszlopreaktorban, rögzített enzimekkel (Wang et al. M.I.T.)

Gombák növekedését gátló hatóanyagok felhasználása más farmakológiai feladatok

megoldásáramegoldására

Immunszupressziv hatásKoleszterinszint szabályozásKoleszterinszint szabályozás

A 33 tagu gyürüs peptid aminosav összetétele: A 33 tagu gyürüs peptid aminosav összetétele: 1:N-metil- γγγγ-butenil- γγγγ-metil-L-treonin, 2:aminovajsa v; 3:szarkozin; 4:metilvalin; 5:valin; 6:metil-leucin; 7:alanin; 8:D-alanin;9:metil-leucin; 10:metil-leucin; 11:metil-valin(Az egyetlen D-alanin kivételével minden aminósav L )

A Trichoderma polysporum tenyészet termelte depsipeptid, a cyclosporin-A immunszupresszív aktivitású

Immunszupresszív hatású bioaktív makrolidok

Az intravénásan illetve szájon keresztül is adható vegyület Streptomyces tsukubaensis tenyészlevéből izolálható. Gátolja a T-sejtek aktíválását. A citoszolban kialakuló komplex gátolja a calcineurin aktívitását, a kalcium-függő szerin/treonin foszfatáz hatásos működését. Az intracelluláris receptora azonban nem azonos a ciklosporint kötő fehérje szakasszal, azonban nem azonos a ciklosporint kötő fehérje szakasszal,

A „-vastatin” vegyületcsoport a 3-hidroxi-3-metil- glutaril-CoA redukcióját (már 1 nM) kompetitíven gátolva akadályozza a meval on-sav képz ődését,

a mevalon-sav hiány viszont akadályozza a(z ergo)sz terin szintézist.Ezért gátolja a gombák növekedését

A mevalonsav oxidoreduktázt gátló "-vastatin" vegyületek a zsírsav szintézis enzimeit alkalmazva malonil-CoA építőelemek felhasználásával sztearinsav méretű ∆8,14,16-trienil-β,δ-dihidroxi-oktadecén-savon keresztül készülnek

Riboszómális fehérjeszintézist gátló biológiailag aktiv termékek

Az aminoglikozid antibiotikum csoport Waksman által els őként talált képvisel őjeA riboszóma 30S alegységében az S-12 fehérjéhez kötődik.

Katalitikusan hidrogénezhető pl.nehézhidrogénnel, triciummal

A rezisztencia oka lehet a templát módosulása is!

Escherichia coli-ban egy 4-500 aminosavat tartalmazó peptidlánc 15-20 másodperc alatt készül el. Egy mRNS egyidőben 4-5 riboszómához kapcsolódhat egymástól 97 nukleotídnyi távolságra. A mRNS életidejét működésben létének köszönheti. Általában átlagban 50 ciklust ér meg, ha folyamatosan szolgálatban van, azaz működő riboszómákkal van kapcsolatban, mert a riboszómához kapcsolt mRNS-t a ribonukleáz nem képes bontani.

Micromonospora purpurea terméke

Streptomycin Streptomycin szintézis

MAKROLID SZERKEZETŰ ANTIBIOTIKUMOK

A Streptomyces erythreus által termelt makrolid szerkezetű

antibiotikumok első képviselője

TETRACIKLINEK

Oxitetraciklin Oxitetraciklin spontán

lebomlása

α-doxycyclin előállítása oxytetracyclinből

vérszint alakulása α−doxycyclin adagolása után

Riboszómális fehérjeszintézist gátolja az eukariótákban Streptomyces törzsek tenyészlevéből izolálható

[7-klór-4,6,2’-trimetoxi-6’-metil-2’-grizén-3,4’-dion] képz ődése

Penicillium griseofulvumtenyészetében

Ansaláncú antibiotikumok

Rifamycinek a Nocardia mediterranea Nocardia mediterranea

tenyészlevében

A rifamycinek biológiai aktivitásának összehasonlítása

MIC érték in vitro MIC érték in vitro Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus fertőzés kivédése

mérőtörzs használatakor egérben in vivo végzett méréssel mg.ml-1 mg/kg i.m. adva mg/kg per os adagolva

rifamycin-B 0,026 305 500

rifamycin-O 0,01 500 500rifamycin-S 0,005 65 172rifamycin-S 0,005 65 172rifamycin-SV 0,005 18 74rifamp(ic)in 0,002 0,12 0,11

Rifamicin ansa láncú antibiotikum-csoport

A rifamycin váz szintézise tiotempláton folyik a zsírsavszintézishez hasonlóan, metilmalonil-CoA elemekből.

A bioszintézis az aromás mag képződésével indul.

FUNGISZTATIKUMOK

Polién fungisztatikumok

mikozaminmikozamin

Streptomyces noursey által termelt polién szerkezeti képlete (C47 H75O17N) az

építőelemeinek feltüntetésével

Mikózamin képződése glükózból

Fumagillin

Aspergillusfumigatus

Új antibiotikum el őállítás (kutatás) műveleteiTalajminta, élőhelyekről populáció gyűjtése

Ismételt szélesztés szilárd táptalajra, majd az önálló telepeket tartalmazó lemez fertőzése telepeket tartalmazó lemez fertőzése

Homogén tenyészet izolálása a tesztorganizmus növekedését gátló telepről

Levegőztethető tenyészet indítása nitrogén- és Levegőztethető tenyészet indítása nitrogén- és szénforrást tartalmazó folyékony táptalajon.

A tenyészet biológiai aktivitásának meghatározása

Inokulum oltáshoz használható tenyészet előállítása, az optimális paraméterek megállapítása

A termelés szempontjából optimális fizikai és A termelés szempontjából optimális fizikai és kémiai körülmények keresése

A hatásos aktivitás mennyiségi meghatározása,tárolhatóságának (stabilitásának) vizsgálata,az aktivitás fél-életidejének meghatározása,az aktivitás fél-életidejének meghatározása,Biológiai homogenitásának vizsgálata.

A termék kinyerése

Kromatográfiás módszerrel a biológiai aktivitáshomogenitásának vizsgálata (bioautográfia)

Baktérium spektrum vizsgálata (Gram+, Gram–, élesztő)A hatóanyag kémiai természetének vizsgálata,

meglevő anyagokkal való összehasonlításmeglevő anyagokkal való összehasonlításToxicitás-vizsgálat, állati vagy növényi sejteken Hatásmód vizsgálataA metabolizmus vizsgálata a gazdaszervezetben és a

pusztítandó baktériumbanpusztítandó baktériumbanRezisztencia kialakulásának vizsgálataA hatásos anyagot termelő törzs élettani

képességeinek vizsgálata, javításaElőnyösebb hatású származékok előállítása