haloferax mediterranei : clonaje, secuenciación y...

“NAD-glutamato deshidrogenasa de Haloferax mediterranei: clonaje, secuenciación y expresión. Purificación y propiedades de la enzima nativa y recombinante.”

Díaz González, Susana

ISBN: 978- 84- 690-5983- 8 · Depósito Legal: A - 545- 2007

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UNIVERSIDAD DE ALICANTE

FACULTAD DE CIENCIAS Departamento de Agroquímica y Bioquímica

NAD-glutamato deshidrogenasa de Haloferax mediterranei: clonaje, secuenciación y expresión. Purificación y propiedades de la enzima nativa

y recombinante.

ISBN: 978-84-690-5983- 8 · Depósito Legal: A- 454- 2007

Susana Díaz González Alicante, 2007

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1. INTRODUCCIÓN.

1.1. DOMINIO ARCHAEA.

1.1.1. Características generales y Filogenia.

1.2. ARQUEAS HALOFÍLICAS.

1.2.1.Características generales. 1.2.2. Taxonomía.

Haloferax mediterranei.

1.2.3. Adaptaciones halofílicas. 1.2.4. Metabolismo. 1.2.5. Proteínas halofílicas. 1.2.6. Aplicaciones de los organismos halofílicos.

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1.3. GLUTAMATO DESHIDROGENASA (E.C. 1.4.1.2-4).

1.3.1. Deshidrogenasas piridín-dependientes. 1.3.2. Glutamato deshidrogenadas.

1.3.3. Especificidad del coenzima. 1.3.4. Centro activo. 1.3.5. Regulación de la síntesis. 1.3.6. Aplicaciones.

1.4. AISLAMIENTO Y SECUENCIACIÓN DE GENES DE HALÓFILOS. 1.5. EXPRESIÓN Y RENATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

RECOMBINANTES.

2. OBJETIVOS E INTERÉS DEL TRABAJO.

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3. MATERIALES Y MÉTODOS. 3.1. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE NAD-GLUTAMATO

DESHIDROGENASA NATIVA.

3.1.1. Fuente de microorganismos. 3.1.2. Medio y condiciones de cultivo. 3.1.3. Extracto enzimático. 3.1.4. Determinación de la concentración de proteína. 3.1.5. Determinación de la actividad enzimática de la proteína. 3.1.6. Cromatografía en Sepharosa 4B. 3.1.7. Cromatografía en Blue-Sepharosa. 3.1.8. Cromatografía en Sephacryl S-300. 3.1.9. Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS. 3.1.10. Determinación de la masa molecular de NAD-GDH nativa y del tamaño de subunidad.

3.1.10.1. Determinación de la masa molecular mediante tamizado molecular

3.1.10.2. Determinación del tamaño de subunidad mediante electroforesis en gel

de poliacrilamida en presencia de SDS 3.1.11. Determinación de parámetros cinéticos.

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3.2. COMPORTAMIENTO FRENTE A LA CONCENTRACIÓN DE SALES, TEMPERATURA y pH.

3.2.1. Efecto de la concentración de sales sobre la actividad enzimática. 3.2.2. Efecto de las sales sobre la estabilidad. 3.2.3. Efecto de la temperatura en la actividad enzimática. 3.2.4. Determinación del pH óptimo de actuación.

3.3. SECUENCIACIÓN DEL EXTREMO N-TERMINAL. 3.4. AISLAMIENTO DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. Mediterranei.

3.4.1. Extracción de DNA de Hfx. Mediterranei. 3.4.2. Medida de la concentración de DNA genómico. 3.4.3. Electroforesis en gel de azarosa. 3.4.4. Generación de un producto de PCR de 203 pb. 3.4.5. Secuenciación del producto de PCR de 203 pb. 3.4.6. Marcaje no radiactivo del producto generado. DOT BLOT. 3.4.7. Preparación de una genoteca de Hfx. mediterranei en fago lambda. 3.4.8. Preparación , crecimiento e infección de células XL1-Blue P2. 3.4.9. Hibridación de la genoteca con el producto de PCR de 203 pb. Marcado. 3.4.10. Aislamiento de DNA de fago.

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3.4.11. Secuenciación de fagos positivos. 3.4.12. Análisis de secuencias. 3.4.13. Construcción del modelo estructural de NAD-glutamato deshidrogenasa de

Hfx. Mediterranei.

3.5. CLONAJE DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. Mediterranei.

3.5.1 Amplificación mediante PCR del gen que codifica la NAD-GDH de Hfx.

Mediterranei.

3.5.2 Electroforesis en gel de agarosa, purificación de la banda y secuenciación. 3.5.3 Ligación del producto de PCR correspondiente al gen de la glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei en el vector de clonaje pCR2.1. 3.5.4. Transformación en E. coli Novablue. 3.5.5. Análisis de tranformantes: Aislamiento y purificación de plásmidos. 3.5.6. Secuenciación de los plásmidos con inserto. 3.5.7. Digestión mediante las enzimas de restricción NdeI y BamHI, del plásmido que contiene el gen de la NAD-GDH de Hfx. Mediterranei. 3.5.8. Ligación del gen de NAD-GDH en el vector de expresión pET3a. 3.5.9. Transformación en E. coli Novablue con el plásmido pET3a. 3.5.10. Análisis de transformantes: Aislamiento y purificación de plásmidos. 3.5.11. Transformación en E. coli BL21 (DE3).

3.5.11.1. Cepa E. coli BL21 (DE3) 3.5.11.2. Tranformación de E. coli BL21 (DE3) con el plásmido pET3a con inserto

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3.6. EXPRESIÓN Y LOCALIZACIÓN DE LA NAD-GDH RECOMBINANTE.

3.6.1 Crecimiento e inducción. 3.6.2 Conservación de las células y test de estabilidad del plásmido. 3.6.3 Obtención de fracciones celulares y localización de la proteína expresada. 3.6.4 Fracción celular total. 3.6.5 Fracción periplásmica. 3.6.6 Fracción citoplasmática.

3.6.6.1. Fracción citoplasmática soluble

3.6.6.2. Fracción citoplasmática insoluble o cuerpos de inclusión

3.7. SOLUBILIZACIÓN DE LOS CUERPOS DE INCLUSIÓN Y RENATURALIZACIÓN DE LA NAD-GDH RECOMBINANTE.

3.7.1. Solubilización de los cuerpos de inclusión. 3.7.2. Renaturalización de la NAD-GDH recombinante. 3.7.3. Renaturalización mediante diálisis. 3.7.4. Renaturalización mediante dilución. 3.7.5. Medida de la actividad enzimática y de la concentración de proteína.

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3.8. PURIFICACIÓN DE LA NAD-GDH RECOMBINANTE.

3.8.1. Precipitación en presencia de sulfato amónico. 3.8.2. Cromatografía en DEAE-Celulosa.

3.9. ANÁLISIS MEDIANTE NANOELECTROSPRAY LC/MS DE LA NAD-

GDH NATIVA.

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

4.1. PURIFICACIÓN DE NAD-GDH NATIVA.

4.1.1. Cromatografía en Sepharosa 4B. 4.1.2. Cromatografía en Blue-Sepharosa. 4.1.3. Cromatografía en Sephacryl S-300.

4.2. SECUENCIACIÓN DEL EXTREMO N-TERMINAL.

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4.3. AISLAMIENTO DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. mediterranei.

4.3.1. Secuenciación del producto de PCR. Análisis de secuencias. 4.3.2. Marcaje no radiactivo del producto de PCR. DOT BLOT. 4.3.3. Hibridación de la genoteca con el producto de PCR de 203 pb. Marcado. 4.3.4. Electroforesis en gel de agarosa y concentración del DNA de fago. 4.3.5. Secuenciación de fagos positivos. 4.3.6. Análisis de secuencias. Estructura primaria y secundaria.

4.3.6.1. Uso de codones de NAD-GDH de Hfx. Mediterranei

4.3.6.2. Residuos implicados en la halofilicidad de las GDHs

4.3.6.3. Residuos implicados en la termoestabilidad de las GDHs

4.3.6.4. Comparación de la secuencia primaria de la NAD-GDH y análisis de

su estructura secundaria

4.3.7 Construcción del modelo estructural de NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. Mediterranei.

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4.4. CLONAJE Y EXPRESIÓN DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. Mediterranei.

4.4.1. Electroforesis en gel de agarosa de la NAD-GDH de Hfx. Mediterranei. 4.4.2. Digestión mediante las enzimas de restricción NdeI y BamHI. 4.4.3. Ligación en el vector de expresión pET3a y transformación en células E. coli Novablue. 4.4.4. Transformación en E. coli BL21 (DE3). 4.4.5. Obtención de fracciones celulares y localización de la proteína.

4.5. SOLUBILIZACIÓN DE LOS CUERPOS DE INCLUSIÓN,

RENATURALIZACIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA NAD-GDH RECOMBINANTE.

4.5.1. Solubilización de los cuerpos de inclusión. 4.5.2. Renaturalización de la NAD-GDH recombinante. 4.5.3. Renaturalización mediante diálisis. 4.5.4. Renaturalización mediante dilución. 4.5.5. Efecto de la composición del tampón en el proceso de renaturalización mediante dilución rápida. 4.5.6. Efecto de las sales y el EDTA en el proceso de renaturalización.

4.5.6.1. Efecto del tipo de sal

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4.5.6.2. Efecto de la concentración de sal

4.5.6.3. Efecto del EDTA en el proceso de renaturalización

4.5.7. Purificación de la NAD-glutamato 4.5.7.1. Precipitación en presencia de sulfato amónico

4.5.7.2. Cromatografía DEAE-celulosa

4.6. CARACTERIZACIÓN DE NAD-GDH NATIVA Y

RECOMBINANTE.

4.6.1. Determinación de la Mr de la NAD-glutamato deshidrogenasa mediante tamizado molecular. 4.6.2. Determinación del tamaño de subunidad. 4.6.3. Efecto de la concentración de sales sobre la actividad enzimática. 4.6.4. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. 4.6.5. Efecto del pH en la actividad enzimática. 4.6.6. Determinación de parámetros cinéticos. 4.6.7. Efecto de las sales sobre la estabilidad.

4.7. ANÁLISIS MEDIANTE NANOELECTROSPRAY LC/MS DELA NAD-

GDH NATIVA

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5. CONCLUSIONES.

6. TRABAJO FUTURO. 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 8. APÉNDICE I. 9. APÉNDICE II: ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS. 10. APÉNDICE III: ABREVIATURAS.

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Susana Díaz González 1

1. INTRODUCCIÓN. El organismo en el que se basa el presente trabajo es Haloferax mediterranei, un microorganismo halófilo extremo clasificado dentro del dominio Archaea.

Hasta 1977 todos los organismos vivos se clasificaban dentro de dos grupos: eucariotas (células con núcleo) y procariotas (células sin núcleo). En ese mismo año Woese y colaboradores (1977) propusieron que los procariotas no eran un grupo homogéneo, basándose en la comparación de fragmentos de RNA ribosómico 16S ó 18S generados por tratamiento con ribonucleasa. Entonces propusieron la clasificación de los seres vivos en tres reinos independientes: eubacterias, arqueobacterias y eucariotas.

Woese y col. en 1990, propusieron una nueva clasificación en la que se definía mejor las

diferencias entre eubacterias, arqueobacterias y eucariotas. Propusieron un valor taxonómico de mayor rango que el reino al que denominaron “Dominio”. Los tres Dominios son: Bacteria, Eucarya y Archaea, que sustituirían a Eubacterias, Eucariotas y Arqueobacterias (Figura 1).

Figura 1: Representación esquemática del árbol filogenético universal de Woese y col., (1990).

Thermotoga Deinococcus

Chlamydia Cyanobacteria

Proteobacteria Gram

Spirochaetes

AeropyrumSulfolobus

PyrobaculumPyrococcusMethanococcus

MethanobacteriumArchaeglobus Halobacteriu

Thermoplasma

Methanopyru

Fungi

Plants Ciliates

Flagellates Trichomonad

Diplomonads Microsporidi

Bacteria ArchaeaAnimals

Eucarya


Los nombres de los Dominios se escogieron teniendo en cuenta algunas consideraciones como son: mantener la continuidad con los nombres ya existentes, sugerir las características básicas del grupo y evitar cualquier connotación que señale relación entre bacterias y arqueas. Existe una gran controversia sobre la relación entre los tres Dominios aunque su existencia es muy clara. Dicha discusión sobre la relación existente entre ellas ha llevado a la realización de diferentes estudios como son: la microscopía electrónica de ribosomas (Lake y col., 1982; 1984), las comparaciones de las secuencias de RNA 5S (Hori y col., 1982) que sitúan a las arqueas más estrechamente relacionadas con eucariotas que con eubacterias. Hay datos que contradicen la relación existente entre Archaea y Eucarya, como son las secuencias de algunas proteínas de arqueas muy similares a las homólogas de bacterias, sobre todo a bacterias gram-positivas (Woese y col., 1990). En el presente trabajo, seguiremos la nomenclatura propuesta por Woese y col., 1990. El organismo objeto de estudio pertenece al Dominio Archaea, es por ello que a continuación se presentan las características de dicho taxon.

1.1. DOMINIO ARCHAEA: 1.1.1. Características generales y Filogenia. El Dominio Archaea está formado por un grupo heterogéneo de microorganismos capaces de habitar ambientes extremos. Entre sus características destacan las siguientes (Bullock, 2000):

- poseen membranas lipídicas que contienen cadenas laterales isoprenoide con enlaces éter, en contraste con los hidrocarburos con enlaces éster de todos los demás sistemas biológicos,

- carecen en todos los casos de ácido murámico (peptidoglicano) como constituyente de la pared celular,

- presentan una morfología típica que no se ha encontrado en ninguno de los organismos que componen el Dominio Bacteria, como por ejemplo las formas poligonales que tienen algunas


arqueas halófilas o los cocos extremadamente irregulares que presentan algunos hipertermófilos,

- no catabolizan la glucosa mediante glicólisis, sino que emplean una vía metabólica de oxidación simple,

- y su maquinaria fundamental de transcripción es muy similar a la que poseen los organismos pertenecientes al Dominio Eucarya.

En base a sus propiedades metabólicas y ecológicas, Woese y Fox en 1977 diferenciaron los

tres primeros fenotipos de arqueas: metanógenos (microorganismos estrictamente anaerobios y productores de metano), halófilos (microorganismos capaces de vivir en lugares con concentraciones salinas saturantes) y termoacidófilos (microorganismos aerobios que viven en ambientes ácidos y con elevadas temperaturas). Pero se han descubierto muchos más fenotipos en las siguientes décadas, como por ejemplo metanógenos hipertermófilos o psicrófilos, metanógenos alcalófilos y/o halófilos, e hipertermófilos anaeróbicos, alcalófilos y neutrófilos. Finalmente el estudio basado en la amplificación mediante PCR del rRNA 16S ha puesto de manifiesto la existencia de arqueas mesofílicas en diferentes ambientes (mares y suelos) cuyo fenotipo es desconocido hasta el momento (Forterre y col., 2002).

De acuerdo con las comparaciones de rRNA 16S el Dominio Archaea se divide principalmente

en dos phyla (Woese y col., 1990):

Phylum Crenarchaeota: comprende a los microorganismos que se han denominado hipertermófilos y termoacidófilos. Algunos géneros son Sulfolobus, Desulfurococcus, Pyrodictium, Thermoproteus y Thermofilum. Actualmente se incluyen en este phylum varios grupos de microorganismos mesofílicos, y probablemente, psicrófilos que se han detectado mediante PCR en diversos ambientes, aunque todavía no se han cultivado (Forterre y col., 2002).

Phylum Euryarchaeota: abarca un amplio rango ecológico, comprendiendo microorganismos hipertermófilos (géneros Pyrococcus y Thermococcus), metanógenos (género Methanosarcina), halófilos (géneros Haloferax, Halobacterium y Halococcus) e


incluso metanógenos termofílicos (géneros Methanococcus y Methanobacterium) (Brown y col., 1997).

Mediante la amplificación por PCR de secuencias de RNA ribosómico 16S procedentes

de organismos no aislados, se han detectado nuevas especies de arqueas que no se encuadran dentro de los dos phyla propuestos, y que parecen estar más cercanas al Dominio Eucarya.

Estas secuencias se clasifican provisionalmente en otro phylum dentro del Dominio Archaea denominado Korarchaeota (Barns y col., 1996) (Figura 2).


Figura 2: Filogenia del Dominio Archaea basada en secuencias de RNA ribosómico 16S de especies cultivadas y no cultivadas. Los triángulos grises incluyen secuencias de especies cultivadas y sin cultivar mientras que los blancos sólo incluyen secuencias de especies no cultivadas (Forterre y col., 2002).

Methanopyral

Archaeoglobal

Methanoc

hermoplasmatale

Methanomicrobiales

Methanosarcinales

Halobacteriales

ThermoprotealesThermoprotealesDesulfurococcales

Sulfolobales

Euryarchaeot

Crenarchaeota

Uncultured

Methanobacteriales

Thermoplasmatales

Methanococcale

ThermococcalesArchaeoglobales


Huber y col., (2002) propusieron un nuevo phylum, denominado Nanoarchaeota, dentro del Dominio Archaea. Dicho phylum está representado por la especie Nanoarchaeum equitans, un microorganismo simbionte hipertermófilo de tan solo 400 nm de diámetro que ha sido encontrado en chimeneas submarinas. El archaeon N. equitans crece pegado a la superficie de una arquea específica perteneciente al género Ignicoccus, y a pesar de varios intentos, no se ha podido obtener ningún cultivo puro del mismo. Por tanto, el contacto directo célula-célula con el huésped parece ser un requisito imprescindible para su crecimiento. Los estudios filogenéticos basados en secuencias de rRNA que se han realizado sitúan a N. equitans en una rama aislada. Pero, para conocer su posición exacta deberemos esperar hasta que vayan apareciendo más miembros pertenecientes a éste grupo y se realicen estudios filogenéticos más completos.

1.2. ARQUEAS HALOFÍLICAS. Las arqueas halofílicas están clasificadas dentro del phylum Euryarchaeota, y muy relacionadas con los metanógenos (Woese y col., 1990; Barns y col., 1996). El único componente dentro del órden halobacteriales es la familia Halobacteriaceae cuyos miembros, muestran una estricta dependencia por altas concentraciones de sal para su crecimiento y estabilidad estructural, siendo considerados por ello, halófilos por excelencia. Filogenéticamente la familia Halobacteriaceae está clasificada dentro del phylum Euryarchaeota, y se encuentra muy relacionada con los microorganismos metanógenos, pertenecientes a los órdenes Methanomicrobiales y Methanosarcinales (Oren y Mana., 2002). En la actualidad dicha familia está dividida en 18 géneros (septiembre 2004), aunque en las bases de datos aparecen dos géneros más, denominados Haloalcalophilium y Natronoliminobium, cuya descripción todavía está pendiente de publicación. 1.2.1. Características generales.

Abundan en salinas y lagos hipersalinos, como por ejemplo el Mar Muerto y el Gran Lago Salado. En general crecen en las salinas de todo el mundo, a una concentración de NaCl de aproximadamente 4.5 M, diez veces la salinidad del agua del mar, ambientes bajo los que muy pocos


organismos vivos pueden crecer. Se conocen desde muy antiguo en salinas solares empleadas para extraer sal del mar, y se cultivaron por primera vez en el laboratorio a finales del siglo XIX.

Se trata de organismos quimioheterótrofos aerobios. Pueden vivir en medios prácticamente

anaerobios como en las salinas donde existe un bajo contenido en O2, cuya solubilidad en estos medios tan saturados es prácticamente nula. Como hábitat, las salinas además de la elevada concentración de sal presentan temperaturas elevadas, que pueden alcanzar más de 50°C pudiendo llegar a crecer microorganismos incluso a 60°C como por ejemplo Haloterrigena thermotolerans (Montalvo-Rodríguez y col., 2000). Una característica fundamental de estos microorganismos es que son halófilos obligados, necesitando en general concentraciones de NaCl mayores de 1,5 M para crecer. La concentración de NaCl media óptima de crecimiento se sitúa entre 2 y 4,5 M dependiendo de las especies, pudiendo crecer algunas de ellas incluso a concentraciones saturantes de sal. Las arqueas halófilas son básicamente heterótrofas aerobias. Estos microorganismos llevan a cabo la degradación de los compuestos carbonados mediante el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT) y la cadena transportadora de electrones, en combinación con el ciclo del glioxilato y reacciones de la vía Embden-Meterhof y de la vía modificada de Etner-Doudoroff (Oren y Mana, 2002). Muchas de estas especies pueden crecer en medio mínimo en presencia de glucosa (Rodríguez-Valera y col., 1980). Sobre el crecimiento de halófilos en presencia de ácidos grasos no existen datos actualmente, aunque los genes

implicados en la β-oxidación se han encontrado en el genoma de Halobacterium NRC-1 (Ng y col., 2000).

Debido a las elevadas concentraciones de sal y a las usuales elevadas temperaturas de las salinas, la solubilidad del oxígeno es muy baja convirtiéndose en un factor limitante para el desarrollo de estos microorganismos. Con el fin de sobrevivir en estos medios microaerófilos, e incluso anaeróbicos, algunas especies de la familia Halobacteriaceae han desarrollado diversas estrategias. Por ejemplo, Haloferax mediterranei, Halobacterium salinarum o Natronobacterium vacuolatum, forman vesículas de gas que les permiten flotar hasta la superficie donde la concentración de oxígeno es mayor (Pfeifer y col., 1997). Otras especies son capaces de utilizar aceptores de electrones alternativos en la respiración como


el nitrato (Mancinelli y col., 1986; Hochstein y col., 1991; Lledó y col., 2004), tiosulfato o azufre (Tindall y col., 1986), dimetilsulfóxido (DMSO) (Oren y col., 1990) o fumarato (Oren y col., 1991). Algunas especies como Hbt. salinarum pueden crecer anaeróbicamente por fermentación de algunos aminoácidos, como por ejemplo L-arginina (Hartmann y col., 1980). Este último microorganismo también puede comportarse como fotoheterótrofo, al obtener energía en forma de ATP mediante la fosforilación de ADP mediada por la proteína de membrana bacteriorrodopsina, que se activa por efecto de la luz (Stoeckenius y col., 1979). Finalmente, destacar que aunque los halófilos son organismos quimioheterótrofos, se han descrito diversos casos de fijación de CO2 que implican la carboxilación reductiva de propionato, la reacción de la enzima glicina sintetasa o el intercambio de CO2, con el grupo carboxilo del piruvato (Oren y Mana, 2002).

Antiguamente, se asumía que las arqueas dominaban los ambientes extremos, como por ejemplo las salinas, mientras que las bacterias estaban restringidas a ambientes moderados. Más tarde, mediante técnicas de biología molecular, se encontró la presencia de arqueas en ambientes moderados, tales como el agua de mar o en sedimentos (Olsen, 1994), y de bacterias en ambientes con elevadas temperaturas (Pace, 1997). Recientemente, empleando técnicas de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) se ha puesto de manifiesto que las bacterias constituyen una parte significativa de la microbiota del hábitat de las salinas. Por tanto, parece ser que las bacterias, al igual que las arqueas, también se encuentran en ambientes extremos, como es el caso de Salinibacter ruber (Antón y col., 2000). Se ha observado la presencia de arqueas halofílicas extremas en los sedimentos de la plataforma continental en la costa de la India, realizándose su estudio mediante la técnica del número más probable (Raghavan y col., 2004). Se postula que también en Marte (Steven Squyres conferencia de prensa 24 marzo de 2004. NASA News), podrían haber existido organismos halofílicos ya que se ha comprobado que existió agua en Marte, como se ha podido observar recientemente con el robot “Opportunity” descubriendo sobre la superficie de Marte lo que podría haber sido un mar salado, y que al perder su atmósfera y evaporarse el agua pudo dar lugar a la precipitación de los minerales que estaban disueltos en ella llegando a estar así más concentrados y formando pequeños reservorios de cristales de sal. Con los datos que se conocen de nuestro planeta, sea el caso de Rio Tinto (Amaral-Zettler y col., 2002) en el que se encuentran organismos extremófilos, habría sido relativamente fácil para los organismos halofílicos evolucionar bajo


las condiciones dadas en Marte. Los organismos halofílicos terrestres servirían como análogos de posibles vestigios de vida en Marte (Mancinelli, 2003; Mancinelli, 2004).

1.2.2. Taxonomía. Los arqueas halófilos extremos están clasificados dentro de la familia Halobacteriaceae. Actualmente, ésta familia, se encuentra en proceso de reclasificación, distinguiéndose en este momento los siguientes géneros:

• Halobacterium: primer género descrito aislado de salazones de pescado (Kamekura, 1998). Crecen entre 3,5 y 5,2 M de NaCl. Requieren aminoácidos para su crecimiento.

• Halococcus: segundo género descrito después de Halobacterium clasificado dentro de la familia Halobacteriaceae. Su morfología es de cocos sin motilidad, con una pared celular formada por heteropolisacáridos en lugar de por glicoproteínas como el resto de los halófilos.

• Natrobacterium: requieren elevadas concentraciones de sal, alto pH y bajas concentraciones de Mg+2 para su crecimiento (Kamekura, 1998). Tienen forma de varilla.

• Natrococcus: como los microorganismos del género Natrobacterium, también son alcalinofílicos. Morfología cocoide.

• Haloarcula: requieren elevadas concentraciones de NaCl y de Mg+2 para su crecimiento.

• Haloferax: tienen el menor requerimiento salino, encontrándose su óptimo alrededor de 2 M de NaCl. Necesitan elevadas concentraciones de Mg+2 a diferencia de Natrobacterium.

• Halobaculum: requieren concentraciones relativamente bajas de NaCl y muy altas de Mg+2

para su crecimiento.

• Halorubrum: necesitan concentraciones de NaCl del órden de entre 1,5 y 5,3 M. (Kamekura and Dyall-Smith, 1995).

• Natrialba: tienen forma de varilla y son móviles. Éstos microorganismos no tienen bacteriorruberinas por lo que no presentan pigmentación. Crecen entre 2 M de NaCl y saturación.


• Natromonas: éste género está compuesto por una única especie, N. pharaonis, que pertenecía anteriormente al género Natronobacterium del que se transfirieron dos de sus especies a los géneros Halorubrum y Natrialba.

• Haloterrigena: requieren al menos cantidades de 2 M de sal para su crecimiento (Ventosa y col., 1999).

• Halogeometricum: requieren al menos concentraciones de 1,5 M de NaCl para su crecimiento. Crecen de forma anaeróbica en presencia de nitrato (Montalvo-Rodríguez y col., 1998).

• Natronorubrum: para su crecimiento necesitan al menos concentraciones de 1,5 M de sal. Su pH óptimo se encuentra entre 9,0 y 9,5 estimulando su crecimiento la presencia de ciertos azúcares (Xu y col., 1999).

• Natrinema: requieren al menos 1,7 M de NaCl para su crecimiento, teniendo su óptimo entre 3,4 y 4,3 M de NaCl. Si se encuentra por debajo de 1,5 M sus células se lisan (McGenity y col., 1998).

• Halohabdus: este género se compone de una única especie H. utahensis, que se ha aislado a partir de sedimentos del Gran Lago Salado. Para su óptimo crecimiento requieren concentraciones de 4,6 M de NaCl, no creciendo en presencia de sustratos complejos como la peptona o el extracto de levadura (Waino y col., 2000).

Existe otro género pendiente de clasificación que es Haloalcalophilum.

Haloferax mediterranei

El Archaeon halofílico extremo Haloferax mediterranei fue descrito por primera vez en 1983 por Rodríguez Valera y col. como Halobacterium mediterranei. Posteriormente, en 1986, Torreblanca y col. propusieron una nueva clasificación de éste microorganismo junto con Hbt. volcanii y Hbt. denitrificans, pasando a formar parte del género Haloferax. Esta distinción se realizó basándose en un estudio sobre los lípidos polares de la membrana celular y otras características morfológicas y fisiológicas. Actualmente


el género Haloferax está compuesto por cinco especies: las tres anteriormente citadas, Hfx. gibbonsi (Juez y col., 1986) y Hfx. lucentensis, descrita inicialmente como Hfx. alicantei (Gutierrez y col., 2002). Haloferax mediterranei, al igual que las especies pertenecientes a su género, presenta una amplia variedad morfológica siendo el bacilo la forma predominante. Su tamaño se encuentra entre 0,5 y

2 μm, presenta una débil motilidad durante la fase exponencial de crecimiento, y posee abundantes

vacuolas de gas. 1.2.3. Adaptaciones halofílicas. El logro de vivir en medios con elevada concentración de sal se debe a que los organismos que se encuentran en este tipo de medios han desarrollado dos estrategias diferentes para combatir el estrés osmótico:

- La primera de ellas consiste en la acumulación citoplasmática de solutos compatibles, compuestos de bajo peso molecular como el glicerol, la ectoina o la sacarosa, utilizándose por las bacterias halofílicas (H. elongata), algunas algas y hongos, y arqueas metanógenas halofílicas.

- La segunda estrategia consiste en la acumulación de sales inorgánicas en el citoplasma, desarrollada por arqueas halófilas de la familia Halobacteriaceae, un grupo de bacterias halofílicas anaeróbicas y la bacteria halófila Salinibacter ruber (Antón y col., 2002).

Los organismos que utilizan la primera estrategia, el K+ es el catión intracelular dominante,

pudiendo alcanzar una concentración de 5 M y el Cl− es el anión intracelular más abundante. En

concentraciones más bajas se encuentra el Na+, a 1 M aproximadamente. Éste hecho, contrasta con la

concentración de iones en el medio, en el que el Na+ es el catión dominante, y la concentración de K+ es

muy pequeña. La existencia de bombas en la membrana citoplasmática mantiene un gradiente entre el medio extra e intracelular (Madigan y Oren, 1999).


Las proteínas de éste tipo de microorganismos han desarrollado mecanismos específicos que les permiten ser estables y solubles en presencia de altas concentraciones de KCl (Madern y col., 1995; Danson y col., 1997). 1.2.4. Metabolismo.

Las haloarqueas por lo general son microorganismos quimioheterótrofos aerobios, es decir, utilizan materia orgánica como fuente de carbono y energía, siendo el O2 el aceptor final de electrones en la cadena respiratoria. No obstante, en condiciones de iluminación y de baja presión de O2 pueden comportarse como fotótrofos (pueden realizar la fotofosforilación a través de la bacteriorrodopsina). No son capaces de crecer autotróficamente (con CO2 como única fuente de carbono), pero algunas pueden hacer una fijación no reductora del CO2 a glicina en presencia de amonio y de propionato (Javor, 1988). No todas son aerobias estrictas: algunas pueden fermentar ciertos aminoácidos (Hartmann y col., 1980) y otras pueden realizar una respiración anaerobia teniendo como aceptor final de electrones el nitrato (Mancinelli y Hochstein, 1986).

Durante mucho tiempo se creyó que las haloarqueas eran incapaces de metabolizar

carbohidratos. Sin embargo, se ha demostrado que sí pueden hacerlo (Rodríguez-Valera y col., 1980; Pimenov y col., 1987). El catabolismo de las hexosas lo realizan a través de una modificación de la ruta de Entner-Doudoroff donde la glucosa es oxidada a gluconato y éste deshidratado a 2-ceto-3-deoxigluconato, posteriormente fosforilado dando 2-ceto-3-deoxi-6-fosfogluconato, continuando la vía normal de Entner-Doudoroff (Danson y Hough, 1992). En todas las arqueas la conversión de piruvato a acetil-CoA está catalizada por la piruvato oxidorreductasa, que es distinta del sistema de la piruvato deshidrogenasa de bacterias y eucariotas, en halófilos el aceptor de electrones es la ferredoxina utilizándose en lugar de NAD+ (Danson y Hough, 1992). Presentan un ciclo de los ácidos tricarboxílicos completo, idéntico al de bacterias y eucariotas, sirviendo para generar energía y suministrar precursores para biosíntesis. También permite la utilización de aminoácidos y otros compuestos nitrogenados como fuente de carbono y nitrógeno en el crecimiento (Danson y Hough, 1992).


1.2.5. Proteínas halofílicas.

Los organismos que crecen en medios hipersalinos, tales como el Mar Muerto o el Gran Lago Salado, han desarrollado varios mecanismos para superar la presión osmótica extracelular. Mientras que las bacterias y eucariotas halofílicas sintetizan grandes cantidades de pequeños osmoprotectores orgánicos, las arqueas halofílicas acumulan iones inorgánicos en el interior de la célula que exceden a los del medio. Consecuentemente, toda la maquinaria bioquímica de estos organismos debe estar adaptada para funcionar a altas concentraciones salinas. En el caso particular de las enzimas halofílicas, aunque catalizan las mismas reacciones que sus homólogas no halofílicas, éstas requieren altas concentraciones salinas en el rango de 1 a 4 M de sales neutras, tanto para su estabilidad como para su actividad enzimática (Leicht y col., 1978; Dym y col., 1995). Este comportamiento debe estar en correspondencia con marcadas diferencias en cuanto a composición y estructura de estas proteínas con respecto a las no halofílicas. La inestabilidad de las proteínas halofílicas en bajas concentraciones salinas, ha dificultado diversos intentos de purificar enzimas de fuentes halofílicas, debido a que la mayoría de las técnicas de purificación se desarrollan bajo condiciones de baja salinidad que originan en las proteínas y enzimas halofílicas una pérdida de su estructura nativa y de su actividad. Sin embargo, en algunos casos sí es posible la utilización de estas técnicas en presencia de altas concentraciones salinas, como en la purificación de NAD-glutamato deshidrogenasa y NADP-glutamato deshidrogenasa de Hbt. salinarum (anteriormente Hbt. halobium) (Bonete y col., 1986; 1987). Además, hay otras enzimas halofílicas como isocitrato deshidrogenasa de Hfx. volcanii (Camacho y col., 1995), así como glucosa deshidrogenasa (Bonete y col., 1996) y NADP-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei (Ferrer y col., 1996), que se pueden purificar en condiciones salinas bajas, utilizando glicerol 20% para estabilizar la estructura de la proteína. Aunque la mayoría de las enzimas halofílicas estudiadas se inactivan irreversiblemente en ausencia de concentraciones elevadas de sales neutras, algunas enzimas pueden renaturalizarse por un nuevo aumento de la concentración salina (Mevarech y Neumann, 1977).

El efecto de altas concentraciones salinas puede deberse a los propios solutos, o al efecto que

tienen los solutos en la actividad del agua. Todo soluto que se disuelve atrae a las moléculas del disolvente y por lo tanto se reduce la libertad del mismo. Se sabe que las sales pueden afectar a las interacciones hidrofóbicas, en gran parte por su influencia en la estructura de la distribución del agua.


Cuando los compuestos hidrofóbicos, como el tolueno, o grupos no polares de aminoácidos se disuelven en agua se produce un descenso en la entropía debido a un incremento en la ordenación de la estructura que forman las moléculas de agua alrededor de estos grupos.

La formación de estructuras nativas estables a partir de cadenas polipeptídicas lineales es un

proceso espontáneo basado en un balance de interacciones hidrofóbicas, hidrofílicas y electrostáticas (Eisemberg y col., 1978). Además, se ha sugerido que la sal elimina agua de las proteínas y forma uniones hidrofóbicas particularmente fuertes. Las proteínas halofílicas parecen tener esta característica, aumentando la frecuencia de aminoácidos polares y disminuyendo la frecuencia de aminoácidos no polares. Este aumento de la frecuencia de aminoácidos polares es debido a un exceso molar del 16-18% de aminoácidos cargados negativamente, concretamente de glutamato y aspartato (Pundak y Eisenberg, 1981; Danson, 1988), mientras que en las proteínas no halofílicas el exceso es sólo de 7-9%. Anteriormente Baxter (1959) propuso que el efecto de las sales sobre las enzimas halofílicas consistía en el apantallamiento de las cargas negativas de la molécula proteica por los cationes del medio, que de no ser neutralizadas se repelerían electrostáticamente, llevando a una expansión molecular, con la consecuente desorganización de las estructuras secundaria y terciaria de la proteína. Posteriormente se ha comprobado que estos residuos de aminoácidos acídicos aumentan la estabilización de la proteína compitiendo con la sal y originando una capa de hidratación apropiada a fuerzas iónicas elevadas, de forma que se unen alrededor de siete moléculas de agua por residuo, mientras que los demás aminoácidos sólo unen de dos a cuatro moléculas de agua por residuo (Pundak y Eisenberg, 1981).

Otro mecanismo propuesto para el efecto salino en las enzimas halofílicas, está basado en el

poder "salting-out" de ciertas sales como el cloruro de sodio o el sulfato de sodio que actúan disminuyendo la solubilidad de las proteínas. Este tipo de sales parece estabilizar mejor la conformación nativa de las enzimas halofílicas que las sales del tipo "salting-in" que actúan incrementando la solubilidad de las proteínas. En presencia de altas concentraciones de NaCl las cadenas polipeptídicas de una enzima pueden formar uniones hidrofóbicas estables. Otras sales como NaSCN, NaNO3 y especialmente NaClO4, no estabilizan bien la estructura del agua y por eso no mantienen la actividad enzimática máxima (Lanyi y Stevenson, 1970; Leich y col., 1978). Los aniones "salting-out" hacen disminuir las interacciones de los grupos no polares con el agua e incrementar las interacciones hidrofóbicas entre las partes no


hidratadas de la molécula. Por otro lado, los aniones "salting in" facilitan la interacción con el agua de los grupos no polares y debido a esto, disminuyen las interacciones hidrofóbicas internas. Altas concentraciones de sales "salting in" pueden ser causa de la desnaturalización de muchas enzimas, incluyendo las halofílicas.

Una investigación teórica de las secuencias primarias de las proteínas halofílicas sugiere que

estas proteínas son simplemente grandes aniones que compiten eficazmente con cualquier ion salino del entorno por las moléculas de agua (Rao y Argos, 1981).

El incremento en la hidratación y la unión a sales es una consecuencia de la adaptación

halofílica, que se ha determinado directamente por medidas de densidad de masa, densidad electrónica y haz de electrones de alta densidad. El sutil balance en la competición de la proteína y la sal por el agua está forzado por el requerimiento salino de las proteínas halofílicas; a bajas concentraciones de sal ocurre desactivación, desnaturalización y para oligómeros, disociación. Por ejemplo, para malato deshidrogenasa de Har. marismortui, la estructura y estabilidad de la enzima difiere para distintas disoluciones salinas sin detectarse alteraciones en la actividad catalítica (Hecht y Jaenicke, 1989).

En microorganismos del dominio Bacteria que pueden crecer en concentraciones saturantes de

NaCl aparece una tendencia a favorecer el uso de ácido aspártico y ácido glutámico en detrimento de lisina, un hecho reconocido como distintivo de los Archaea que requieren altas concentraciones salinas. El resto de aminoácidos que componen la masa de proteínas de una bacteria halotolerante como Halomonas elongata es similar al de una bacteria no halotolerante como E. coli (Olsen y col., 1994; Gandbhir y col., 1995). Estos datos son indicativos de una respuesta convergente al desafío que supone la adaptación al medio salino. En haloarqueas, este enriquecimiento en aminoácidos acídicos es entendido habitualmente como resultado de la presencia de altas concentraciones salinas en el interior de la célula. H. elongata es capaz de resistir tanto la ausencia de sales como la saturación de sales exógenas, lo que hace especialmente interesante el estudio de la composición de sus proteínas y si los cationes metálicos intervienen en su arquitectura. Los genes de las haloarqueas parecen "invadidos" por codones para aspártico y glutámico a través de sucesivas mutaciones acumulativas durante la evolución a partir de un organismo no halofílico ancestral (Olson y col., 1994), con codones para estos aminoácidos


que comprenderían por encima de un 25% del total de codones (Gandbhir y col., 1995). Si asumimos un contenido del 15% de codones para estos dos aminoácidos acídicos en el ancestro, y un genoma de unos 5 millones de pares de bases (Sapienza y Doolittle, 1982), entonces serían necesarios al menos 3x105 eventos mutacionales para dar lugar a esta adaptación. Los codones para el glutámico pueden obtenerse mediante un simple cambio de bases en los codones de lisina y alanina, y los codones para el aspártico a través de cambios en los codones de alanina. Así, alanina y lisina pueden haber sido los blancos primarios de las mutaciones. No puede hacerse un cómputo similar para Halomonas ya que se carece de datos sobre su genoma. Sin embargo, el enriquecimiento en aminoácidos acídicos sugiere que el coste genético de la adaptación en este linaje fue mucho más profunda y extensa que la simple adquisición de halotolerancia mediante la expresión aumentada de osmolitos. Se ha observado que para tener actividad a elevadas concentraciones de sal se requieren de un exceso de residuos ácidos frente a residuos básicos, característica que se ha encontrado en la mayoría de proteínas halofílicas (DasSarma y col., 2001). La conversión masiva de lisina en glutámico aparece como una atractiva posibilidad en vista de los datos de composición de aminoácidos (Gandbhir y col., 1995). 1.2.6. Aplicaciones de los organismos halofílicos.

Tradicionalmente el estudio de los organismos halofílicos ha estado relacionado con la industria de la alimentación ya que interferían en el correcto almacenamiento de los alimentos en salazón. Son por lo tanto de interés los métodos para controlar su crecimiento (Kamekura y Seno, 1991). En 1992, Rodriguez-Valera discutió como posibles aplicaciones:

i) Utilización en el descubrimiento de agentes anticancerosos, debido a las similitudes entre

eucariotas y haloarqueas a nivel molecular. ii) Reemplazo de algunas enzimas usadas ahora convencionalmente por las enzimas de

haloarqueas, ya que estos últimos suelen presentar una mayor resistencia al estrés salino.

iii) Sustitución de polisacáridos ácidos de algas utilizados como agentes estabilizantes, gelificantes, espesantes y emulgentes, por los de haloarqueas.


iv) Producción masiva de ésteres de polihidroxiácidos para la producción de poliplástico, puesto que algunas cepas acumulan grandes cantidades de polihidroxialcanoato (PHA),

un copolímero de β-hidroxibutirato y β-hidroxivalerato, que se emplea para la producción

de plásticos biodegradables. También es importante su aplicación en la producción de exopolisacáridos (Antón y col., 1988; Hezayen y col., 2000 y Eichler, 2001).

El uso biotecnológico más sofisticado y sustancial de uno de los productos de las haloarqueas es

la explotación de las bombas de protones fotoinducidas que operan en las membranas púrpura de Hbt.

halobium (actualmente denominado Hbt. salinarum). Las membranas púrpura consisten en bacteriorrodopsina con un cromóforo retinal como aceptor de la luz, que después de una modificación biotecnológica se puede usar en aplicaciones holográficas, procesado de señales ópticas, mecanismos de reconocimiento óptico, memorias de asociación óptica y equipos neuronales, memorias ópticas y dispositivos fotoeléctricos. También su posible utilización en "biochips" para una computadora óptica (Kandler, 1993). Recientemente, se ha utilizado una p-nitrofenilfosfato fosfatasa de Hbt. salinarum, en un medio orgánico a muy bajas concentraciones de sal después de retener la enzima en micelas reversas (Marhuenda-Egea y col., 2002). Bajo esas condiciones, la enzima fue activa y estable. La explotación de las micelas reversas combinadas con enzimas halofílicas podría dar lugar a nuevas aplicaciones de estas enzimas. A partir de la producción de herbicidas, pesticidas, explosivos, tintes etc. se generan residuos que generalmente contienen mezclas complejas de compuestos xenobióticos, sales y disolventes orgánicos. Las enzimas halofílicas retenidas en micelas reversas, podrían aplicarse en la eliminación medioambiental de esos residuos (Marhuenda-Egea y Bonete, 2002). Del mismo organismo, Hbt.

salinarum, se ha purificado y caracterizado una endopeptidasa extracelular que muestra actividad proteasa a bajas concentraciones de sal y podría tener aplicaciones en la eliminación del sabor amargo de las proteínas hidrolíticas que se utilizan en la industria alimentaria (Capiralla y col., 2002). A partir del organismo halofílico Haloferax mediterranei se ha purificado y caracterizado en

nuestro departamento una α-amilasa que hidroliza al azar los enlaces α-1,4-glicosídicos del almidón,

produciendo glucosa y esta enzima presenta una alta estabilidad a temperatura y concentración de sal


elevadas y pH básicos que la hacen interesante en posibles aplicaciones en la industria de detergentes, alimentaria, etc. (Pérez-Pomares y col., 2003).

Actualmente la biotecnología está siendo aplicada a multitud de industrias: alimentaria, farmacológica, médica, medio ambiental, etc., Por ejemplo, en la industria farmacéutica se emplean biomoléculas como el glicerol o solutos compatibles procedentes de halófilos y carotenos como aditivos alimentarios (Fujiwara, 2002 ; Irwin y col., 2004). En nuestro departamento se ha puesto en marcha el

estudio del uso de β-carotenos obtenidos a partir de células de halófilos como suplemento en la comida

de animales como el canario con la finalidad de potenciar el color del plumaje (Martínez-Espinosa 2003; 2004).

1.3. GLUTAMATO DESHIDROGENASA (E.C. 1.4.1.2-4). 1.3.1. Deshidrogenasas piridín-dependientes. En las células se producen un gran número de reacciones de oxidación-reducción catalizadas por enzimas que utilizan como coenzima NAD+ o NADP+. Algunas de esas enzimas pueden funcionar con ambos coenzimas y otras sólo funcionan con uno u otro coenzima, actuando en este caso en diferentes aspectos del metabolismo. En general, las deshidrogenasas que utilizan NAD+ como coenzima, son enzimas catabólicas que producen energía e intervienen principalmente en el catabolismo, mientras que las que utilizan NADP+ participan principalmente en la transferencia de electrones desde los intermediarios del catabolismo hasta los intermediarios de la biosíntesis (Sund, 1968). Estas enzimas catalizan reacciones del tipo:

Sustrato reducido + NAD(P)+ ↔ Sustrato oxidado + NAD(P)H + H+


Estas reacciones comprenden la transferencia reversible de dos equivalentes de reducción del

sustrato en forma de ion hidruro (H−) a la posición 4 del anillo de nicotinamida (en forma oxidada) del

nucleótido de piridina; el otro hidrógeno se separa del sustrato en forma de ion H+ libre. Esta transferencia directa de un átomo de hidrógeno desde el sustrato al NAD+ se ha comprobado mediante el empleo de sustratos marcados con deuterio o tritio. La forma oxidada y reducida del NAD+ y del NADP+ absorben luz en la zona ultravioleta, cerca de los 260 nm, que es el máximo de absorción del anillo de adenina. Cuando estos coenzimas se reducen, aparece un nuevo máximo de absorción a 340 nm. Este incremento refleja la reducción de la porción nicotinamida del anillo aromático de la piridina. La aparición o desaparición de la absorción a 340 nm se emplea para seguir el curso de las reacciones catalizadas por las deshidrogenasas piridín-dependientes. 1.3.2. Glutamato deshidrogenasas.

Las glutamato deshidrogenasas (GDHs) catalizan la interconversión de 2-oxoglutarato y L-glutamato según la reacción reversible:

2-oxoglutarato + NAD(P)H + NH4+ ↔ L-glutamato + NAD(P)+ + H2O

Las glutamato deshidrogenasas proporcionan una ruta para la incorporación de nitrógeno en compuestos orgánicos, siendo fundamental en la síntesis de todos los aminoácidos, pues en muchas

especies es la ruta principal de formación de grupos α-amino directamente a partir de amonio. Supone

además una conexión entre el metabolismo de los carbohidratos y el de aminoácidos (Smith, y col., 1975). 1.3.3. Especificidad del coenzima. Basándose en la especificidad del coenzima se conocen 3 tipos diferentes de glutamato deshidrogenasas:


a) NAD-específicas (NAD-GDH; E.C. 1.4.1.2) b) NADP-específicas (NADP-GDH; E.C. 1.4.1.4) c) No específicas, funcionan con ambos coenzimas (NAD(P)-GDH; E.C. 1.4.1.3)

Generalmente las GDHs procedentes de fuentes animales son de tipo no específico, mientras

que las procedentes del resto de fuentes suelen ser coenzimas específicas para uno de los dos. Es conveniente indicar, sin embargo, que las enzimas pueden también diferenciarse según otros

aspectos como son por ejemplo, la inducción y represión de su síntesis por metabolitos o regulación de la actividad por nucleótidos de purina di y trifosfatados (Smith y col., 1975). A NAD-GDH se le asigna un papel catabólico, mientras que a NADP-GDH se la ha implicado en la síntesis de glutamato (Sanwal y Lata, 1961). El NADPH producido a partir de las glutamato deshidrogenasas NADP-específicas es utilizado principalmente como poder reductor para la biosíntesis (Léjohn y McCrea, 1968).

Todas las glutamato deshidrogenasas que se conocen hasta ahora son oligoméricas y

dependiendo del tamaño de la subunidad pueden ser clasificadas en los siguientes dos grupos estructurales: GDHs hexaméricas (con seis subunidades idénticas de aproximadamente 50 kDa) y las GDHs tetraméricas (con cuatro subunidades idénticas con una masa molecular de 115 kDa). El grupo de las hexaméricas incluye las NAD-GDHs o las NADP-GDHs de la mayoría de especies de bacterias conocidas (Rice y col., 1985), las NADP-GDHs de eucariotas inferiores (Kinnaird y col., 1983) y las NAD(P)-GDHs (duales) de vertebrados (Nakatani y col., 1988). En el grupo de las tetraméricas se incluirían las NAD-GDHs encontradas en eucariotas inferiores (Kinnaird y col., 1983).

Las deshidrogenasas que utilizan glutamato, leucina, valina y fenilalanina se han reconocido como miembros de una superfamilia (Britton y col., 1993; Baker y col., 1995). Así pues, de acuerdo con el orden anteriormente establecido se podrían considerar como una familia de enzimas que incluyen dos subfamilias de la forma siguiente: GDHs pequeñas (S_GDHs que contienen miembros de las GDHs hexaméricas) y la subfamilia de las GDHs grandes (L_GDHs que contendrían miembros de las GDHs tetramericas) (Benachenhou-Lahfa y col., 1993).


Dentro del Dominio Archaea, en termófilos como Pyrococcus furiosus se ha descrito una glutamato deshidrogenasa que utiliza ambos cofactores NAD+ y NADP+ (Robb y col., 1992), en Thermococcus litoralis glutamato deshidrogenasa es exclusivamente NADP-específica, no habiéndose detectado NAD-GDH específica (Kesen y col., 1994).

En halófilos extremos como Halobacterium salinarum se ha aislado una GDH NADP-específica y

otra NAD-específica (Bonete y col., 1987, 1989). En Hfx. mediterranei también existen ambas enzimas, NADP-glutamato deshidrogenasa (Ferrer y col., 1996) y NAD-glutamato deshidrogenasa. Recientemente, se ha aislado una GDH NADP-específica de una levadura halotolerante, Debaryomyces hansenii, que aumenta su actividad al aumentar la concentración de sal (Alba-Lois y col., 2004). 1.3.4. Centro activo. En 1992, Baker y col., utilizando la estructura tridimensional de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Clostridium symbiosum, propusieron un modelo para el centro activo de la proteína. Tanto el glutamato como el 2-oxoglutarato poseen cargas negativas y parece ser que la enzima puede suministrar cargas positivas para estabilizar la unión del sustrato como sugiere la conservación en la secuencia de residuos de Lys, Arg e His. Siete son los residuos que conservan su alineamiento en la secuencia de las glutamato deshidrogenasas hexaméricas, y además cuatro de éstos (Lys89, Arg93, Lys113 y Lys125 en la GDH de C. symbiosum) están cerca del bolsillo donde se introduce el anillo de nicotinamida. El modelo de unión propuesto para el L-glutamato implica una conformación para el L-glutamato lo más extendida posible para éste y así maximizar la separación entre los grupos carboxilos C1 y C5. En este modelo, el carboxilo C1 quedaría a una distancia de 3 a 3,5 Å de los grupos –NH3+ de la Lys113 y Lys125 mientras que el carboxilo C5 está a una distancia similar del NH3+ de Ly89. El grupo 2-amino del glutamato está a una distancia aproximada de 4,0 Å del grupo carbonilo de la cadena principal de Gly164, además las cadenas laterales de Val376 y Ala163 producen interacciones hidrofóbicas con los C3, C4 y C5 del glutamato.

Todos estos residuos se han conservado en la secuencia de las GDHs hexaméricas, con excepción de la Gly164, que en algunos casos es prolina (Baker y col., 1992).


1.3.5. Regulación de la síntesis. El control de la síntesis de glutamato es fundamental en el control de la síntesis de los aminoácidos y por lo tanto en el control de la síntesis de proteínas y del crecimiento (Tempest y col., 1973; Tyler, 1978). En la mayoría de los organismos estudiados, la formación de glutamato implica su utilización en la ruta de la asimilación del amonio (Moat y col., 1988).

El amonio puede ser incorporado al glutamato por la vía de la glutamato deshidrogenasa o por una vía alternativa que requiere la utilización de dos enzimas, la glutamina sintetasa (GS E.C. 6.3.1.2) que cataliza la transferencia de amonio a L-glutamato formando L-glutamina, y la glutamato sintasa (GOGAT E.C. 1.4.1.13) que interviene en la reacción de la L-glutamina con 2-oxoglutarato para dar dos moléculas de L-glutamato.

En un medio rico en amonio como fuente de nitrógeno, la mayoría de los organismos asimilan el amonio por la vía de la GDH, a pesar de la baja afinidad de la enzima por el amonio (Tyler, 1978; Brown, 1980). En algunas bacterias se ha encontrado que la GDH es activa a bajas concentraciones de amonio (Kim, y col., 1982; Yamamoto y col., 1984). Sin embargo, cuando el suministro de amonio es limitado, la asimilación por la vía GS/GOGAT es más eficiente porque GS posee una Km mucho más baja para el amonio que la GDH. (Harder y col., 1983). Los valores de Km de las GDHs de la mayoría de las bacterias para NADP+ y NADPH son bastante similares, mientras que los valores de Km para el amonio y el glutamato muestran una gran variedad (Smith y col., 1975).

La actividad NADP-GDH de Saccharomyces cerevisiae disminuyó bajo condiciones en las que la concentración intracelular de amonio aumentaba, en respuesta a un incremento del nivel de amonio en el medio de cultivo. Esta disminución en la actividad se debió a una represión de la síntesis de la subunidad NADP-GDH (Bogóñez y col., 1985).


La síntesis de la NAD-GDH en Neurospora crassa está sometida principalmente a una represión por catabolito. Vierula y col., (1986), demostraron que durante la desrepresión se producía síntesis de novo de la subunidad de NAD-GDH y que la desrepresión estaba regulada a nivel transcripcional.

1.3.6. Aplicaciones. En todas las aplicaciones convencionales e industriales hay que tener en cuenta la economía y eficacia del sistema a comercializar. La primera aplicación importante es la biomédica, el ácido glutámico está considerado como un importante neurotransmisor en el sistema nervioso central de mamíferos, lo que ha generado un interés extra por el estudio de dicho aminoácido que permita determinar ácido glutámico en volúmenes de muestra muy pequeños (Stalikas y col., 1994). Recientemente se ha conseguido la producción de anticuerpos monoclonales de la glutamato deshidrogenasa del archaeon termofílico Sulfolobus solfataricus (Cho, y col., 2000). Estos anticuerpos podrían tener aplicaciones en innumerables campos de la investigación biomédica. Otra aplicación destacable está en la utilización de sistemas multienzimáticos para la fabricación de biosensores. Los biosensores son dispositivos que pueden detectar o responder a ambientes químicos que van a interaccionar con un componente biológico sensible, que está en contacto con un transductor físico. Normalmente, los biosensores comerciales están basados en métodos electroquímicos que utilizan enzimas. Estos electrodos enzimáticos están basados en la oxidación o reducción de especies redox en la superficie del electrodo. En la naturaleza, sólo unas pocas enzimas pueden generar o consumir especies electroquímicamente activas, limitando el número de sustancias que pueden ser medidas con electrodos monoenzimáticos. Una solución es el acoplamiento de varios sistemas enzimáticos basándose en reacciones cíclicas. Se puede incluir aquí la glutamato deshidrogenasa; para medir concentraciones de glutamato se podría utilizar un sistema enzimático acoplado de glutamato oxidasa y GDH inmovilizada en una matriz unida a un electrodo de oxígeno que sería el transductor (Wollenberger y col., 1993).


1.4. AISLAMIENTO Y SECUENCIACIÓN DE GENES DE HALÓFILOS. El desarrollo de aplicaciones informáticas que posibilitan relacionar regularidades en la estructura proteica con la función y la secuencia, permiten poder atribuir funciones a proteínas de las que únicamente se conoce su secuencia de DNA. La posibilidad de comparar secuencias de una misma proteína, de diferentes organismos, permite reconstruir la historia evolutiva y las relaciones filogenéticas entre especies. Mediante la secuenciación de genomas completos se pueden realizar construcciones filogenéticas con la finalidad de construir modelos que nos permitan conocer más datos acerca de la evolución de los organismos (Chenna y col., 2003). Recientemente, se ha conseguido secuenciar el genoma completo de Halobacterium salinarum

(Ng y col., 2000), organismo halofílico muy próximo a Hfx. mediterranei, objeto del presente estudio. En este caso en particular, la secuenciación completa del genoma de Hbt. salinarum sirve como un modelo excelente por las características que presentan los halófilos como organismos pertenecientes al Dominio Archaea. El conocimiento de genomas permite realizar diagnósticos precisos detectando las secuencias que codifican para determinados genes diana. Este estudio detallado de las secuencias ha llevado, por ejemplo, a crear un ensayo específico de PCR para poder aislar la glutamato deshidrogenasa de Streptococcus suis de multitud de muestras diferentes permitiendo realizar su diagnóstico de una forma rápida y precisa (Okwumabua y col., 2003). Analizando con detalle las secuencias de las proteínas halofílicas, en general, se observa un alto contenido en residuos aminoacídicos de carácter ácido (aspártico y glutámico), apareciendo éstos en la superficie de la proteína (Elcock y McCammon., 1998; Fukuchi y col., 2003) lo cual está sugiriendo la inestabilidad de las proteínas halofílicas a bajas concentraciones de sal. Sin embargo, la malato deshidrogenasa de Salinibacter ruber no contiene en su composición aminoacídica una elevada proporción de residuos acídicos lo que explica su total estabilidad en ausencia de sal (Madern y Zaccai., 2004).

Al comparar la composición de aminoácidos de varias glutamato deshidrogenasas de E. coli, S.

cerevisiae, Hbt. salinarum (NADP-GDH), bovina, etc., aparece un mayor número de estos residuos


acidídos (Asp y Glu) que en el resto de glutamato deshidrogenasas, así mismo el número de residuos aminoacídicos básicos (Lys y Arg) es menor en la GDH halófila que en las no halófilas y presenta un bajo porcentaje de residuos de fenilalanina; en cuanto al resto de los aminoácidos no hay diferencias significativas en su contenido (Benachenhou y Baldacci, 1991).

La glutamato deshidrogenasa NAD-específica de P. assaccharolyticus muestra una mayor homología de secuencia con las GDHs bovina y de pollo, que poseen una especificidad dual de coenzima, que con respecto a la presentada por la NADP-GDH de E. coli. Esto es especialmente destacable debido a que la GDH de mamíferos posee una regulación alostérica por nucleótidos y la NAD-GDH de P. assaccharolyticus no (Snedecor y col. 1991).

En el organismo hipertermofílico P. furiosus ES4 (perteneciente al Dominio Archaea) la secuencia primaria de la glutamato deshidrogenasa presenta una homología del 40 al 50 % con un grupo de organismos que incluye Clostridium difficile (52%), Hbt. salinarum (48 %), Sulfolobus solfataricus (40 %) y bovina (40 %), y sólo un 33 % con otro grupo que incluye Clostridium symbiosum, E. coli y S.

cerevisiae. Su gen codifica para 420 aminoácidos y la región de control es rica en AT, detectándose un promotor cuya secuencia es TTTATATA, denominado caja A, que es similar a la caja TATA de eucariotas y característico de las regiones promotoras de arqueas. También se ha descrito la secuencia TGCA en el lugar de comienzo de la transcripción, secuencia característica del Dominio Archaea (DiRuggiero y col., 1993).

El gen que codifica para la NAD-GDH de Hbt. salinarum se transcribe en una única molécula de RNA con una longitud de 1700 nucleótidos. Este gen codifica a un polipéptido de 435 aminoácidos.

La organización del genoma de Hfx. mediterranei se ha determinado mediante el uso de electroforesis en campo pulsante (PFGE) y el análisis de patrones de restricción obtenidos con varias endonucleasas. Estas técnicas ha revelado la presencia de un cromosoma circular de 2,9 Mpb., que es muy parecido al de Hfx. volcanii, y tres plásmidos de 490, 320 y 130 Kb (López-García y col., 1992).

Haloferax mediterranei es un buen organismo modelo para estudios de organización genómica debido a que este género muestra una mayor estabilidad en la organización del DNA que el género


Halobacterium, constituyendo un modelo en estudios de Biología Molecular en general (López-García y col., 1995).

1.5. EXPRESIÓN Y RENATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES. La expresión de genes clonados, habitualmente en E. coli, para la producción de proteínas recombinantes se ha convertido en una herramienta fundamental para poder llevar a cabo el estudio de la estructura y función de las proteínas. La obtención de proteína recombinante se puede realizar de dos formas distintas, mediante expresión homóloga o heteróloga. En el primero de los casos el huésped utilizado para expresar la proteína de interés es el mismo organismo del que procede la proteína problema, y en el caso de la expresión heteróloga el huésped es otro organismo diferente. En los sistemas de expresión homóloga se realiza la modificación postraduccional de las proteínas expresadas y su correcto plegamiento, procesos que permiten obtener la proteína problema en su estado nativo. Sin embargo, este sistema no es el más empleado actualmente, ya que existen limitaciones en cuanto a versatilidad de vectores de expresión se refiere y al tiempo requerido para optimizar el proceso. Durante los últimos años, el método que más se ha aplicado para la producción de proteínas recombinantes ha sido la expresión heteróloga. La mayoría de los métodos descritos para este tipo de expresión utilizan como huésped E. coli por su rápido crecimiento, su amplio conocimiento genético, su amplia variedad de cepas y de vectores de expresión, pero sobretodo por su capacidad de producir proteínas recombinantes a gran escala. El único inconveniente es que no permite la modificación postraduccional de las proteínas, y en muchos casos no proporciona el correcto plegamiento de la misma dando lugar a la formación de cuerpos de inclusión (Baneyx, 1999). Empleando E. coli como huésped de expresión se han expresado proteínas en el medio extracelular, en el espacio periplásmico, y en el citoplasma, siendo este último caso el más habitual. Las proteínas que normalmente son secretadas se pliegan de forma más adecuada en E. coli cuando son exportadas al espacio periplásmico. Las proteínas expresadas en el periplasma también pueden formar agregados como cuerpos de inclusión. Algunas cruzan las membranas internas y externas y pueden


dirigirse al medio. Las proteínas exportadas al medio pueden experimentar modificaciones no deseadas como oxidación o desaminación (Creighton, 1997). Frecuentemente, las proteínas se expresan en el citoplasma encontrándose de forma soluble, o formando agregados insolubles que se denominan cuerpos de inclusión. Cuando se consigue de forma soluble, la proteína puede encontrarse activa o inactiva. En el segundo caso se necesita de un paso posterior de reactivación para obtener la proteína en su estado nativo. Al obtenerla en forma de cuerpos de inclusión e inactiva es necesario realizar un paso previo de solubilización, seguido de la renaturalización in vitro para conseguir finalmente la proteína en su forma activa (Georgiou y col., 1999).

Los cuerpos de inclusión se describen como agregados proteicos densos y refráctiles resistentes a proteasas y a algunos detergentes, compuestos mayoritariamente por la proteína recombinante mal plegada e inactiva que se forman en el periplasma de E. coli durante su superproducción (Marston, 1986; Carrió y col., 2000). Además como consecuencia de sus propiedades refráctiles se pueden observar fácilmente mediante microscopía electrónica (Misawa y Kumagai, 1999). Los cuerpos de inclusión son frecuentes en bacterias recombinantes que producen proteínas heterólogas bajo el control de promotores fuertes, y por lo tanto representan un problema importante en procesos biotecnológicos destinados a la producción de proteínas (Villaverde y Carrió, 2003).

La formación de cuerpos de inclusión es independiente del huésped empleado para expresar una proteína, ya que se han obtenido incluso cuando se expresa una proteína endógena (expresión homóloga). No existe tampoco una relación entre la formación de cuerpos de inclusión y las características intrínsecas de la proteína a expresar, como son el peso molecular y la hidrofobicidad. Sin embargo, se ha observado relación entre estos parámetros en caso de que la proteína forme puentes disulfuro (Lilie y col., 1998). El desequilibrio entre la cantidad de proteínas nacientes y su plegamiento debido a una alta expresión, parece ser la causa de la agregación de la proteína, y por tanto de la formación de los cuerpos de inclusión.

En los procesos de producción de proteínas recombinantes la formación de cuerpos de inclusión

presenta ventajas e inconvenientes. Estos agregados son una fuente de proteína recombinante concentrada y prácticamante pura y que se puede purificar más fácilmente que la proteína soluble.


Además se evita el traslocamiento a través de la membrana lo que evita las posibles modificaciones en la proteína y por último se encuentra protegida frente al ataque de proteasas periplasmáticas. Por el contrario, tiene desventajas como la obtención de la proteína de forma inactiva haciendo el proceso de plegamiento más complejo, habiéndose de optimizar cuidadosamente este proceso (De Bernardez, 2001) y la ausencia de protección contra las proteasas citoplasmáticas, puesto que se ha visto que con el tiempo los cuerpos de inclusión parece que pueden ser atacados por éstas proteínas (Carrió y col., 2000).

La expresión de proteínas halofílicas en huéspedes mesofílicos como E. coli, presenta el inconveniente de que en la mayor parte de los casos se obtiene en forma de cuerpos de inclusión, haciéndose necesario un paso posterior de renaturalización de la proteína. Los cuerpos de inclusión se pueden solubilizar solamente con agentes desnaturalizantes fuertes, en los que las proteínas se despliegan hasta niveles que dependen del tipo de proteína y del agente desnaturalizante utilizado. Las proteínas solubilizadas así son altamente flexibles, solvatadas y solubles (Tsumoto y col., 2003). Debido a que se trata de proteínas halofílicas requieren de la presencia de elevadas concentraciones de sal para ser activas, solubles y estables. Para solucionar éste problema, se han utilizado disoluciones con altas concentraciones de sal durante el proceso de renaturalización in vitro. Se podría pensar que la solución sería realizar la expresión homóloga de dichas proteínas, pero esta opción también presenta dificultades puesto que se debería comenzar por poner a punto las técnicas de Biología Molecular necesarias en cada caso. Tal vez, sea por eso por lo que, hasta la fecha, solamente se ha expresado una proteína halófila de forma homóloga, la dihidrolipoamida deshidrogenasa de Hfx. volcanii (Jolley y col., 1996). Sin embargo, el número de proteínas expresadas heterólogamente en E. coli es mayor habiéndose expresado satisfactoriamente, entre otras, la dihidrofolato reductasa (Blecher y col., 1993), la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa (Bischoff y col., 1996), la citrato sintasa, la dihidrolipoamida deshidrogenasa (Connaris y col., 1998), la isocitrato deshidrogenasa (Camacho y col., 2002) y la glucosa deshidrogenasa (Pire y col., 2001), todas ellas del género Haloferax, y la malato deshidrogenasa (Cedrin y col., 1993) de Haloarcula marismortui. La mayoría de ellas se obtuvieron en forma de cuerpos de inclusión. Solamente la citrato sintasa y la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa se obtuvieron de forma soluble, aunque en ambos casos se requirió de un paso posterior de reactivación para conseguir la proteína en su estado nativo.


Se han expresado muchas glutamato deshidrogenasas de diversos organismos utilizando E. coli como huésped de expresión tales como la NAD-GDH de Clostridium symbiosum (Teller y col., 1992), la NADP-GDH del archaeon hipertermofílico Pyrococcus sp. KOD1 (Rahman y col., 1997), NADP-GDH de P. furiosus y P. furiosus ES4 (DiRuggiero y Robb, 1995; DiRuggiero y col., 1993), la NAD(P)-GDH de Symbiobacterium toebii (Ha y col., 2003), la NADP-GDH de P. horikoshii (Wang y col., 2003) y la NAD-GDH de Hbt. salinarum (Hayden y col., 2002).


2. OBJETIVOS E INTERÉS DEL TRABAJO.

El estudio de la glutamato deshidrogenasa de un organismo halofílico como Haloferax

mediterranei posee gran interés desde el punto de vista de investigación básica en enzimas que intervienen en el metabolismo del carbono y del nitrógeno.

Los objetivos del presente trabajo son:

• Purificar y caracterizar la glutamato deshidrogenasa del organismo halofílico Haloferax

mediterranei con el objeto de suministrar información acerca de sus propiedades moleculares.

• Secuenciar, clonar y expresar el gen que codifica para la NAD glutamato deshidrogenasa.

• A partir de la secuencia, realizar comparaciones con enzimas análogas de diferentes fuentes. Estas comparaciones nos revelan los puntos clave del comportamiento de las enzimas halofílicas.

• Renaturalizar la enzima recombinante con el fin de llevar a cabo estudios de plegamiento de la enzima halofílica.

• Purificar y caracterizar la enzima NAD-GDH recombinante con la finalidad de realizar su cristalización.


3. MATERIALES Y MÉTODOS. Todos los reactivos son de grado Biología Molecular excepto los utilizados en los cultivos

celulares. Las disoluciones se prepararon con agua ultrapura tipo MilliQ 18mΩ y se esterilizaron mediante

autoclave (121°C, durante 20 minutos) o por filtración a través de membranas de esterilización de tamaño

de poro de 0,2 μm. Los recipientes y las puntas de micropipeta también se usaron estériles.

3.1. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE NAD-GLUTAMATO DESHIDROGENASA NATIVA. 3.1.1. Fuente de microorganismos.

La cepa de Haloferax mediterranei (R-4) empleada en éste trabajo se viene manteniendo en el Departamento de Agroquímica y Bioquímica. 3.1.2. Medio y condiciones de cultivo.

Para la preparación del medio de cultivo se utilizó una disolución al 25% de sales inorgánicas cuyo contenido en porcentaje p/v de cada una de ellas es el siguiente (Rodríguez Valera y col., 1980):

NaCl 19,5%

MgCl2.6H2O 3,5%

MgCl2.7H2O 4,9%

CaCl2 0,09%

KCl 0,5%

NaHCO3 0,02%

NaBr 0,06%


Se adicionaron al medio de cultivo 0,5% de extracto de levadura (Difco) y 1% de glucosa. El pH del medio se ajustó entre 7-7,3 con tampón Tris-HCl 1 M pH 7,5. Se realizó un precultivo, inoculando con una pequeña cantidad de microorganismos procedentes de la cepa de Hfx. mediterranei, en un erlenmeyer con 100 mL. del medio de cultivo esterilizado previamente en un autoclave Selecta Autotester, Modelo 437-G a una temperatura de 121°C y una atmósfera de presión durante 20 minutos. La glucosa se esterilizó mediante filtración y se añadió posteriormente al medio. El precultivo se mantuvo, en un incubador HT. Modelo Infors AG con agitación a 37°C y a una velocidad de 135 rpm durante 4 días. Al cabo de éste tiempo el precultivo se sembró en un matraz conteniendo dos litros de cultivo, esterilizado previamente de igual modo que para el precultivo. Los matraces se mantuvieron en el incubador a 37°C con agitación a 170 rpm. El cultivo presentaba una curva de crecimiento típica y al alcanzar la fase estacionaria se detenía el cultivo procediendo a la cosecha de los microorganismos. Las células cosechadas se almacenaron a –20°C hasta su uso.

3.1.3. Extracto enzimático. Las células se cosecharon en una centrífuga refrigerada BECKMAN J2-21 con rotor de ángulo fijo tipo JA-14 a 9000 x g durante 30 minutos, se desechó el sobrenadante y las células se resuspendieron al 20% peso/volumen en tampón Tris-HCl 50mM pH 7,0 conteniendo sulfato de amonio 2,5 M. Posteriormente, las células fueron disgregadas en un sonicador Branson Sonifier, modelo B12 con sonda de titanio de 12,7 mm. de diámetro y 150 W de potencia durante periodos de 3 min. con intervalos de reposo para reestablecer el equilibrio térmico.

La suspensión sonicada se centrifugó en una ultracentrífuga Beckman modelo L5-65 B con rotor de ángulo fijo tipo 35, durante 1 hora a 28000 x g. El sobrenadante obtenido se utilizó como extracto enzimático y se sometió posteriormente a distintas etapas de purificación.


3.1.4. Determinación de la concentración de proteína. Se llevó a cabo mediante el método Bradford (1976) que se basa en el principio de unión proteína-colorante. El enlace del colorante con la proteína provoca un desplazamiento del máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm permitiendo la determinación de concentración de proteína a partir de la absorbancia a 595 nm. El reactivo utilizado contiene 0,01 % de Coomassie Brilliant Blue G-250, 4,7 % de etanol y 8,5 % de ácido fosfórico. El método empleado para determinar la concentración de proteína consistió en añadir

1 mL del reactivo a 100 μL de la disolución de proteína en una cubeta de 1,5 mL de capacidad,

midiéndose la absorbancia a 595 nm tras incubar 5 minutos frente a un blanco preparado con agua. La concentración de proteína se obtuvo mediante la correspondiente curva de calibrado realizada utilizando como patrón albúmina de suero bovino. 3.1.5. Determinación de la actividad enzimática de la proteína.

La medida de actividad de la NAD-glutamato deshidrogenasa se realizó espectrofotométricamente siguiendo la variación de absorbancia a 340 nm debido a la reducción de NAD+

a NADH. Se utilizó un espectrofotómetro Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech. La reacción se llevó a cabo en cubetas de 1 cm a 40ºC en volumen total de 2 mL. La mezcla de reacción contenía tampón Gly-NaOH 0,1 M, pH 8,5 y NaCl 4 M de forma habitual o el tampón adecuado a cada uno de los ensayos de caracterización. Los sustratos se añadieron a una concentración de 0,3 mM de NADH , 20 mM de 2-oxoglutarato y 50 mM de amonio. Se incubó a 40ºC durante 2 min. antes de iniciar la reacción añadiendo el coenzima NADH. Las condiciones de la reacción fueron optimizadas experimentalmente.

Se definió la Unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que es capaz de

transformar un micromol de sustrato por minuto, en las condiciones de ensayo descritas, de acuerdo con la definición de la Unidad Internacional de enzima (U). El valor de absortividad molar del NADH es 6,3 x 103 M-1 x cm-1


3.1.6. Cromatografía en Sepharosa 4B.

El procedimiento utilizado fue similar al realizado por Bonete y col., (1986; 1987). Se hizo pasar el extracto enzimático a través de una columna (Pharmacia 53,4 x 2,6 cm) empaquetada con 220 mL de Sepharosa 4B equilibrada en tampón Tris-HCl 50 mM pH 7,0 y 2,5 M de sulfato de amonio. La elución de la proteína se realizó aplicando un gradiente lineal desde 2,5 M a 0,5 M de sulfato de amonio a temperatura ambiente. El tampón conteniendo 0,5 M sulfato de amonio se suplementó con un 20% de glicerol para evitar pérdidas de actividad de la enzima a bajas concentraciones de sal. Se recogieron fracciones de 5 mL/tubo a una velocidad de 40 mL/hora. 3.1.7. Cromatografía en Blue-Sepharosa. La unión del colorante con la matriz de Sepharosa se realizó utilizando Sepharosa 6B-CL en suspensión acuosa a la que se añadió una disolución del colorante Cibacron-Blue F3GA (Fluka). La mezcla se mantuvo en agitación continua durante 30 min. Posteriormente se añadió NaCl hasta una concentración de 0,5 M y se mantuvo la agitación durante 30 min. A continuación se adicionó NaOH hasta una concentración 0,5 M y se continuó agitando la mezcla a temperatura ambiente durante 72 horas. Tanscurrido este tiempo se filtró y lavó abundantemente con agua, NaCl 1 M, y de nuevo agua hasta que no eluyó colorante sin unir. Seguidamente, se empaquetó en una columna de 1,5 x 50 cm (SIGMA) y se equilibró con tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,0 y glicerol 20%. La muestra obtenida en la etapa anterior de purificación se introdujo en esta columna a una velocidad de flujo de 20 mL/hora, recogiéndose fracciones de 3 mL/tubo. La columna, se lavó con el tampón de equilibrado y eluyéndose la proteína utilizando tampón Tris-HCl 20 mM, pH 7,0 y NaCl 3M. Las fracciones con mayor actividad NAD-glutamato deshidrogenasa se recogieron y utilizaron en el siguiente paso de purificación. 3.1.8. Cromatografía Sephacryl S-300. La columna se HiPrepR Sephacryl-S300 (Pharmacia Biotech) se equilibró con tampón Tris-HCl 20 mM, pH 7,0 y NaCl 3 M. Esta cromatografía de tamizado molecular se llevó a cabo a una velocidad de 30 mL/hora recogiéndose fracciones de 2 mL/tubo. La salida de proteína se determinó midiendo la


absorbancia a 280 nm. Los tubos con mayor actividad se recogieron y se utilizaron para su caracterización y análisis electroforético. 3.1.9. Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS.

Para determinar el grado de pureza de la enzima se efectuaron electroforesis analíticas de la purificación. La electroforesis se realizó en geles de poliacrilamida y en condiciones desnaturalizantes. El peso molecular de la subunidad proteica fue obtenido con la misma técnica.

El sistema empleado en la electroforesis fue el de Laemmli (1970), es un sistema de geles en

discontínuo, el gel superior concentra las muestras de proteína procurando una mejor resolución de la banda y la separación de las moléculas de proteína se realiza en el gel inferior o gel separador. En el apéndice I, se muestran las disoluciones empleadas y el modo de preparación de los geles.

Para el desarrollo electroforético se utilizó un equipo “Mini Protean II” de la casa Bio-Rad. Los

geles se fijaron y tiñeron siguiendo el método propuesto por De Moreno y col., en 1985. 3.1.10. Determinación de la masa molecular de NAD-GDH nativa y del tamaño de subunidad.

3.1.10.1. Determinación de la masa molecular mediante tamizado molecular.

La determinación de la masa molecular mediante tamizado molecular, se realizó exactamente

igual a como se ha descrito en la etapa de purificación del apdo. 3.1.8, aunque en este caso, la columna se calibró previamente con proteínas de masa molecular conocida. Las proteínas utilizadas fueron: ferritina (425 kDa), catalasa (240 kDa), aldolasa (158 kDa), albumina (68 kDa) y citocromo c (12,5 kDa). A partir de los volúmenes de elución para cada proteína se calculó su constante de reparto (Kav) y se representó el logaritmo de su masa molecular frente a Kav. De la recta patrón obtenida se determinó la masa molecular de la NAD-glutamato deshidrogenasa tanto nativa como recombinante, a partir de su correspondiente valor de Kav.


3.1.10.2. Determinación del tamaño de subunidad mediante electroforesis en gel de

poliacrilamida en presencia de SDS.

Se preparó un gel de poliacrilamida tal como se describe el apdo. 3.1.9 y se llevó a cabo la

electroforesis correspondiente. En este caso, se utilizaron un conjunto de proteínas patrón de masa de subunidad conocida que se cargaron en una de las calles del gel. Los patrones utilizados fueron los proporcionados por la casa MBI Fermentas: Protein Molecular Weight Marker (#SM0431) compuesto por:

β-galactosidasa de E. coli (116,0 kDa), BSA (66,2 kDa), ovoalbúmina (45,0 kDa), lactato deshidrogenasa

de músculo porcino (35 kDa), endonucleasa de restricción de E. coli (25,0 kDa), β-lactoglobulina de leche

bovina (18,4 kDa) y lisozima de huevo (14,4 kDa). Una vez realizada la electroforesis y teñido el gel con azul Coomassie se determinó la movilidad

electroforética relativa (Rf) de cada una de las proteínas patrón y la de la proteína nativa, y recombinante. De la representación del logaritmo de la masa molecular de subunidad frente a Rf se obtuvo una recta a partir de la cual se determinó la masa molecular de subunidad de la enzima.

3.1.11. Determinación de parámetros cinéticos.

Para el cálculo de los parámetros cinéticos, Vmax (velocidad enzimática máxima), Km (constante de Michaelis-Menten) y Vmax/Km (eficacia catalítica), se determinó la actividad de la NAD-glutamato deshidrogenasa en el sentido de aminación reductiva, manteniendo constante y a concentración saturante dos de los sustratos y variando el sustrato estudiado. El sustrato 2-oxoglutarato, se varió desde una concentración de 2,2 mM hasta 20 mM, manteniendo la concentración de NADH en 0,3 mM y la de acetato de amonio en 0,1 M.

El sustrato NH4+ se varió entre 11 mM y 100 mM manteniendo constante la concentración de 2-

oxoglutarato en 20 mM y NADH en 0,3 mM. Por último, se varió el coenzima desde una concentración entre 0,03 mM y 0,3 mM manteniendo fijas las concentraciones 20 mM de 2-oxoglutarato y 0,1 M de acetato de amonio.


En todos los casos, la representación de Lineweaver-Burk dió lugar a una recta confirmando un comportamiento cinético de la enzima de tipo Michaelis-Menten. Para el cálculo numérico de los parámetros cinéticos se ajustaron los datos de velocidades iniciales obtenidos para cada una de las concentraciones de los sustratos variados, utilizando la ecuación de Michaelis-Menten (Ecuación 1 ), utilizando el programa informático SigmaPlot (Jandel Scientific, v. 1.02).

v = Vmax x S/ (Km + S) (1)

Esta ecuación se reagrupó para el cálculo de Vmax/Km de la siguiente forma:

v = Vmax/Km x S/ (1 + S/Km) (2)

En la Ecuación (2) aparecen como parámetros la eficacia catalítica (Vmax/Km) y la constante de Michaelis-Menten (Km).

3.2. COMPORTAMIENTO FRENTE A LA CONCENTRACIÓN DE SALES, TEMPERATURA Y pH. 3.2.1. Efecto de la concentración de sales sobre la actividad enzimática. Para estudiar el efecto de la concentración de sales sobre la actividad enzimática, se midió la actividad tanto de la NAD-GDH nativa como recombinante en tampones conteniendo la concentración de sal ensayada. El tampón utilizado, fue Bis-Tris Propano 100 mM, pH 8,5 conteniendo NaCl o KCl en concentraciones de 0,5 M hasta 4 M de cada una de las sales.

Una vez medida esta actividad, se representó frente a la concentración de sal correspondiente y de la curva obtenida se determinó la concentración óptima de sal para la reacción catalizada por la NAD-GDH.


3.2.2. Efecto de las sales sobre la estabilidad. En este caso, se utilizó una muestra enzimática altamente concentrada y se ajustó la concentración de NaCl mediante dilución al valor ensayado. Se midió la actividad justo en el momento de ajustar la concentración de sales y se tomó como actividad inicial. Cada cierto tiempo, se tomó una alícuota determinándose su actividad y refiriéndola a la actividad inicial como actividad residual (%). El logaritmo de los valores de actividad residual se representó frente al tiempo, obteniéndose en todos los casos una línea recta. A partir de la pendiente de esta recta, se estimó el tiempo de vida media que es el tiempo necesario para que la enzima conserve el 50% de su actividad inicial. Para observar el efecto de concentración de sales en la estabilidad de la enzima, se tomaron alícuotas en un tiempo suficiente para apreciar cambios significativos en su actividad. 3.2.3. Efecto de la temperatura en la actividad enzimática. De la misma forma que en el apartado anterior se utilizó una muestra enzimática muy activa y se realizó el ensayo de actividad a diferentes temperaturas en un rango de 283K a 353K. La temperatura se controló en cada momento mediante un termómetro digital y se mantuvo constante utilizando un baño termostatizado a la temperatura deseada. La enzima se preincubó en el tampón de actividad a dicha temperatura durante el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio térmico. Una vez realizadas todas las medidas se refirieron a la actividad máxima medida como porcentaje de actividad residual. De la representación del porcentaje de actividad residual frente a la temperatura se pudo determinar el rango de temperaturas óptimo para la reacción. 3.2.4. Determinación del pH óptimo de actuación.

Para estudiar el efecto del pH sobre la actividad enzimática, se midió ésta para la NAD-GDH tanto nativa como recombinante en tampones conteniendo NaCl o KCl 4 M. El tampón utilizado fue Bis-Tris Propano 100 mM, conteniendo NaCl o KCl 4 M y en un rango de pH entre 6,2 y 9,5. Una vez medidas las actividades a cada pH, se representaron éstas frente al pH correspondiente y de la curva obtenida se determinó el rango de pHs óptimos para la reacción catalizada por la enzima.


3.3. SECUENCIACIÓN DEL EXTREMO N-TERMINAL. Para la secuenciación del N-terminal de la enzima nativa, se procedió a su transferencia a una membrana PVDF (“Immobilon P”). Previamente a su transferencia se realizó una electroforesis inicial SDS-PAGE al 12,5% acrilamida/bisacrilamida en una Protean-Biorad. Una vez terminada, se sumergió el gel durante 20 minutos en el tampón de transferencia (50 mM Tris, 50 mM glicina, 20% metanol) y se procedió a la transferencia. Se cortaron 2 membranas de PVDF (“Immobilon P”) del mismo tamaño que el gel, se humedecieron de 3 a 5 segundos con metanol al 100% y se lavaron en agua para eliminar el metanol. Las membranas se sumergieron en tampón de transferencia y se colocaron en el siguiente órden sobre el electrodo positivo: 7 trozos de papel Whatman 3 MM del tamaño del gel humedecido en tampón de tansferencia, las dos membranas de PVDF (“Immobilon P”), el gel de electroforesis, otros 7 trozos de papel Whatman 3 MM, se realizó la transferencia durante 2 horas a una corriente constante. Posteriormente, se tiñó la membrana con una disolución de azul Coomassie 0,025% (p/v) en metanol 50% y acético 10%. Se destiñó con una disolución de acético 10%, metanol 50% y se lavó con agua. La secuenciación del extremo N-terminal se llevó a cabo en el Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" por el Dr. J. Berenguer.

3.4. AISLAMIENTO DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. mediterranei. 3.4.1. Extracción de DNA de Hfx. mediterranei. Se preparó un cultivo del microorganismo en un medio con sales al 25% y extracto de levadura al 0,5%, suplementado con glucosa al 1%, el pH del medio se ajustó a 7,4 con tampón Tris-HCl 1M pH 7,4. Se incubó a 37°C con agitación constante en un incubador Infors-AG. El cultivo se detuvo en la fase exponencial del crecimiento, y la extracción del DNA se realizó, según Ausubel y col. (1989), a partir de 15 mL de cultivo. Las células se lisaron con SDS al 10% y se trataron con proteinasa K a una concentración de 20 mg/mL durante 1 hora a 37°C. A continuación se trató con NaCl/CTAB durante 10 minutos a 65°C y se adicionó cloroformo/alcohol isoamílico 24:1. Los desechos de la membrana celular, proteínas desnaturalizadas y polisacáridos acomplejados a CTAB,


quedan en la fase orgánica, mientras que los ácidos nucleicos se mantienen en la fase acuosa. La extracción se repitió con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico 25:24:1. El DNA precipitado con isopropanol se lavó con etanol al 70%. El precipitado se resuspendió en 0,5 mL de agua ultrapura estéril. Para resuspender el DNA se mantuvo durante varios días en un baño a 37°C hasta su total disolución. Se empleó alternativamente otro método para la extracción del DNA en el que la lisis de las células se realizó en agua y la extracción con fenol saturado pH 8,0. (Dyall-Smith y Doolittle, 1994). 3.4.2. Medida de la concentración de DNA genómico. La concentración de DNA se midió espectrofotométricamente registrando la absorbancia de la muestra a 260 nm. Para DNA puro, un valor de absorbancia de 1 corresponde a una concentración de 50

μg/mL. La pureza de la muestra se estimó leyendo la absorbancia a 280 nm. Para DNA puro la relación

A260/A280 debe estar entre 1,8-2. 3.4.3. Electroforesis en gel de agarosa. Para visualizar el DNA se realizó una electroforesis en agarosa al 0,8% en tampón TAE 1X

(apéndice I) con 0,5 μg/mL de bromuro de etidio. Las muestras se prepararon con distintas

concentraciones de DNA, tampón de carga (apéndice I), y en algunos casos agua ultrapura para ajustar los volúmenes. El patrón empleado, Marker III (Fermentas) se preparó del mismo modo. Dependiendo de las necesidades, se trabajó con geles de dimensiones 10x8 cm o 11x15 cm. Los soportes de los geles fueron suministrados por la casa comercial Ecogen. La electroforesis se corrió a 80V durante aproximadamente 2 o 3 horas, dependiendo del tamaño del gel, en tampón TAE 1X con 10-

3 μg/mL de bromuro de etidio. La fuente empleada, Electrophoresis Power Suply EPS 500/400, fue

suministrada por Pharmacia. Una vez terminada la electroforesis, se observaron las bandas teñidas con bromuro de etidio mediante un transiluminador UV Spectroline, Modelo TC-312A. El gel se fotografió con una cámara Kodak Digital Science DC40, para observar de éste modo las bandas obtenidas.


3.4.4. Generación de un producto de PCR de 203 pb. A partir de la secuencia conocida del N-terminal de la NADP-glutamato deshidrogenasa de Hfx.

mediterranei (Ferrer, 1995) se diseñó un oligonucleótido en el que se introdujeron degeneraciones. Se utilizó también en la generación del producto de PCR un oligonucleótido degenerado antisentido construido mediante alineamiento múltiple de glutamato deshidrogenasas de las bases de datos y que corresponde con una secuencia consenso de GDHs.

Para el diseño de los oligonucleótidos se utilizaron los programas Net Primer (PREMIER; Biosof-International) y Oligo Calculator (Molecular Biology Core Facilities: DANA-FARBER: Cancer Institute) para comprobar la ausencia de formación de dímeros, realizar el cálculo de la Tm del oligonucleótido a diseñar y el contenido en GC. Los oligonucleótidos diseñados y solicitados a las casas Gibco y Applied Biosystems fueron los siguientes: La secuencia degenerada correspondiente al N-terminal de la NADP-GDH de Hfx. mediterranei, fue:

N-ter- 5’-GCSCAGGAGGCSAACCCSTTCGAG-3’

La secuencia consenso conservada en GDHs que se encuentra a aproximadamente 300 pb. del

N-terminal de GDHs. Es una secuencia antisentido que codifica para los aminoácidos MTWMTK.

ConsI- 5’-GCSGTCTTCCASGTCATCCA-3’

Siendo S el aminoácido degenerado que puede ser C ó G.

Se utilizó un termociclador 2400 con sistema de enfriamiento Peltier de Perkin-Elmer. Las condiciones y cantidades de reactivos de la PCR se optimizaron modificando la temperatura de hibridación y el tiempo de elongación. La concentración final de Mg2+ fue de 1,5 mM, empleándose 2,5 U

de Taq polimerasa y 1 μg de DNA genómico en la reacción de amplificación del fragmento. Se probaron

diferentes temperaturas de hibridación y cantidades de oligonucleótidos, localizándose diferentes bandas en las amplificaciones.


3.4.5. Secuenciación del producto de PCR de 203 pb.

En general, la secuenciación de DNA se realizó en secuenciadores ABI PRISMTM 310 y 3100 Genetic Analyzer de Applied Biosystems, empleando el método de Sanger de terminación de cadena y utilizando terminadores didesoxi marcados, con la utilización de cebadores específicos. La secuenciación se realizó en la Unidad de Biología Molecular y Análisis Genético de los Servicios Técnicos de Investigación de la Universidad de Alicante.

El método se basa en la acción de los cuatro terminadores didesoxi (ddNTPs) marcados con diferentes marcadores fluorescentes, en la reacción de PCR. La reacción de marcaje se realizó empleando el kit de secuenciación ABI PRISMTM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction

Kit, que proporciona premezclados los cuatro terminadores marcados así como , dITP, dATP, dCTP, dTTP, Tris-HCl pH 9,0, MgCl2, pirofosfatasa termoestable, y AmpliTaq DNA Polymerase, FS. Esta enzima es un mutante de la Taq polimerasa que no posee actividad nucleasa 5’-3’ y en la que se ha reducido drásticamente la discriminación por los didesoxinucleótidos. Una vez finalizada la reacción de amplificación se purificaron diferentes bandas a partir de gel de agarosa con kit “GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit” de Amersham Pharmacia Biotech.

La reacción de secuenciación se realizó con 50 ng de cada una de las bandas, 4 pmol. de

oligonucleótidos N-ter y consenso, 4 μL de Premix (BigDye terminator) completándose con agua hasta un

volumen final de 10 μL.

Acabada la reacción de secuenciación se llevó a cabo la purificación de la misma mediante la eliminación de ddNTPs no incorporados en la reacción. La columnas que se emplearon para la purificación fueron Centri-Sep Columns de Princeton Separations. Los cebadores empleados para dicha secuenciación fueron los mismos que se utilizaron en la amplificación del producto de PCR. El programa para la adquisición de datos primarios utilizado fue ABI


Prism 310 Collection v 1.2.2, y el análisis de las secuencias obtenidas se llevó a cabo con el programa Sequencing Analysis v 3.1 de Applied Biosystems. 3.4.6. Marcaje no radiactivo del producto generado. DOT BLOT. Con la finalidad de localizar la glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei se realizó el marcaje no radiactivo del producto de PCR previamente secuenciado, utilizando el “PCR DIG Probe Synthesis Kit” de Boehringer Mannheim. Este sistema emplea digoxigenina para marcar directamente fragmentos de DNA generados por el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la hibridación y posterior detección.

Para comprobar que el producto de PCR se había marcado correctamente, se realizó un DOT BLOT, que consiste en la detección de diferentes diluciones del producto marcado para así estimar la mejor concentración de sonda a preparar. Para ello, se realizaron diluciones de la sonda 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000 y 1/100000 y se colocaron en una membrana de nitrocelulosa junto con una batería de disoluciones control de concentraciones conocidas. Se llevaron a cabo los pasos de detección que se utilizan en las técnicas de hibridación. 3.4.7. Preparación de una genoteca de Hfx. mediterranei en fago lambda.

Para la preparación y amplificación de la genoteca se siguió el protocolo recomendado por el manual del kit empleado para la construcción de la misma: “EMBL3 BamHI Arms Genomic Cloning System” (Promega), y los protocolos de Sambrook y col., (1989) en el que se indican los pasos a seguir para la preparación de las células hospedadoras, la infección de éstas por la genoteca, así como la técnica de siembra en placa. La amplificación de la genoteca permitió determinar la eficacia del empaquetamiento y, como consecuencia, la representatividad de todo el genoma. Dicha representatividad se calcula mediante la estimación del número de recombinantes con una probabilidad de que un clon de la genoteca tenga una secuencia determinada. La genoteca disponible en nuestro departamento posee una probabilidad del 99%, lo que significa que estadísticamente en 1000 calvas de lisis se encuentra todo el genoma representado dado que la eficiencia en la construcción de la genoteca es de 2x104 unidades


formadoras de calvas/mL, de tal forma que en 50 μL de la genoteca habrá al menos un clon que

contenga la secuencia buscada. Una vez amplificada la genoteca se conservó a – 80ºC. 3.4.8. Preparación, crecimiento e infección de células XL1-Blue P2. Teniendo en cuenta el rendimiento obtenido en la construcción de la genoteca, se realizaron diferentes diluciones en tampón SM (apéndice I), con el fin de obtener placas con calvas de lisis aisladas. El rango de diluciones empleado fue de 1:10 a 1:1000. Una vez obtenida la dilución óptima se trabajó en todo momento con esta, siendo en nuestro caso 1:100. Las células hospedadoras empleadas fueron XL1-Blue P2. Se inoculó una colonia en un medio de cultivo de LB (Luria-Bertani) (apéndice I) suplementado con 10 mM de MgSO4 y 0,2% (p/v) de maltosa. El crecimiento se detuvo a una OD600 de entre 0,5 y 1, centrifugándose posteriormente a 500 x g durante 10 minutos. El precipitado se resuspendió suavemente en el doble del volumen inicial con 10 mM de MgSO4, diluyendo las células hasta una OD600 de 0,5. El crecimiento con MgSO4 y maltosa facilita la adsorción e infección del fago. Para la adsorción el fago emplea receptores codificados por el gen lamB

cuya función es el transporte de maltosa, y cuya expresión es inducida por su presencia en el medio. Se alcanzó un volumen final de 2 mL de células hospedadoras que fueron infectadas con 2 mL de la genoteca diluida 1:100. Se incubó la mezcla durante 30 minutos a 37ºC para permitir la infección. Tras la infección se sembraron en placas Petri con medio de cultivo LB-agar al 2% y LB Top agar. El LB Top agar consiste en el mismo medio de cultivo, pero con 0,7% de agarosa en lugar de agar. Esta suspensión debe reservarse a 48ºC (para evitar la solidificación) hasta el momento de la siembra. Se

mezclaron 200 μL de las células infectadas con 3 mL de LB Top agar (cantidad recomendada para placas

Petri de 9 cm). Rápidamente se repartió uniformemente sobre placas de LB agar precalentadas a 37ºC. Se dejó solidificar el Top agar y se incubó a 37ºC durante toda la noche. El número de placas debe ser alrededor de 20 para que los resultados obtenidos sean estadísticamente representativos. Una vez obtenidas las placas con calvas de lisis aisladas y en las que se encuentra representado todo el genoma de Hfx. mediterranei se lleva a cabo la hibridación en placa empleando la sonda de 203 pb. obtenida para glutamato deshidrogenasa.


3.4.9. Hibridación de la genoteca con el producto de PCR de 203 pb. marcado.

Las calvas de lisis de las placas se transfirieron a membranas de nylon HybondN+ de Amersham Biosciences para llevar a cabo la hibridación. Las placas se enfriaron a 4ºC durante 30 minutos para evitar romper o deteriorar la capa de LB Top agar durante la transferencia.

Las membranas de nylon se colocan sobre la superficie de la placa evitando generar burbujas, se deja transferir durante 1 minuto, tiempo durante el cual se señala la orientación relativa de la membrana para su localización posterior en la placa. Las membranas se separan de las placas y se sumergen en la disolución de desnaturalización (apéndice I) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Empleando papel Whatman 3MM se secan parcialmente las membranas y se incuban en la disolución de neutralización (apéndice I) durante 15 minutos. A continuación, se realiza una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente en 2XSSC. Finalmente, se secan las membranas totalmente en papel Whatman 3MM.

Una vez secas las membranas, se fijaron las calvas de lisis transferidas, irradiándolas con luz ultravioleta durante 1 minuto por cada lado, comenzando por la parte que no contenía las calvas. La fuente de UV empleada fue Spectroline Modelo TC-312A.

La hibridación de las membranas se llevó a cabo en un horno de hibridación, empleando 10 mL de una solución de hibridación (apéndice I) que contenía 40 ng de la sonda de 203pb. marcada con digoxigenina, durante toda la noche a 68ºC. Previamente es necesario realizar una incubación durante una hora a 68ºC en una solución de prehibridación que posee la misma composición que la de hibridación excepto la sonda que no se adiciona en este tratamiento previo a la hibridación. Con este paso se preparan las membranas bloqueando los sitios de unión no específicos de ácidos nucleicos sobre la membrana. Se lavó la membrana en un horno de hibridación Hybridisier HB-2D de la marca Techne, en tubos giratorios durante 2 horas a la temperatura de hibridación. Dicha temperatura ha de ser determinada experimentalmente para obtener las mejores condiciones de hibridación. La solución de hibridación se incubó en un baño hirviendo durante 10 minutos, enfriándose posteriormente en hielo


durante 5 minutos antes de ser añadida a las membranas, de esta manera se consiguen desnaturalizar las hebras de la sonda para poder llevar a cabo la hibridación con el DNA fijado en las membranas. La solución de hibridación se incubó con las membranas en el horno de hibridación a 68°C durante la noche. Posteriormente, se llevaron a cabo los lavados siguientes para eliminar la sonda unida inespecíficamente:

- 2 veces, 5 minutos cada vez en 2XSSC (apéndice I), 0.1% SDS a temperatura ambiente. - 2 veces, 15 minutos cada vez en 0.1XSSC, 0.1% SDS a 68ºC. La detección se realizó de acuerdo a los protocolos de Roche Molecular Biochemicals (1995).

En este proceso se usa un anticuerpo frente a la digoxigenina que contiene la sonda marcada. Dicho anticuerpo tiene unido un fragmento activo de la enzima fosfatasa alcalina. Una vez unido la anti-digoxigenina-fosfatasa alcalina a la sonda, se utiliza un sustrato quimioluminiscente para la fosfatasa

alcalina (CSPD®) (apéndice I), de forma que al exponer la membrana a una placa autorradiográfica, ésta

queda impresionada en los lugares en los se encuentra la sonda hibridada. Este último paso de la detección se realizó por exposición de las membranas a una placa autoradiográfica Curix RP2 de Agfa.

El revelado de la placa se llevó a cabo como sigue:

- Sumergir la placa de 15 a 60 segundos en revelador G150 de AGFA diluido 1:4.

- Baño de paro en ácido acético al 10% (v/v), durante 1 minuto.

- Fijación durante 5 minutos en Agefix de AGFA diluido 1:5.

Todos estos pasos se realizaron en cámara oscura con luz roja, y a partir de aquí con luz blanca.

- Lavado de la placa con agua destilada.

- Secar al aire.


En la figura 3 se resumen los principales pasos descritos.

Figura 3: Esquema de la localización de genes en una genoteca construida en fago λ.

A partir de los resultados obtenidos en las placas autorradiográficas, en las que se observaban

diferentes positivos, se realizó un segundo proceso de selección aislando varios de ellos mediante extracción de la calva de lisis correspondiente de la placa original con ayuda de una pipeta Pasteur y posterior difusión del fago en una disolución de cloroformo a una concentración final del 5% (v/v) en tampón SM (apéndice I). Para esta segunda búsqueda las calvas aisladas se usaron para infectar de

nuevo células E. coli XL1-Blue P2 (5 μL de la calva resuspendida en 200 μL de células preparadas tal y

como hemos descrito anteriormente), se siguen los mismos pasos que para la primera búsqueda. Las placas autorradiográficas, en este caso, sólo poseen positivos si la calva original es

realmente positiva para el gen de interés.


3.4.10. Aislamiento de DNA de fago. A partir de las calvas obtenidas en el segundo screening se procedió al aislamiento del DNA de fago tal y como se detalla en el siguiente protocolo:

- Se preparó un cultivo de células E. coli XL1-BLUE P2 en medio LB con un 20% de maltosa y MgSO4 10mM.

- Posteriormente a la inoculación se incubó a 37°C hasta que la Abs600 fue aproximadamente de 0,5.

- Una vez se tuvo el cultivo celular preparado, se realizó la infección con 50μL de lisado

de fago incubando la mezcla a 37°C con agitación durante aproximadamente 30 minutos.

- Finalizado el tiempo de incubación se añadió la mezcla anterior a un erlenmeyer

conteniendo 100 mL de medio LB, 10 μL de DNAsa/RNAsa y MgSO4 10mM y se realizó

una nueva incubación a 37°C durante la noche.

- Transcurrido este tiempo se añadieron 500 μL de cloroformo a los 100 mL anteriores,

incubándose a 37°C durante 15 minutos. - Centrifugar a > 8000 x g durante 10 minutos descartando el precipitado que

corresponde a los desechos celulares. - Finalizado el proceso, se guardaron 50 mL del lisado y el resto (150 mL) se pasó a

tubos de centrífuga.

Posteriormente se aplicó el kit de aislamiento de DNA de fago MAXI Lambda Kit de QIAGEN resuspendiéndose el DNA en agua ultrapura estéril. 3.4.11. Secuenciación de fagos positivos. Utilizando el método de secuenciación descrito en el apartado 3.4.5, se procedió a realizar la secuenciación de los fagos que dieron señal positiva tras la hibridación. Puesto que se trata de DNAs


grandes se realizaron modificaciones en el programa de PCR para secuenciación, que consistieron en la desnaturalización previa del DNA a secuenciar y en un aumento del número de ciclos de hibridación con el oligonucleótido utilizado en la secuenciación. La estrategia que se siguió fue la secuenciación por Primer Walking (paseo con oligonucleótidos), en la que se fueron diseñando diferentes oligonucleótidos a lo largo de la secuencia obtenida de la NAD-glutamato deshidrogenasa. 3.4.12. Análisis de secuencias. Las secuencias se trataron con el grupo de programas GCG (Genetics Computer Group) de la Universidad de Wisconsin, a los que se accedió a través del nodo español de EMBL (Centro Nacional de Biotecnología de la Universidad Autónoma de Madrid).

Para realizar la comparación del producto de PCR con el que se había buscado en la genoteca construida en fago lambda, se utilizó el programa BESTFIT y GAP en los que se realiza la comparación de 2 secuencias indicadas previamente. La traducción de las secuencias a aminoácidos se realizó con el programa MAP. El programa proporciona los 6 posibles marcos de lectura de la secuencia. Se trabajó tanto con los seis marcos como con los ORFs (Open Reading Frame), es decir las secuencias que codificarían para una proteína, con comienzo en ATG (metionina) y finalización en uno de los codones de terminación: TAA, TAG o TGA.

Se utilizó el programa FASTA, que emplea el método de Pearson y Lipman (1988), para buscar

el porcentaje de similaridad y de identidad entre una secuencia y un grupo de secuencias del mismo tipo (ácidos nucleicos o proteínas), se comparó la secuencia con las bases de datos SwissProt y PIR.

Los alineamientos múltiples con otras secuencias procedentes de las bases de datos se realizaron con el programa CLUSTALW (Thompson y col., 1994).

Los parámetros bioquímicos como la composición aminoacídica, la masa molecular teórica de

subunidad, el índice alifático, etc. se calcularon con ayuda del programa PROTPARAM TOOL del Servidor EXPASY (Swiss Institute of Bioinformatics).


La estimación de los codones más frecuentemente utilizados en la NAD-GDH de Hfx.

mediterranei se realizó con el programa CODONFRECUENCY también del paquete informático GCG. La tabla, se completó visualmente mediante la correspondencia con la compilación propuesta por Soppa (1994).

La predicción de la estructura secundaria se realizó con los programas PSIPREDICTION

(McGuffin y col., 2000) (Proteomic Tools Secondary Structure Prediction) de Expasy Molecular Biology Server del Swiss Institute of Bioinformatics, y con el programa PREDATOR (Frishman, y Argos, 1996; 1997) (Protein Secondary Structure Prediction from a single sequence or a set of sequence) de Network Protein Sequence analysis del Pôle Bioinformatique Lyonnais. 3.4.13. Construcción del modelo estructural de NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei.

Para realizar el modelo atómico se escogió la estructura tridimensional disponible de Thermotoga

marítima y el alineamiento con otras GDHs como guía para introducir pequeñas inserciones o delecciones en el lugar adecuado utilizando el programa FRODO (Jones y col., 1985). La visualización del monómero de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei y de la imagen tridimensional del motivo de unión del 2-oxoglutarato, se realizó con el programa Swiss-Pdb Viewer 3.51 de Glaxo Welcome Experimental Research.

Para la representación de la imagen tridimensional de la estructura del monómero se empleó el

programa RasWin Molecular Graphics v2.6.

3.5. CLONAJE DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. mediterranei. Una vez se obtuvo el fago que contenía el gen que codificaba para la NAD-GDH de Hfx.

mediterranei, se procedió a la amplificación del gen a partir del DNA de fago y se realizó su clonaje en un vector que permitiera su incorporación como si se tratase de un producto de PCR.


Puesto que el objetivo final era realizar la expresión del gen, se diseñaron 2 oligonucleótidos que contenían los sitios de corte para las enzimas de restricción NdeI y BamHI, con el fin de facilitar el clonaje en el vector de expresión pET3a.

3.5.1. Amplificación mediante PCR del gen que codifica la NAD-GDH de Hfx. mediterranei. Para realizar la amplificación del gen se utilizó el DNA de fago y los 2 oligonucleótidos que contenían las secuencias de corte para BamHI y NdeI. La secuencia de dichos oligonucleótidos fue la siguiente:

Nad-gdhFOR 5’ GCCACTCGACATATGCAGAC 3’ Nad-gdhREV 5’ GAGTGCAGACCTAGGGAG 3’

Se muestran en negrita las secuencias de restricción para las enzimas NdeI y BamHI. La reacción de PCR se preparó de la siguiente manera:

Reacción Reacción Control

H2O ultrapura 62,9 66,9

Tampón PCR 10X 10 10

MgCl2 (50mM) 3 3

dNTPs 1,6 1,6

Nad-gdhFOR 8,4 8,4

Nad-gdhREV 8,4 8,4

Fago 14-7 4 ------

DMSO 1,2 1,2

EcoTaq 0,5 0,5

Volumen total (μL) 100 100


El equipo de PCR utilizado fue un “Gene Amp PCR System 2400” de Applied Biosystems, y las condiciones de la reacción fueron las siguientes:

Figura 4: Programa de amplificación de PCR con los oligonucleótidos Nad-gdhFOR y Nad-gdhREV.

3.5.2. Electroforesis en gel de agarosa, purificación de la banda y secuenciación. Para comprobar la especificidad de la amplificación, se realizó un gel de agarosa como se describe en el apartado 3.4.3. La banda de interés se recortó a partir del gel de agarosa y se purificó con el kit “GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit” de Amersham Pharmacia Biotech. Una vez purificada se secuenció con los oligonucleótidos utilizados para la amplificación del gen, comprobando de ésta forma que el gen se encontraba completo y sin mutaciones. 3.5.3. Ligación del producto de PCR correspondiente al gen de la glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei en el vector de clonaje pCR2.1.

El vector utilizado fue pCR2.1 (kit TA-Cloning, Invitrogen). Dicho vector (Figura 5) es un plásmido de 3,9 Kb, confiere resistencia a ampicilina y kanamicina y contiene el origen de replicación junto con una

porción del gen lac Z de E. coli. Ese fragmento codifica los primeros 146 aminoácidos de la β-

galactosidasa para la α-complementación.

96°C 96°C

53°C

72°C 72°C3 min 1 min2 min 7 min

1 min35 ciclos


Figura 5: Mapa del vector de clonaje pCR 2.1.

Además, el kit proporciona el plásmido en forma lineal y con dos residuos de timina (T) en los

extremos 3’ (Figura 6). Esto permite una ligación muy eficiente del producto de PCR con el vector, ya que en el programa de PCR empleado para amplificar el gen se incluye un tiempo de elongación, en el que la polimerasa añade residuos de adenina en el extremo 3’ del producto de PCR.

Figura 6: Esquema de la ligación del plásmido pCR2.1 y el producto de PCR.

pCR®2.13 9 Kb


La enzima empleada para la ligación fue la T4 DNA ligasa (Invitrogen) de la que se utilizaron 1U, y la reacción se llevó a cabo a 14°C durante 16 horas.

3.5.4. Transformación en E. coli NovaBlue.

3.5.4.1. Cepa E. coli novaBlue:

La cepa Escherichia coli NovaBlue fue suministrada, en forma de células competentes, por la casa comercial Novagen. Dicha cepa carece del gen de la T7 RNA polimerasa, por lo tanto el huésped no se emplea para expresar sino para clonar. El genotipo de esta cepa es el siguiente:

Nova Blue: end A1, hsd R17 (rK12−,mK12

−), sup E44, thi1, rec A1, gyr A96, rel A1, lac F’ [pro A+B+,

lac 1q ZΔM15: Tn 10 (TcR)]

El significado de los marcadores genéticos es el siguiente:

- end A1: mutación en endonucleasa A. Aumenta la calidad del DNA aislado a partir de ésta cepa, impidiendo su degradación.

- hsd R17 (rK12−,mK12

−): mutación que proporciona la pérdida en la actividad de restricción,

pero no de modificación de la enzima Eco K, una enzima de restricción tipo I. El DNA clonado será metilado, y por tanto protegido frente a la restricción si el vector fuera después introducido en una cepa hsd +.

- sup E44: incluye un supresor para las mutaciones ámbar (mutaciones que convierten cualquier codón en el codón de terminación UAG) del tRNA. El supresor inserta una glutamina en el codón UAG.

- thi1: mutación en el metabolismo de la tiamina. Cuando se crece en medio mínimo éste microorganismo requiere la presencia de tiamina ya que es incapaz de sintetizarla.


- rec A1: mutación en una ATPasa DNA dependiente, esencial para la recombinación genética en E. coli. Previene la recombinación del DNA introducido con el DNA de la célula, asegurando la estabilidad de los insertos.

- gyr A96: mutación en DNA girasa. Confiere resistencia al ácido nalidíxico, que en condiciones normales inhibiría la actividad enzimática.

- rel A1: mutación que elimina el factor estricto que actúa en la inhibición de síntesis de rRNA cuando se detiene la síntesis de proteínas. Esta mutación permite la síntesis de rRNA en ausencia de síntesis de proteínas.

- F’: contiene el episoma F’, plásmido de E. coli con fragmentos del cromosoma bacteriano. El episoma F’ posee las características que se marcan entre corchetes cuyo significado es:

pro A+B+: mutación en el metabolismo de la prolina. Cuando se crece en medio mínimo este microorganismo requiere la presencia de prolina, ya que es incapaz de sintetizarla.

lac 1q: mutante del gen lac l que sintetiza aproximadamente diez veces más represor que el tipo salvaje. Esta superproducción del represor inhibe la transcripción del operón lac en ausencia de inductor.

lac ZΔM15: mutación por deleción que elimina las secuencias del gen lac

Z que codifica para la porción amino-terminal de la β-galactosidasa. El

péptido expresado puede formar parte en la α-complementación para

formar la β-galactosidasa activa.

Tn 10 (TcR): transposón que confiere resistencia frente a tetraciclina.

3.5.4.2. Transformación de E. coli con el producto de la ligación.

La transformación de E. coli NovaBlue se llevó a cabo mediante un shock térmico, siguiendo el siguiente protocolo (Novagen, 1999):


- Las células competentes guardadas a –80°C se descongelaron lentamente en hielo.

- Una vez descongeladas, se añadió a las células 2 μL del producto de la ligación (plásmido

con inserto), y se incubó durante 5’ en hielo. - Posteriormente, se sometieron las células a un shock térmico introduciéndolas en un baño a

42°C durante 30 segundos, y se transfirieron inmediatamente a hielo, donde se mantuvieron durante 2 minutos.

- A continuación, se añadieron 80 μL de SOC (apéndice I) a temperatura ambiente, y se

incubó a 37°C durante 60 minutos a 220 rpm en un agitador orbital.

- Por último, se sembraron volúmenes entre 10-100 μL del medio anterior en placas de LB

con kanamicina 50 μg/mL, IPTG 0,5 mM y X-Gal 0,01% (apéndice I), y se dejaron crecer a

37°C durante 14-16 horas.

Además de la transformación con el producto de la ligación, se realizaron dos controles. El primer control consistió en transformar las células con un plásmido sin inserto. Y en el segundo control se siguió todo el proceso de transformación pero sin añadir ningún tipo de DNA.

3.5.5. Análisis de transformantes: Aislamiento y purificación de plásmidos.

La identificación de colonias que poseían plásmido con inserto se realizó mediante α-

complementación. Como ya se ha comentado en el apartado 3.5.3., el plásmido pCR2.1 contiene un pequeño segmento del DNA de E. coli que contiene las secuencias reguladoras y la información que

codifica para los 146 primeros aminoácidos del gen de la β-galactosidasa (lac Z). Incluido en esta

secuencia, existe un sitio de inserción múltiple, que no interrumpe la lectura del gen pero que añade un

pequeño número de aminoácidos en el fragmento amino-terminal de la β-galactosidasa. La síntesis de

este fragmento está inducida por IPTG (isopropiltio-β-D-galactósido). Los vectores de este tipo se

emplean en células hospedadoras que codifican la porción carboxi-terminal de la β-galactosidasa,

también inducido por IPTG, como ocurre con las NovaBlue. Aunque ninguno de los dos fragmentos son activos por separado, se pueden asociar para formar la enzima activa, en lo que se conoce como

α-complementación o complementación en trans. Las bacterias Lac+ resultantes de la α-


complementación son fácilmente reconocibles porque forman colonias azules en presencia del sustrato X-

Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-galactósido). Sin embargo, la inserción de un fragmento de DNA extraño

en el sitio de inserción del plásmido, da lugar a un fragmento amino-terminal incapaz de producir α-

complementación. Las bacterias que lleven los plásmidos recombinantes formarán por lo tanto colonias blancas. El análisis de transformantes se llevó a cabo por el aislamiento y purificación de plásmidos. Para ello, se seleccionaron 10 colonias blancas (con inserto), las cuales se crecieron individualmente en medio

líquido LB (apéndice I), con ampicilina (50 μg/mL), durante toda la noche a 37°C en un agitador orbital.

La purificación de los plásmidos se realizó a partir de 3 mL de cultivo, y empleando el kit CONCERTTM Rapid Plasmid Miniprep System de Gibco BRL (Life Technologies). La pureza de los plásmidos se determinó espectrofotométricamente mediante la relación A260/A280, empleando un espectrofotómetro Ultraspec 2000 suministrado por Pharmacia Biotech. Todos los clones se conservaron a –80°C en presencia de glicerol como agente crioprotector. Se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1% (apartado 3.4.3.) para analizar los plásmidos aislados, pudiendo diferenciar aquellos que tienen inserto mediante comparación con el plásmido pCR2.1 sin inserto. 3.5.6. Secuenciación de los plásmidos con inserto. Con el fin de conocer la secuencia insertada en el plásmido pCR2.1 se procedió a la secuenciación de los plásmidos con inserto, utilizando los oligonucleótidos universales de plásmido M13For y M13Rev, tal y como se describe en el apartado 3.4.5.


3.5.7. Digestión mediante las enzimas de restricción NdeI y BamHI, del plásmido que contiene el gen de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei. Tanto el plásmido con inserto seleccionado como el vector de expresión pET3a, se digirieron con las enzimas de restricción NdeI (Fermentas) y BamHI (Promega). Las secuencias de reconocimiento de estas enzimas de restricción son las siguientes:

CATATG GGATCC GTATAC CCTAGG

Figura 7: Sitios de corte de las enzimas de restricción NdeI y BamHI.

Los tampones para estas enzimas difieren en la concentración de NaCl que contienen. Debido a ello la digestión se llevó a cabo en dos etapas.

En primer lugar se digirió con la enzima que mejor trabaja en el tampón de menos fuerza iónica, es decir, BamHI durante 2 horas a 37°C. Posteriormente, se añadió la cantidad apropiada de NaCl a la segunda enzima, es decir, NdeI incubándose a 37°C durante la noche. La cantidad aproximada de DNA

digerido fue de 1,5 μg. Transcurrido ese tiempo se inactivaron las enzimas incubando la digestión a 95°C

durante 10 minutos. Se realizó una electroforesis en gel de agarosa tal y como se describe en el apartado 3.4.3. en la que se cargó el volumen total de cada digestión (tubo control y tubo con plásmido + inserto). De este modo, se comprobó que el inserto tenía el tamaño esperado y que la digestión se había efectuado con éxito.

NdeI BamHI


Posteriormente, se recortó la banda perteneciente al inserto (gen de la NAD-glutamato deshidrogenasa). La banda se purificó con el Kit GFXTM PCR suministrado por la casa comercial Amersham Pharmacia Biotech.

3.5.8. Ligación del gen de NAD-GDH en el vector de expresión pET3a. El gen de la glutamato deshidrogenasa se introdujo en el vector de expresión pET3a previamente digerido como se indica en el apartado anterior. El tamaño del plásmido de es 4640pb. En la Figura 8 se muestra el mapa del vector pET3a.

Figura 8: Mapa del vector de expresión pET3a.

Para llevar a cabo la ligación, se mantuvo una relación vector: inserto de 1:2. La concentración

de plásmido lineal y de inserto se determinó espectrofotométricamente. La enzima empleada fue la T4 DNA ligasa realizándose la ligación en un baño termostatizado a 16°C durante 16 horas aproximadamente.

BamHI (510)

NdeI (560)


3.5.9. Transformación en E. coli NovaBlue con el plásmido pET3a. La reacción de la ligación se empleó para transformar la cepa E. coli NovaBlue (Novagen). Para ello se siguió el protocolo descrito en el apartado 3.5.4. utilizando en este caso placas LB agar y

ampicilina (50 μg/mL), ya que los plásmidos sólo confieren resistencia frente a dicho antibiótico.

3.5.10. Análisis de transformantes: Aislamiento y purificación de plásmidos. El análisis de los transformantes se llevó a cabo de la misma forma que en el apartado 3.5.5. En este caso, la diferenciación no pudo realizarse mediante diferencia de color puesto que los vectores de expresión no contienen la porción del gen lac Z de E. coli. Por esta razón se analizaron todas las colonias

obtenidas creciéndose en medio LB líquido con ampicilina (50 μg/mL) para la purificación de los

plásmidos.

El aislamiento del DNA plasmídico se realizó con el kit CONCERTTM Rapid Plasmid Miniprep System de Gibco BRL (Life Technologies) del mismo modo que se realizó en el apartado 3.5.5. Mediante electroforesis en gel de agarosa tal y como se describe en el apartado 3.4.3. se comprobó si los plásmidos aislados tenían inserto, además de observar su pureza y concentración. Se realizó la secuenciación de los plásmidos con inserto y se comprobó que la glutamato deshidrogenasa se había clonado sin mutaciones.

3.5.11. Transformación en E. coli BL21 (DE3).

3.5.11.1. Cepa E. coli BL21 (DE3):

La cepa E. coli BL21 (DE3) fue suministrada en forma de células competentes por la casa comercial Novagen. Se empleó como huésped de expresión esta cepa ya que contiene una copia cromosómica del gen de la T7 RNA polimerasa bajo el control del promotor lacUV5, pudiendo inducir la expresión por adición de IPTG.


El genotipo de dicha cepa es:

BL(21)DE3: F- omp T, hsd SB (rB-, mB-), gal, dcm, (DE3). El significado de los marcadores genéticos es el siguiente:

- F-: cepa que no contiene el episoma F. - omp T: mutación que produce la carencia de una proteasa, lo que favorece la obtención de

proteínas recombinantes intactas. - hsd SB (rB-, mB-): mutación que elimina tanto la restricción como la metilación del DNA en la

secuencia TGA(N)8TGCT. - gal: indica la incapacidad de esta cepa para emplear galactosa. - dcm: mutación en la citosina metilasa. Bloquea la metilación de la citosina en la secuencia

5’....GmGAGG....3’ ó 5’....CmCTGG....3’. - (DE3): el gen que codifica la T7 RNA polimerasa está integrado en el genoma del

microorganismo. 3.5.11.2. Transformación de E. coli BL21 (DE3) con el plásmido pET3a con inserto.

La transformación se llevó a cabo de la misma forma que se describe en el apartado 3.5.4. utilizándose 50 ng de plásmido purificado. El crecimiento de células se realizó en placas LB agar con

ampicilina (50 μg/mL).

En este caso, todos los transformantes obtenidos tenían plásmido con inserto puesto que la

transformación se realizó con un plásmido purificado.


3.6. EXPRESIÓN Y LOCALIZACIÓN DE LA NAD-GDH RECOMBINANTE. 3.6.1. Crecimiento e inducción.

La inducción de la expresión del gen de la NAD-GDH se realizó mediante el protocolo que se describe a continuación (Novagen, 1999):

- Con una colonia seleccionada al azar, se sembraron 3 mL de medio de cultivo LB con

ampicilina (50 μg/mL), y se incubó a 37°C a 225 rpm en un agitador orbital, hasta una

densidad óptica a 600 nm (DO600) de 0,5.

- A continuación, se sembraron con dicho cultivo, 100 mL de LB con ampicilina (50 μg/mL),

incubándose a 37°C con agitación hasta alcanzar una DO600 entre 0,5-1. - Una vez crecido el cultivo, se guardó una alícuota de 5 mL para llevar a cabo el test de

estabilidad de plásmido y conservar el clon.

- Al resto del cultivo se añadieron 400 μL de IPTG 1 mM para obtener una concentración final

de 0,4 mM, incubándose con agitación a 37°C durante 3 horas.

3.6.2. Conservación de las células y test de estabilidad del plásmido.

Las células se conservaron a –80°C en presencia del agente crioprotector glicerol. Para ello se

transfirieron 900 μL, de la alícuota recogida antes de inducir, a un criovial y se añadieron 100 μL de

glicerol al 80% (apéndice I). Test de estabilidad del plásmido

El uso de ampicilina como antibiótico de selección requiere un cuidado adicional, ya que durante

el cultivo las células pueden segregar al medio pequeñas cantidades de β-lactamasa. Además, la

ampicilina es susceptible de hidrolizarse bajo condiciones ácidas creadas por el propio metabolismo de


las bacterias. Por lo tanto, durante el crecimiento se puede perder la selección por ampicilina, y podrán crecer células que pierdan el plásmido.

Con el fin de determinar la cantidad de células que contenían el plásmido que se deseaba expresar, se realizó un test de estabilidad. Éste consiste en sembrar una determinada dilución de las células, antes de inducir, en placas de LB con distintos aditivos, ampicilina, IPTG, y ampicilina más IPTG (Novagen, 1999).

En las placas que no contienen ni ampicilina ni IPTG crecerán todas las células viables; en presencia de ampicilina, sólo crecerán aquellas células que conserven el plásmido; con IPTG, crecerán aquellas que han perdido el plásmido; y en presencia de ampicilina e IPTG, solo crecerán mutantes que contienen el plásmido, pero que han perdido la capacidad para expresar el gen deseado.

En un cultivo típico, todas las células crecerán en ausencia de aditivos y en presencia de

ampicilina, menos de un 2% crecerán en las placas con IPTG, y menos de un 0,01% crecerán en presencia de IPTG y ampicilina. Si el plásmido empleado es inestable, la fracción de células que ha perdido dicho plásmido, se verá reflejada por un aumento de colonias en presencia de IPTG y un descenso en presencia de ampicilina. Y si aparecen mutantes que retienen el plásmido, pero que han perdido la capacidad para expresar el gen deseado, se verá reflejado por un aumento de colonias en presencia de IPTG más ampicilina, pero este caso es poco frecuente. 3.6.3. Obtención de fracciones celulares y localización de la proteína expresada.

Las distintas fracciones celulares que se analizaron con el fin de comprobar si se había expresado la glutamato deshidrogenasa y cual era su localización, fueron:

- Fracción celular total - Fracción periplasmática - Fracción citoplasmática soluble - Fracción citoplasmática insoluble o cuerpos de inclusión


Para localizar la proteína expresada se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes. A continuación se describe el método empleado para aislar cada una de las fracciones y para preparar las muestras para la electroforesis:

3.6.4. Fracción celular total.

La fracción celular total se obtuvo del siguiente modo: - Se transfirió a un eppendorf 1 mL de cultivo procedente del cultivo inicial (apartado 3.8.1) y

se centrífugo a 10000 x g durante 1 minuto, descartándose el sobrenadante.

- El precipitado obtenido, se resuspendió en 100 μL de PBS (apéndice I). Posteriormente se

añadieron 100 μL de 2X sample buffer (apéndice I), mezclándose en el vortex.

- La mezcla se sonicó con un sonicador VirSonic 475 durante 15 segundos, 8-10 veces con una amplitud de 16-18 microns.

- A continuación, se incubó a 80-85°C durante 5-10 minutos para desnaturalizar las proteínas. Posteriormente, se dejó enfriar y se guardó a –20°C hasta que se realizó la electroforesis en poliacrilamida.

3.6.5. Fracción periplasmática.

La fracción periplasmática se obtuvo mediante un shock osmótico (Connaris y col., 1998) del siguiente modo:

- Se centrifugó el resto del cultivo a 6500 x g durante 15 minutos recogiéndose el precipitado

obtenido. - Se resuspendió el precipitado en 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 con sacarosa 20% (p/v) hasta

llegar a una densidad óptica a 600 nm de 3-5. Se incubó posteriormente en hielo durante 10 minutos.

- Seguidamente, se centrífugo a 11000 x g durante 2 minutos a 4°C y se eliminó el sobrenadante.


- El precipitado se resuspendió en 20 mM Tris-HCl pH 8,0 y se incubó en hielo durante 10 minutos.

- Transcurrido ese tiempo, se centrífugo a 10000 x g durante 10 minutos a 4°C. - El sobrenadante (fracción periplásmática) se transfirió a un vaso de precipitados, y el

precipitado se conservó en hielo hasta el siguiente paso. - Se tomó 1 mL de dicho sobrenadante y se concentró con ácido tricloroacético al 100% (p/v)

y se lavó con acetona varias veces.

3.6.6. Fracción citoplasmática.

La fracción citoplasmática se obtuvo mediante una adaptación del protocolo propuesto por Connaris y col., (1998). Debido a la elevada densidad de los cuerpos de inclusión, las fracciones soluble e insoluble citoplasmática, se pueden separar por una simple centrifugación. A continuación se describe el método empleado para obtener cada una de las fracciones:

3.6.6.1. Fracción citoplasmática soluble.

- El precipitado procedente de la fracción periplasmática se resuspendió en 8 mL de 20 mM

Tris-HCl pH 7,4 con 2 M NaCl y 1 mM EDTA (tampón A).

- Una vez resuspendido, se añadieron 80 μL de lisozima preparada a una concentración de

10 mg/mL y 800 μL de Tritón X100 al 1% incubándose a 30°C durante 1 hora. Con éste

paso se facilita la ruptura de la membrana de las células y se solubilizan los lípidos de membrana. Además de eliminar impurezas asociadas a los cuerpos de inclusión (Misawa y Kumagai, 1999).

- Transcurrido este tiempo, la mezcla se incubó en hielo durante 15 minutos. Después se sonicó con un sonicador VirSonic 475 durante 15 segundos entre 8 y 10 veces con una amplitud de 16-18 microns.

- A continuación se centrifugó a 14000 x g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante obtenido (fracción soluble citoplasmática) se transfirió a un vaso de precipitados, y el


precipitado (fracción insoluble citoplasmática o cuerpos de inclusión) se conservó en hielo hasta el siguiente paso.

- Finalmente se tomó 1 mL de sobrenadante y se precipitó con ácido tricloroacético del mismo modo que en el apartado anterior.

3.6.6.2. Fracción citoplasmática insoluble o cuerpos de inclusión.

El precipitado obtenido en el paso anterior se lavó dos veces con 4 mL del tampón A, para ello

se centrifugó a 10000 x g durante 5 minutos, y se descartó el sobrenadante. Mediante este paso se consiguieron eliminar algunos contaminantes.

- El precipitado obtenido se solubilizó con 8 mL de 20 mM Tris-HCl pH 8,0 conteniendo 8 M

urea, 50 mM DTT y 2 mM EDTA (tampón de solubilización) a 37°C.

- Para preparar la muestra para la SDS-PAGE, se transfirieron 100 μL de la muestra anterior

a un eppendorf y se añadieron 100 μL de 2XSB (apéndice I). Posteriormente, se incubó la

muestra a 80-85°C durante 5-10 minutos, y se guardó a –20°C, hasta su uso. Estas fracciones se aislaron tanto de los cultivos empleados como control (células transformadas

con plásmido sin inserto) como de los cultivos empleados para la expresión de la glutamato deshidrogenasa.

3.7. SOLUBILIZACIÓN DE LOS CUERPOS DE INCLUSIÓN Y RENATURALIZACIÓN DE LA NAD-GDH RECOMBINANTE. 3.7.1. Solubilización de los cuerpos de inclusión. Para solubilizar los cuerpos de inclusión se emplearon agentes caotrópicos con alto poder desnaturalizante y detergentes.


Además, los tampones utilizados pueden contener un agente reductor, como el DTT, el DTE o el

β-mercaptoetanol, para evitar la formación de puentes disulfuro entre residuos de cisteína, agentes

quelantes de metales como el EDTA e inhibidores de proteasas como el PMSF (Rudolph y col., 1997).

En nuestro caso, los cuerpos de inclusión se solubilizaron en dos tampones distintos diferenciándose en el agente caotrópico empleado. Por un lado Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, conteniendo urea 8 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM y por otro Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, conteniendo cloruro de guanidinio 6 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM.

En los dos casos fue necesario incubar los cuerpos de inclusión a 37ºC para conseguir su total

solubilización.

3.7.2. Renaturalización de la NAD-GDH recombinante. Para la renaturalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei se realizaron diferentes ensayos y se probaron distintas vías de renaturalización. Se varió la composición del tampón: Gly-NaOH, fosfato y Tris-HCl; el pH del tampón de renaturalización (rango de 7 a 9), el factor de dilución (1:10-1:20) y el modo de realizar la dilución (dilución rápida y diálisis). Puesto que la glutamato deshidrogenasa es una enzima halofílica, todos los tampones empleados contenían una elevada concentración de sal (NaCl o KCl). 3.7.3. Renaturalización mediante diálisis. Se dializaron 3 mL de cuerpos de inclusión solubilizados en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, conteniendo urea 8 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM, frente a tampón Gly-NaOH 100 mM, pH 8,0, conteniendo 3,25 mM EDTA y 4 M NaCl y además con Tris-HCl 100 mM pH 8,0, 3,25 mM EDTA y 4 M NaCl, con el fin de renaturalizar la enzima. Para ello se emplearon bolsas de diálisis Sigma y se dializó frente a un volumen de tampón 100 veces mayor, con un total de 3 cambios de tampón. Una vez acabada


la diálisis se realizaron medidas de actividad para comprobar si la NAD-glutamato deshidrogenasa se había renaturalizado. 3.7.4. Renaturalización mediante dilución.

Se realizaron ensayos de renaturalización mediante dilución rápida empleando distintos tampones y diferentes condiciones de dilución.

Con el fin de determinar las condiciones óptimas en el proceso de renaturalización, se realizaron diferentes ensayos de renaturalización de la enzima bajo distintas condiciones: diferentes diluciones, distintas sustancias tamponantes, composición y concentración de sales, pH y la influencia de la presencia del agente quelante EDTA. En cada caso se siguió el proceso de renaturalización mediante la determinación de la actividad enzimática en alícuotas tomadas cada cierto tiempo. Una vez solubilizados los cuerpos de inclusión en tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, conteniendo urea 8 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM se realizaron los siguientes ensayos:

- Se realizó una dilución 1:20 de los cuerpos de inclusión solubilizados, utilizando una serie de tampones:

Gly-NaOH 100 mM, pH 8,0, 3,25 mM EDTA, NaCl 4 M. Gly-NaOH 100 mM, pH 8,0, 3,25 mM EDTA, KCl 4 M. Gly-NaOH 100 mM, pH 8,0, NaCl 4 M. Gly-NaOH 100 mM, pH 8,0, 3,25 mM EDTA (con NaCl 3 M, 2 M y 1 M) Tris-HCl 100 mM, pH 7,3, Gly-NaOH 100 mM, pH 8,0, NaCl 4 M. Tris-HCl 20 mM suplementado con sulfato de sodio 1 M, pH 8,5. Fosfato de sodio 100 mM , pH 7,0, NaCl 4 M., Sulfato de amonio 2,5 M pH 7,0.


3.7.5. Medida de la actividad enzimática y de la concentración de proteína. El proceso de renaturalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa recombinante se siguió mediante la medida de la actividad enzimática como se describe en el apartado 3.1.3 y la determinación de la concentración de proteína se realizó mediante el método de Bradford (1976) tal y como se describe en el apartado 3.1.4.

3.8. PURIFICACIÓN DE LA NAD-GDH RECOMBINANTE. La purificación de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei se llevó a cabo en dos pasos que se describen a continuación:

3.8.1. Precipitación en presencia de sulfato amónico. El primer paso de la purificación consistió en una precipitación de las proteínas no halofílicas en presencia de sulfato amónico, quedando la proteína halofílica, NAD-GDH, en solución. Tras realizar la renaturalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa, se adicionó sulfato amónico hasta alcanzar una concentración de 2,5 M; centrifugando a 27000xg durante 30 minutos se obtuvo un precipitado correspondiente a las proteínas no halofílicas y un sobrenadante en el que se encontraba la NAD-glutamato deshidrogenasa. 3.8.2. Cromatografía en DEAE-Celulosa.

La preparación de la columna se llevó a cabo como sigue: Se pesaron 7,5 g de DEAE-celulosa fast flow (Sigma), resuspendiéndose en HCl 0,5 M e

incubándose durante 30 minutos y removiendo la mezcla cada 5 minutos aproximadamente. A continuación se realizó un lavado con agua destilada hasta alcanzar un pH neutro y se eliminaron las partículas más pequeñas con una pipeta Pasteur. Seguidamente se repitió el mismo proceso utilizando


NaOH 0,5 M. Al acabar, se empaquetó una columna de 2,5 x 10 cm (Sigma), y se equilibró con tampón fosfato 50 mM pH 6,6 que contenía (NH4)2SO4 2,5 M y EDTA 1 mM a temperatura ambiente.

Una vez equilibrada la columna, se introdujo el sobrenadante obtenido en el paso anterior con

ayuda de una bomba peristáltica LKB Pump P-1 (Pharmacia Biotech) a una velocidad de flujo de 55 mL/h recogiéndose fracciones de 10 mL. La proteína retenida, se lavó con dos volúmenes de columna con el tampón anterior. La elución se realizó con tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 conteniendo 4 M NaCl.

3.9. ANÁLISIS MEDIANTE NANOELECTROSPRAY LC/MS DE LA NAD-GDH NATIVA. Con la finalidad de obtener la secuencia correspondiente al extremo N-terminal, se realizó un ensayo de identificación y caracterización de la proteína a través de su análisis peptídico. Para llevar a cabo la digestión del monómero con tripsina, se realizó una diálisis previa frente a 100 mM de hidrógeno carbonato de amonio pH 8,5, a 4°C durante la noche con un volumen 100 veces mayor y se realizaron 3 cambios de tampón cada hora. Posteriormente se llevó hasta una concentración

de 30 μg/mL en un evaporador Eppendorf concentrator 5301. Para esta diálisis se utilizaron cassettes de

diálisis Slide-A-Lyzer de la casa Pierce especiales para volúmenes de 0,5 a 3 mL con un límite de exclusión de 10000 Da.

La tripsina liofilizada grado análisis (Sigma) se reconstituyó disolviéndola en HCl 1 mM hasta una

concentración de 1 mg/mL. La NAD-GDH nativa purificada con una concentración de 30 μg/mL se digirió

con tripsina en una relación 1:20 (tripsina:enzima problema). La solución de tripsina se adicionó a la enzima dializada y se incubó la digestión a 37°C durante 18 horas. La tripsina realiza cortes preferentemente por el lado carboxilo de los residuos de lisina y arginina siendo mayor para arginina especialmente a pHs elevados.

La muestra se liofilizó para realizar su posterior análisis en las Instalaciones de Laboratorio

Agilent Technologies en Alemania analizándose con un sistema HPLC/MS NanoLC/Trap de Agilent


Technologies mod. 1100. con un volumen de inyección de 5 μL. Se utilizó un flujo de 10 μL/min. con una

fase móvil de 0,1% de ácido fórmico en agua.


4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

4.1. PURIFICACIÓN Y DE NAD-GDH NATIVA. El proceso utilizado en la purificación de la actividad glutamato deshidrogenasa nativa se realizó en diferentes etapas, siguiendo la metodología habitual de trabajo puesta a punto en nuestro departamento y que ha sido aplicada con éxito en la purificación de diferentes enzimas halofílicas, tales como: nitrato reductasa (Martínez-Espinosa, 2001), glucosa deshidrogenasa (Bonete y col., 1996), NADP-

glutamato deshidrogenasa (Ferrer y col., 1996), α-amilasa (Pérez-Pomares y col., 2003), todas ellas de

Hfx. mediterranei, isocitrato deshidrogenasa de Hfx. volcanii y Sulfolobus solfataricus (Camacho y col., 1995), malato sintasa e isocitrato liasa de Hfx. volcanii (Serrano y col., 1998), NAD y NADP-glutamato deshidrogenasa de Halobacterium salinarum (Bonete y col., 1986; Bonete y col.,1987). Además de todas las enzimas anteriormente mencionadas y que pertenecen a organismos del Dominio Archaea, también se han purificado mediante los mismos métodos enzimas halofílicas y termofílicas procedentes de organismos del Dominio Bacteria, tales como: NAD-glutamato deshidrogenasa de Thermus Thermophilus

(Ruiz y col., 1998), y las NAD-glutamato deshidrogenasas I y II de Salinibacter ruber (Bonete et al, 2003). 4.1.1. Cromatografía en Sepharosa 4B.

Esta cromatografía, realizada en primer lugar, se basa en las experiencias de Mevarech y col.,

1976 en las que utilizando geles de agarosa descubrieron que éstos eran capaces de absorber proteínas halofílicas cuando la concentración del medio era 2,5 M o superior de sulfato de amonio. En nuestro caso, se utiliza un gradiente lineal decreciente entre 2,5 y 0,5 M suplementando este último con un 20% en glicerol para evitar posibles pérdidas de actividad si la elución de la enzima se produce a concentraciones de sulfato de amonio que supongan una baja concentración salina. El glicerol puede ser un buen sustituyente de la sal, en cuanto a la estabilidad se refiere (Ferrer y col., 1996). La sustitución de iones salinos por otros compuestos en el disolvente, concretamente el glicerol, tiene un efecto estabilizante debido a que actúa de forma similar a los iones de tipo “salting-out”. Dicho efecto supone la exclusión del glicerol del volumen de hidratación alrededor de la proteína, favoreciendo su estado nativo (Zaccai y


Eisenberg, 1990). Como se observa en el cromatograma de la Figura 9, aparecen dos picos de actividad glutamato deshidrogenasa, que corresponden a la NADP-glutamato deshidrogenasa y a la NAD-glutamato deshidrogenasa objeto del presente estudio. La NADP-GDH eluye aproximadamente en las fracciones (215 a 225) que se corresponde con una concentración de sulfato amónico de (1,5 M), mientras que la NAD-GDH se separó en las fracciones de (227 a 239) a una concentración de sulfato amónico de (1,4 M).

Figura 9: Cromatografía en Sepharosa-4B utilizando un gradiente lineal de sulfato de amonio de 2,5 M a 0,5 M, representado en la Figura por la línea recta. En color azul se muestra la actividad NADP-GDH medida en tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,5 y NaCl 2M. Se representa en rojo la actividad NAD-GDH medida en tampón Gly-NaOH 0,1 M, pH 8,5 conteniendo NaCl 4M.

Las fracciones con mayor actividad, se reunieron y se utilizaron en las siguientes etapas

cromatográficas. Los valores de actividad y concentración de proteína son los que se muestran en la Tabla I. El factor de purificación conseguido en esta etapa fue de 10 respecto del extracto inicial. Puesto

fraction number

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

Abs

280

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Act

iv. U

/mL

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,0

Fracciones


que se trata de enzimas muy similares, se obtuvieron picos de elución en concentraciones muy cercanas de sulfato amónico.

Tabla I: Purificación de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei. El factor de

purificación y el rendimiento de cada etapa cromatográfica utilizada viene referido al extracto crudo inicial.

4.1.2. Cromatografía en Blue-Sepharosa. La muestra obtenida en el paso anterior de purificación se introdujo en una columna de Blue-Sepharosa, tal y como se indica en el apartado 3.1.7. Una vez introducida la muestra se lavó con un volumen igual al volumen total de gel. Comprobado que la enzima era retenida por la columna, se procedió a la elución de la proteína utilizando un tampón Tris-HCl 20 mM, pH 7,0 conteniendo NaCl 3 M. En este caso, se observó un pico de actividad en las primeras fracciones de elución, obteniéndose un factor de purificación muy elevado (Tabla I), indicando que la enzima quedaba retenida específicamente en la matriz. Además, esta etapa también permitió la concentración de la enzima. Esta cromatografía de pseudo-afinidad se basa en el uso de compuestos de triazina basados en colorantes textiles, como ligandos inmovilizados en Sepharosa. Estos colorantes contienen multiples grupos aromáticos y sulfonados confiriendo numerosas posibilidades de interacción. En este caso, se trata del colorante

Vol mL Actividad (U/ml)

U totales [prot] mg/ml

Actividad específica U/mg

Factor de purificación

rendimiento

Extracto 60 4,12 247 9,2 0,45 1 100

Sepharosa 4-B gradiente

89 1,74 155 0,37 4,70 10,4 63

Blue-Sepharosa

32 4,21 135 0,07 60 133 54

Sephacryl S-300 36 0,81 17 0,008 101 224 12


Cibacron-Blue F3GA que ha resultado de gran utilidad en la purificación de numerosas deshidrogenasas NAD-dependientes. Algunas de estas enzimas son: la NAD-GDH de Phycomyces spores (Van Laere, 1988), la GDH de P. furiosus (Klump, y col., 1992), y la NAD-GDH de Thermus thermophilus (Ruiz, y col., 1998). 4.1.3. Cromatografía en Sephacryl S-300. La muestra obtenida del paso cromatográfico Blue-Sepharosa se introdujo en tandas en la columna HiPrepR Sephacryl-S300, equilibrada como se indica en el apartado 3.1.8. El total del volumen introducido fue de 32 mL, recogiendo un volumen total de muestra purificada de 36 mL (Tabla I). Este paso, consiguió aumentar la actividad específica hasta 224 veces respecto del extracto inicial, permitiendo una purificación a homogeneidad de la enzima. Además, se aprovechó para el cálculo de la masa molecular de la enzima mediante el calibrado previo de la columna. En la Figura 10, se muestra el gel de electroforesis en poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, correspondiente a la purificación de la NAD-GDH nativa. Se observa una banda que se correponde con una masa molecular aproximada de 54 kDa.


Figura 10: Electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% en presencia de SDS. Calle 1: Patrones de Mr conocida (Fermentas)

Calles 2 y 3: NAD-glutamato deshidrogenasa nativa purificada.

4.2. SECUENCIACIÓN DEL EXTREMO N-TERMINAL. Para conocer el extremo N-terminal de la NAD-glutamato deshidrogenasa se realizó la secuenciación a partir de la banda de la enzima purificada y transferida a una membrana de nitrocelulosa. El análisis se realizó en el Centro de Biología Molecular de la Universidad Autónoma de Madrid. Los resultados no fueron concluyentes puesto que el amino-terminal parecía estar bloqueado.

4.3. AISLAMIENTO DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. mediterranei. Para realizar el aislamiento del gen de la NAD-GDH se utilizaron 2 oligonucleótidos degenerados, uno directo y otro reverso que se corresponde con secuencias consenso para glutamato deshidrogenasas. Los oligonucleótidos utilizados y el proceso empleado se describen el apartado 3.4.4. La amplificación se realizó a diferentes temperaturas de hibridación puesto que los oligonucleótidos se

45,0

116,0

66,2

35,0

25,0

18,4

14,4

kDa 1 2 3


encontraban degenerados. El resultado de los diferentes programas de PCR se muestra en la Figura 11, correspondiente a un gel de agarosa en el que se han cargado parte de las diferentes amplificaciones para observar las bandas amplificadas.

Figura 11: Electroforesis en gel de agarosa al 1%, en el que se muestran las diferentes amplificaciones a distintas temperaturas.

4.3.1. Secuenciación del producto de PCR. Análisis de secuencias.

Tras la secuenciación de las bandas purificadas detectamos un producto de PCR de un tamaño de 203 pb. La secuenciación de este producto de PCR se analizó mediante los programas del paquete informático GCG tal y como se describe en el apartado 3.4.12. El resultado del análisis en aminoácidos con el programa FASTA nos proporcionó homología con glutamato deshidrogenasas de las bases de datos.

El producto de PCR en bases fue el siguiente: 1 TGCCCAGGAG GCAGAACCCG TTCGAGGGTT GTTGAAGTCT CTGTCCCTCT 51 CAAACGGGAC AGATGGCGAA GTTGAGGTCT TCACCGGCTA TCGTGCACAA 101 CACGATAACG TTCGCGGGCC ATACAAGGGC GGACTCCGAT ACCATCCAGA 151 CGTGACCGCA GAGGAGTGTG TCGGGCTTTC GATGTGGATG ACCTGGAAGA - CCG

1 2 3 4 5 6

pb

1375 831

1904 2027 3530 4268 5148

564

1584

21226

200

400

50

250

100 150

300 350 500

Calle 1: Marcadores de peso molecular Marker III (Fermentas) Calle 2-5: Reacciones de amplificación a diferentes temperaturas con los olignucleótidos degenerados Calle 6: Marcadores de peso molecular de 50-500 pb. (Gibco)


En aminoácidos y comparado con las bases de datos nos mostró el siguiente resultado:

10 20 30 40 sus1rb.pep AQEANPFEWIVEVSVPLKRDDGEVEVFTGYRAQHDNVRGPY ||::|::|||| ||||||||||||:||||| S18609 TARRQLYHAASYLDIDQNIVERLKYPKKVHEVTIPIERDDGTVEVFTGYRAQHDSVRGPY 30 40 50 60 70 80 50 60 sus1rb.pep KGGLRYHPDSTAEECVGLSMWMTWKT ||||||||| | :|||||:|||||| S18609 KGGLRYHPDVTRDECVGLGMWMTWKCAVMDLPFGGAKGGVAVNPKELSPEE

90 100 110 120 130 140

El número de acceso S18609 corresponde a la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hbt.

salinarum con la que mostró un 81,8 % de identidad. Con la GDH de P. furiosus mostró un 56,9 % y un 55,2 % con la GDH de P. endeavori y con la GDH de P. horikoshii.

Una vez confirmado que el producto era GDH, el programa de PCR utilizado para obtener suficiente cantidad para marcarlo y utilizarlo como sonda, fue:

Figura 12: Programa de PCR para amplificar el producto utilizado como sonda.

96°C 96°C

49°C

72°C 72°C3 min 1 min2 min 7 min

1 min

30 ciclos


En la Figura 13 se observan las bandas obtenidas:

Figura 13: Electroforesis en gel de agarosa al 1%.

Calle 1: Marcadores de peso molecular de 50-500 pb. (Gibco) Calle 2 y 4: Producto de PCR de 203 pb. utilizado como sonda para realizar la búsqueda en la genoteca de Hfx. mediterranei

4.3.2. Marcaje no radiactivo del producto de PCR. DOT BLOT. El producto de PCR obtenido se marcó con digoxigenina siguiendo el método de “PCR DIG Probe Synthesis Kit” de Boehringer Mannheim tal y como se describe en el apartado 3.4.6. de Materiales y Métodos. Para estimar el rendimiento del marcaje se realizó un DOT BLOT. Esta es una técnica orientativa y necesaria para evitar el exceso de sonda en las hibridaciones que pueda dar lugar a ruido de fondo o a falsos positivos. Para realizar el DOT BLOT se depositaron en una membrana de nitrocelulosa diferentes diluciones del producto marcado, frente a diferentes diluciones conocidas de un DNA control proporcionado por la casa comercial.

pb 1 2 4 3

200

400

50

250

100 150

300 350 500


Control DNA Sonda de 203 pb. Figura 14: Placa autorradiográfica en la que se ha realizado la estimación del marcaje gracias a la distinta intensidad obtenida en función de la concentración de la sonda.

La dilución 1/1000 de la sonda presentó la misma intensidad que la DNA control con una

concentración de DNA marcado de 10 pg/μL. Dicha concentración se consideró adecuada por presentar

suficiente intensidad y un ruido de fondo muy bajo. Puesto que para realizar hibridaciones la

concentración óptima de sonda es de 15 ng/mL, se emplearon 1,5 μL del producto de PCR marcado por

mL de solución de hibridación preparada.

4.3.3. Hibridación de la genoteca con el producto de PCR de 203 pb. marcado.

La genoteca se amplificó consiguiendo obtener placas con una densidad de calvas que permitieron su selección por hibridación en placa y asegurando a su vez que todo el genoma se encuentra representado con una dilución óptima de 1:100. De la primera búsqueda de la genoteca se seleccionaron 12 fagos positivos (Figura 15). La segunda búsqueda se realizó con todos ellos, con 2 de los cuales se obtuvieron placas con todos los fagos positivos, indicando que se trata de fagos que contienen el gen de la glutamato deshidrogenasa.

1ng/μL 100pg/μL 10pg/μL 1pg/μL 0,1pg/μL

1/10 1/100 1/1000 1/10000 1/100000


Figura 15: Búsqueda en la genoteca de DNA genómico de Hfx. mediterranei en fago λ con la sonda de 203 pb. (A) Primera

búsqueda en la genoteca (B) Segunda búsqueda sobre las calvas aisladas de la primera búsqueda, todos los fagos son positivos.

Desde el desarrollo del primer fago λ recombinante (Campbell, 1971) en el que se comprobó que

para su viabilidad únicamente se requiere una tercera parte de su genoma, se ha llevado a cabo un detallado análisis de su estructura y función permitiendo emplearlo como vector de clonaje. Así mismo se han obtenido distintas variantes que deben de ser elegidas en función de: las enzimas de restricción empleadas y el tamaño del fragmento de DNA a insertar. La capacidad de desnaturalización y posterior hibridación que posee el DNA, ha sido aprovechado para la identificación de secuencias ya sea sobre células completas, virus, RNA, DNA, tejidos, etc. La optimización de los métodos de hibridación (Khandjian, 1987) ha permitido que se puedan emplear diferentes soportes para la transferencia, fijación y posterior hibridación de los ácidos nucleicos. De hecho, actualmente la hibridación de DNA ha cobrado gran importancia, ya que está permitiendo el desarrollo de una nueva tecnología: los chips de DNA.

A B


4.3.4. Electroforesis en gel de agarosa y concentración del DNA de fago. Seguidamente a la hibridación, detección e identificación de fagos positivos, se realizó el aislamiento de DNA viral según el protocolo descrito en el apartado 3.4.10. de Materiales y Métodos. En la Figura 16 se muestra una electroforesis en gel de agarosa al 1% en la que se puede observar el aislamiento de 2 de los fagos que dieron señal en el proceso de hibridación y que resultaron contener el gen de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei. Este gel se realizó para comprobar la integridad del DNA.

Figura 16: Electroforesis en gel de agarosa de 2 de los fagos aislados del segundo screening. Calle 1: Marcadores de peso molecular Marker III (Fermentas)

Calle 2: Fago 4.7 Calle 3: Fago 1.7

4.3.5. Secuenciación de fagos positivos. Una vez localizados los fagos positivos de la hibridación se aisló el DNA de los mismos, procediéndose a su secuenciación tal y como se describe en el apartado 3.4.5. Los oligonucleótidos utilizados en las primeras reacciones de secuenciación fueron los mismos que se emplearon en la generación del producto de PCR empleado para la búsqueda en la genoteca. Una vez comprobado que

pb 1 2 3

1375 1904 2027

5148

831

3530 4268

564

1584

21226


se trataba de una glutamato deshidrogenasa por comparación de secuencias utilizando los programas informáticos detallados en el apartado 3.4.12. se procedió a la secuenciación completa del fago.

La secuencia obtenida del DNA de fago empleando el oligonucleótido consenso (apdo. 3.4.4.), se comparó con el producto de PCR con el que se había hecho la búsqueda en la genoteca. La primera secuencia comparada es la correspondiente al fago14-7 y la inferior es el producto de PCR.

Percent Similarity: 72.222 % fago147co.seq x gdh_c1.txt . . . . . 3 AAGCCCGACGCACTCATCGCGGGTcACACCCGGGTGATAGCTGGAGGCCA 52 ||||||||| ||||| || |||||| | || || || | |||| || 27 AAGCCCGACACACTCCTCTGCGGTCACGTCTGGATGGTATC.GGAGTCCG 75 . . . . . 53 CCTTTGTAGGGACCGCGGACGCTGTCGTGCTGGGCTCGGTAGCCGGTGTA 102 || ||||| || ||||| ||| | ||||| || || || ||||||||| | 76 CCCTTGTATGGCCCGCGAACGTTATCGTGTTGTGCACGATAGCCGGTGAA 125 . . . . 103 GACCGAAACAGACCCGTCGTCGCGCTCGATTGGGACGGTCACCTC 147 |||| ||| || ||||| || | || ||||| | || || 126 GACCTCAACTTCGCCATCGTCCCGTTTGAGAGGGACAGAGACTTC 170

Como se aprecia en la comparación, la secuencia del fago muestra un 72,2% de similaridad con el producto de PCR de 203 pb., lo que significa que se trata de una glutamato deshidrogenasa pero que no es la codificada por la secuencia del producto de PCR, por lo tanto es posible que se trate de otro gen de glutamato deshidrogenasa como ocurre en otros organismos.

Se realizó también la comparación en aminoácidos, obteniéndose lo siguiente:

91,3 % identity in 58 aa overlap

61 118 fago147 VHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKT : ||:||::|||| | |:||||||||:||||||||||||| | :||||| ||||||| PrPCR203 IVEVSVPLKRDDGEVEVFTGYRAQHDNVRGPYKGGLRYHPDSTAEECVGLSMWMTWKT 10 67


Como se observa en la comparación, la secuencia de la glutamato deshidrogenasa obtenida del fago no era totalmente idéntica a la secuencia del producto de PCR con el que se había generado la sonda. Se optó por acabar de secuenciar el gen completo presente en el fago y por otra parte seguir con la búsqueda de la GDH codificada por el producto de PCR.

Comparando la secuencia obtenida del fago 14-7 con las bases de datos se obtuvo homología con la NAD-GDH de Hbt. salinarum del mismo modo que ocurría con el producto de PCR. 92,3 % identity in 107 aa overlap 40 50 ↓60 70 80 90 fago147c DYRRRIEPRNLPRLXRSTPEPRNATRVMQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALET |: ::: :::: |::|:|| |||||| S18609 MTMASKSDSTHDESGDEAADSTEP----ESALET 10 20 30 100 110 120 130 140 150 fago147c ARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPEAVHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYK ||||||:||::|||| |:|||||:|: |||||:|||||||:| |:||||||||||||||| S18609 ARRQLYHAASYLDIDQNIVERLKYPKKVHEVTIPIERDDGTVEVFTGYRAQHDSVRGPYK 40 50 60 70 80 90 160 170 fago147c GGLRYHPGVTRDECVGLR ||||||| ||||||||| S18609 GGLRYHPDVTRDECVGLGMWMTWKCAVMDLPFGGAKGGVAVNPKELSPEEKERLTRRFTQ 100 110 120 130 140 150

A partir de las primeras secuencias obtenidas en directo y en reverso, se generaron nuevos oligonucleótidos comprobando que la secuencia de los mismos no se encontraba en el resto del fragmento secuenciado hasta el momento para evitar posibles inespecificidades. Se realizó la secuenciación completa del gen mediante la estrategia de secuenciación por “paseo con oligonucleótidos”. Dichos cebadores empleados se muestran mediante flechas en la Figura 17.


CCGCGCTCAGATATCTATGAGAGATGTTCCAGCGAACCCCGATAGCGAACGGCCGTACGAGTGCTTCCA

GTGCGGGACGATTATCGTCGCAGAATCGAACCCCGGAACCTGCCCCGACTGTAGCGGTCGACTCCGGAA CCGAGGAACGCCACTCGAGTAATGCAGACATCTGAACCTGAAGGGTCGTCCCCTAACACCGCGGAGGCA 48 M Q T S E P E G S S P N T A E A 16 GCGTCTCAGTCCTCGGAGCCGAAGCCAGCGTCGGAGTCGGCGCTCGAAACGGCACGGCGACAGCTCTAC 117 A S Q S S E P K P A S E S A L E T A R R Q L Y 39 CGCGCCGCCGACCACCTCGATATCGACCCAAACGTGGTCGAGCGTCTCAAACACCCGGAAGCAGTCCAC 186 R A A D H L D I D P N V V E R L K H P E A V H 62 GAGGTGACCGTCCCAATCGAGCGCGACGACGGGTCTGTTTCGGTCTACACCGGCTACCGAGCCCAGCAC 255 E V T V P I E R D D G S V S V Y T G Y R A Q H 85 GACAGCGTCCGCGGTCCCTACAAAGGTGGCCTCCGCTATCACCCGGGTGTGACCCGCGATGAGTGCGTC 324 D S V R G P Y K G G L R Y H P G V T R D E C V 108 GGGCTTCGAATGTGGATGACCTGGAAGACCGAAGTGCGCCGCGATGGACCTATCTTCGGCGGCGCGAAA 393 G L R M W M T W K T E V R R D G P I F G G A K 131 GGCGGTATCGCGGTCAACCCGAAGGACCTGACCCTCGACGAGAAAGAACGGCTCACTCGACGGTTCACA 462 G G I A V N P K D L T L D E K E R L T R R F T 154 CAAGAGATTCGAACCATCATCGGGCCGATGAAGGATATCCCGGCACCGGATATGGGGACCGACCCGCAG 531 Q E I R T I I G P M K D I P A P D M G T D P Q 177 ACGATGGCGTGGGTGATGGACGCCTATTCGATGCAGGAAGGCGAGACGGTCCCCGGCGTCGTGACGGGC 600 T M A W V M D A Y S M Q E G E T V P G V V T G 200 AAACCGCCGATTGTCGGTGGGAGCGAAGGCCGTGATACCGCACCCGGTCGCTCGGTTGCCATCATCGCC 669 K P P I V G G S E G R D T A P G R S V A I I A 223 CGCGAAGCCATCGACTACCTCAGTTGGGATATCGAAGACACCACGGTCGCCGTGCAGGGCTTCGGTTCC 738 R E A I D Y L S W D I E D T T V A V Q G F G S 246 GTCGGTGCCCCCGCTGCACGTCTGCTCGATGATTACGGCGCGAATGTCGTCGCCGTCTCCGACGTGAAC 807 V G A P A A R L L D D Y G A N V V A V S D V N 269 GGCGCAATCTACGACCCCGACGGACTGGACACGCACGCAATTCCGACTCACGAAGAAGAACCCGAAGCC 876 G A I Y D P D G L D T H A I P T H E E E P E A 292 GTGATGACGCACGACGCGCCGGAGACGTTTTCGAACGAGGAACTCCTCGAACTCGACGTCGACGTGCTC 945 V M T H D A P E T F S N E E L L E L D V D V L 315 ATCCCGGCGGCGGTCGGCAACGTCTTGACCGCCGAGAACGCCGACGACGTACAGGCGAACCTCATCGTC 1014 I P A A V G N V L T A E N A D D V Q A N L I V 338 GAGGGTGCTAACGGGCCGACGACGAGTGCGGCCGACGCCAACTTCGCCGAGCGTGGGGTTCCGGTCATC 1083 E G A N G P T T S A A D A N F A E R G V P V I 361 CCGGATATTCTCGCCAACGCTGGCGGCGTCACCGTGAGCTACTTCGAGTGGTTGCAGGACATCAACCGG 1152 P D I L A N A G G V T V S Y F E W L Q D I N R 384

317Forw

Consenso

776Forw

1152Forw

gnadForw

390Forw

641Forw


CGGACGTGGTCCCTCGAACGCGTCCACGACGAACTCGAAACGGAGATGCTGAACGCGTGGTCGGTCGTC 1221 R T W S L E R V H D E L E T E M L N A W S V V 407 CGCGACGAATACGAGTCGCGCGACGTCCCGTGGCGCGATGCGGCGTACATCGTTGCACTGTCGCGGATT 1290 R D E Y E S R D V P W R D A A Y I V A L S R I 430 GCGGCAGCACACGACGCGCGCGGGCTCTGGCCCTGATTCGTCGGCCTCCGTAGTTCTGCACTCGTCGAC 1323 A A A H D A R G L W P * 441 CACCCACGTTGCGGAGGTTGTCGCCGAATATGTTCGGGACAACACCCTCAATGGAGGGTCGAGAACCGG GAGATGCATGTCCGATACGACACTCGACGTTCGCGAGTTACCTCCCGCAGAGCGCCATCCGAAGATTCA CAGCGCGTTTGACGACCTCGAAAGCGGCGAGGCGCTCACGATTCTAACGACCACGACCCGAAGCCGCTG TTCTACGAAATGCAGGCCGAGGTCGATGCATTCGATGCCGACACTACGCCGTCGAGCAGCGCGGCCCGG CAGAATTCGCTGCGACGTTCCCGAAAAAATAGTCGCAGTCGTCGGCCGCGAGCGCCGCGAGACAGTCCG TCGGCGCACACTCTTCACCGTACTCTTCGACGTATATCGTGCACACCGTGAGTGGCGAATATGTTCGGA Figura 17: Secuencia de la NAD-glutamato deshidrogenasa en bases y en aminoácidos. La zona subrayada y en negrita corresponde a un posible caja TATA conservada en arqueas. Se muestra en una caja, una posible secuencia de unión al ribosoma (Shine-Dalgarno) a -15 pb. del codón de inicio. Los codones de inicio y stop, se han marcado en negrita. Mediante flechas se representan los oligonucleótidos utilizados para realizar la secuenciación completa. La segunda secuencia Shine-Dalgarno y el codón de inicio del posible gen NarK se indican mediante doble subrayado. La secuencia de la NAD-GDH de Hfx.

mediterranei, se encuentra depositada en las bases de datos de EMBL con el número de acceso AJ315142.

4.3.6. Análisis de secuencias. Estructura primaria y secundaria. La NAD-GDH de Hfx. mediterranei consta de 1323 pb. que codifican un ORF de 441 aa.

Se ha encontrado a –15 pb. del codón de inicio una posible secuencia de unión al ribosoma, “secuencia Shine-Dalgarno” (Figura 17). También se ha localizado una secuencia identificada como caja Pribnow a –74 pb. del codón de inicio, siguiendo la identificación propuesta por Palmer (1995) y Soppa, (1999).

Al final del gen, a continuación del codón de STOP, podría encontrarse un comienzo de otro gen a

46 pb. puesto que se observa una posible secuencia Shine-Dalgarno, y a 12 pb. corriente abajo de ésta, se localiza un posible codón de inicio. Este fragmento muestra un 57,8% de homología con un fragmento de un gen NarK de Thermus thermophilus (numero de acceso AJ225043) que podría codificar para un transportador de NO3-/NO2-.

gnadRev


Una vez obtenida la secuencia del gen de la glutamato deshidrogenasa localizado en la

genoteca de Hfx. mediterranei construida en fago λ (gen NAD-GDH), se continuó además con la

búsqueda del otro gen de glutamato deshidrogenasa correspondiente a la secuencia codificada por el producto PCR (203 pb.) (GDHII).

A partir de la amplificación de DNA genómico de Hfx. mediterranei y posterior inserción en un

vector de clonaje se ha podido obtener un fragmento de glutamato deshidrogenasa de aproximadamente 1500 pb. que codifica para la glutamato deshidrogenasa correspondiente a la secuencia del producto de PCR de 203 pb. (GDHII). Este producto no representa el gen completo, debido a que la amplificación se ha generado con un oligonucleótido del producto de PCR de 203 pb. que se encuentra muy cerca del extremo N-terminal (Figura 18).

La secuencia parcial correspondiente a este gen (GDHII) es la siguiente:

VEVSVPLKRDDGEVEVFTGYRAQHDNVRGPYKGGLRYHPDVTAEEC

VGLSMWMTWKCAVMDLPFGGGKGGVAVDSKDLSDAEKERLTRRFADEIRGDVGPNQDIPAPDMGTDARTM

AWFMDAYSMQQGETIPGVVTGKPPVVGGSYGREEAPGRSTAIITREAIDYYGKDITETTVAVQGYGSVGA

NAARLLDEWDATIVAVSDVNGGIYDSNGFDTHTVPSHKEK

Figura 18: Secuencia de la glutamato deshidrogenasa (GDHII) amplificada de DNA genómico y que se corresponde con el producto de PCR.

Secuencia de plásmido

Continuación del gen


Se realizó la comparación de las 2 glutamato deshidrogenasas obteniéndose lo siguiente:

MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPEAVHEVTVPIER ||:||::| VEVSVPLKR DDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKTEVRRDGPIFGGAKGGIAVNPKD ||| | |:||||||||:||||||||||||| || :||||| |||||| | | |||:|||:||: || DDGEVEVFTGYRAQHDNVRGPYKGGLRYHPDVTAEECVGLSMWMTWKCAVMDL-P-FGGGKGGVAVDSKD LTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGTDPQTMAWVMDAYSMQEGETVPGVVTGKPPIVGGSEG |: |||||||||: ||| :|| |||||||||| |||| ||||||| |||:|||||||||:|||| | LSDAEKERLTRRFADEIRGDVGPNQDIPAPDMGTDARTMAWFMDAYSMQQGETIPGVVTGKPPVVGGSYG RDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWDIEDTTVAVQGFGSVGAPAARLLDDYGANVVAVSDVNGAIYDPDGLDT |: ||||| |||:|||||| : || :|||||||:||||| ||||||:: | :||||||||:||| :| || REEAPGRSTAIITREAIDYYGKDITETTVAVQGYGSVGANAARLLDEWDATIVAVSDVNGGIYDSNGFDT HAIPTHEEEPEAVMTHDAPETFSNEELLELDVDVLIPAAVGNVLTAENADDVQANLIVEGANGPTTSAAD |::|:|:|: HTVPSHKEK ANFAERGVPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRTWSLERVHDELETEMLNAWSVVRDEYESRDVPWRD AAYIVALSRIAAAHDARGLWP Figura 19: Comparación de las dos secuencias de las glutamato deshidrogenasas encontradas en Hfx. mediterranei. En negrita se muestra la secuencia aminoacídica de la glutamato deshidrogenasa que está en proceso de secuenciación completa (GDHII).

De la misma forma que ocurre en Hbt. salinarum parece que existen al menos 3 GDHs, ya que se ha purificado la NADP-GDH (Ferrer, 1995), se ha secuenciado la NAD-GDH objeto de esta tesis y además se ha clonado otra GDH de Hfx. mediterranei que se encuentra de momento en proceso de secuenciación completa. Podríamos suponer que no se trata de la secuencia de la NADP-GDH de Hfx. mediterranei puesto que al analizar el fragmento obtenido de esta nueva GDH (GDHII), se encuentra una elevada homología en los residuos aminoacídicos implicados en el sitio de unión al coenzima con las glutamato deshidrogenasas NAD-dependientes.


De esta forma podría hacerse una primera aproximación comparando estos residuos; pertenecientes al motivo estructural de unión al coenzima (Plegamiento de Rossman).

↓ ??? GDHII V A V Q G Y G S V G A N A A R L L D E W D A T I V A V S D NAD Hbt.sal V A V Q G Y G S V G A N A A R L L D K W G A T I V A I S D NAD Hfx.med V A V Q G F G S V G A P A A R L L D D Y G A N V V A V S D NAD Th.term V V V Q G L G Q V G A A V A L H A E R L G M R V V A V A T NADP E.coli V S V S G S G N V A Q Y A I E K A M E F G A R V I T A S D NADP Salty V A V S G S G N V A Q Y A I E K A M A F G A R V V T A S D NADP BacFr V A I S G F G N V A W G A A T K A T E L G A K V V T I S G Figura 20: Comparación de los residuos implicados en la unión del coenzima de la nueva GDH (GDHII) con las glutamato deshidrogenasas NAD-dependientes de Hbt. salinarum, Hfx. mediterranei y Thermus thermophilus; y con las NADP-dependientes de Escherichia coli, Bacteroides fragilis y Salmonella typhimurium. Mediante cajas se muestran los residuos diferentes en las

NADP-GDHs. El residuo más típico para cada enzima es el señalado por la flecha (↓).

En la Figura 20, se observa que las NADP-GDHs poseen una Alanina en lugar de Glicina como

se ha comentado por muchos autores. Este cambio no se encuentra en el fragmento de la nueva GDH (GDHII) por lo que podría tratarse de una enzima NAD- ó NAD(P)-dependiente. Un hecho común encontrado también en las NADP-GDHs es la sustitución del residuo final del motivo, alanina en NAD-GDHs por treonina en NADP-GDHs.

El fragmento de la nueva GDH (GDHII) posee glicina al igual que las NAD-GDHs. Según un

estudio realizado por Wierenga y col., (1985), se determinó que los residuos implicados en el centro catalítico de las deshidrogenasas NAD-dependientes mostraban una secuencia conservada GXGXXG, que para las NADP-dependientes cambia GXGXXA. Sin embargo, existen ejemplos de deshidrogenasas en las que esta regla parece no cumplirse, puesto que contienen una glicina en la tercera posición siendo enzimas NADP-dependientes tal y como ocurre en la glucosa deshidrogenasa de Hfx. mediterranei (Pire y col., 2001) y en la glutamato deshidrogenasa de Clostridium symbiosum (Teller y col., 1992).


La secuenciación completa de esta nueva GDH, su expresión y renaturalización permitiría clasificarla según su especificidad por el coenzima, así como el sentido de reacción en el que la enzima muestra mayor actividad.

4.3.6.1. Uso de codones de NAD-GDH de Hfx. mediterranei.

Existe cierta controversia acerca de la implicación de la frecuencia de uso de codones en la expresión de proteínas recombinantes.

Algunos autores comentan que parece existir una relación directa entre los codones más frecuentemente utilizados en la proteína problema y el organismo en el que se realiza la expresión (E.

coli). Brinkmann y col., (1989) defienden que la expresión de proteínas heterólogas que contienen un número elevado de codones no frecuentes en E. coli, conduce a una baja producción de proteína recombinante. Por eso en algunos casos para solucionar este problema se pueden utilizar dos estrategias diferentes:

- Alterar los codones poco frecuentes de la proteína de interés sin modificar la secuencia

aminoacídica. Recientemente se ha publicado un trabajo en el que se ha realizado la sustitución de 13 codones para optimizar la expresión de una enzima fibrinolítica de los gusanos de tierra (Hu y col., 2004).

- Realizar la coexpresión de la proteína de interés con genes que codifican para los tRNAs poco frecuentes (Andrews y Asenjo, 1996).

El uso preferencial, en la proteína problema, de codones raramente utilizados en E. coli puede constituir una barrera en la expresión heteróloga y parece ser que se produce en genes que tienen un contenido bajo de G + C (Young y col., 1989).


Recientemente, McHardy y col., (2003) han realizado un estudio comparativo de niveles de expresión con la frecuencia de uso de codones, confirmando que existe una relación entre el nivel de expresión y los codones que codifican la proteína problema y el vector de expresión. Sin embargo, existen indicios de que en la expresión heteróloga del gen de glutamato deshidrogenasa de Clostridium symbiosum en E. coli no se encuentra modulada por la frecuencia compartida de uso de codones en ambos organismos, puesto que el gen contiene codones de uso muy poco frecuente en E. coli y se obtuvo expresión de la enzima (Teller, y col., 1992).

Se ha realizado el análisis de la secuencia aminoacídica en cuanto al uso de frecuencia de codones según Soppa, (1994), mediante la introducción de la secuencia aminoacídica en el programa CODONFRECUENCY 1.0 del paquete informático GCG (apdo. 3.4.12.).

Se han buscado los codones más utilizados en la traducción a aminoácidos en la NAD-GDH de

Hfx. mediterranei y se ha observado que en la secuencia aminoacídica se utilizan con más frecuencia los codones que contienen en la tercera posición G ó C. De esta forma se refleja probablemente el bajo contenido de A + T en la NAD-GDH de Hfx. mediterranei. El DNA genómico de la familia Halobacteriaceae posee un elevado contenido en G + C, siendo del 68% aproximadamente (Moore y McCarth., 1969; Doolittle y col., 1992). Para 12 de los 18 aminoácidos que se encuentran codificados por más de un codón, el uso de codones con G ó C en tercera posición es del 90% o superior (Soppa, 1994).

Se ha elaborado una tabla en la que se recogen los datos de uso de frecuencia de codones para

la NAD-GDH de Hfx. mediterranei (Tabla II). Puesto que puede ser importante la similaridad existente en la frecuencia de uso de codones del organismo mesofílico E. coli en el que se realiza la expresión heteróloga, se han estudiado los codones más y menos frecuentemente utilizados, marcándose en la Tabla II.


Tabla II: Frecuencia de uso de codones en la NAD-GDH de Hfx. mediterranei. En sombreado se marcan los codones más utilizados por la NAD-GDH de Hfx. mediterranei. Mediante el símbolo (*) se han señalado los codones más frecuentes utilizados por la GDH de E. coli y mediante el símbolo (#) se indican los codones que por el contrario raramente se encuentran en E. coli. Los codones más frecuentemente utilizados en E. coli se han tomado de Di Fraia, y col., 2000.

Phe UUU 1 Ser UCU 3 Tyr UAU 2 Cys UGU 0 Phe UUC 5* Ser UCC 5 Tyr UAC 10* Cys UGC 1 Leu UUA 0 Ser UCA 0 Stop UAA 0 Stop UGA 1 Leu UUG 2 Ser UCG 11 Stop UAG 0 Trp UGG 9

Leu CUU 1 Pro CCU 3 His CAU 0 Arg CGU 4 Leu CUC 18 Pro CCC 7 His CAC 10 Arg CGC 14* Leu CUA 0# Pro CCA 3 Gln CAA 1 Arg CGA 5# Leu CUG 5* Pro CCG 17* Gln CAG 9* Arg CGG 6#

Ile AUU 5 Thr ACU 2 Asn AAU 1 Ser AGU 2 Ile AUC 17* Thr ACC 13* Asn AAC 13* Ser AGC 3 Ile AUA 0# Thr ACA 2 Lys AAA 5* Arg AGA 0# Met AUG 10 Thr ACG 12 Lys AAG 4 Arg AGG 0#

Val GUU 4 Ala GCU 3 Asp GAU 11 Gly GGU 9 Val GUC 25 Ala GCC 17 Asp GAC 26 Gly GGC 15* Val GUA 1* Ala GCA 11* Glu GAA 20* Gly GGA 2# Val GUG 11 Ala GCG 18* Glu GAG 18 Gly GGG 9#

En la Tabla II, se muestran las secuencias que codifican para los codones más frecuentes

utilizados en la NAD-GDH de Hfx. mediterranei.


El análisis del uso de frecuencia de codones nos proporciona información útil en el diseño de oligonucleótidos, cuando se hace necesario el uso de oligonucleótidos degenerados bien porque se conocen péptidos determinados y se desean construir oligonucleótidos, bien porque se desea realizar el aislamiento de genes a partir de residuos conservados en otros genes (Soppa y col., 1993).

Se ha observado, que los codones utilizados con más frecuencia en la NAD-GDH se corresponden con los que codifican la enzima de E. coli (Tabla II). En nuestro caso, el sistema de expresión heteróloga es eficiente y además el análisis realizado nos confirma los resultados obtenidos en los estudios de expresión.

En la NAD-GDH de Hfx. mediterranei, el codón de stop está codificado por UGA. De los 18

aminoácidos que se encuentran codificados por más de un codón, 16 de ellos presentan G ó C en la tercera posición. Solamente Lys y Glu se encuentran codificados por codones que contienen A en la ultima posición.

Se determinaron diferentes parámetros bioquímicos a partir de la secuencia de la NAD-GDH de

Hfx. mediterranei, utilizando el programa PROTPARAM. TOOL. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

Peso molecular teórico de la subunidad: 47959.2 Da. Peso molecular teórico de GDH nativa: 287755.2 Da. PI teórico: 4.51 Numero total de residuos cargados negativamente (Asp + Glu): 75 Numero total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys): 38 Índice alifático: 80.52 Coeficientes de extinción molar:


Condiciones: 6.0 M cloruro de guanidinio 0.02 M tampón fosfato; pH 6.5 Unidades de los coeficientes de extinción: M-1 cm-1. Se considera que todas las Cys aparecen como medias cisteínas.

λ (nm) 276 nm 278 nm 279 nm 280 nm 282 nm

Coefic. extinción 66000 67200 67080 66570 64800 Abs 0.1% (=1 g/l) 1.376 1.401 1.399 1.388 1.351

4.3.6.2. Residuos implicados en la halofilicidad de las GDHs.

Como se muestra en la tabla, las glutamato deshidrogenasas halofílicas difieren de otras GDHs

de arquea en el número de residuos acídicos (Asp y Glu). En las proteínas halofílicas se ha observado que existe un marcado carácter acídico (Baldacci y col., 1990).


Bacteria Archaea Eucarya Residuos P.

assarolitycus C. difficile

P. furiosus

S. solfataricus

Hbt. salinarum

Hfx. mediterranei

Humano

Ala 8,6 8,6 9,4 8,1 11,3 11,1 9,5 Cys 1,2 1,2 0,2 0,2 0,7 0,2 1,1 Asp 5,2 4,3 5,8 5,2 8,5 8,4 5,4 Glu 9,3 9,0 8,4 7,8 9,2 8,6 6,6 Phe 3,3 2,9 2,5 2,1 0,9 1,4 4,1 Gly 10,7 10,2 8,2 10,2 7,6 7,9 9,5 His 0,5 1,0 1,2 0,8 1,6 2,3 2,7 Ile 5,9 6,9 8,2 7,8 5,1 5,0 6,8 Lys 7,1 7,8 8,2 8,8 3,0 2,0 5,9 Leu 6,4 5,7 5,8 9,0 6,2 5,9 7,2 Met 2,6 3,8 3,1 2,6 2,5 2,3 2,5 Asn 4,8 4,3 3,4 4,7 3,0 3,2 3,8 Pro 3,8 3,3 4,3 3,1 5,5 6,8 4,7 Gln 2,1 2,6 2,8 3,1 2,8 2,3 2,2 Arg 4,5 2,9 4,8 4,0 5,5 6,6 6,3 Ser 3,3 6,2 3,4 4,7 5,1 5,4 6,6 Thr 5,2 4,8 5,5 4,3 7,1 6,6 4,7 Val 9,0 9,0 7,7 8,5 9,0 9,3 5,9 Trp 2,1 1,9 2,4 0,9 2,1 2,0 0,9 Tyr 4,3 3,8 4,8 3,8 3,4 2,7 3,8

Tabla III: Porcentaje de residuos aminoacídicos de diversas GDHs. Se muestran los porcentajes correspondientes a cada residuo en cada GDH de organismos de los Dominios Bacteria, Archaea y Eucarya. En negrita se señalan los porcentajes más significativos entre cada uno de los organismos.

En la Tabla III, se aprecia un elevado porcentaje de residuos Ala y Val en las enzimas halófilas. Este hecho se ha observado en un estudio estadístico realizado con 26 proteínas solubles en las que se ha comprobado la naturaleza acídica de los halófilos, que muestran un contenido bajo en lisinas, un incremento en pequeños residuos hidrofóbicos (Gly, Ala, Val) y una disminución en residuos alifáticos (Madern y col., 1995; Madern y col., 2000). La comparación de las proteínas halofílicas con las mesofílicas pone de manifiesto características que cumplen las enzimas halofílicas y que son: predominio de los residuos ácidos frente a los básicos, un incremento en residuos hidrofóbicos (Ser y Thr) y una disminución en residuos hidrofóbicos fuertes (Ile, Leu y Phe) (Lanyi, 1974).


El análisis de la composición aminoacídica de las glutamato deshidrogenasas (Tabla III) muestra

que las enzimas halófilas poseen más residuos acídicos, siendo del 17,7% y 17% para Hbt. salinarum y Hfx. mediterranei, respectivamente, frente a los porcentajes contenidos en el resto de GDHs analizadas que son de: 14,5% en P. assarolitycus, 13,3% en C. difficile, 14,2% en P. furiosus, 13% en S.

solfatariccus y tan solo del 12% en la GDH de humano. La drástica reducción en el contenido de lisinas (sólo un 3% y 2% para las GDH halofílicas)

confirma lo anteriormente expuesto. Este incremento de residuos residuos acídicos se encuentra compensado por una disminución en residuos básicos, mientras que en las proteínas termofílicas dicha proporción se encuentra compensada La elevada halofilicidad también depende de su composición rica en residuos acídicos que desestabilizan la estructura de la proteína en condiciones de baja salinidad, presumiblemente por interacciones de repulsión (Fukuchi y col., 2003).

Otras diferencias encontradas en las enzimas halófilas son: el aumento en el contenido de

treoninas (Thr) y la disminución en el contenido de fenilalaninas (Phe) (Tabla III). Respecto de la GDH hipertermófila (P. furiosus) se observa una reducción en el porcentaje de isoleucinas (Ile) y un aumento en el contenido de serinas (Ser), confirmando los datos aportados por Lanyi, (1974).

Las secuencias nucleotídicas de los genomas halofílicos pueden haber ido cambiando hacia un

incremento del porcentaje de residuos acídicos (particularmente aspartato), pero al mismo tiempo, este cambio de composición del DNA ha causado inevitablemente aumento y/o disminución de otros residuos aminoacídicos, como el porcentaje en alaninas y lisinas (Fukuchi y col., 2003).

De la misma forma que ocurre con la GDH de Hbt. salinarum (Benachenhou-Lahfa y col., 1994, la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei también muestra un cluster hidrofílico rico en residuos acídicos en la región N-terminal, y que además parece tener un bloque repetitivo. (Figura 21), no encontrándose, hasta el momento, en otras GDHs de Archaea.


La región N-terminal de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei es la siguiente:

1MQTSEPEGSSPNTAEAAS18 QSSEPKPASESALETA33 Si se comparan dos partes de esta región N-terminal, se observa que existen zonas repetidas.

Figura 21: Repetición de residuos acídicos en la región N-terminal de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei

desde los residuos 2 al 34.

(a) Los residuos idénticos se muestran como (:) y las sustituciones conservadas se muestran como (.) (b) Identidades en nucleótidos de la misma parte de la secuencia. En negrita se muestran los residuos acídicos.

La región acídica en el extremo amino terminal, puede jugar un papel clave en el mantenimiento de la estabilidad de la enzima nativa a elevadas concentraciones de sal. Las glutamato deshidrogenasas de Hbt. salinarum y Hfx. mediterranei comparten esta característica, pero su posible implicación en el mantenimiento de la estabilidad a elevadas concentraciones de sal ha de ser confirmada y demostrada mediante la sustitución de dichos residuos acídicos por residuos básicos o mediante la eliminación completa de ese pequeño loop (lazo) acídico (Benachenhou, y col., 1994).

Se han analizado las secuencias de GDHs de 4 organismos halofílicos, concretamente de Hbt.

salinarum, Hfx. volcanii, S. ruber y Hfx. mediterranei. En Hbt. salinarum NRC-36014, se ha comprobado que existen 4 genes que codifican para glutamato deshidrogenasas (Lorna Ingoldsby, comunicación personal). En 3 de ellos se encuentra aún sin asignar la especificidad de coenzima. En Hfx. volcanii se dispone de 3 secuencias que presentan similaridad con glutamato deshidrogenasa y que se han obtenido del genoma secuenciado recientemente y disponible en: (http://zdna2.umbi.umd.edu/~haloweb/hvo.html ). Se desconoce por el momento la especificidad por el coenzima.

2QTSEPEGSSPNTAEAAS18 :.:::. : . :.:

18QSSEPKPASESALETA33

a)

Q T S E P E G S S P N T A E A A CAG ACA TCT GAA CCT GAA GGG TCG TCC CCT AAC ACC GCG GAG GCA GCG ||| | || || || | || || | || | || CAG TCC TCG GAG CCG AAG CCA GCG TCG GAG TCG GCG CTC GAA ACG GCA Q S S E P K P A S E S A L E T A

b)


Puesto que en nuestro departamento se han comenzado a estudiar los genes de la bacteria halofílica Salinibacter ruber y se han aislado dos actividades glutamato deshidrogenasa (Bonete y col., 2003), hemos realizado la secuenciación, clonaje y expresión de una GDH de éste organismo a partir de un fragmento un conting suministrado por la Dra. Antón del Dpto. de Fisiología Genética y Microbiología de la Universidad de Alicante. Se ha comprobado la existencia del cluster acídico rico en aspárticos y glutámicos en las secuencias antes mencionadas como se muestra en la Figura 22.

Figura 22: Secuencias N-terminales de GDHs de organismos halofílicos. Hfx. mediterranei (Hfx. med), Hbt. salinarum (4 genes de GDH) (Hbt. sal, Hbt. sal-a1, Hbt. sal-a2 y Hbt. sal-b) ,Hfx. volcanii (3 ORFs de GDH) (Hfx. vol-1, Hfx. vol-2 y Hfx. vol-3) y la bacteria halofílica Salinibacter ruber (S. ruber). En negrita se muestran los residuos acídicos (D y E) (Asp y Glu).

El número de residuos acídicos para cada una de las regiones N-terminales mostradas en la Figura 22 es de 10 para la GDH de Hfx. mediterranei, la GDH –3 de Hfx. volcanii y para la GDH de Salinibacter ruber. Hbt.sala1 -MPEANPFESLQEQLDDAGEFLDVNADVLERLKHPERVLETTLS-VEMDDGTIET---------- 53 Hfx.vol2 MAQEANPFESLQEQIDDAATYLDVRDDVIERLKNPERVLETNLA-VEMDDGDVE----------- 53 Hbt.sala2 -MTESGPLENMLAQMEQAREYVDIDDGIYERLKSPERTLSVSLP-VRMDDGSVEV---------- 53 Hfx.med -MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVE----------- 53 Hbt.sal MTMASKSDSTHDESGDEAADSTEP----ESALETARRQLYHAASYLDIDQNIVERLK-------- 53 Hfx.vol-3 -MMNEDGKNRNGEAVTDGGSGSEP----ETALATARRQLERAASHADVDDGVVARLKH------- 53 Hfx.vol-1 --MAS--------AAPSTATDDEP--TEETALETARRQLERAAAHLDVDPGVIERLRHPNQVHRV 53 Hbt.sal-b --MAQTPP-----PESAPSTDSEP----ETALETARRQLQAAAEHVDIADGVIERLTHPTRVVQ- 53 S.ruber MPFNFDVYERSAYREPAPIDHDSP-------FQSMER-FDVAAEILELSPGFYEYLCRPAR---- 53 . : .* : : . Figura 23.: Comparación de las secuencias correspondientes al N-terminal de diferentes glutamato deshidrogenasas halofílicas. Hfx. mediterranei (Hfx. med), Hbt. salinarum (4 genes de GDH) (Hbt. sal, Hbt. sal-a1, Hbt. sal-a2 y Hbt. sal-b), Hfx. volcanii (3 ORFs de GDH) (Hfx. vol-1, Hfx. vol-2 y Hfx. vol-3) y la bacteria halofílica Salinibacter ruber (S. ruber).

GDH-Hfx.med MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVE GDH-Hbt.sal MTMASKSDSTHDESGDEAADSTEPESALETARRQLYHAASYLDIDQNIVERLK GDH-Hbt.sal-a1 MPEANPFESLQEQLDDAGEFLDVNADVLERLKHPERVLETTLSVEMDDGTIET GDH-Hbt.sal-a2 MTESGPLENMLAQMEQAREYVDIDDGIYERLKSPERTLSVSLPVRMDDGSVEV GDH-Hbt.sal-b MAQTPPPESAPSTDSEPETALETARRQLQAAAEHVDIADGVIERLTHPTRVVQ GDH-Hfx.vol-1 MASAAPSTATDDEPTEETALETARRQLERAAAHLDVDPGVIERLRHPNQVHRV GDH-Hfx.vol-2 MAQEANPFESLQEQIDDAATYLDVRDDVIERLKNPERVLETNLAVEMDDGDVE GDH-Hfx.vol-3 MMNEDGKNRNGEAVTDGGSGSEPETALATARRQLERAASHADVDDGVVARLKH GDH-S.ruber MPFNFDVYERSAYREPAPIDHDSPFQSMERFDVAAEILELSPGFYEYLCRPAR


En la Figura 23 se muestra la comparación entre los N-terminales de las glutamato deshidrogenasas halofílicas disponibles hasta el momento. Los residuos conservados o parcialmente conservados en la mayoría de ellas, se encuentran sombreados.

4.3.6.3. Residuos implicados en la termoestabilidad de las GDHs.

Las secuencias de genomas completos disponibles, nos permiten observar las posibles

diferencias existentes relacionadas con la termoestabilidad de las proteínas, reflejándose este hecho en los residuos aminoacídicos que contienen. Se ha encontrado cierta correlación comparando genomas de mesófilos y termófilos, observando que estos últimos tienen más proporción de residuos cargados y menos residuos polares no cargados. Este porcentaje de residuos cargados en termófilos es del 29,84% frente al 24,11% de los mesófilos y en cuanto a la disminución de residuos polares no cargados es del 31,15 % en mesófilos frente al 26,79% en termófilos (Jaenicke, 2000).

Pavesi y col., (2000), analizando la secuencia de dos GDHs de Asparagus officinalis, realizaron

un estudio en el que determinaron algunos de los residuos que podrían estar implicados en la termoestabilidad de las GDHs.

La termoestabilidad se ha evaluado utilizando el índice BCD (Balanced Charge Density)

desarrollado mediante estudios de modelado por homología en organismos con diferentes temperaturas de crecimiento (Yip y col., 1998). Se calcula mediante la fórmula siguiente:

BCD= [(n+ + n-) - |n- - n+|]/Ntotal

donde n+ es el número de residuos cargados positivamente (Arg, His y Lys), n- es el número de residuos cargados negativamente (Asp y Glu) y Ntotal es el número de residuos posiblemente implicados en la termoestabilidad, que se han estudiado en la secuencia. Este índice está basado en la observación de


que las GDHs de organismos termofílicos como P. furiosus y T. profundus contienen, en 24 posiciones, cargas más compensadas que la GDH mesofílica de C. symbiosum (Yip y col., 1998).

De esta forma, analizando el alineamiento para diversas GDHs en el que se encuentran representadas glutamato deshidrogenasas con diferentes características, se ha podido realizar una predicción de la termoestabilidad mediante la aplicación de este índice. En la Tabla IV, se observa como P. furiosus y T. litoralis tienen valores más elevados de BCD que el resto de las GDHs analizadas. Por lo tanto el análisis pone de manifiesto que éstas serían las GDHs más termoestables analizadas. Por otro lado, se observa que para T. maritima el índice BCD se encuentra más cercano a las GDHs mesofílicas que a las termofílicas. Además se ha visto que existe una posible correlación entre la disminución de cargas equivalentes así como un aumento en residuos hidrofóbicos y polares a medida que se pasa de organismos hipertermofílicos a mesofílicos. Se ha encontrado también una disminución en el número de glicinas en las enzimas termoestables. La secuencia de la GDH de C. symbiosum contiene 48 residuos de glicina, mientras que las secuencias de P. furiosus y T. maritima contienen 34 y 39 respectivamente. Para la NAD-GDH de Hfx. mediterranei el contenido en glicinas es de 35.

Este análisis está confirmado por estudios previos en proteínas termofílicas en las que se ha

realizado la sustitución de glicinas (Kelly y col., 1993). El índice BCD calculado para la NAD-GDH de Hfx.

mediterranei, de Hbt. salinarum y de S. ruber pone de manifiesto la proximidad, en cuanto a termoestabilidad se refiere, de las proteínas halofílicas a las glutamato deshidrogenasas termofílicas.


Tabla IV: Predicción de la termoestabilidad para diferentes glutamato deshidrogenasas mediante el índice BDC. Los residuos cargados positivamente se marcan en color magenta en la tabla y los cargados negativamente se señalan en azul. (*) Residuos aminoacídicos correspondientes a las 24 posiciones analizadas en cada una de las GDHs de los diferentes organismos. Estas posiciones son las que están marcadas mediante cajas en la Figura 24 (pág. 101). Las posiciones, marcadas según la numeración para Hfx. mediterranei son: E59, A60, E69, D71, Q84, S87, D144, E147, R148, R152, Q156, R159, T160, I161, K166, W181, D184, A185, S187, M188, Q189, G191, E192 y R337. Knapp y col., (1997) realizaron una comparación estructural de las GDHs termofílicas T.

maritima y P. furiosus con la GDH de C. symbiosum, revelando diferentes mecanismos que podrían estar contribuyendo a la termoestabilidad de estas enzimas. En miembros termotolerantes de la familia de las gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasas existe un elevado contenido de fenilalaninas (Zwickl y col.,

Organismo Residuos aminoacídicos (*) Residuos carg. +

Residuos carg. -

BCD

B.subtilis QRKDQDGERRRSQIKWDESRLEFR 8 6 0,50

C.difficile MRKDQDGERRDYKLVWDENKLGQR 7 6 0,50

T. litoralis QREDQWRERRRYDVTWDEETIRRR 8 7 0,58

P. furiosus QREDQWRERRRYDVEWDEETIRRR 8 8 0,67

Hfx. mediterranei EAEDQSDERRQRTIKWDASMQGER 5 7 0,42

Hbt. salinarum KKEDQSEERRQRDVQWDASMQGER 6 7 0,50

T. maritima KRRDQVNERRSQVINWDTSMNGHR 7 3 0,25

S. ruber AREDINGERRAFDVKWDTSMHRQR 7 5 0,42

S. solfataricus ERRSQSEEQRQYKYLWDEIKIGKR 7 5 0,42

A. thaliana FRPDQNSERRQHDLTWDESKFGYR 6 5 0,42

C. symbiosum EREDQGRMRQTYRHIYGQRKIGGQ 7 3 0,25

E. coli ERVDQSGMRQTYRHTFGMKKLNNQ 6 2 0,17

S. cerevisiae EREDQSNRRYRSRHTYGARTYNSQ 7 3 0,25


1990), mientras que se ha observado una disminución de este residuo en las glutamato deshidrogenasas (DiRuggiero y col., 1993). Se ha observado que las proteínas termofílicas comparadas con las mesofílicas poseen una elevada frecuencia de isoleucinas. (Chakravarty y Varadarajan, 2000; Kumar y col., 2000). La GDH de P.

furiosus contiene 35 residuos de isoleucinas, mientras que en T. maritima y en C. symbiosum hay 21 y 20 residuos respectivamente (Knapp y col., 1997). En la NAD-GDH de Hfx. mediterranei existen 22 isoleucinas, 8 de las cuales se encuentran conservadas en la GDH de P. furiosus. Se encuentran 11 residuos de valinas en la GDH de Hfx. mediterranei que son isoleucinas en la de GDH de P. furiosus y 3 cambios por leucinas. Mediante mutagénesis dirigida se ha comprobado que las sustituciones de isoleucinas por valinas han mermado la termoestabilidad (Pace, 1992). La cantidad de residuos conteniendo azufre (metionina y cisteína), disminuye también en las enzimas termoestables. La estructura primaria de la GDH de C. symbiosum contiene 17 metioninas mientras que existen solamente 12 en las GDHs de P. furiosus y T. maritima respectivamente. La NAD-GDH de Hfx. mediterranei contiene solamente 10 residuos de metioninas. El número de cisteínas también es inferior de tal forma que la GDH de C. symbiosum contiene 2 cisteínas y las GDHs de P. furiosus y T.

maritima contienen únicamente 1. La existencia de un solo residuo de cisteína en la composición aminoacídica de las GDHs P. furiosus y T. maritima corrobora la teoría de la escasa presencia de este aminoácido en las secuencias de GDHs termófilas y coincide con la cantidad presente en la NAD-GDH de Hfx. mediterranei.

Knapp y col., (1997) concluyen en su estudio que las variaciones en la estructura secundaria y terciaria no contribuyen a la termoestabilidad de las glutamato deshidrogenasas. Recientemente, Pack y Yoo, (2004) han analizado las diferencias aminoacídicas en la estructura entre las proteínas termofílicas y las mesofílicas, para observar posibles rasgos implicados en la termoestabilidad. De esta forma, han encontrado que existe una relación entre la termoestabilidad de las proteínas y las características siguientes:


- una baja frecuencia de serinas parcialmente expuestas, - una baja frecuencia de alaninas expuestas y muy alta frecuencia de alaninas en estado

interno (no expuestas), - elevada frecuencia de glutámicos no expuestos, - alta frecuencia de argininas expuestas

El estudio mediante el índice BCD ha de tomarse con cautela, puesto que harían falta estudios de redes de pares iónicos, entre otros, para concluir que se trata de residuos firmemente implicados en el análisis de la termoestabilidad.

4.3.6.4. Comparación de la secuencia primaria de la NAD-GDH y análisis de su estructura

secundaria.

Mediante la utilización del programa ClustalW, se realizaron diferentes alineamientos con glutamato deshidrogenasas. Este análisis se lleva a cabo gracias a la base de datos PROSITE, que permite clasificar la proteína objeto de estudio dentro de la familia de correspondiente proteínas. Los alineamientos que se realizaron se revisaron visualmente con la finalidad de corregir posibles errores. Se han obtenido, por tanto, diferentes comparaciones que aportan datos sobre la similaridad de la NAD-glutamato deshidrogenasa halofílica con otras GDHs disponibles. Los alineamientos realizados fueron los que se detallan a continuación: Comparación con glutamato deshidrogenasas de diversas fuentes Inicialmente, la secuencia obtenida se comparó con la de otras GDHs pertenecientes a los distintos dominios incluyendo enzimas halofílicas y no halofílicas para así poder observar las posibles semejanzas y diferencias entre la NAD-GDH de Hfx. mediterranei y las de estos organismos. Esta comparación mostró una elevada homología con las GDHs de diversas fuentes, confirmándose como una posible glutamato deshidrogenasa.


Se encontró un grado de identidad del 73,3% con la NAD-GDH de Hbt. salinarum, un 47% con la NADP-GDH de Pyrococcus horikoshii, un 45,6% con la NAD(P)-GDH de Pyrococcus endeavori y un 46% con la NAD-GDH de Pyrococcus furiosus. Estas secuencias se obtuvieron de las bases de datos disponibles Swissprot y EMBL. La NAD-GDH de Hfx. mediterranei muestra elevada homología con la NAD-GDH de Hbt. salinarum. DHE_BACSU ------------MSAKQVSKDEEKE--ALNLFLSTQTIIKEALRKLGYPGDMYELMKEPQ 46 DHE_CLOSDI ------------MSGKDVN-----------VFEMAQSQVKNACDKLGMEPAVYELLKEPM 37 DHE_THELI -------------VEQDP-------------FEIAVKQLERAAQYMDISEEALEFLKRPQ 34 DHE_PYRFU ------------MVEQDP-------------YEIVIKQLERAAQYMEISEEALEFLKRPQ 35 DHE_HFMED -MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPE 59 DHE_HALSA MTMASKSDSTHDESGDEAADSTEP----ESALETARRQLYHAASYLDIDQNIVERLKYPK 56 DHE_THEMA ------PE--------------------KSLYEMAVEQFNRAASLMDLESDLAEVLRRPK 34 DHE_SRUBER --MPFNFDVYERSAYREPAPIDH-----DSPFQSMMERFDVAAEILELSPGFYEYLCRPA 53 DHE_SULSO ------------MEEVLSS----------SLYTQQVKKLYKVGELLGLDNETLETLSQPE 38 DHE_ATHA ----------------------------MNALAATNRNFKLAARLLGLDSKLEKSLLIPF 32 DHE_CLOSY ---SKYVDRVIAEVEKKYADEPEFVQTVEEVLSSLGP--VVDAHPEYEEVALLERMVIPE 55 DHE_ECOLI MDQTYSLESFLNHVQKRDPNQTEFAQAVREVMTTLWP--FLEQNPKYRQMSLLERLVEPE 58 DHE_YEAST ------------------MSEPEFQQAYDEVVSSLEDSTLFEQHPKYRKV--LPIVSVPE 40 . . . : * DHE_BACSU RMLTVRIPVKMDNGSVKVFTGYRSQHNDAVGPTKGGVRFHPEVNEEEVKALSIWMTLKCG 106 DHE_CLOSDI RVIEVSIPVKMDDGSIKTFKGFRSQHNDAVGPTKGGIRFHQNVSRDEVKALSIWMTFKCS 97 DHE_THELI RIVEVSIPVEMDDGSVKVFTGFRVQYNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTA 94 DHE_PYRFU RIVEVTIPVEMDDGSVKVFTGFRVQHNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTA 95 DHE_HFMED AVHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKTE 119 DHE_HALSA KVHEVTIPIERDDGTVEVFTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPDVTRDECVGLGMWMTWKCA 116 DHE_THEMA RVLIVEFPVRMDDGHVEVFTGYRVQHNVARGPAKGGIRYHPDVTLDEVKALAFWMTWKTA 94 DHE_SRUBER RMHVTSIPVEMDSGRVKIFEGYRVIHNNVLGPSKGGIRFAPDVTLNEVKALAGWMTWKCS 113 DHE_SULSO RIIQVKIQIRGSDGKLKTFMGWRSQHNSALGPYKGGVRYHPNVTQDEVEALSMIMTWKNS 98 DHE_ATHA REIKVECTIPKDDGTLASFVGFRVQHDNARGPMKGGIRYHPEVDPDEVNALAQLMTWKTA 92 DHE_CLOSY RVIEFRVPWEDDNGKVHVNTGYRVQFNGAIGPYKGGLRFAPSVNLSIMKFLGFEQAFKDS 115 DHE_ECOLI RVIQFRVVWVDDRNQIQVNRAWRVQFSSAIGPYKGGMRFHPSVNLSILKFLGFEQTFKNA 118 DHE_YEAST RIIQFRVTWENDKGEQEVAQGYRVQYNSAKGPYKGGLRFHPSVNLSILKFLGFEQIFKNS 100 . . .:* .. . ** ***:*: . * *


DHE_BACSU I-ANLP--YGGGKGGIICDPRTMSFGELERLSRGYVRAISQIVGPTKDIPAPDVYTNSQIM 164 DHE_CLOSDI V-TGIP--YGGGKGGIIVDPSTLSQGELERLSRGYIDGIYKLIGEKVDVPAPDVNTNGQIM 155 DHE_THELI V-MDLP--YGGGKGGVICNPKEMSDREKERLARGYVRAIYDVISPYTDIPAPDVYTNPQIM 152 DHE_PYRFU V-MDLP--YGGGKGGIIVDPKKLSDREKERLARGYIRAIYDVISPYEDIPAPDVYTNPQIM 153 DHE_HFMED VRRDGPI-FGGAKGGIAVNPKDLTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGTDPQTM 179 DHE_HALSA V-MDLP--FGGAKGGVAVNPKELSPEEKERLTRRFTQEIRDVIGPNQDIPAPDMGTDPQTM 174 DHE_THEMA V-MNLP--FGGGKGGVRVDPKKLSRNELERLSRRFFSEIQVIIGPYNDIPAPDVNTNADVM 152 DHE_SRUBER L-VDLP--FGGAKGGVACNPEEMSPGELERLTRRYTADLFDVFGPDKDIPAPDMNTNEQIM 171 DHE_SULSO L-LLLP--YGGGKGGVRVDPKKLTREELEQLSRKYIQAIYKYLGSELDIPAPDVNTDSQTM 156 DHE_ATHA V-AKIP--YGGAKGGIGCDPSKLSISELERLTRVFTQKIHDLIGIHTDVPAPDMGTGPQTM 150 DHE_CLOSY L-TTLP--MGGAKGGSDFDPNGKSDREVMRFCQAFMTELYRHIGPDIDVPAGDLGVGAREI 173 DHE_ECOLI L-TTLP--MGGGKGGSDFDPKGKSEGEVMRFCQALMTELYRHLGADTDVPAGDIGVGGREV 176 DHE_YEAST L-TGLD--MGGGKGGLCVDLKGRSNNEIRRICYAFMRELSRHIGQDTDVPAGDIGVGGREI 158 : **.*** : : * :: : .. *:** *: .. : DHE_BACSU AWMMDEYSRLREFDSP--GFITGKPLVLGGSQGRETATAQGVTICIEEAVKKKGIK----- 218 DHE_CLOSDI SWMVDEYNKLTGQSSI--GVITGKPVEFGGSLGRTAATGFGVAVTAREAAAKLGID----- 209 DHE_THELI AWMMDEYETISRRKDPSFGVITGKPPSVGGIVARMDATARGASYTVREAAKALGMD----- 208 DHE_PYRFU AWMMDEYETISRRKTPAFGIITGKPLSIGGSLGRIEATARGASYTIREAAKVLGWD---T- 210 DHE_HFMED AWVMDAYSMQEGETVP--GVVTGKPPIVGGSEGRDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWD----- 233 DHE_HALSA AWLMDAYSMQEGETTP--GVVTGKPPVVGGSEGREEAPGRSVAIITQLVCEYYDQP----- 228 DHE_THEMA AWYMDTYSMNVGHTVL--GIVTGKPVELGGSKGREEATGRGVKVCAGLAMDVLGID----- 206 DHE_SRUBER AWVLDTYSMHARQTEN--AVVTGKPVGLGGSKGRRQATGRGVMTVTLAAMEQIGLA----- 225 DHE_SULSO AWFLDEYIKITGKVDF--AVFTGKPVELGGIGVRLYSTGLGVATIAKEAANKFIGG----- 210 DHE_ATHA AWILDEYSKFHGYSPA---VVTGKPIDLGGSLGRDAATGRGVMFGTEALLNEHGKT----- 203 DHE_CLOSY GYMYGQYRKIVGGFYNG--VLTGKARSFGGSLVRPEATGYGSVYYVEAVMKHEN---DT-- 227 DHE_ECOLI GFMAGMMKKLSN-NTAC--VFTGKGLSFGGSLIRPEATGYGLVYFTEAMLKRHG---MG-- 229 DHE_YEAST GYLFGAYRTYKN-SWEG--VLTGKGLNWGGSLIRPEATGYGLVYYTQAMIDYATNGKES-- 214 .: . ...*** ** * :.. . DHE_BACSU LQNARIIIQGFGNAGSFLAKFM-HDAGAKVIGISDANG-----GLYNPDGLDIPYLLDKR 272 DHE_CLOSDI MKKAKIAVQGIGNVGSYTVLNC-EKLGGTVVAMAEWCKSEGSYAIYNENGLDGQAMLDYM 268 DHE_THELI LKGKTIAIQGYGNAGYYMAKIMSEEYGMKVVAVSDTKG-----GIYNPDGLNADEVLAWK 263 DHE_PYRFU LKGKTIAIQGYGNAGYYLAKIMSEDFGMKVVAVSDSKG-----GIYNPDGLNADEVLKWK 265 DHE_HFMED IEDTTVAVQGFGSVGAPAARLL-DDYGANVVAVSDVNG-----AIYDPDGLDTHAIPTHE 287 DHE_HALSA LDETTVAVQGYGSVGANAARLL-DKWGATIVAISDVNG-----AMYEPDGIDTASVPSHD 282 DHE_THEMA PKKATVAVQGFGNVGQFAALLISQELGSKVVAVSDSRG-----GIYNPEGFDVEELIRYK 261 DHE_SRUBER PGDCTVAVQGFGNVGATAADLL-GEQGCTVVAVSDITG-----GYYNENGLDLKAMKAYT 279 DHE_SULSO VEEARVIIQGFGNVGYYAGKFL-SEMGAKIVGVSDSKG-----GVINEKGIDVGKAIEIK 264 DHE_ATHA ISGQRFVIQGFGNVGSWAAKLI-SEKGGKIVAVSDITG-----AIKNKDGIDIPALLKHT 257 DHE_CLOSY LVGKTVALAGFGNVAWGAAKKL-AELGAKAVTLSGPDG-----YIYDPEGITTEEKINYM 281 DHE_ECOLI FEGMRVSVSGSGNVAQYAIEKA-MEFGARVITASDSSG-----TVVDESGFT-KEKLARL 282 DHE_YEAST FEGKRVTISGSGNVAQFAALKV-IELGGTVVSLSDSKG-----CIISETGIT-SEQVADI 267 . : * *... . * : : . *:


DHE_BACSU DSFG--------MVTNLF-TDVITNEELLEK-------DCDILVPAAISNQITAKNAHNI 316 DHE_CLOSDI KEHG--------NLLNFPGAKRISLEEFWAS-------DVDIVIPAALENSITKEVAESI 313 DHE_THELI KKTG--------SVKDFPGATNITNEELLEL-------EVDVLAPSAIEEVITKKNADNI 308 DHE_PYRFU NEHG--------SVKDFPGATNITNEELLEL-------EVDVLAPAAIEEVITKKNADNI 310 DHE_HFMED EEPE--------AVMTHDAPETFSNEELLEL-------DVDVLIPAAVGNVLTAENADDV 332 DHE_HALSA EEPE--------AVTTY-ADTVISNEELLTL-------DVDVLIPAALGNVITKENAEAI 326 DHE_THEMA KEHG--------TVVTYPKGERITNEELLEL-------DVDILVPAALEGAIHAGNAERI 306 DHE_SRUBER QQNGG-------TLAGYEEAQHITNEELLTL-------DVDVLVPAAKEDQINREIAEDL 325 DHE_SULSO EKTG--------SVINYPEGRKVTNEELLIS-------DCDILIPAALENVINKFNAPKV 309 DHE_ATHA KEHR--------GVKGFDGADPIDPNSILVE-------DCDILVPAALGGVINRENANEI 302 DHE_CLOSY LEMRA---SGRNKVQDYADKFG--VQFFPGEKPWG--QKVDIIMPCATQNDVDLEQAKKI 334 DHE_ECOLI IEIKA---SRDGRVADYAKEFG--LVYLEGQQPWS--LPVDIALPCATQNELDVDAAHQL 335 DHE_YEAST SSAKVNFKSLEQIVGEYSTFTENKVQYISGARPWTHVQKVDIALPCATQNEVSGDEAKAL 327 . : : *: *.* : * : DHE_BACSU QAS---IVVERANGPTTIDATKILNERG---------VLLVPDILASAGGVTVSYFEWVQ 364 DHE_CLOSDI KAK---LVCEAANGPTTPEADEVFAERG---------IVLTPDILTNAGGVTVSYFEWVQ 361 DHE_THELI KAK---IVAELANGPTTPEADEILYEKG---------ILIIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQ 356 DHE_PYRFU KAK---IVAEVANGPVTPEADEILFEKG---------ILQIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQ 358 DHE_HFMED QAN---LIVEGANGPTTSAADANFAERG---------VPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQ 380 DHE_HALSA AAD---LVVEGANGPTTSTADSILADRD---------VAVIPDILANAGGVTVSYFEWLQ 374 DHE_THEMA KAK---AVVEGANGPTTPEADEILSRRG---------ILVVPDILANAGGVTVSYFEWVQ 354 DHE_SRUBER RAR---IVAEGANGPTHPAADEVLAEK-----------------------------EVLQ 353 DHE_SULSO KAK---LIVEGANGPLTADADEIMRQRG---------IAVVPDILANAGGVVGSYVEWAN 357 DHE_ATHA KAK---FIIEAANHPTDPDADEILSKKG---------VVILPDIYANSGGVTVSYFEWVQ 350 DHE_CLOSY VANNVKYYIEVANMPTTNEALRFLMQQ--------PNMVVAPSKAVNAGGVLVSGFEMSQ 386 DHE_ECOLI IANGVKAVAEGANMPTTIEAT-ELFQQ--------AGVLFAPGKAANAGGVATSGLEMAQ 386 DHE_YEAST VAQGVKFVAEGSNMGSTPEAIAVFETARATASTLKESVWYGPPKAANLGGVAVSGLEMAQ 387 * * :* * : * : DHE_BACSU NNQGYYWSEEEVAEKLRSVMVSSFETIYQTAAT--HKVDMR----LAAYMTGIRKSAEAS 418 DHE_CLOSDI NLYGYYWSEEEVEQKEEIAMVKAFESIWKIKEE--YNVTMR----EAAYMHSIKKVAEAM 415 DHE_THELI NITGDYWTVEETRAKLDKKMTKAFWDVYNTHKE--KNINMR----DAAYVVAVSRVYQAM 410 DHE_PYRFU NITGYYWTIEEVRERLDKKMTKAFYDVYNIAKE--KNIHMR----DAAYVVAVQRVYQAM 412 DHE_HFMED DINRRTWSLERVHDELETEMLNAWSVVRDEYES--RDVPWR----DAAYIVALSRIAAAH 434 DHE_HALSA DINRRAWSLERVNDELEAEMQAAWRAVKDEYEN--RDVTWR----DAAYIVALSRIAEAH 428 DHE_THEMA DLQSFFWDLDQVRNALEKMMKGAFNDVMKVKEK--YNVDMR----TAAYILAIDRVAYAT 408 DHE_SRUBER NRQGFFWTEEEVNRRLDRMMGEAFDKVYTAADK--YDVSLR----IAAYVVGIRRVAEAL 407 DHE_SULSO NKMGEIISDEEAKKLIVDRMNNAFNTLYDYHQKKLEDHDLR----TAAMALAVDRVVRAM 413 DHE_ATHA NIQGFMWEEEKVNDELKTYMTRSFKDLKEMCKT--HSCDLR----MGAFTLGVNRVAQAT 404 DHE_CLOSY NSERLSWTAEEVDSKLHQVMTDIHDGSAAAAERYGLGYN----LVAGANIVGFQKIADAM 442 DHE_ECOLI NAARLGWKAEKVDARLHHIMLDIHHACVEHGGE-GEQTN----YVQGANIAGFVKVADAM 441 DHE_YEAST NSQRITWSSERVDQELKKIMVNCFNECIDSAKKYTKEGNALPSLVKGANIASFIKVSDAM 447 : :.. * .* .. : *


DHE_BACSU RFRGWV-- 424 DHE_CLOSDI KLRGWY-- 421 DHE_THELI KDRGWIKK 418 DHE_PYRFU LDRGWVKH 420 DHE_HFMED DARGLWP- 441 DHE_HALSA EARGLWP- 435 DHE_THEMA KKRGIYP- 415 DHE_SRUBER RMRGIYA- 414 DHE_SULSO KARGIL-- 419 DHE_ATHA ILRGWGA- 411 DHE_CLOSY MAQGIAW- 449 DHE_ECOLI LAQGVI-- 447 DHE_YEAST FDQGDVF- 454 :* Figura 24: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas procedentes de organismos de distintos dominios. BACSU: Bacillus

subtilis; CLOSDI: Clostridium dificcile; PYRFU: Pyrococcus furiosus; THEMA: Thermotoga marítima; SRUBER: Salinibacter ruber; HFMED: Haloferax mediterranei; HALSA: Halobacterium salinarum THELI: Themococcus litoralis; SULSO: Sulfolobus

solfataricus; ATHA: Arabidopsis Thaliana; CLOSY: Clostridium symbiosum; ECOLI: Escherichia coli; YEAST: S. cerevisiae. Este alineamiento realizado utilizando secuencias de GDHs disponibles en las bases de datos y procedentes de Bacteria, Archaea y Eucarya es el que se observa en la Figura 24. El análisis comparativo de las secuencias revela que los residuos clave en el mantenimiento de las propiedades catalíticas y el marco estructural de la enzima se encuentran en general conservados independientemente de la procedencia del organismo.

Comparación con glutamato deshidrogenasas procedentes de HALÓFILOS En este alineamiento se han buscado homologías entre las GDHs de organismos halofílicos procedentes de Archaea y Bacteria. En la Figura 25 se observa la presencia de regiones peptídicas idénticas en las GDHs que se han comparado, mostrándose dichas regiones mediante cajas.

(*) residuos que son idénticos en todas las secuencias del alineamiento. (:) residuos conservados en esa posición. (.) residuos semiconservados. Cajas: residuos estudiados en el apartado de termoestabilidad.


DHE_Hfx.vol.2 -----------------------------MAQEANPFESLQEQIDDAATYLDVRDDVIER 31 DHE_a1HALSA ------------------------------MPEANPFESLQEQLDDAGEFLDVNADVLER 30 DHE_HFMED ------MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVER 54 DHE_Hfx.vol.1 ------MASAAP-----------STATDDEPTEETALETARRQLERAAAHLDVDPGVIER 43 DHE_Hfx.vol.3 MMNEDGKNRNGE----------AVTDGGSGSEPETALATARRQLERAASHADVDDGVVAR 50 DHE_bHALSA ------MAQTPP----------PESAPSTDSEPETALETARRQLQAAAEHVDIADGVIER 44 DHE_HALSA ----MTMASKSD-----STHDESGDEAADSTEPESALETARRQLYHAASYLDIDQNIVER 51 DHE_a2HALSA ------------------------------MTESGPLENMLAQMEQAREYVDIDDGIYER 30 DHE_SRUBER ------MPFNFD------VYERSAYREPAPIDHDSPFQSMMERFDVAAEILELSPGFYEY 48 .: . :: * :: .. DHE_Hfx.vol.2 LKNPERVLETNLAVEMDDGDVELFRAYRSQFNGDRGPYKGGIRYHPNVSRDEVKALSGWM 91 DHE_a1HALSA LKHPERVLETTLSVEMDDGTIETFKAFRSQFNGDRGPYKGGIRYHPGVTRDEVKALSGWM 90 DHE_HFMED LKHPEAVHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWM 114 DHE_Hfx.vol.1 LRHPNQVHRVSVPLERDDGSTAVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRFHPDVTEAECIGLSMWM 103 DHE_Hfx.vol.3 LKHPTRVQQVSVPLRRDDGSLDVFTGFRAQHDDVRGPYKGGLRYHPEVTADECIGLSMWM 110 DHE_bHALSA LTHPTRVVQVSVPVERDDGTVTVYDGYRAQHDDVRGPYKGGLRYHPGVSAEECVGLSMWM 104 DHE_HALSA LKYPKKVHEVTIPIERDDGTVEVFTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPDVTRDECVGLGMWM 111 DHE_a2HALSA LKSPERTLSVSLPVRMDDGSVEVFDAYRCQFDSARGPYKGGIRYHPTVSEEEVSALAGWM 90 DHE_SRUBER LCRPARMHVTSIPVEMDSGRVKIFEGYRVIHNNVLGPSKGGIRFAPDVTLNEVKALAGWM 108 * * ..:.:. *.* : .:* .:. ** ***:*: * *: * .* ** DHE_Hfx.vol.2 VYKCAVV-DIP-YGGGKGGIVIDPKAYSESELERITRSFAKELRPLVGESRDIPAPDVNT 149 DHE_a1HALSA VYKTAVA-DIP-YGGGKGGIILDPEEYSDSELERITRAFATELRPFIGEDKDVPAPDVNT 148 DHE_HFMED TWKTEVRRDGPIFGGAKGGIAVNPKDLTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGT 174 DHE_Hfx.vol.1 TWKCAVM-DLP-FGGGKGGVVVDPKDLSTDEKERLTRRFAEELRPFIGPTKDIPAPDMGT 161 DHE_Hfx.vol.3 TWKCAVM-DLP-FGGGKGGVAVDPKTLSDEERERLTRRFAEEIRNVVGPKKDVPAPDMGT 168 DHE_bHALSA TWKCAVM-DLP-FGGAKGGVVVDPKTLSADEHERLTRRFAAELRDEVGPSQDIPAPDMGT 162 DHE_HALSA TWKCAVM-DLP-FGGAKGGVAVNPKELSPEEKERLTRRFTQEIRDVIGPNQDIPAPDMGT 169 DHE_a2HALSA TWKTALV-DLP-FGGAKGGIVCNPKELSDNEIEQLTRRYTEGIRRMIGPETDIPAPDMNT 148 DHE_SRUBER TWKCSLV-DLP-FGGAKGGVACNPEEMSPGELERLTRRYTADLFDVFGPDKDIPAPDMNT 166 .:* : * * :**.***: :*: : * *::** :: : .* *:****:.* DHE_Hfx.vol.2 GQREMNWIKDTYETLENTTAPGVITGKALSNGGSEGRVEATGRSTMLTAREAFDYLGRDI 209 DHE_a1HALSA GQREMNWIKDTYETLEDTTAPGVITGKALENGGSEGRVNATGRSTMFAAREVFDYLDRDL 208 DHE_HFMED DPQTMAWVMDAYSMQEGETVPGVVTGKPPIVGGSEGRDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWDI 234 DHE_Hfx.vol.1 DAQTMAWFMDAYSMQEGETKAGVVTGKPPVVGGSEGRDTAPGRSVAIIARETIDDLGWDI 221 DHE_Hfx.vol.3 GPQEMAWFMDAYSMQQGETTPGVVTGKPPVIGGSYGREEAPGRSVAIVTREAVDFYDWDI 228 DHE_bHALSA DAQTMAWFMDAYSMQQGETVPGVVTGKPPVAGGSHGRAEAPGRSVAIATREAINYYDIPI 222 DHE_HALSA DPQTMAWLMDAYSMQEGETTPGVVTGKPPVVGGSEGREEAPGRSVAIITQLVCEYYDQPL 229 DHE_a2HALSA DPRTMAWVMDTYSVYQGYAVPEVVTGKPPEIGGTDGRVEATGRGVSIITEETFEYFDTDI 208 DHE_SRUBER NEQIMAWVLDTYSMHARQTENAVVTGKPVGLGGSKGRRQATGRGVMTVTLAAMEQIGLAP 226 . : * *. *:*. : *:***. **: ** *.**.. : . : .


DHE_Hfx.vol.2 EGATVAVQGYGNAGSIAARLVEDLGASVVAVSDSSGGIYDPDGLDTRAVKDFKNETG-TV 268 DHE_a1HALSA SDATVAVQGYGNAGSVAAKLIADQGADVVAVSDSSGAVHNPDGLDTRAVKAFKTETG-SV 267 DHE_HFMED EDTTVAVQGFGSVGAPAARLLDDYGANVVAVSDVNGAIYDPDGLDTHAIPTHEEEPE-AV 293 DHE_Hfx.vol.1 EDTTVAVQGFGSVGAPAARLLDDEGATVVAVSDVNGAIYDPDGLDTHDVPTHEEEPE-AV 280 DHE_Hfx.vol.3 EDTTVAVQGFGSVGANAARLLDEWGAKVVAVSDVDGAIYDPDGLDTQDVEGHDERPG-MV 287 DHE_bHALSA DDATVAVQGYGSVGANAALLLDDWGARVVAVSDVNGGVLDTDGLDTHAIPSHGNQPA-AV 281 DHE_HALSA DETTVAVQGYGSVGANAARLLDKWGATIVAISDVNGAMYEPDGIDTASVPSHDEEPE-AV 288 DHE_a2HALSA QDADVAIQGFGNVGSVTADLLSERGANIVAVSDVTGAIHDPTGLDIADVQAYADANGGRL 268 DHE_SRUBER GDCTVAVQGFGNVGATAADLLGEQGCTVVAVSDITGGYYNENGLDLKAMKAYTQQNGGTL 286 **:**:*..*: :* *: . *. :**:** *. : *:* : . : DHE_Hfx.vol.2 SDYEG-TEAITNEELLTLDVDLLVPAALENAIDGELAHDVKADVIVEAANGPLTPDADDV 327 DHE_a1HALSA SGYEGATEELSNEALLTMDVDLLVPAALENAIDEDLAHDVDADVVVEAANGPLTPDADDV 327 DHE_HFMED MTHD-APETFSNEELLELDVDVLIPAAVGNVLTAENADDVQANLIVEGANGPTTSAADAN 352 DHE_Hfx.vol.1 MKYD-APRKLSNEELLELDVDVLIPAAVGNVLTAENADDVRADLVVEGANGPTTSAADEI 339 DHE_Hfx.vol.3 SGYD-APESLSNEELLELDVDVLIPAAIGNVITTENVDSISAEMVVEGANGPTTFAADAV 346 DHE_bHALSA MRHD-APNTLTNEELLELDVDVVIPAAVGNVITAANADRIQADIVVEGANGPTTSAADRI 340 DHE_HALSA TTY--ADTVISNEELLTLDVDVLIPAALGNVITKENAEAIAADLVVEGANGPTTSTADSI 346 DHE_a2HALSA EGYD-A-EPISNDDLLTLDVDALIPAAIEDVITVDVAERLAADVIVEAANGPTTFDAAQV 326 DHE_SRUBER AGYEEA-QHITNEELLTLDVDVLVPAAKEDQINREIAEDLRARIVAEGANGPTHPAADEV 345 : ::*: ** :*** ::*** : : .. : * ::.*.**** * DHE_Hfx.vol.2 LTEREIHVFPDILANAGGVTVSYFEWVQNRQRFYWTEQRVNDELERVIVDAFEELVDACE 387 DHE_a1HALSA LTERGVTVVPDILANAGGVTVSYFEWVQNRQRFQWTEDRVNEELEAIITDAFDAMTDAHE 387 DHE_HFMED FAERGVPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRTWSLERVHDELETEMLNAWSVVRDEYE 412 DHE_Hfx.vol.1 FEARGILVVPDILANAGGVTVSYFEWLQDLNHRSWSLERVHDELETEMLRAWTAVRERVE 399 DHE_Hfx.vol.3 LEERGIPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRQWSLERVHEELESEMLKAWNAVREHVE 406 DHE_bHALSA LEERAVPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRTWSPERVRDELESEMLSAWNAVRSEVD 400 DHE_HALSA LADRDVAVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRAWSLERVNDELEAEMQAAWRAVKDEYE 406 DHE_a2HALSA LSDRGVPVVPDILANAGGVIVSYLEWVQNSQQYSWDVEEVNRDLRQRLTGAFDEMLVAYE 386 DHE_SRUBER LAEK--------------------EVLQNRQGFFWTEEEVNRRLDRMMGEAFDKVYTAAD 385 : : * :*: : * :.*. * : *: : : DHE_Hfx.vol.2 SHDLPNFRTAAYVVAIRRVVDSYDSAGNWP 417 DHE_a1HALSA DAGTPNLRTAAYVVAVQRVVDAYEGSGSWP 417 DHE_HFMED SRDVP-WRDAAYIVALSRIAAAHDARGLWP 441 DHE_Hfx.vol.1 EHDVT-WRDAAYMVALERVSEAHEHRGLWP 428 DHE_Hfx.vol.3 ERDLT-WRDAAYVVALSRIGGAKETRGLWP 435 DHE_bHALSA DGDLS-WRDAAYVVALQRIGRAKEARGLWP 429 DHE_HALSA NRDVT-WRDAAYIVALSRIAEAHEARGLWP 435 DHE_a2HALSA DRNIPTLRTAAYTIALERSADAHEFRGLFP 416 DHE_SRUBER KYDVS-LRIAAYVVGIRRVAEALRMRGIYA 414 . . . * *** :.: * : * :. Figura 25: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas procedentes de organismos halofílicos de Bacteria y Archaea: Hfx.vol.2: Haloferax volcanii (ORF 2); a1HALSA: Halobacterium salinarum-a1; HFMED: Haloferax mediterranei; Hfx.vol.1: Haloferax volcanii

(ORF 1); Hfx.vol.3: Haloferax volcanii (ORF 3); bHALSA: Halobacterium salinarum-b ; HALSA: NAD-GDH Halobacterium

salinarum; a2HALSA: Halobacterium salinarum-a2; SRUBER: Salinibacter ruber.

(*) residuos que son idénticos en las secuencias del alineamiento. (:) residuos conservados en esa posición. (.) residuos semiconservados. Cajas: Regiones peptídicas conservadas

: Residuos acídicos idénticos


Del mismo modo que ocurre en la NAD-GDH de Hbt. salinarum, la NAD-GDH de Hfx.

mediterranei muestra un elevado número de residuos acídicos, (Asp y Glu) característica no presente en otras arqueas no halofílicas. Sin embargo, este carácter acídico es común en proteínas halofílicas. En la Figura 25, se observa el elevado número de residuos acídicos idénticos conservados en las GDHs halofílicas. Dichos residuos se indican mediante flechas. Comparación con diversas glutamato deshidrogenasas NAD-dependientes Puesto que la GDH objeto de este estudio es una enzima con una especificidad por NAD, se llevó a cabo la comparación con diversas NAD-GDHs, realizando por tanto un estudio en base al coenzima utilizado por las distintas GDHs. DHE_HFMED -MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPE 59 DHE_HALSA MTMASKSDSTHDESGDEAADSTEP----ESALETARRQLYHAASYLDIDQNIVERLKYPK 56 DHE_THER --MPLKAYRPPEDPG---------------LWDTYLEWLERALKVAGVHPTTLEYLAHPK 43 DHE_PEPAS --MTDT----------------------LNPLVAAQEKVRIACEKLGCDPAVYELLKEPQ 36 DHE_CLODI --MSGKD---------------------VNVFEMAQSQVKNACDKLGMEPAVYELLKEPM 37 . . .... ::.::....:: . : * . . . * * * DHE_HFMED AVHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKTE 119 DHE_HALSA KVHEVTIPIERDDGTVEVFTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPDVTRDECVGLGMWMTWKCA 116 DHE_THER RLVTLSLPVVMDDGKVRIFQGYRVVHDIARGPAKGGVRLDPGVTLGQTAGLAAWMTLKAA 103 DHE_PEPAS RVIEISIPVKMDDGTVKVFKGWRSAHSSAVGPSKGGVRFHPNVNMDEVKALSLWMTFKGG 96 DHE_CLODI RVIEVSIPVKMDDGSIKTFKGFRSQHNDAVGPTKGGIRFHQNVSRDEVKALSIWMTFKCS 97 : :::*: ***.: : *:* *. . ** ***:* . .*. .: .* *** * DHE_HFMED VRRDGPI-FGGAKGGIAVNPKDLTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGTDPQTM 179 DHE_HALSA VM-DLP--FGGAKGGVAVNPKELSPEEKERLTRRFTQEIRDVIGPNQDIPAPDMGTDPQTM 174 DHE_THER VY-DLP--FGGAAGGIAVDPKGLSPRELERLVRRYTAELVGLIGPDSDILGPDLGADQQVM 161 DHE_PEPAS AL-GLP--YGGGKGGICVDPAELSERELEQLSRGWVRGLYKYLGDRIDIPAPDVNTNGQIM 154 DHE_CLODI VT-GIP--YGGGKGGIIVDPSTLSQGELERLSRGYIDGIYKLIGEKVDVPAPDVNTNGQIM 155 . * :**. **: *:* *: * *:* * : : :* *: .**:.:: * * DHE_HFMED AWVMDAYSMQEGE-TVPGVVTGKPPIVGGSEGRDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWDIEDTT 238 DHE_HALSA AWLMDAYSMQEGE-TTPGVVTGKPPVVGGSEGREEAPGRSVAIITQLVCEYYDQPLDETT 233 DHE_THER AWIMDTYSMTVGS-TVPGVVTGKPHALGGSEGRDDAAGLGALLVLEALAKRRGLDLRGAR 220 DHE_PEPAS SWFVDEYVKLNGERMDIGTFTGKPVAFGGSEGRNEATGFGVAVVVRESAKRFGIKMEDAK 214 DHE_CLODI SWMVDEYNKLTGQ-SSIGVITGKPVEFGGSLGRTAATGFGVAVTAREAAAKLGIDMKKAK 214 :*.:* * *. *..**** .*** ** *.* .. : . . : :


DHE_HFMED VAVQGFGSVGAPAARLLDDYGANVVAVSDVNG-----AIYDPDGLDTHAIPTHEEEPEAV 293 DHE_HALSA VAVQGYGSVGANAARLLDKWGATIVAISDVNG-----AMYEPDGIDTASVPSHDEEPEAV 288 DHE_THER VVVQGLGQVGAAVALHAERLGMRVVAVATSMG-----GMYAPEGLDVAEVLSAYEATGSL 275 DHE_PEPAS IAVQGFGNVGTFTVKNIERQGGKVCAIAEWDRNEGNYALYNENGIDFKELLAYKEANKTL 274 DHE_CLODI IAVQGIGNVGSYTVLNCEKLGGTVVAMAEWCKSEGSYAIYNENGLDGQAMLDYMKEHGNL 274 :.*** *.**: .. : * : *:: .:* :*:* : : : DHE_HFMED MTHDAPETFSNEELLELDVDVLIPAAVGNVLTAENADDVQANLIVEGANGPTTSAADANF 353 DHE_HALSA TTY-ADTVISNEELLTLDVDVLIPAALGNVITKENAEAIAADLVVEGANGPTTSTADSIL 347 DHE_THER PRL----DLAPEEVFGLEAEVLVLAAREGALDGDRARQVQAQAVVEVANFGLTPEAEAYL 331 DHE_PEPAS IGFPGAERITDEEFWTKEYDIIVPAALENVITGERAKTINAKLVCEAANGPTTPEGDKVL 334 DHE_CLODI LNFPGAKRISLEEFWASDVDIVIPAALENSITKEVAESIKAKLVCEAANGPTTPEADEVF 334 . :: **. : :::: ** . : : * : *. : * ** *. .: : DHE_HFMED AERGVPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRTWSLERVHDELETEMLNAWSVVRDEYES 413 DHE_HALSA ADRDVAVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRAWSLERVNDELEAEMQAAWRAVKDEYEN 407 DHE_THER LGKGALVVPDLLSGGGGLLASYLEWVQDLNMFFWSPEEVRERFETRVARVVDAVCRRAER 391 DHE_PEPAS TERGINLTPDILTNSGGVLVSYYEWVQNQYGYYWTEAEVEEKQEADMMKAIKGVFAVADE 394 DHE_CLODI AERGIVLTPDILTNAGGVTVSYFEWVQNLYGYYWSEEEVEQKEEIAMVKAFESIWKIKEE 394 :. : **:*:..**: .** **:*: *: .*.:. * : . : : DHE_HFMED RDVPWRDAAYIVALSRIAAAHDARGLWP 441 DHE_HALSA RDVTWRDAAYIVALSRIAEAHEARGLWP 435 DHE_THER DGLDLRMGALALALERLDEATRLRGVYP 419 DHE_PEPAS YNVTLREAVYMYAIKSIDVAMKLRGW-- 420 DHE_CLODI YNVTMREAAYMHSIKKVAEAMKLRGWY- 421 .: * .. ::. : * ** . Figura 26: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas NAD-dependientes.

THER: Thermus thermophilus; HFMED: Haloferax mediterranei; HALSA: Halobacterium salinarum; CLODI: Clostridum symbiosum; PEPAS: Peptostreptococcus asaccharolyticus. Como se ha comentado anteriormente existe posiblemente una relación entre la presencia de una glicina conservada en la mayoria de las NAD-GDHs, marcada en la Figura 26 con ( ). Mediante flechas se muestran los residuos del dominio de unión al coenzima que se encuentran en las NAD-GDHs. Comparación con diversas GDHS duales: NAD(P)-dependientes

De la misma forma, se realizó un alineamiento por especificidad de coenzima en el que se buscaron diferencias entre la NAD-GDH halófila y otras GDHs de diversos organismos. Se realizó con GDHs que tienen especificidad DUAL procedentes de diversas fuentes.

(*) residuos que son idénticos en las secuencias del alineamiento. (:) residuos conservados en esa posición. (.) residuos semiconservados.


DHE_HFMED MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPEA 60 DHE_THERMA -----PE--------------------KSLYEMAVEQFNRAASLMDLESDLAEVLRRPKR 35 DHE_THLI -------------------------VEQDPFEIAVKQLERAAQYMDISEEALEFLKRPQR 35 DHE_PYRFU ------------------------MVEQDPYEIVIKQLERAAQYMEISEEALEFLKRPQR 36 DHE_PYRPRF ------------------------MVEIDPFEMAVKQLERAAQYMDISEEALEWLKKPMR 36 DHE_AEPYR -------------------MEVLALQPTDPLEEARAQLRRAVDLLGYDDYVYEVLANPDR 41 DHE_SULSO ---------------------MEEVLSSSLYTQQVKKLYKVGELLGLDNETLETLSQPER 39 . :: :. . : . * * .* DHE_HFMED VHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKTEV 120 DHE_THERMA VLIVEFPVRMDDGHVEVFTGYRVQHNVARGPAKGGIRYHPDVTLDEVKALAFWMTWKTAV 95 DHE_THLI IVEVSIPVEMDDGSVKVFTGFRVQYNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTAV 95 DHE_PYRFU IVEVTIPVEMDDGSVKVFTGFRVQHNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTAV 96 DHE_PYRPRF IVEVSVPIEMDDGSVKVFTGFRVQHNWARGPTKGGIRWHPAETLSTVKALATWMTWKVAV 96 DHE_AEPYR VLQVRVTIKMDDGTVKTFLGWRSQHNSALGPYKGGVRYHPNVTMNEVIALSMWMTWKNSL 101 DHE_SULSO IIQVKIQIRGSDGKLKTFMGWRSQHNSALGPYKGGVRYHPNVTQDEVEALSMIMTWKNSL 99 : * . :. .** :..: *:* *:: . ** ***:*:** * . .* **** : DHE_HFMED RRDGPIFGGAKGGIAVNPKDLTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGTDPQTMA 180 DHE_THERMA M-NLP-FGGGKGGVRVDPKKLSRNELERLSRRFFSEIQVIIGPYNDIPAPDVNTNADVMA 153 DHE_THLI M-DLP-YGGGKGGVICNPKEMSDREKERLARGYVRAIYDVISPYTDIPAPDVYTNPQIMA 153 DHE_PYRFU M-DLP-YGGGKGGIIVDPKKLSDREKERLARGYIRAIYDVISPYEDIPAPDVYTNPQIMA 154 DHE_PYRPRF V-DLP-YGGGKGGIIVNPKELSEREQERLARAYIRAVYDVIGPWTDIPAPDVYTNPKIMG 154 DHE_AEPYR A-GLP-YGGGKGGVRVNPKILSPRELELLSRKYFESISDIVGVDQDIPAPDVYTDPQVMS 159 DHE_SULSO LL-LP-YGGGKGGVRVDPKKLTREELEQLSRKYIQAIYKYLGSELDIPAPDVNTDSQTMA 157 .* :**.***: :** :: * * *:* : : :. ******: *:.. *. DHE_HFMED WVMDAYS--MQEGETVPGVVTGKPPIVGGSEGRDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWD-IEDT 237 DHE_THERMA WYMDTYS--MNVGHTVLGIVTGKPVELGGSKGREEATGRGVKVCAGLAMDVLGID-PKKA 210 DHE_THLI WMMDEYETISRRKDPSFGVITGKPPSVGGIVARMDATARGASYTVREAAKALGMD-LKGK 212 DHE_PYRFU WMMDEYETISRRKTPAFGIITGKPLSIGGSLGRIEATARGASYTIREAAKVLGWDTLKGK 214 DHE_PYRPRF WMMDEYETIMRRKGPAFGVITGKPLSIGGSLGRGTATAQGAIFTIREAAKALGID-LKGK 213 DHE_AEPYR WFLDEYN--RVKRGQFFGVVTGKPVELGGLNARIVSTGYGVAVSTRVAAEKFLGG-LEGR 216 DHE_SULSO WFLDEYI--KITGKVDFAVFTGKPVELGGIGVRLYSTGLGVATIAKEAANKFIGG-VEEA 214 * :* * .:.**** :** * :.. .. * . : . : DHE_HFMED TVAVQGFGSVGAPAARLL-DDYGANVVAVSDVNGAIYDPDGLDTHAIPTHEEEPEAVMTH 296 DHE_THERMA TVAVQGFGNVGQFAALLISQELGSKVVAVSDSRGGIYNPEGFDVEELIRYKKEHGTVVTY 270 DHE_THLI TIAIQGYGNAGYYMAKIMSEEYGMKVVAVSDTKGGIYNPDGLNADEVLAWKKKTGSVKDF 272 DHE_PYRFU TIAIQGYGNAGYYLAKIMSEDFGMKVVAVSDSKGGIYNPDGLNADEVLKWKNEHGSVKDF 274 DHE_PYRPRF KIAVQGYGNAGYYTAKLAKEQLGMTVVAVSDSRGGIYNPDGLDPDEVLKWKREHGSVKDF 273 DHE_AEPYR TVAVQGYGNVGYYAAKFL-AEMGAKIVAVSDSRGGIYDPEGIDPEEALKVKRSTGTVANY 275 DHE_SULSO RVIIQGFGNVGYYAGKFL-SEMGAKIVGVSDSKGGVINEKGIDVGKAIEIKEKTGSVINY 273 : :**:*..* . : : * .:*.*** .*.: : .*:: :.. :* . DHE_HFMED DAPETFSNEELLELDVDVLIPAAVGNVLTAENADDVQANLIVEGANGPTTSAADANFAER 356 DHE_THERMA PKGERITNEELLELDVDILVPAALEGAIHAGNAERIKAKAVVEGANGPTTPEADEILSRR 330 DHE_THLI PGATNITNEELLELEVDVLAPSAIEEVITKKNADNIKAKIVAELANGPTTPEADEILYEK 332 DHE_PYRFU PGATNITNEELLELEVDVLAPAAIEEVITKKNADNIKAKIVAEVANGPVTPEADEILFEK 334 DHE_PYRPRF PGATNITNEELLELEVDVLAPAAIEEVITEKNADNIKAKIVAEVANGPVTPEADDILREK 333 DHE_AEPYR QRGKKISTMEILELPVDILVPAAIEEVITDENADRIKAKIISEGANGPTTTAAEKILVKK 335 DHE_SULSO PEGRKVTNEELLISDCDILIPAALENVINKFNAPKVKAKLIVEGANGPLTADADEIMRQR 333 .:. *:* *:* *:*: .: ** ::*: : * **** *. *: : .:


DHE_HFMED GVPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRTWSLERVHDELETEMLNAWSVVRDEYES--- 413 DHE_THERMA GILVVPDILANAGGVTVSYFEWVQDLQSFFWDLDQVRNALEKMMKGAFNDVMKVKEK--- 387 DHE_THLI GILIIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQNITGDYWTVEETRAKLDKKMTKAFWDVYNTHKE--- 389 DHE_PYRFU GILQIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQNITGYYWTIEEVRERLDKKMTKAFYDVYNIAKE--- 391 DHE_PYRPRF GILQIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQNINGYYWTEEEVREKLDKKMTKAFWEVYNTHKD--- 390 DHE_AEPYR GVLVLPDILANAGGVIMSHIEWVNNRMGGWITDEEALKKLEQKMVENTKTVITYWEKNLK 395 DHE_SULSO GIAVVPDILANAGGVVGSYVEWANNKMGEIISDEEAKKLIVDRMNNAFNTLYDYHQK--K 391 *: :**:*.***** *:.** :: :.. : * : :. DHE_HFMED -RDVPWRDAAYIVALSRIAAAHDARGLWP- 441 DHE_THERMA -YNVDMRTAAYILAIDRVAYATKKRGIYP- 415 DHE_THLI -KNINMRDAAYVVAVSRVYQAMKDRGWIKK 418 DHE_PYRFU -KNIHMRDAAYVVAVQRVYQAMLDRGWVKH 420 DHE_PYRPRF -KNIHMRDAAYVVAVSRVYQAMKDRGWVKK 419 DHE_AEPYR PEENSLRDAAYMIAVERVFRAMKLRGWI-- 423 DHE_SULSO LEDHDLRTAAMALAVDRVVRAMKARGIL-- 419 : * ** :*:.*: * ** Figura 27: Alineamiento de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei con GDHs NAD(P)-dependientes.

THERMA: Thermotoga maritima; HFMED: Haloferax mediterranei; THLI: Thermococcus litoralis; PYRFU: Pyrococcus furiosus; PYRPRF: Pyrococcus profundus; AEPYR: Aeropyrum pernix; SULSO: Sulfolobus

solfatariccus. Las GDHs duales parecen mantener la glicina discutida por Wierenga y col., 1985, del mismo modo que se conserva en las GDHs NAD-dependientes. Comparación con diversas GDHs NADP-dependientes

Por último, se realizó un alineamiento más observando las diferencias por especificidad de coenzima en el que se buscaron diferencias entre la NAD-GDH halófila y otras GDHs de diversos organismos. Se realizó con GDHs que tienen especificidad por NADP procedentes de diversas fuentes.


DHE_ECOLI MDQTYSLESFLNHVQKRDPNQTEFAQAVREVMTTLWP--FLEQNPKYRQMSLLERLVEPE 58 DHE_SALTY MDQTCSLESFLNHVQKRDPHQTEFAQAVREVMTTLWP--FLEQNPRYRHMSLLERLVEPE 58 DHE_BACFR ----MNIEKIMSSLEAKHPGESEYLQAVKEVLLSIED--IYNQHPEFEKAKIIERLVEPD 54 DHE_NEUCR ---------------SNLPSEPEFEQAYKELAYTLENSSLFQKHPEYRTALTVASIP--E 43 DHE_HFMED -MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPE 59 DHE_SULSH -------------------------------------------------LDTLEALSQPE 11 : : : DHE_ECOLI RVIQFRVVWVDDRNQIQVNRAWRVQFSSAIGPYKGGMRFHPSVNLSILKFLGFEQTFKNA 118 DHE_SALTY RVIQFRVVWLDDKNQVQVNRAWRVQFNSAIGPYKGGMRFHPSVNLSILKFLGFEQTFKNA 118 DHE_BACFR RIFTFRVTWVDDKGEVQTNLGYRVQFNNAIGPYKGGIRFHASVNLSILKFLGFEQTFKNA 114 DHE_NEUCR RVIQFRVVWEDDNGNVQVNRGYRVQFNSALGPYKGGLRLHPSVNLSILKFLGFEQIFKNA 103 DHE_HFMED AVHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKTE 119 DHE_SULSH RVIQVKIQIRGSDGKLKTFMGWRSQHNSALGPYKGGVRYSPNVTQDEVIALSMIMTWKNS 71 : . : . ..:.. .:* *.... ******:* ..*. . * : :*. DHE_ECOLI LTTLP--MGGGKGGSDFDPKGKSEGEVMRFCQALMTELYRHLGADTDVPAGDIGVGGREV 176 DHE_SALTY LTTLP--MGGGKGGSDFDPKGKSEGEVMRFCQALMTELYRHLGPDTDVPAGDIGVGGREV 176 DHE_BACFR LTTLP--MGGGKGGSDFSPRGKSDAEIMRFCQAFMLELWRHLGPDMDVPAGDIGVGGREV 172 DHE_NEUCR LTGLS--MGGGKGGADFDPKGKSDAEIRRFCCAFMAELHKHIGADTDVPAGDIGVGGREI 161 DHE_HFMED VRRDGPIFGGAKGGIAVNPKDLTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGTDPQTM 179 DHE_SULSH LLLLP--YGGGKGGIRVDPKKLTLKELEDLSRKYVQLIHNYLGSDVDIPAPDINTNPQTM 129 : **.*** ..*: : * : : :*. *:** *:... : : DHE_ECOLI GFMAGMMKKLSNNTA-CVFTGKGLSFGGSLIRPEATGYGLVYFTEAMLKRHGMG-FEGMR 234 DHE_SALTY GFMAGMMRKLSNNSS-CVFTGKGLSFGGSLIRPEATGYGLVYFTEAMLKRHGLG-FEGMR 234 DHE_BACFR GYMFGMYKKLTREFT-GTFTGKGLEFGGSLIRPEATGFGGLYFVNQMLQTKGID-IKGKT 230 DHE_NEUCR GYMFGAYRKAANRFE-GVLTGKGLSWGGSLIRPEATGYGLVYYVGHMLEYSGAGSYAGKR 220 DHE_HFMED AWVMDAYSMQEGETVPGVVTGKPPIVGGSEGRDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWD-IEDTT 238 DHE_SULSH AWFLDEYIKITGEVDFAVFTGKPSELGGIGVRLYSTGLGVATIAREAANKFIGG-IEGSR 188 .:. . . ..*** ** * :.* . . . . . # # # DHE_ECOLI VSVSGSGNVAQYAIEKAMEFGARVITASDSSGTVVD--ESGFTKEKLARLIEIKASRDGR 292 DHE_SALTY VAVSGSGNVAQYAIEKAMAFGARVVTASDSSGTVVD--ESGFTPEKLARLCEIKASRDGR 292 DHE_BACFR VAISGFGNVAWGAATKATELGAKVVTISGPDGYIYD--PNGISGEKIDYMLELRASGNDI 288 DHE_NEUCR VALSGSGNVAQYAALKLIELGATVVSLSDSKGALVATGESGITVEDINAVMAIKEARQS- 279 DHE_HFMED VAVQGFGSVGAPAARLLDDYGANVVAVSDVNGAIYD--PDGLDTHAIPTHEEEPEAVMTH 296 DHE_SULSH VIIQGFGNVGSFTAKFLNEMGAKIIGVSDIGGGVIS--DDGIDVNKALEVVQSTGSVVNY 246 * :.* *.*. : ** :: *. * : .*: . : DHE_ECOLI VADYAKEF-GLVYLEGQQPWSLP--VDIALPCATQNELDVDAAHQLIANGVKAVAEGANM 349 DHE_SALTY VADYAREF-GLTYLEGQQPWSVP--VDIALPCATQNELDVDAARVLIANGVKAVAEGANM 349 DHE_BACFR VAPYADEFPGSTFVAGKRPWEVK--ADIALPCATQNELNGEDAKNLIDNNVLCVGEISNM 346 DHE_NEUCR LTSFQHAG-HLKWIEGARPWLHVGKVDIALPCATQNEVSKEEAEGLLAAGCKFVAEGSNM 338 DHE_HFMED DAPETFSNEELLELD----------VDVLIPAAVGNVLTAENADDVQAN---LIVEGANG 343 DHE_SULSH PEGKKVTNEELLTSD----------CDILIPAAVENVINKFNAPKVKAK---LIVEGANG 293 *: :*.*. * : * : : * :* DHE_ECOLI PTTIEATELFQQAG-------VLFAPGKAANAGGVATSGLEMAQNAARLGWKAEKVDARL 402 DHE_SALTY PTTIEATDLFLEAG-------VLFAPGKAANAGGVATSGLEMAQNAARLSWKAEKVDARL 402 DHE_BACFR GCTPEAIDLFIEHK-------TMYAPGKAVNAGGVATSGLEMSQNAMHLSWSAAEVDEKL 399 DHE_NEUCR GCTLEAIEVFENNRKEKKGEAVWYAPGKAANCGGVAVSGLEMAQNSQRLNWTQAEVDEKL 398 DHE_HFMED PTTSAADANFAERG-------VPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRTWSLERVHDEL 396 DHE_SULSH PLAADADEIIKQRG-------IVVIPDILANAGGVVGSYVEWANNKSGGIISDEEAKKLI 346


: * : : *. .*.***. * .* :: . ... : DHE_ECOLI HHIML-----DIHHACVEHGGEGE-QTNYVQGANIAGFVKVADAMLAQGVI---- 447 DHE_SALTY HHIML-----DIHHACVEYGGDNK-HTNYVQGANIAGFVKVADAMLAQGVI---- 447 DHE_BACFR HSIMH-----GIHAQCVKYGTEPDGYINYVKGANIAGFMKVAHAMMGQGII---- 445 DHE_NEUCR KDIMKNAFFNGLNTAKTYVEAAEGELPSLVAGSNIAGFVKVAQAMHDQGDWWSKN 453 DHE_HFMED ETEMLN-----AWSVVRDEYESR--DVPWRDAAYIVALSRIAAAHDARGLWP--- 441 DHE_SULSH IDRMTN-----AFNALYEFHKRKFADQDLRTVAMALRVDRVVG-MKARAI----- 390 * : . ::. :. Figura 28: Alineamiento de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei con GDHs NADP-dependientes.

ECOLI: Escherichia coli; SALTY: Salmonella thiphymorium; BACFR: Bacteroides fragilis; NEURC: Neurospora crassa; HFMED: Haloferax mediterranei; SULSO: Sulfolobus shibatae. En la Figura 28 se han marcado mediante (#) aquellos residuos que se encuentran modificados en las GDHs NADP-dependientes y que son: Gln242 de Hfx. mediterranei, que suele estar sustituido por Serina, Gly248 que suele ser Alanina y Ala264 que se encuentra en todas las NAD-dependientes y sustituida por residuos no polares en la NADP-dependientes. Comparación con diversas GDHs de Archaea Puesto que la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei pertenece al Dominio Archaea, se ha realizado un alineamiento en el que se observa la elevada homología que presenta la enzima halofílica con otras GDHs pertenecientes al mismo Dominio, llegando a existir grandes regiones peptídicas totalmente coincidentes en todas ellas. DHE_HFMED -MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPE 59 DHE_HALSA MTMASKSDSTHDESGDEAADSTEP----ESALETARRQLYHAASYLDIDQNIVERLKYPK 56 DHE_THERMA ------PE--------------------KSLYEMAVEQFNRAASLMDLESDLAEVLRRPK 34 DHE_PYRAB --MVE-----------------------QDPFEIAVKQLERAAQYMKISEEALEFLKRPQ 35 DHE_PYRFU --MVE-----------------------QDPYEIVIKQLERAAQYMEISEEALEFLKRPQ 35 DHE_THERPR --MVE-----------------------IDPFEMAVKQLERAAQYMDISEEALEWLKKPM 35 DHE_AEPYR MEVLALQP--------------------TDPLEEARAQLRRAVDLLGYDDYVYEVLANPD 40 DHE_SULSO --MEEVLS--------------------SSLYTQQVKKLYKVGELLGLDNETLETLSQPE 38 . :: :. . : . * * *


DHE_HFMED AVHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKTE 119 DHE_HALSA KVHEVTIPIERDDGTVEVFTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPDVTRDECVGLGMWMTWKCA 116 DHE_THERMA RVLIVEFPVRMDDGHVEVFTGYRVQHNVARGPAKGGIRYHPDVTLDEVKALAFWMTWKTA 94 DHE_PYRAB RIVEVTIPVEMDDGSVKVFTGFRVQYNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTA 95 DHE_PYRFU RIVEVTIPVEMDDGSVKVFTGFRVQHNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTA 95 DHE_THERPR RIVEVSVPIEMDDGSVKVFTGFRVQHNWARGPTKGGIRWHPAETLSTVKALATWMTWKVA 95 DHE_AEPYR RVLQVRVTIKMDDGTVKTFLGWRSQHNSALGPYKGGVRYHPNVTMNEVIALSMWMTWKNS 100 DHE_SULSO RIIQVKIQIRGSDGKLKTFMGWRSQHNSALGPYKGGVRYHPNVTQDEVEALSMIMTWKNS 98 : * . :. .** :..: *:* *:: . ** ***:*:** * . .* **** DHE_HFMED VRRDGPI-FGGAKGGIAVNPKDLTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGTDPQTM 179 DHE_HALSA VMDL-P--FGGAKGGVAVNPKELSPEEKERLTRRFTQEIRDVIGPNQDIPAPDMGTDPQTM 174 DHE_THERMA VMNL-P--FGGGKGGVRVDPKKLSRNELERLSRRFFSEIQVIIGPYNDIPAPDVNTNADVM 152 DHE_PYRAB VMDL-P--YGGGKGGIIVDPKKLSDREKERLARGYIRAIYDVISPYEDIPAPDVYTNPQIM 153 DHE_PYRFU VMDL-P--YGGGKGGIIVDPKKLSDREKERLARGYIRAIYDVISPYEDIPAPDVYTNPQIM 153 DHE_THERPR VVDL-P--YGGGKGGIIVNPKELSEREQERLARAYIRAVYDVIGPWTDIPAPDVYTNPKIM 153 DHE_AEPYR LAGL-P--YGGGKGGVRVNPKILSPRELELLSRKYFESISDIVGVDQDIPAPDVYTDPQVM 158 DHE_SULSO LLLL-P--YGGGKGGVRVDPKKLTREELEQLSRKYIQAIYKYLGSELDIPAPDVNTDSQTM 156 : * :**.***: *:** *: * * *:* : : :. ******: *:.. * DHE_HFMED AWVMDAYS--MQEGETVPGVVTGKPPIVGGSEGRDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWD-IED 236 DHE_HALSA AWLMDAYS--MQEGETTPGVVTGKPPVVGGSEGREEAPGRSVAIITQLVCEYYDQP-LDE 231 DHE_THERMA AWYMDTYS--MNVGHTVLGIVTGKPVELGGSKGREEATGRGVKVCAGLAMDVLGID-PKK 209 DHE_PYRAB AWMMDEYETIARRKTPAFGIITGKPLSIGGSLGRNEATARGASYTIREAAKVLGWDDLKG 213 DHE_PYRFU AWMMDEYETISRRKTPAFGIITGKPLSIGGSLGRIEATARGASYTIREAAKVLGWDTLKG 213 DHE_THERPR GWMMDEYETIMRRKGPAFGVITGKPLSIGGSLGRGTATAQGAIFTIREAAKALGID-LKG 212 DHE_AEPYR SWFLDEYN--RVKRGQFFGVVTGKPVELGGLNARIVSTGYGVA-VSTRVAAEKFLGGLEG 215 DHE_SULSO AWFLDEYI--KITGKVDFAVFTGKPVELGGIGVRLYSTGLGVATIAKEEAANKFIGGVEE 214 .* :* * .:.**** :** * :.. .. . DHE_HFMED TTVAVQGFGSVGAPAARLL-DDYGANVVAVSDVNGAIYDPDGLDTHAIPTHEEEPEAVMT 295 DHE_HALSA TTVAVQGYGSVGANAARLL-DKWGATIVAISDVNGAMYEPDGIDTASVPSHDEEPEAVTT 290 DHE_THERMA ATVAVQGFGNVGQFAALLISQELGSKVVAVSDSRGGIYNPEGFDVEELIRYKKEHGTVVT 269 DHE_PYRAB KTIAIQGYGNAGYYLAKIMSEDYGMKVVAVSDSKGGIYNPDGLNADEVLKWKREHGSVKD 273 DHE_PYRFU KTIAIQGYGNAGYYLAKIMSEDFGMKVVAVSDSKGGIYNPDGLNADEVLKWKNEHGSVKD 273 DHE_THERPR KKIAVQGYGNAGYYTAKLAKEQLGMTVVAVSDSRGGIYNPDGLDPDEVLKWKREHGSVKD 272 DHE_AEPYR RTVAVQGYGNVGYYAAKFL-AEMGAKIVAVSDSRGGIYDPEGIDPEEALKVKRSTGTVAN 274 DHE_SULSO ARVIIQGFGNVGYYAGKFL-SEMGAKIVGVSDSKGGVINEKGIDVGKAIEIKEKTGSVIN 273 : :**:*..* . : . * .:*.:** .*.: : .*:: ... :* DHE_HFMED HDAPETFSNEELLELDVDVLIPAAVGNVLTAENADDVQANLIVEGANGPTTSAADANFAE 355 DHE_HALSA Y-ADTVISNEELLTLDVDVLIPAALGNVITKENAEAIAADLVVEGANGPTTSTADSILAD 349 DHE_THERMA YPKGERITNEELLELDVDILVPAALEGAIHAGNAERIKAKAVVEGANGPTTPEADEILSR 329 DHE_PYRAB FPGATNITNEELLELEVDVLAPAAIEEVITKKNADNIKAKIVAEVANGPVTPEADEILFE 333 DHE_PYRFU FPGATNITNEELLELEVDVLAPAAIEEVITKKNADNIKAKIVAEVANGPVTPEADEILFE 333 DHE_THERPR FPGATNITNEELLELEVDVLAPAAIEEVITEKNADNIKAKIVAEVANGPVTPEADDILRE 332 DHE_AEPYR YQRGKKISTMEILELPVDILVPAAIEEVITDENADRIKAKIISEGANGPTTTAAEKILVK 334 DHE_SULSO YPEGRKVTNEELLISDCDILIPAALENVINKFNAPKVKAKLIVEGANGPLTADADEIMRQ 333 . .:. *:* *:* ***: .: ** : *. : * **** *. *: :


DHE_HFMED RGVPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRTWSLERVHDELETEMLNAWSVVRDEYES-- 413 DHE_HALSA RDVAVIPDILANAGGVTVSYFEWLQDINRRAWSLERVNDELEAEMQAAWRAVKDEYEN-- 407 DHE_THERMA RGILVVPDILANAGGVTVSYFEWVQDLQSFFWDLDQVRNALEKMMKGAFNDVMKVKEK-- 387 DHE_PYRAB KGILQIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQNITGYYWTLEEVREKLDKKMTKAFYDVYNTAKE-- 391 DHE_PYRFU KGILQIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQNITGYYWTIEEVRERLDKKMTKAFYDVYNIAKE-- 391 DHE_THERPR KGILQIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQNINGYYWTEEEVREKLDKKMTKAFWEVYNTHKD-- 390 DHE_AEPYR KGVLVLPDILANAGGVIMSHIEWVNNRMGGWITDEEALKKLEQKMVENTKTVITYWEKNL 394 DHE_SULSO RGIAVVPDILANAGGVVGSYVEWANNKMGEIISDEEAKKLIVDRMNNAFNTLYDYHQK-K 392 :.: :**:*.***** *:.** :: :.. . : * : :.. DHE_HFMED --RDVPWRDAAYIVALSRIAAAHDARGLWP- 441 DHE_HALSA --RDVTWRDAAYIVALSRIAEAHEARGLWP- 435 DHE_THERMA --YNVDMRTAAYILAIDRVAYATKKRGIYP- 415 DHE_PYRAB --KNIHMRDAAYVVAVQRVYQAMLDRGWVKH 420 DHE_PYRFU --KNIHMRDAAYVVAVQRVYQAMLDRGWVKH 420 DHE_THERPR --KNIHMRDAAYVVAVSRVYQAMKDRGWVKK 419 DHE_AEPYR KPEENSLRDAAYMIAVERVFRAMKLRGWI-- 423 DHE_SULSO KLEDHDLRTAAMALAVDRVVRAMKARGIL-- 421 . : * ** :*:.*: * ** Figura 29: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas de organismos del Dominio Archaea.

HFMED: Haloferax mediterranei; HALSA: Halobacterirum salinarum; THERMA: Themotoga marítima; PYRAB: Pyrococcus abyssi; PYRFU: Pyrococcus furiosus; THERPR: Thermococcus profundus: AEPYR: Aeropyrum pernix; SULSO: Sulfolobus solfataricus. En la Figura 29 se observa que en las GDHs halofílicas existen residuos acídicos (señalados mediante flechas), que no están no presentes en las GDHs no halofílicas de Archaea. Además se han sombreado los residuos observados por Syntichaki y col., (1996) como característicos de las glutamato deshidrogenasas de Archaea. En rojo se señalan los residuos aminoacídicos hidrofóbicos, en azul los residuos ácidos, en verde los no polares y en magenta los básicos.

Para estimar las distancias evolutivas entre pares de secuencias se empleó el programa PRODIST, incluido en el paquete PHYLIP (versión 3,5c desarrollada por J. Felsenstein), utilizando el modelo basado en la matriz de sustitución Dayhoff PAM (Dayhoff, M.O., 1974). La matriz de distancias obtenida se utilizó para dibujar un árbol con el método "neighbor-joining" en el programa NEIGHBOR. La confianza estadística se estimó a través del programa SEQBOOT que genera 100 posibles subconjuntos de alineamientos al azar. El programa CONSENSE permite calcular un árbol consenso de todos los


alineamientos. Todos estos programas también están incluidos en el paquete informático PHYLIP. Los árboles filogenéticos se visualizaron con el programa Treeview 3.2 distribuido por la Universidad de Glasgow.

Este análisis ha confirmado que las glutamato deshidrogenasas hexaméricas pueden

organizarse en dos familias (Figura 31). En la familia I, se encuentran las secuencias para las GDHs de Bacteria y Eucarya. En la familia II se engloban GDHs de los tres dominios. La existencia de dos familias de genes codificando GDHs hexaméricas se ha deducido del alineamiento de las secuencias primarias y del porcentaje de similaridad entre cada par de proteínas (Benachenhou-Lahfa y col., 1993). La NAD-GDH de Hfx. mediterranei se encuentra relacionada con la GDH del archaeon halofílico Hbt. salinarum y con la GDH de la bacteria hipertermofílica T. maritima. El análisis de las secuencias ha confirmado también la pertenencia de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei a la familia II, encontrándose un péptido típico de las GDHs englobadas en dicha familia (EGANGPTT) (Benachenhou-Lahfa, 1994). En la GDH de Bacteriodes fragilis (Abrahams y Abratt, 1998) se han encontrado péptidos que parecen ser característicos de la familia I y que son: ASVNL, KFLGFEQ y RPEATGF. De la misma forma, en la GDH de Penicillium chrysogenum (Díez y col., 1999) existen también estas “huellas “ peptídicas que han llevado a englobarla en la familia I de las GDHs hexaméricas. En la Figura 30 se muestran las regiones para secuencias de GDHs pertenecientes a las familias I y II representadas en el árbol. En subrayado gris se muestran los péptidos que son característicos de las GDHs de la familia II y en negro aquellos que se encuentran en las GDHs englobadas en la familia I. DHE_THELI -------------VEQDP-------------FEIAVKQLERAAQYMDISEEALEFLKRPQ 34 DHE_PYRFU ------------MVEQDP-------------YEIVIKQLERAAQYMEISEEALEFLKRPQ 35 DHE_HFMED -MQTSEPEGSSPNTAEAASQSSEPKPASESALETARRQLYRAADHLDIDPNVVERLKHPE 59 DHE_HALSA MTMASKSDSTHDESGDEAADSTEP----ESALETARRQLYHAASYLDIDQNIVERLKYPK 56 DHE_CLOSY ---SKYVDRVIAEVEKKYADEPEFVQTVEEVLSSLGP--VVDAHPEYEEVALLERMVIPE 55 DHE_ECOLI MDQTYSLESFLNHVQKRDPNQTEFAQAVREVMTTLWP--FLEQNPKYRQMSLLERLVEPE 58 DHE_YEAST ------------------MSEPEFQQAYDEVVSSLEDSTLFEQHPKYRKV--LPIVSVPE 40 DHE_THELI RIVEVSIPVEMDDGSVKVFTGFRVQYNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTA 94 DHE_PYRFU RIVEVTIPVEMDDGSVKVFTGFRVQHNWARGPTKGGIRWHPEETLSTVKALAAWMTWKTA 95 DHE_HFMED AVHEVTVPIERDDGSVSVYTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPGVTRDECVGLRMWMTWKTE 119 DHE_HALSA KVHEVTIPIERDDGTVEVFTGYRAQHDSVRGPYKGGLRYHPDVTRDECVGLGMWMTWKCA 116 DHE_CLOSY RVIEFRVPWEDDNGKVHVNTGYRVQFNGAIGPYKGGLRFAPSVNLSIMKFLGFEQAFKDS 115 DHE_ECOLI RVIQFRVVWVDDRNQIQVNRAWRVQFSSAIGPYKGGMRFHPSVNLSILKFLGFEQTFKNA 118 DHE_YEAST RIIQFRVTWENDKGEQEVAQGYRVQYNSAKGPYKGGLRFHPSVNLSILKFLGFEQIFKNS 100


DHE_THELI V-MDLP--YGGGKGGVICNPKEMSDREKERLARGYVRAIYDVISPYTDIPAPDVYTNPQIM 152 DHE_PYRFU V-MDLP--YGGGKGGIIVDPKKLSDREKERLARGYIRAIYDVISPYEDIPAPDVYTNPQIM 153 DHE_HFMED VRRDGPI-FGGAKGGIAVNPKDLTLDEKERLTRRFTQEIRTIIGPMKDIPAPDMGTDPQTM 179 DHE_HALSA V-MDLP--FGGAKGGVAVNPKELSPEEKERLTRRFTQEIRDVIGPNQDIPAPDMGTDPQTM 174 DHE_CLOSY L-TTLP--MGGAKGGSDFDPNGKSDREVMRFCQAFMTELYRHIGPDIDVPAGDLGVGAREI 173 DHE_ECOLI L-TTLP--MGGGKGGSDFDPKGKSEGEVMRFCQALMTELYRHLGADTDVPAGDIGVGGREV 176 DHE_YEAST L-TGLD--MGGGKGGLCVDLKGRSNNEIRRICYAFMRELSRHIGQDTDVPAGDIGVGGREI 158 DHE_THELI AWMMDEYETISRRKDPSFGVITGKPPSVGGIVARMDATARGASYTVREAAKALGMD----- 208 DHE_PYRFU AWMMDEYETISRRKTPAFGIITGKPLSIGGSLGRIEATARGASYTIREAAKVLGWD---T- 210 DHE_HFMED AWVMDAYSMQEGETVP--GVVTGKPPIVGGSEGRDTAPGRSVAIIAREAIDYLSWD----- 233 DHE_HALSA AWLMDAYSMQEGETTP--GVVTGKPPVVGGSEGREEAPGRSVAIITQLVCEYYDQP----- 228 DHE_CLOSY GYMYGQYRKIVGGFYNG--VLTGKARSFGGSLVRPEATGYGSVYYVEAVMKHEN---DT-- 227 DHE_ECOLI GFMAGMMKKLSN-NTAC--VFTGKGLSFGGSLIRPEATGYGLVYFTEAMLKRHG---MG-- 229 DHE_YEAST GYLFGAYRTYKN-SWEG--VLTGKGLNWGGSLIRPEATGYGLVYYTQAMIDYATNGKES-- 214 DHE_THELI LKGKTIAIQGYGNAGYYMAKIMSEEYGMKVVAVSDTKG-----GIYNPDGLNADEVLAWK 263 DHE_PYRFU LKGKTIAIQGYGNAGYYLAKIMSEDFGMKVVAVSDSKG-----GIYNPDGLNADEVLKWK 265 DHE_HFMED IEDTTVAVQGFGSVGAPAARLL-DDYGANVVAVSDVNG-----AIYDPDGLDTHAIPTHE 287 DHE_HALSA LDETTVAVQGYGSVGANAARLL-DKWGATIVAISDVNG-----AMYEPDGIDTASVPSHD 282 DHE_CLOSY LVGKTVALAGFGNVAWGAAKKL-AELGAKAVTLSGPDG-----YIYDPEGITTEEKINYM 281 DHE_ECOLI FEGMRVSVSGSGNVAQYAIEKA-MEFGARVITASDSSG-----TVVDESGFT-KEKLARL 282 DHE_YEAST FEGKRVTISGSGNVAQFAALKV-IELGGTVVSLSDSKG-----CIISETGIT-SEQVADI 267 DHE_THELI KKTG--------SVKDFPGATNITNEELLEL-------EVDVLAPSAIEEVITKKNADNI 308 DHE_PYRFU NEHG--------SVKDFPGATNITNEELLEL-------EVDVLAPAAIEEVITKKNADNI 310 DHE_HFMED EEPE--------AVMTHDAPETFSNEELLEL-------DVDVLIPAAVGNVLTAENADDV 332 DHE_HALSA EEPE--------AVTTY-ADTVISNEELLTL-------DVDVLIPAALGNVITKENAEAI 326 DHE_CLOSY LEMRA---SGRNKVQDYADKFG--VQFFPGEKPWG--QKVDIIMPCATQNDVDLEQAKKI 334 DHE_ECOLI IEIKA---SRDGRVADYAKEFG--LVYLEGQQPWS--LPVDIALPCATQNELDVDAAHQL 335 DHE_YEAST SSAKVNFKSLEQIVGEYSTFTENKVQYISGARPWTHVQKVDIALPCATQNEVSGDEAKAL 327 DHE_THELI KAK---IVAELANGPTTPEADEILYEKG---------ILIIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQ 356 DHE_PYRFU KAK---IVAEVANGPVTPEADEILFEKG---------ILQIPDFLCNAGGVTVSYFEWVQ 358 DHE_HFMED QAN---LIVEGANGPTTSAADANFAERG---------VPVIPDILANAGGVTVSYFEWLQ 380 DHE_HALSA AAD---LVVEGANGPTTSTADSILADRD---------VAVIPDILANAGGVTVSYFEWLQ 374 DHE_CLOSY VANNVKYYIEVANMPTTNEALRFLMQQ--------PNMVVAPSKAVNAGGVLVSGFEMSQ 386 DHE_ECOLI IANGVKAVAEGANMPTTIEAT-ELFQQ--------AGVLFAPGKAANAGGVATSGLEMAQ 386 DHE_YEAST VAQGVKFVAEGSNMGSTPEAIAVFETARATASTLKESVWYGPPKAANLGGVAVSGLEMAQ 387 DHE_THELI NITGDYWTVEETRAKLDKKMTKAFWDVYNTHKE--KNINMR----DAAYVVAVSRVYQAM 410 DHE_PYRFU NITGYYWTIEEVRERLDKKMTKAFYDVYNIAKE--KNIHMR----DAAYVVAVQRVYQAM 412 DHE_HFMED DINRRTWSLERVHDELETEMLNAWSVVRDEYES--RDVPWR----DAAYIVALSRIAAAH 434 DHE_HALSA DINRRAWSLERVNDELEAEMQAAWRAVKDEYEN--RDVTWR----DAAYIVALSRIAEAH 428 DHE_CLOSY NSERLSWTAEEVDSKLHQVMTDIHDGSAAAAERYGLGYN----LVAGANIVGFQKIADAM 442 DHE_ECOLI NAARLGWKAEKVDARLHHIMLDIHHACVEHGGE-GEQTN----YVQGANIAGFVKVADAM 441 DHE_YEAST NSQRITWSSERVDQELKKIMVNCFNECIDSAKKYTKEGNALPSLVKGANIASFIKVSDAM 447 DHE_THELI KDRGWIKK 418 DHE_PYRFU LDRGWVKH 420 DHE_HFMED DARGLWP- 441 DHE_HALSA EARGLWP- 435 DHE_CLOSY MAQGIAW- 449 DHE_ECOLI LAQGVI-- 447 DHE_YEAST FDQGDVF- 454


Figura 30: Alineamiento de GDHs procedentes de organismos de distintas familias representadas en el árbol. PYRFU: Pyrococcus furiosus; HFMED: Haloferax mediterranei; HALSA: Halobacterium salinarum THELI: Themococcus litoralis; CLOSY: Clostridium symbiosum; ECOLI: Escherichia coli; YEAST: S. cerevisiae. En verde se muestran las GDHS pertenecientes a la familia I y en magenta aquellas englobadas en la familia II.

Figura 31: Árbol filogenético para diversas GDHs.

Familia I

Familia II


Wierenga y col. (1985) identificaron una secuencia conservada característica para la unión con

el coenzima y que corresponde a un plegamiento βαβ denominado de Rossman (En la Figura 32 se

encuentra señalado en rojo). Este plegamiento probablemente representa un dominio primordial de unión a dinucleótidos, que se repite en las deshidrogenasas de la glicólisis y en otras enzimas, ya que descienden de un ancestro común. En este motivo estructural formado por 26 aminoácidos, se encuentran tres residuos de glicina conservados con una secuencia Gly-X-Gly-X-X-Gly, al igual que seis

residuos hidrofóbicos conservados que forman un cluster entre las helices α y las hebras β. Para la NAD-

GDH de Hfx. mediterranei este motivo está presente en los residuos Gly243, Gly245 y Gly248, y el cluster hidrofóbico está formado por los residuos Val239, Val241, Ala252, Leu255, Val263, Val265, estando la

ultima posición ocupada por el Asp267. En la NAD-GDH de Hfx. mediterranei el contenido de hélices α es

del 46,93%, en hebras β es del 37,83% y de plegamiento al azar es del 15,19%.


α1

α2

α3

α4

α5α1

α6

α7

α8

α9

α10

α11

α12 α13

α15

β1 β2

β3

β4

β5

β6

β7

β9

β10

β11

β12

α14

CCGAGGAACGCCACTCGAGTAATGCAGACATCTGAACCTGAAGGGTCGTCCCCTAACACCGCGGAGGCA 48 M Q T S E P E G S S P N T A E A 16 GCGTCTCAGTCCTCGGAGCCGAAGCCAGCGTCGGAGTCGGCGCTCGAAACGGCACGGCGACAGCTCTAC 117 A S Q S S E P K P A S E S A L E T A R R Q L Y 39 CGCGCCGCCGACCACCTCGATATCGACCCAAACGTGGTCGAGCGTCTCAAACACCCGGAAGCAGTCCAC 186 R A A D H L D I D P N V V E R L K H P E A V H 62 GAGGTGACCGTCCCAATCGAGCGCGACGACGGGTCTGTTTCGGTCTACACCGGCTACCGAGCCCAGCAC 255 E V T V P I E R D D G S V S V Y T G Y R A Q H 85 GACAGCGTCCGCGGTCCCTACAAAGGTGGCCTCCGCTATCACCCGGGTGTGACCCGCGATGAGTGCGTC 324 D S V R G P Y K G G L R Y H P G V T R D E C V 108 GGGCTTCGAATGTGGATGACCTGGAAGACCGAAGTGCGCCGCGATGGACCTATCTTCGGCGGCGCGAAA 393 G L R M W M T W K T E V R R D G P I F G G A K 131 GGCGGTATCGCGGTCAACCCGAAGGACCTGACCCTCGACGAGAAAGAACGGCTCACTCGACGGTTCACA 462 G G I A V N P K D L T L D E K E R L T R R F T 154 CAAGAGATTCGAACCATCATCGGGCCGATGAAGGATATCCCGGCACCGGATATGGGGACCGACCCGCAG 531 Q E I R T I I G P M K D I P A P D M G T D P Q 177 ACGATGGCGTGGGTGATGGACGCCTATTCGATGCAGGAAGGCGAGACGGTCCCCGGCGTCGTGACGGGC 600 T M A W V M D A Y S M Q E G E T V P G V V T G 200 AAACCGCCGATTGTCGGTGGGAGCGAAGGCCGTGATACCGCACCCGGTCGCTCGGTTGCCATCATCGCC 669 K P P I V G G S E G R D T A P G R S V A I I A 223 CGCGAAGCCATCGACTACCTCAGTTGGGATATCGAAGACACCACGGTCGCCGTGCAGGGCTTCGGTTCC 738 R E A I D Y L S W D I E D T T V A V Q G F G S 246 GTCGGTGCCCCCGCTGCACGTCTGCTCGATGATTACGGCGCGAATGTCGTCGCCGTCTCCGACGTGAAC 807 V G A P A A R L L D D Y G A N V V A V S D V N 269 GGCGCAATCTACGACCCCGACGGACTGGACACGCACGCAATTCCGACTCACGAAGAAGAACCCGAAGCC 876 G A I Y D P D G L D T H A I P T H E E E P E A 292 GTGATGACGCACGACGCGCCGGAGACGTTTTCGAACGAGGAACTCCTCGAACTCGACGTCGACGTGCTC 945 V M T H D A P E T F S N E E L L E L D V D V L 315 ATCCCGGCGGCGGTCGGCAACGTCTTGACCGCCGAGAACGCCGACGACGTACAGGCGAACCTCATCGTC 1014 I P A A V G N V L T A E N A D D V Q A N L I V 338 GAGGGTGCTAACGGGCCGACGACGAGTGCGGCCGACGCCAACTTCGCCGAGCGTGGGGTTCCGGTCATC 1083 E G A N G P T T S A A D A N F A E R G V P V I 361 CCGGATATTCTCGCCAACGCTGGCGGCGTCACCGTGAGCTACTTCGAGTGGTTGCAGGACATCAACCGG 1152 P D I L A N A G G V T V S Y F E W L Q D I N R 384 CGGACGTGGTCCCTCGAACGCGTCCACGACGAACTCGAAACGGAGATGCTGAACGCGTGGTCGGTCGTC 1221 R T W S L E R V H D E L E T E M L N A W S V V 407 CGCGACGAATACGAGTCGCGCGACGTCCCGTGGCGCGATGCGGCGTACATCGTTGCACTGTCGCGGATT 1290 R D E Y E S R D V P W R D A A Y I V A L S R I 430 GCGGCAGCACACGACGCGCGCGGGCTCTGGCCCTGATTCGTCGGCCTCCGTAGTTCTGCACTCGTCGAC 1323 A A A H D A R G L W P * 441 Figura 32: Predicción de la estructura secundaria de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei. En verde se marcan las hélices α y en

amarillo las hebras β. La zona señalada en color rojo muestra el plegamiento de Rossman (βαβ).


La determinación de la estructura secundaria se realizó con los programas PSIPREDATOR y PSIPREP, obteniendo la misma predicción en ambos programas. La estructura secundaria de la NAD-

glutamato deshidrogenasa de Haloferax mediterranei está formada por 15 helices α y 12 hebras β (Figura

32). En la Figura 33 se muestran los residuos implicados en la unión del 2-oxoglutarato: K93, K117, K131, A169, P170, T199, V371 y S374, y el motivo GGXXGGXXVNPK139 que forma un conformación extendida, siendo similares a los encontrados en la GDH de P. furiosus. Estos residuos se encuentran conservados en todas las secuencias comparadas, con la excepción del residuo P170 de la NAD-GDH estudiada que puede estar sustituido por Gly en algunos casos. Además las GDHs de distintas fuentes muestran un alto grado de similitud en ciertas secuencias, lo que indicaría que estos residuos estarían implicados en la función enzimática de la proteína. Mediante comparación con la GDH de Clostridium

symbiosum (Teller y col., 1992), podríamos asignar a los residuos D166, I167, P168, A169, P170 y D171 de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei un papel importante en la estabilización del centro catalítico.

Figura 33: Imagen tridimensional del motivo de unión del 2-oxoglutarato en la NAD-GDH de Hfx. mediterranei obtenida mediante el programa Swiss-Pdb Viewer 3.51 de Glaxo Welcome Experimental Research.

P138

N137

A135 I134 G133

G132 K131

A130

P170

A169

S374

V371

K117

T199


4.3.7. Construcción del modelo estructural de NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei.

Se han determinado las estructuras tridimensionales de las glutamato deshidrogenasas de C.

symbiosum (Rice y col., 1987), T. maritima (Knapp y col., 1997), T. litoralis (Sedelnikova y col., 1996) y P.

furiosus (Yip-Kitty y col., 1995). Todas ellas presentan un alto grado de similaridad en las secuencias, además, las estructuras de las GDHs de C. symbiosum y P. furiosus presentan un alto grado de homología, sugiriendo que las estructuras 3D están altamente conservadas, pudiendo servir como modelos para otras glutamato deshidrogenasas hexaméricas.

Los 441 residuos que comprenden la cadena polipeptídica de la subunidad de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei, están organizados en dos dominios claramente diferenciados y separados por una profunda hendidura (Figura 34). El modelado del monómero se llevó a cabo mediante sustitución atómica con la GDH de T. marítima.

El Dominio I (color magenta), consiste en una parte del N-terminal de la cadena polipeptídica (residuos 4 al 205) y los residuos desde el 357 hasta el 438 del extremo C-terminal. El Dominio II (color amarillo), algo más pequeño, comprende los residuos del 206 al 356, conteniendo el sitio de unión al coenzima.


Figura 34: Modelado molecular para el monómero de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei, realizado con el programa Swiss-Pdb Viewer 3.51 de Glaxo Welcome Experimental Research. El Dominio I se muestra en color magenta y el Dominio II en amarillo.

4.4. CLONAJE Y EXPRESIÓN DEL GEN NAD-GDH DE Hfx. mediterranei. Una vez secuenciado el gen que codifica la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx.

mediterranei, se amplificó el gen mediante PCR empleando los oligonucleótidos Nad-gdhFOR y Nad-gdhREV, siguiendo la metodología descrita en el apartado 3.5.1. para llevar a cabo su expresión y posterior caracterización.


4.4.1. Electroforesis en gel de agarosa de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei. Una vez finalizada la reacción de amplificación del gen se realizó una electroforesis en gel de agarosa para comprobar que se había amplificado con éxito una única banda del tamaño esperado. La electroforesis se realizó tal y como se describe en el apartado 3.4.3. de Materiales y Métodos. En la Figura 35 se observa una única banda que se corresponde en tamaño con el gen de la glutamato deshidrogenasa.

Figura 35: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la PCR de amplificación. Calle 1: Marcadores de peso molecular Marker III (Fermentas) Calle 2: Banda correspondiente al gen de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei Calle 3: Control de amplificación sin DNA

Se recortó la banda del gel y se purificó para realizar su secuenciación tal y como se describe en el apartado 3.4.5. Comparando con la secuencia original obtenida a partir del fago, se comprobó que el fragmento amplificado se correspondía totalmente con el gen de la NAD-GDH y que éste no había sufrido ninguna mutación.

pb 1 2 3

1323 pb 1584 1375

1904 2027 3530 4268 5148

831 564

21226


Una vez realizada la ligación de la banda correspondiente al gen de la NAD-GDH en el vector pCR2.1 (apdo. 3.5.3), se llevó a cabo la transformación en E. coli NovaBlue con la reacción de ligación (apdo. 3.5.4.2), obteniéndose colonias blancas correspondientes a plásmido con inserto y colonias azules, plásmidos que no llevaban inserto. Se seleccionaron 11 colonias blancas y se aisló el DNA plasmídico tal y como se describe en el apartado 3.5.5. de Materiales y Métodos.

Se realizó una electroforesis en gel de agarosa (Figura 36) comprobándose que se habían obtenido plásmidos con inserto.

Figura 36: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los plásmidos aislados del vector pCR2.1 Calle 1: Marcadores de peso molecular Marker III (Fermentas) Calles 2- 12: Plásmidos aislados 1-11

11 12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pb

1584 1904

831 1375

2027 3530 4268 5148

564

21226


4.4.2. Digestión mediante las enzimas de restricción NdeI y BamHI. Se seleccionó el plásmido que se observa en la calle 2 (Figura 37), puesto que era el que tenía mayor concentración y se secuenció, comprobando que el gen se encontraba completo y sin ninguna modificación. A este plásmido se le llamó p1-pCR2.1. El plásmido p1-pCR2.1. y el vector de expresión pET3a se digirieron con las enzimas de restricción NdeI y BamHI siguiendo la metodología descrita en el apartado 3.5.7. En la Figura 37 se muestra una electroforesis en gel de agarosa en la que se observan dos bandas en la calle 2. La más alta es el plásmido pCR2.1 linealizado y la banda inferior se corresponde con el gen de la NAD-GDH.

Figura 37: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la digestión con NdeI y BamHI Calle 1: Marcadores de peso molecular Marker III (Fermentas) Calle 2: Plásmido p1-pCR2.1 digerido Calle 3: pET3a lineal Calle 4: Plásmido p1-pCR2.1 sin digerir

pb 1 2 3 4

1584 1375 1904 2027 3530 4268 5148

21226


4.4.3. Ligación en el vector de expresión pET3a y transformación en células E. coli NovaBlue. Una vez recortada y purificada la banda inferior, que se observa en la calle 2 de la Figura 37 (gen de la NAD-GDH), se llevó a cabo la reacción de ligación en el vector de expresión linealizado pET3a (calle 3 de la Figura 37). Se realizó una nueva transformación en células E. coli NovaBlue siguiendo la metodología indicada en el apartado 3.5.4.2. La razón de ésta transformación es el aislamiento, secuenciación y conservación del gen de la NAD-GDH en el plásmido de expresión, para futuros ensayos. Además la transformación con un plásmido purificado permite obtener todos los transformantes positivos. Los plásmidos aislados se muestran en la Figura 38.

La eficiencia de transformación para este ensayo fue aproximadamente del 66%, obteniendo 10 plásmidos con inserto de los 15 totales aislados. En la Figura 38 se muestran los plásmidos aislados, observando que se habían obtenido plásmidos con inserto (calles 2, 4, 5, 6, 9, 11, 13, 14, 15 y 16)

Figura 38: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los plásmidos aislados del vector de expresión pET3a + NAD-GDH.

Calle 1: Marcadores de peso molecular Marker III (Fermentas) Calles 2, 4, 5, 6, 9, 11, 13, 14, 15 y 16: plásmidos pET3a con inserto (NAD-GDH) Calles 3, 7, 8, 10 y 12: plásmidos circulares pET3a sin inserto.

3 13 pb 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16

1375 1584 1904 2027 3530 4268 5148

21226


4.4.4. Transformación en E. coli BL21 (DE3). Se seleccionó el plásmido de la calle 6 (Figura 38) al que se le llamó p6-pET3a. Se realizó la transformación con dicho plásmido en células E. coli BL21 (DE3), siguiendo la metodología descrita en los apartados 3.5.4. y 3.5.11.2. En este ensayo se obtuvieron un gran número de transformantes. Todos los transformantes contenían el vector de expresión con el inserto. 4.4.5. Obtención de fracciones celulares y localización de la proteína. Tras crecer en medio líquido, una colonia seleccionada al azar, hasta una DO600 entre 0,5 y 1, se tomó una alícuota para realizar el test de estabilidad del plásmido como se describe en el apartado 3.6.2. En nuestro ensayo con el plásmido pET3a-NAD-GDH, todas las células crecieron en ausencia de aditivos y en presencia de ampicilina, no creciendo colonias en presencia de IPTG, lo que nos llevaba a la conclusión de que el plásmido a expresar era estable. Se realizó una etapa de inducción con IPTG, incubando el cultivo durante 3 horas. Finalizada la inducción se realizó la obtención de las distintas fracciones celulares:

- Fracción celular total - Fracción citoplasmática soluble - Fracción citoplasmática insoluble

Para localizar la fracción de expresión de la NAD-GDH recombinante se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE), como se describe el apartado 3.1.9. de Materiales y Métodos. En el gel se cargaron parte de cada una de las fracciones. En la Figura 39 se observan bandas muy intensas en la fracciones correspondientes a las proteínas totales y fracción insoluble inducida con IPTG; y además, también aparece banda de expresión en las mismas fracciones sin inducir. Esto puede ser debido a que el escape desde el promotor de este tipo de vectores es muy alto por lo que el IPTG no actuaría como regulador de la transcripción.


Figura 39: Expresión de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei en E. coli. Las fracciones obtenidas se muestran en las calles siguientes: Calle 1: Marcadores de peso molecular (Fermentas) Calles 2, 3 y 4: Fracciones celulares de E. coli BL21 (DE3) que contienen el plásmido control pET3a. Calles 5, 6 y 7: Fracciones inducidas con IPTG, proteínas totales, fracción soluble e insoluble respectivamente.

Calles 8, 9 y 10: Fracciones sin inducir, proteínas totales, fracción soluble e insoluble respectivamente.

Las bandas de expresión obtenidas se corresponden en tamaño con la NAD-GDH de Hfx.

mediterranei. La conclusión que se extrae del ensayo es que la proteína expresada se obtiene en forma de cuerpos de inclusión induciendo y sin inducir con IPTG.

116,0

66,2

45,0

35,0

25,0

18,5

1 2 3 4 5 6 7 9 10 8 KDa


4.5. SOLUBILIZACIÓN DE LOS CUERPOS DE INCLUSIÓN, RENATURALIZACIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA NAD-GDH RECOMBINANTE.

La formación de cuerpos de inclusión es independiente del huésped empleado para expresar la proteína, puesto que se han obtenido incluso en la expresión homóloga. No existe tampoco una relación directa entre las características intrínsecas de las proteínas y la formación de los cuerpos de inclusión. Uno de los casos en el que sí se ha encontrado una cierta relación ha sido en las proteínas que forman puentes disulfuro en su estructura. Como consecuencia de la elevada expresión, la concentración de la proteína se ve incrementada y este hecho parece ser la causa de la agregación de la proteína en forma de cuerpos de inclusión. En condiciones óptimas la proteína expresada y acumulada en forma de cuerpos de inclusión, puede llegar a suponer un 50% del total de las proteínas celulares. La gran mayoría de esos cuerpos de inclusión estarán constituidos exclusivamente por la proteína recombinante. Si la proteína expresada se encuentra en forma de cuerpos de inclusión se obtendrá mejor purificación de la proteína expresada, ésta se encontrará también protegida frente al ataque de proteasas presentes en el citoplasma. Los cuerpos de inclusión tienen el inconveniente de que para conseguir la proteína en forma activa se hace necesario un paso previo de solubilización (Lilie y col., 1998).

4.5.1. Solubilización de los cuerpos de inclusión. Como se ha comentado anteriormente, se hace necesaria la solubilización de los cuerpos de inclusión. Para ello, se utilizan agentes caotrópicos y detergentes en los que se desnaturalizan las proteínas. El grado de desnaturalización depende de las proteínas y del agente desnaturalizante utilizado (Tsumoto y col., 2003). Durante el proceso de solubilización se añade un agente reductor como el DTT para mantener los residuos de cisteína en un estado reducido y prevenir la formación no nativa de puentes disulfuro.


En nuestro caso se consiguió la solubilización total de los cuerpos de inclusión con los siguientes tampones:

- Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, conteniendo urea 8 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM. - Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, conteniendo cloruro de guanidinio 6 M, DTT 50 mM y EDTA 2 mM. De los dos tampones empleados, se consiguieron resultados óptimos de renaturalización cuando

se empleó urea en el tampón de solubilización. Con cloruro de guanidinio se conseguía la solubilización de los cuerpos de inclusión pero no la renaturalización posterior de la proteína recombinante, no observándose en ningún caso actividad significativa. 4.5.2. Renaturalización de la NAD-GDH recombinante.

El objetivo de la renaturalización preparativa de proteínas es obtener proteína plegada a partir de cuerpos de inclusión de una forma rápida y utilizando procedimientos sencillos y fácilmente automatizables (Middelberg, 2002). Los métodos que se utilizan para renaturalizar la proteína desnaturalizada se basan en eliminar del medio las altas concentraciones de agentes desnaturalizantes y reductores empleados en la solubilización, creando así un medio idóneo para que las proteínas se plieguen de manera casi espontánea. Entre estos métodos están: dilución, diálisis, filtración en gel y la inmovilización en un soporte sólido (Clark, 2001; Li y col., 2004). En la diálisis, el agente desnaturalizante se va eliminando gradualmente, pero algunas proteínas a concentraciones intermedias de agente desnaturalizante tienden a formar estructuras intermedias, irreversibles e inactivas que forman agregados mediante interacciones hidrofóbicas. En estos casos, es mejor llevar a cabo una dilución rápida en la que la concentración del agente desnaturalizante disminuye rápidamente, evitando la tendencia de la proteína a agregarse. La dilución es el método más utilizado en estudios de plegamiento de proteínas a pequeña escala. En él se diluye la proteína solubilizada directamente en un tampón de renaturalización. Lo más importante es controlar la cantidad de proteína adicionada en el tampón, con la finalidad de mantener una concentración baja de proteína desnaturalizada y evitar la agregación (Hevehan y col., 1997). En general, la concentración de proteína óptima para evitar la formación de agregados se encuentra entre 10 y 50


μg/mL. De cualquier forma las condiciones de renaturalización dependen de cada proteína y deben

optimizarse en cada caso, teniendo en cuenta parámetros externos como la fuerza iónica, el pH, la temperatura y el tiempo de renaturalización (De Bernardez y col., 1999; De Bernardez, 2001).

Una forma de minimizar las interacciones intermoleculares que provocan la agregación durante

el proceso de renaturalización es el mantenimiento de la proteína solubilizada inmovilizada, unida a una matriz. Para poder utilizar éste método, la proteína ha de estar fusionada con un péptido de unión a la matriz, como puede ser una cola de histidinas o que la proteína posea un dominio de unión a la celulosa (De Bernandez-Clark y col., 1998). Cuando la proteína solubilizada queda unida a la columna, ésta se equilibra con tampón de renaturalización y la proteína plegada se eluye de la columna. La proteínas en general pueden ser adsorbidas en columnas de intercambio iónico a baja fuerza iónica y adecuado pH en presencia de elevadas concentraciones de urea (Li y col., 2004).

Para evitar la reagregación de proteínas durante el proceso de plegamiento se utiliza la adición

de moléculas de bajo peso molecular que inhiben la formación de interacciones moleculares. Estas pequeñas moléculas son relativamente fáciles de eliminar una vez que la proteína se encuentra plegada. Los aditivos más comunes son la L-arginina en concentraciones de 0,4 a 1 M, (Arakawa y col., 2003), pequeñas concentraciones de agentes desnaturalizantes como la urea en concentraciones de 1 a 2 M o el cloruro de guanidinio (0,5 a 1,5 M) y detergentes (Chaps, SDS, CTAB y tritón X-100). También se utilizan cofactores específicos como el Zn2+ o el Ca2+ que estabilizan proteínas y previenen la agregación (Carrió, 2002). Se ha visto además que éste último (Ca2+) participa en el plegamiento de algunas proteínas (Smeller, y col., 2004).

Por el contrario se ha comprobado que la agregación puede aprovecharse para el plegamiento

de algunas proteínas hipertermofílicas de Archaea, en las que el plegamiento a partir de cuerpos de inclusión se puede realizar sin llevar a cabo una desnaturalización completa, adicionando para su solubilización cloruro de guanidinio 2 M y eliminándolo posteriormente mediante diálisis Este estudio se ha realizado basándose en las propiedades estructurales de los agregados proteicos (Umetsu y col., 2004).


En el caso de la NAD-glutamato deshidrogenasa recombinante, la renaturalización se llevó a

cabo mediante dilución y diálisis, siguiéndose el proceso espectrofotometricamente mediante la medida de la actividad enzimática.

4.5.3. Renaturalización mediante diálisis. Tras la diálisis de los cuerpos de inclusión solubilizados frente a Gly-NaOH 100 mM, pH 8,0, conteniendo 3,25 mM EDTA y 4 M NaCl al igual que en el tampón Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, conteniendo 3,25 mM EDTA y 4 M NaCl no se consiguió ningún efecto apreciable en la renaturalización de la proteína. Debido a ésto, se descartó la renaturalización mediante diálisis. 4.5.4. Renaturalización mediante dilución. Los primeros ensayos de renaturalización de la proteína expresada se realizaron con cuerpos de inclusión solubilizados en presencia de urea, mediante dilución rápida (1:20) con distintas composiciones de tampones. 4.5.5. Efecto de la composición del tampón en el proceso de renaturalización mediante dilución rápida. La sustancia tamponante, empleada en la preparación de los tampones utilizados, puede ser importante en el proceso de renaturalización de la enzima puesto que su presencia puede suponer interacciones favorables o desfavorables a la hora de realizar la correcta renaturalización de la proteína.

Para estudiar el efecto de la sustancia tamponante en la renaturalización de la NAD-GDH se ensayaron tampones comúnmente utilizados en el estudio de enzimas halofílicas tales como: tampón fosfato, Tris-HCl y Gly-NaOH, tampón óptimo este último para la medida de actividad de la NAD-GDH de Hbt. salinarum (Bonete y col., 1986).


Como se observa en la Figura 40 el tampón más efectivo en el proceso de renaturalización fue el

preparado con glicina. Este resultado puede estar relacionado con el efecto activador que los aminoácidos ejercen sobre algunas glutamato deshidrogenasas como la NAD-GDH de Hbt. salinarum (Bonete y col., 1986; Pérez-Pomares y col., 1999) y con las especiales características de la glicina, ya que es el aminoácido más sencillo lo que podría permitir una más fácil interacción con la proteína en plegamiento. La adición de glicina puede perturbar las fuerzas cohesivas del agua (enlaces de hidrógeno) y por lo tanto, su tensión superficial, como ocurre con la mayoría de sales inorgánicas.

El segundo tampón en efectividad fue el fosfato, que dado el carácter halofílico de la enzima,

puede estar influyendo en la estabilización de la estructura de la misma. Como ya se ha comentado, es sabido que las enzimas halofílicas requieren altas concentraciones salinas para su actividad y estabilidad y poseen respuestas muy variadas para las diferentes sales. El fosfato tendría un efecto estabilizador debido a su capacidad para producir un efecto salting-out (Ugwu y Apte, 2004). Este efecto puede ponerse de manifiesto a pesar de que su concentración, 100 mM, es muy inferior a la de NaCl o KCl (4 M).

El tampón menos efectivo ensayado fue Tris-HCl, posiblemente debido a la carencia de los

efectos que glicina o fosfato pueden ejercer sobre la enzima.


Figura 40: Efecto del tipo de tampón usado en la disolución de renaturalización. En todos los casos la concentración de cada sustancia fue de 100 mM. Se estudió el efecto de la Gly-NaOH ( ), del fosfato (▲) y del Tris-HCl ( ). La concentración de NaCl fue de 4 M conteneniendo EDTA 3,25 mM.

Tiempo (horas)

0 10 20 30 40

Act

ivid

ad U

/mL

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

Gly-NaOH 0,1M

Tris-HCl 0,1MFosfato 0,1M


4.5.6. Efecto de las sales y el EDTA en el proceso de renaturalización.

Puesto que se trata de una enzima halofílica, la concentración y tipo de sal presente en la disolución está estrechamente ligada al mantenimiento de su estructura. El plegamiento correcto de la enzima dependerá en su mayor parte de estos factores. Danson y Hough (1997), explicaron el efecto estabilizador de la sal sobre las proteínas halofílicas en base a la tensión superficial existente en la interfase entre la superficie de la proteína y el agua. El área superficial de la proteína desnaturalizada es mayor que la del estado plegado y por lo tanto éste aumento de la tensión superficial del agua producido por la sal favorece la formación de la proteína nativa compacta. Conforme aumenta la concentración de sal, la tensión superficial del agua aumenta y la proteína se agrega para reducir la accesibilidad del disolvente al área superficial, pudiendo llegar incluso a la precipitación. Sin embargo, la superficie de la proteína está cargada y los grupos polares actúan atrayendo los iones salinos, contrarrestando la exclusión preferencial de la sal o aditivo. Por lo tanto, el efecto neto de la sal en la estructura de la proteína es un balance entre estos dos efectos y variará con la naturaleza del catión y del anión. El NaCl y el KCl son ambos agentes “salting-out” por lo tanto, el problema de una proteína halofílica en concentraciones extremas de sal es atraer las moléculas de agua a su superficie, probablemente en forma de iones hidratados. Al mismo tiempo debe reducir su hidrofobicidad superficial para contrarrestar la tendencia a precipitar a estos niveles de soluto (Danson y Hough, 1997). Por ejemplo, en la estructura de la glucosa deshidrogenasa de Hfx. mediterranei, resuelta a 1,5 Å de resolución se ha identificado un átomo de K+, de los 5 encontrados, que tiene como ligandos moléculas de agua de la primera esfera de hidratación (Esclapez, 2004).

4.5.6.1. Efecto del tipo de sal.

Para estudiar el efecto del tipo de sal, se han escogido el NaCl, principal componente en el

medio externo y KCl, soluto compatible que le permite mantener el equilibrio osmótico. En ambos casos, se realizó el estudio a 4 M de sal. Una vez solubilizados los cuerpos de inclusión y disueltos 1:20 en el tampón Gly-NaOH 100 mM pH, 8,5, conteniendo EDTA 3,25 mM, NaCl ó KCl 4 M se determinó su actividad durante un periodo de tiempo de aproximadamente 100 horas. En ambos casos se obtuvo un


tiempo (horas)

0,0 20,0 40,0 100,0

Act

ivid

ad U

/mL

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

4M NaCl

4M KCl

incremento de la actividad de forma hiperbólica, con un rápido aumento de la actividad en las primeras 20 horas como se observa en la Figura 41. El proceso de renaturalización, seguido mediante medida de actividad, fue a todos los tiempos ensayados superior en presencia de NaCl que con KCl.

Un hecho similar se observa en otras enzimas halofílicas como la glucosa deshidrogenasa de

Hfx. mediterranei (Pire y col., 2001) y la isocitrato deshidrogenasa de Hfx. volcanii (Camacho, y col., 2002).


Figura 41: Renaturalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa en presencia de NaCl y KCl. Los cuerpos de inclusión solubilizados se diluyeron en tampón Gly-NaOH 100 mM, pH 8,5, conteniendo EDTA 3,25 mM y 4 M NaCl ( ) y 4 M de KCl ( ). La renaturalización se monitorizó mediante la medida de actividad a distintos tiempos.


4.5.6.2. Efecto de la concentración de sal.

Para determinar la concentración de sal óptima en el proceso de renaturalización, se ensayaron diferentes concentraciones de NaCl tal y como se describe en el apartado 3.7.4. de Materiales y Métodos. Para concentraciones de NaCl de 2 y 3 M (Figura 42), se observó un 12,5% de la actividad que se obtiene a una concentración de sal de 4 M, indicando una menor efectividad en el proceso de renaturalización. Para 1 M de NaCl no se obtuvo una renaturalización apreciable de la enzima. Estos resultados pondrían de manifiesto la importancia de la concentación de sal que estaría en relación con el carácter halofílico de la enzima y la estrecha relación existente entre la estructura o su estabilidad y la sal presente en el medio. Es de destacar que la NAD-GDH de Hfx. mediterranei también presenta una actividad óptima a 4 M de sal. En otras enzimas halofílicas como la glucosa deshidrogenasa, la renaturalización se obtuvo a concentraciones más bajas del órden de 2 M de NaCl (Esclapez, 2004).


Figura 42: Efecto de la concentración de sales en la renaturalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa. La renaturalización se llevó a cabo en tampón Gly-NaOH 0,1 M, pH 8,5, EDTA 3,25 mM y distintas concentraciones de NaCl: 4 M NaCl ( ), 3 M de NaCl (▲) y 2 M de NaCl ( ). Una vez diluida la proteína, se siguió su actividad con el tiempo.

4.5.6.3. Efecto del EDTA en el proceso de renaturalización.

Se estudió el efecto del EDTA en el proceso de renaturalización de la NAD-GDH recombinante. El EDTA actúa como agente quelante de cationes divalentes, utilizándose de forma habitual en los tampones de renaturalización actuando posiblemente ayudando a la estabilización de la enzima (Esclapez, 2004).

Tiempo (horas)

0 10 20 30 40

Act

ivid

ad U

/mL

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

2M NaCl3M NaCl4M NaCl

Tiempo (horas)

0 10 20 30 40

Act

ivid

ad U

/mL

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

2M NaCl3M NaCl4M NaCl


En la Figura 43 se observa que la presencia del agente quelante EDTA en el tampón de renaturalización ejerce un efecto apreciable en la renaturalización óptima de la enzima de forma que la adición de 3,25 mM en el tampón supone un aumento en la actividad del 37% a las 30 horas de haber iniciado el proceso. En muchos casos la presencia de metales interviene en la renaturalización de la enzima, bien positivamente en enzimas que requieren metales, o en otros casos negativamente interferiendo en el proceso de renaturalización (Britton y col., 2003). En nuestro caso, la presencia de EDTA estaría acomplejando posibles metales traza presentes en la muestra y eliminando así su posible interferencia en el proceso de renaturalización. Figura 43: Renaturalización de la NAD-GDH en presencia/ausencia de EDTA. En presencia de 3,25 mM de EDTA ( ) y en ausencia de EDTA ( ).

tiempo (horas)

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0

Activ

idad

U/m

L

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

Gly-NaOH 0,1 M NaCl 4M EDTA 3,25 mMGly-NaOH 0,1M NaCl 4M


4.5.7. Purificación de la NAD-glutamato deshidrogenasa recombinante. La enzima recombinante se consiguió purificar a homogeneidad en dos etapas cromatográficas como se describe en el apartado 3.8.1. de Materiales y Métodos.

4.5.7.1. Precipitación en presencia de sulfato amónico.

Las características de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei permitieron llevar a cabo una precipitación en presencia de sulfato de amonio 2,5 M como primer paso de purificación. Durante esta etapa, la mayoría de proteínas de E. coli precipitan, quedándose en disolución la NAD-GDH. Esta purificación se siguió mediante medida de actividad enzimática en el sobrenadante y en el precipitado, no encontrándose pérdidas apreciables en el precipitado (Tabla V). Este paso de purificación se emplea con éxito en la purificación de enzimas recombinantes a partir de cuerpos de inclusión (Pire y col., 2001) ya que permite aprovechar las diferencias entre enzimas halofílicas y proteínas no halofílicas contaminantes del huésped mesofílico empleado en la transformación en las células de expresión E. coli BL21 (DE3).

Tabla V: Etapas de purificación para la NAD-glutamato deshidrogenasa recombinante de Hfx.

mediterranei.

Activ. (U/mL)

Vol (mL)

U totales [Prot] (mg/mL)

Activ. Espec. (U/mg)

Factor Rendimiento

Cuerpos Inclusión

0,33 50 16,5 0,05 6,6 1 100

Precipitación Sobrenad. 0,32 50 16 0,05 6,4 1,1 97

Precipitación Pellet 0,06 10 0,06 0,01 6 -- --

DEAE 2,5 5 12,5 0,03 83 12,5 76


4.5.7.2. Cromatografía DEAE-celulosa.

El siguiente paso de purificación consistió en una cromatografía en DEAE-celulosa en presencia de sulfato de amonio. La DEAE-celulosa es una resina intercambiadora de aniones pero en este caso, a causa de la elevada concentración de sales tanto de la muestra como del tampón de equilibrado de la columna, las fuerzas electrostáticas responsables de la separación son parciales o nulas. En estas condiciones la DEAE-celulosa presenta un comportamiento hidrofóbico quedando la proteína halofílica absorbida en la resina de la que se eluye en presencia de oncentraciones adecuadas de NaCl (Pire y col., 2001). La cromatografía se realizó de acuerdo al protocolo descrito en el apartado 3.8.2. Este paso de purificación, además de conseguir la purificación a homogeneidad de la muestra, permitió su concentración (Tabla V) obteniéndose una muestra en condiciones óptimas para su posterior caracterización. La purificación se siguió mediante electroforesis en presencia de SDS tal y como se describe en el apartado 3.1.9. de Materiales y Métodos. El gel de electroforesis se muestra en la Figura 44, en la que se observa, cada una de las etapas de purificación.

Figura 44: Purificación de la NAD-GDH recombinante. Calle 1 y 6: Patrones de peso molecular conocido (Fermentas rango medio). Calle 2: Cuerpos de inclusión solubilizados Calle 3: NAD-GDH recombinante purificada mediante DEAE Calle 4: Precipitación con sulfato amónico Calle 5: NAD-GDH nativa

1 2 3 4 5 6kDa

116,0

66,2

45,0

25,0

35,0

18,4


4.6. CARACTERIZACIÓN DE NAD-GDH NATIVA Y RECOMBINANTE. 4.6.1. Determinación de la Mr de la NAD-glutamato deshidrogenasa mediante tamizado molecular.

Se determinó la masa molecular de la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante mediante una cromatografía de filtración en gel (Sephacryl-S300). Previamente la columna se equilibró con una serie de patrones, calculándose a partir de sus volúmenes de elución los coeficientes de partición Kav tal y como se indica en el apdo. 3.1.10.1 de Materiales y Métodos. La representación del logMr para cada una de las proteínas patrón frente a la Kav dio como resultado una recta (Figura 45). A partir del ajuste de los datos a la recta correspondiente, se obtuvo la ecuación:

LogMr= -4,17 Kav + 3,44

A partir de la ecuación anterior se obtuvieron los valores de Mr para la enzima nativa y

recombinante. En el caso de la NAD-GDH nativa la Mr calculada fue de 310 ± 40 kDa, valor idéntico

dentro del margen de error, al determinado para la NAD-GDH recombinante que fue de 290 ± 38 kDa.


Kav

0,20 0,30 0,40 0,50 0,60

log

Mr

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

recombinantenativa

Figura 45: Determinación de la masa molecular de la NAD-Glutamato deshidrogenasa nativa ( ) y recombinante (▲) mediante tamizado molecular en Sephacryl S300. Los patrones ( ) utilizados para el calibrado de la columna fueron: ferritina (425 kDa), catalasa (240 kDa), aldolasa (158 kDa), albúmina (68 kDa) y citocromo c (12,5 kDa).

4.6.2. Determinación del tamaño de subunidad.

Mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS (SDS-PAGE), se determinó la Mr de la subunidad de la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa. Como se observa en la Figura 46, aparece una única banda electroforética para la NAD-GDH nativa indicando que se logró la purificación de la enzima a homogeneidad. Se realizó la determinación del tamaño de subunidad a partir de la ecuación que relaciona el logMr, para los patrones de masa molecular conocida, con la movilidad relativa (Rf) calculada para cada proteína patrón:

LogMr= -0,972 Rf + 2,02


A partir de la ecuación anterior se obtuvo el valor de Mr para la subunidad de la enzima, que fue

de 54 ± 4 kDa.

Figura 46: Gel de electroforesis en condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS (SDS-page).

Calle 1: patrones de Mr conocida (Fermentas rango medio). Calle 2: NAD-GDH nativa purificada. Calle 3: cuerpos de inclusión solubilizados de la NAD-GDH recombinante.

Como se observa en la Figura 46, (calles 2 y 3), la distancia electroforética es la misma para la enzima nativa purificada que para la enzima recombinante obtenida en forma de cuerpos de inclusión.

45,0

116,0

66,2

35,0

25,0

18,4

kDa 1 2 3


Rf

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

log

Mr

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Figura 47: Determinación de la masa molecular de la subunidad de la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante

( ) mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Los patrones ( ) utilizados fueron: β-galactosidasa

(116 kDa), BSA (66,2 kDa), Ovoalbúmina (45 kDa), Lactato deshidrogenasa (35 kDa), Endonucleasa de restricción (25 kDa), β-

lactoglobulina (18,4 kDa).

Del análisis del gel anterior, se desprende que la movilidad electroforética relativa (Rf) de la

NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante, es exactamente la misma. Esto nos permite confirmar que sus masas moleculares de subunidad son coincidentes. La Mr para la enzima


recombinante calculada a partir de la secuencia conocida es de 47,959 kDa, valor que es inferior al calculado a partir de su movilidad electroforética. Esta aparente discrepancia entre el valor real de Mr de la subunidad, estimada mediante SDS-PAGE, respecto de su valor real es un hecho que se observa frecuentemente en proteínas de origen halofílico, debido a su elevada carga negativa intrínseca (Camacho y col., 1995., Bonete y col., 1996, Hayden y col., 2002). La interacción entre la proteína halofílica con esta elevada carga neta negativa y el detergente aniónico SDS, supone un aumento del tamaño del complejo proteína-SDS, lo que se traduce en una menor movilidad electroforética relativa (Bonete y col., 1996).

El valor real de Mr de la subunidad (47,959 kDa) es idéntico al observado en un gran número de glutamato deshidrogenasas de otras fuentes, contenidas en la Tabla VI, que presentan valores entre 45 y 48 kDa.


Tabla VI: Comparación de masas moleculares de glutamato deshidrogenasas de diversas fuentes.

Fuente coenzima Subunidades Mr (kDa) subunidad

Mr (kDa) de la proteína

Halobacterium salinarum (Bonete y col., 1986)

NAD ---- ---- 148 kDa

Halobacterium salinarum (Bonete y col., 1987)

NADP ---- ---- 215 kDa

Sulfolobus solfataricus (Maras y col., 1992)

NAD(P) 6 46 kDa 266 kDa

Archaeon ES4 (DiRuggiero y col., 1993)

NADP 6 46 kDa 270 kDa

Thermococcus litoralis (Kesen y col., 1994)

NADP 6 45 kDa 270-350 kDa

Pyrococcus furiosus (Consalvi y col., 1991)


Clostridium symbiosum (Syed y col., 1990)

NAD 6 48 kDa 280 kDa

Bacillus acidocaldarius (Consalvi y col., 1994


Thermus thermophilus (Ruiz y col., 1998)


Pyrococus horikoshii (Wang y col., 2003)


Symbiobacterium toebii (Ha y col., 2003)


Thermococcus kodakaraensis (Izumikawa y col., 2004)

NADP 6 47 kDa 280 kDa

De acuerdo con los valores de masa molecular de la subunidad y la masa molecular de la

proteína, se puede concluir que la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei nativa y recombinante es un homohexámero. Puesto que los resultados de la determinación de la masa molecular en ambos casos indican el mismo número de subunidades, la proteína nativa y la recombinante poseerían en principio la misma estructura cuaternaria, lo que nos confirma que la enzima recombinante se encuentra renaturalizada óptimamente.


Como se observa en la Tabla VI existen numerosas glutamato deshidrogenasas NAD-dependientes cuya estructura se corresponde con un hexámero con tamaños comprendidos entre 270 y 289 kDa, valores muy cercanos al de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei con un valor calculado a partir del tamaño de subunidad de 287,754 kDa. Este parecido estaría relacionado con la elevada homología existente en la familia de NAD-GDH hexaméricas. Como también se puede apreciar en la Tabla VI, este parecido se mantiene en la mayoría de las GDHs a pesar de la variedad de los organismos estudiados. 4.6.3. Efecto de la concentración de sales sobre la actividad enzimática.

Una vez purificada la NAD-GDH nativa según se describe anteriormente, se determinó la actividad enzimática a distintas concentraciones de NaCl y KCl en un rango de 0,5 M a 4 M. Los resultados son los que se muestran en la Figura 48.

Se observó un aumento en la actividad de la enzima nativa a medida que se incrementaba la

concentración de sal, siendo ésta máxima a 4 M de NaCl y 4 M de KCl, siendo las concentraciones más altas ensayadas. Se observa una mayor actividad con KCl (Figura 48A). La diferencia de actividad obtenida con ambas sales no fue significativa. Puesto que la sal presente en el medio intracelular es KCl, no es de extrañar que la enzima muestre más actividad con esta sal ya que, in vivo, es la que se encarga de estabilizar la enzima.

Igualmente, una vez purificada la NAD-GDH recombinante, se procedió a determinar su

comportamiento ante la concentración de sal, obteniéndose los resultados que se muestran en la Figura 48B. Como se puede observar, también en éste caso se obtuvo un aumento de actividad al incrementar la concentración de sal con una mayor actividad a 4 M, la máxima concentración ensayada tanto para NaCl como para KCl. La actividad obtenida con KCl también fue en éste caso, fue ligeramente superior a la obtenida con NaCl (Figura 48B).


Concentración sal (M)

0 1 2 3 4 5

Act

ivid

ad U

/mL

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

NaClKCl

Concentración sal (M)

0 1 2 3 4 5

Act

ivid

ad U

/mL

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

NaClKCl

Figura 48: Efecto de la concentración de NaCl ( ) y de la concentración de KCl ( ) en la actividad de la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa (Gráfica A) y en la enzima recombinante (Gráfica B) de Hfx. mediterranei medida en tampón Gly-NaOH 0,1 M, pH 8.0.

A

B


La NAD-glutamato deshidrogenasa tanto nativa como recombinante, presenta un comportamiento típicamente halofílico similar al encontrado para otras enzimas de organismos halofílicos, tanto del Dominio Archaea como de Bacteria.

En Hfx. mediterranei también se encuentra una actividad glutamato deshidrogenasa NADP-

dependiente (Ferrer y col., 1996) con un máximo de actividad a 2 M de NaCl y 1 M de KCl, siendo ligeramente más activo en KCl que en NaCl (Ferrer y col., 1996).

Las glutamato deshidrogenasas presentes en el archaeon Halobacterium halobium, NAD-

glutamato deshidrogenasa (Bonete y col., 1986) y NADP-glutamato deshidrogenasa (Bonete y col., 1987), presentan un aumento de su actividad al aumentar la concentración de sales en el medio de reacción, observándose por el contrario una mayor actividad con NaCl que con KCl, con valores máximos de actividad de 3,2 M de NaCl y 0,8 M de KCl para la enzima NAD-dependiente y 1,6 M de NaCl y KCl para la enzima NADP-dependiente.

Sin embargo, también se encuentran algunas enzimas halofílicas cuya actividad máxima se

obtiene a concentraciones de sal mucho más bajas, entre ellas la glucosa deshidrogenasa de Hfx.

mediterranei cuyo óptimo de actividad es 1,75 M de NaCl y 1,3 M de KCl. En éste caso, también son parecidos los valores obtenidos con ambas sales aunque ligeramente menores con KCl (Bonete y col., 1996).

En el Dominio Bacteria, encontramos también organismos halofílicos tales como Salinibacter

ruber (Antón y col., 2002). Salinibacter ruber presenta concentraciones intracelulares de ion potasio similares a las de las arqueas halofílicas Halobacterium salinarum y Haloarcula marismortui (Antón y col., 2002), indicando que ésta bacteria utiliza una estrategia similar de adaptación a altas concentraciones salinas. En Salinibacter ruber se encuentran dos actividades glutamato deshidrogenasa GDHI y GDHII (Oren y Mana, 2002; Bonete y col., 2003) una de las cuales presenta un comportamiento similar al encontrado en nuestro caso, con una actividad más elevada a mayores concentraciones de NaCl y una estabilidad dependiente de la concentración de sal. Sin embargo la GDHI, presenta un máximo de


actividad en ausencia de sales, pero sigue mostrando un comportamiento halofílico en cuanto a estabilidad se refiere (Bonete y col., 2003). Se ha encontrado un comportamiento contrario en la malato deshidrogenasa del mismo organismo, siendo completamente estable en ausencia de sal (Madern y Zaccai., 2004).

La NAD-glutamato deshidrogenasa lleva a cabo su función en un medio en el que la

concentración salina es muy elevada ya que Hfx. mediterranei, acumula altas concentraciones de KCl en su interior para contrarrestar la elevada presión osmótica a la que se ve sometido en su medio natural (Kushner, 1985). El hecho de que la enzima pueda ejercer su función de forma óptima tanto con NaCl como con KCl, es una característica común observada en otras enzimas halofílicas. Aunque en el interior de la célula el ion predominante es el K+ las enzimas halofílicas suelen presentar, in vitro, una actividad y estabilidad similar con Na+ probablemente debido al parecido químico de ambos iones. 4.6.4. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. Los ensayos de actividad a distintas temperaturas para la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante, se muestran en la Figura 49, en la que se representa Vapp vs T. En ella se puede observar que en el rango estudiado (283K hasta 353K) la actividad aumenta hasta alcanzar un valor máximo a 60ºC para la enzima nativa, encontrándose exactamente el mismo valor de temperatura óptima para la enzima recombinante. A partir de los 70ºC se produce un descenso pronunciado de la actividad enzimática.


Figura 49: Efecto de la temperatura en la actividad enzimática. Comparación de actividades en la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa ( ) y recombinante ( ). Del máximo de cada curva se determinó la temperatura óptima para la reacción de aminación reductiva de la enzima.

El rango de temperaturas en el que la actividad enzimática está cercana al máximo, comprende

desde 50 a 70ºC con un máximo bien definido a 60ºC. Estos valores están muy cercanos a los que se encuentran para las glutamato deshidrogenasas NAD y NADP-dependientes de Halobacterium salinarum

que muestran un máximo de actividad a 70ºC tanto para las reacciones de aminación como para las de desaminación (Bonete y col., 1986; 1987). Este comportamiento también se observa en la NADP-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei con una temperatura óptima de 60ºC (Ferrer y col., 1996).

Otras enzimas de este organismo, como la α-amilasa extracelular, tienen también temperaturas óptimas

del órden de 50-60ºC (Perez-Pomares y col., 2003) y para nitrito y nitrato reductasas del mismo

temperatura K

280 300 320 340 360

V app (%

)

0

20

40

60

80

100

120

NAD-GDH Nativa

NAD-GDH Recombinante

T


organismo la temperatura óptima de actividad se encuentra en 60°C y 70°C, respectivamente (Martínez-Espinosa y col., 2001; Lledó y col., 2004).

Esta elevada temperatura óptima que comprende un rango de entre 55-70ºC es una

característica común en las enzimas de los organismos halofílicos y suele ir acompañada de una alta termoestabilidad. El carácter termofílico de las enzimas halófilas, ha sido descrito en varios sistemas. Dym y col. (1995) encontraron a partir de la estructura cristalográfica de la malato deshidrogenasa de Haloarcula marismortui, que varios de los motivos estructurales que confieren el carácter halofílico son los mismos que aquellos que contribuyen a la estabilidad de enzimas termofílicos. Estas enzimas se caracterizan por un incremento en el número de puentes salinos y la introducción de residuos aminoacídicos con carga negativa en la secuencia amino terminal (Dym y col., 1995). Esta similitud de las enzimas halofílicas con las termofílicas es tan estrecha que sus temperaturas óptimas pueden llegar a ser incluso del mismo rango como ocurre en la NADP-glutamato deshidrogenasa del archaeon hipertermofílico Archaeoglobus fulgidus que tiene una temperatura óptima de entre 60-80 ºC. (Schreier, 2000). Recientemente se ha caracterizado la glutamato deshidrogenasa de Symbiobacterium toebii, un termófilo, con una temperatura óptima de actividad de 60°C (Ha y col., 2003). De todas formas la temperatura óptima para las glutamato deshidrogenasas de otros organismos termofílicos, suelen estar alrededor de los 90ºC (Ruiz y col., 1998).

Esta alta temperatura óptima de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei, y de las

enzimas halofílicas en general, puede considerarse una respuesta adaptativa a las altas temperaturas que éstos organismos tienen que soportar en sus hábitats salinos naturales, esto es, salinas expuestas a intensa luz solar.

4.6.5. Efecto del pH en la actividad enzimática. Se estudió el efecto del pH en la actividad enzimática de la NAD-glutamato deshidrogenasa tanto para la enzima nativa como recombinante. El estudio, se realizó en presencia de 4 M de NaCl y 4 M de KCl en un rango de pHs comprendido entre 6,3 y 9,5. La enzima nativa, exactamente igual que la


recombinante, mostró el mismo comportamiento frente al pH en presencia de ambas sales, aunque la actividad fue ligeramente superior en 4 M de KCl. Como se muestra en las Figuras 50A y 50B, el perfil de la curva es creciente a pHs por encima de 6,3 y decrecientes a partir de pHs 8,5, encontrándose una actividad óptima para la nativa y recombinante a pHs entre 8,0 y 8,5, tanto en el ensayo con NaCl como en el de KCl (Figura 50).

El pH influye en la velocidad de la reacción enzimática ya que los centros activos de las enzimas están frecuentemente formados por grupos ionizables que deben encontrarse en su forma iónica correcta para mantener la forma adecuada del centro activo, permitir la unión de los sustratos, y catalizar la reacción (Segel, 1993). La distribución de la enzima entre las distintas formas iónicas depende por lo tanto del pH y de las constantes de ionización de los residuos aminoacídicos (Fersht, 1985; Camacho y col., 1993). Este rango óptimo de pHs es idéntico al encontrado para la NADP-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediteranei cuya actividad alcanza un valor máximo a pH 8,5 (Ferrer, y col., 1996). El archaeon hipertermófilo Thermococcus litoralis posee una NADP-glutamato deshidrogenasa con un pH óptimo de 8,0 (Ma y col., 1994) y el termófilo Symbiobacterium toebii con un pH óptimo de 9,0 (Ha y col., 2003). La levadura halotolerante Debaryomyces hansenii posee también una glutamato deshidrogenasa con un pH óptimo de 8,0 (Alba-Lois, y col., 2004).


pH

6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

V app U

/mL

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16KClNaCl

pH

6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

V app U

/mL

0,04

0,08

0,12

0,16

0,20

0,24 KClNaCl

Figura 50: Efecto del pH en la actividad de la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa (Grafica A) y en la enzima recombinante (Grafica B) medidos en Bis-Tris Propano 100 mM, a una concentración de NaCl 4M ( ) y a una concentración de KCl 4M ( ).

A

B


4.6.6. Determinación de parámetros cinéticos. Se determinó la actividad de la NAD-glutamato deshidrogenasa en ambos sentidos de reacción, encontrándose que, en todas las condiciones ensayadas (coenzima, concentración de sustratos, tipo de tampón, temperatura), no se encontró una actividad apreciable en el sentido de desaminación oxidativa. Por otro lado, la enzima mostró una alta actividad cuando se midió en el sentido de aminación reductiva utilizándose como coenzima el NADH, tal y como se describe el apdo. 3.1.5. Cuando se realizaron los ensayos con NADPH como coenzima, no se detectó actividad. Resultados similares se encontraron para la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante.

Una vez se determinaron las condiciones óptimas de concentración de sales, temperatura, y pH, se procedió al estudio del comportamiento cinético de la enzima. Para ello se determinó la actividad de la enzima en tampón Bis-Tris Propano 100 mM, pH 8,0, conteniendo 4 M NaCl a 40ºC, manteniendo constantes las concentraciones de dos de los sustratos y variando el tercero. La representación de la actividad enzimática frente a la concentración de este sustrato mostró en todos los casos cinéticas tipo Michaelis-Menten. El ajuste de los datos a la ecuaciones (1) y (2) detalladas en el apartado 3.1.11. de Materiales y Métodos, permitió calcular los parámetros cinéticos, Vapp, Kmapp y Vapp/Kmapp (Tabla VII). Se obtuvieron valores similares en ambos casos.


Tabla VII: Parámetros cinéticos para la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante de Haloferax mediterranei determinada en tampón Bis-Tris Propano 100 mM, pH 8,0, conteniendo 4M NaCl.

NAD-GDH Nativa NAD-GDH Recombinante

Sustrato Vapp (U/mL) Kmapp (mM) Vapp/Kmapp Vapp (U/mL) Kmapp (mM) Vapp/Kmapp

2-KG 0,67±0,01 2,33±0,11 288±10 0,77±0,03 2,5 ± 0,2 306±22

NH4+ 1,14 ±0,15 90±20 12,4±1,2 1,06 ±0,07 53± 6 20,0±1,3

NADH 0,59±0,006 13,3.10-3±0,8.10-3 44±2 0,728±0,005 13,1.10-3 ±0,5.10-3 55±1,9

El hecho de que la enzima no fuese capaz de actuar utilizando como coenzima NADPH y sí con

NADH, es indicativo de la especificidad por el coenzima típica de la mayoría de las glutamato deshidrogenasa de Archaea. En el organismo, encontramos por lo tanto, dos actividades glutamato deshidrogenasa que difieren en su especificidad por el coenzima. La NADP-glutamato deshidrogenasa (Ferrer y col., 1996) presenta una alta actividad en el sentido de aminación reductiva, siendo su Km para 2-oxoglutarato de 0,34 mM, valor inferior al encontrado para la NAD-glutamato deshidrogenasa de 2,5 mM, indicando una menor afinidad por este sustrato.

Para el NH4+ en cambio, la NADP-GDH presenta un valor de 4,2 mM frente a valores entre 53 y

90 mM encontrados en nuestro caso e indicativos de que la enzima precisa de elevadas concentraciones de amonio para poner de manifiesto su actividad. Los valores de Km para el respectivo coenzima, fueron de 18x10-3 mM para la NADP-GDH y de 13x10-3 mM para la NAD-GDH, valores muy similares.

El valor de Km para el NH4+ de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei (53 mM) es mucho menor que el encontrado para la NAD-glutamato deshidrogenasa de Halobacterium salinarum de 450 mM (Bonete y col., 1986), en cambio, la Km para el 2-oxoglutarato presenta un valor de 2,5 mM en la NAD-GDH de Hfx. mediterranei frente a 20,2 mM en Hbt. salinarum y la Km para el NADH, es 0,07 mM (Bonete y col., 1986) muy superior al encontrado en nuestro caso.


4.6.7. Efecto de las sales sobre la estabilidad.

Para estudiar el efecto de la concentración de sales en la estabilidad de la NAD-glutamato deshidrogenasa tanto nativa como recombinante, se determinó la actividad de la enzima en función del tiempo de incubación en distintas concentraciones de NaCl en un rango comprendido entre 0,5 M y 3 M. Se observó una disminución de la actividad en función del tiempo, que fue mayor a menores concentraciones salinas mostrando la enzima total estabilidad en 3 M de NaCl.

De la representación del logaritmo de la actividad residual frente al tiempo se obtuvieron un

conjunto de rectas (Figura 51) con pendientes que mostraban un aumento en valor absoluto al disminuir la concentración salina.


Tiempo (horas)

0 40 80 120 160

log

(%A

ctR

es)

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

2M NaCl3M NaCl

1M NaCl0,5M NaCl

Tiempo (horas)

0 40 80 120 160

log

%Ac

tvR

esid

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

2M NaCl3M NaCl

1M NaCl0,5M NaCl

Figura 51: Efecto de la concentración de sal en la estabilidad de la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa (A) y recombinante (B) de Hfx. mediterranei en un rango de 0,5 M a 3 M de NaCl. La enzima ha sido incubada en tampón Bis-Tris propano 100 mM, pH 8,0 conteniendo la concentración correspondiente de sal.

A

B


En la Tabla VIII se comparan los tiempos de vida media para la enzima nativa y recombinante a 0,5 y 3 M de NaCl. Tabla VIII. Estudios de estabilidad para la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante. Las vidas medias han sido determinadas a partir de la representación del logaritmo del porcentaje de actividad residual frente al tiempo.

Nativa Recombinante

[NaCl] (M) t/1/2 (horas) t/1/2 (horas)

0,5 2,0 ± 0,2 4,9 ± 0,4

3,0 442 ± 23 927 ± 74

La estabilidad de la enzima, es aproximadamente 200 veces mayor a 3 M que a 0,5 M tanto en la

enzima recombinante como en la nativa. A partir de éstos resultados (Figura 51), se observa una total dependencia de la enzima, por

elevadas concentraciones salinas para su estabilidad, hecho muy común en la mayoría de enzimas halofílicas y que pone de manifiesto su carácter halofílico. Por lo tanto, la alta concentración de sal es importante tanto para una actividad óptima como para su estabilidad (Arakawa y Tokunaga, 2004).

Por ejemplo, la malato-deshidrogenasa de Haloarcula marismortui pierde su estructura y se

disocia a concentraciones de sal por debajo de 2,5 M (Eisenberg y col., 1992). De la misma manera, la dihidrolipoamida deshidrogenasa del mismo organismo pierde su actividad en ausencia de elevadas concentraciones de NaCl o KCl (Danson y col., 1986).

Este comportamiento contrasta con el de la NADP-GDH de Hfx. mediterranei (Ferrer y col. 1996),

enzima que a bajas concentraciones salinas muestra cierta estabilidad de forma que a 0,5 M de NaCl sigue manteniendo más de un 50% de su actividad residual por encima de las 47 horas o la glucosa


deshidrogenasa del mismo organismo para la cual la vida media es de 163 horas a 0,5 M de NaCl (Bonete y col., 1996).

La estabilización o desestabilización de las estructuras proteicas por disoluciones con elevadas

concentraciones salinas probablemente se debe a la modificación de las interacciones hidrofóbicas por la presencia de iones salinos.

Ciertas sales estabilizan estructuras proteicas y otras las desestabilizan, por ejemplo, iones

fosfato y sulfato poseen un carácter “salting-out” comportándose como agentes estabilizadores de la estructura proteica plegada a altas concentraciones de sal. Por otro lado, los iones litio, magnesio, bromuro y tiocianato son iones “salting-in” que rompen agregados proteicos y favorecen el despliegue de algunas proteínas. Los iones sodio, potasio y cloruro pueden ser considerados neutros o ligeramente “salting-out” (Arawaka y col., 1984).

La estabilización de proteínas halofílicas en disoluciones conteniendo altas concentraciones

salinas se ha discutido basándose en peculiaridades de su composición tales como la alta proporción de residuos aminoacídicos de carácter ácido en su superficie comparada con sus proteínas homólogas no halofílicas (Esclapez, 2004).

Zaccai en 1989, propuso que la malato deshidrogenasa de Halobacterium marismortui se

estabiliza por diferentes mecanismos dependiendo del tipo de sal en el que es activa la enzima, por ejemplo, cuando la disolución contiene fosfato de potasio, el modelo de estabilización es predominantemente del tipo “salting-out” sin embargo cuando las sal es KCl propone un modelo en el que la proteína estaría estabilizada por una red de hidratación en su estructura cuaternaria, formada por dímeros de proteína, moléculas de agua e iones salinos (Zaccai y col., 1989).

El efecto predominante en el plegamiento y estabilización de la estructura proteica son las

interacciones del tipo hidrofóbico. Zaccai y Einserberg (1990), explicaron los efectos del disolvente sobre el plegamiento y solubilidad de las proteínas dominadas por interacciones hidrofóbicas, así, por ejemplo,


el agua no es un buen disolvente para los residuos aminoacídicos apolares proporcionando un aumento de los efectos hidrofóbicos, los cuales contribuyen al plegamiento de la proteína de forma que éstos quedan apantallados frente al disolvente. La importancia del entorno en el que está la enzima, se está poniendo de relieve por estudios de mutagénesis dirigida en proteínas tanto halofílicas como no halofílicas. A partir de éstos estudios en proteínas no halofílicas se ha observado que la contribución a la estabilidad de la estructura proteica por parte de las interacciones disolvente-proteína expuesta es mínima, siendo las interacciones hidrofóbicas las dominantes (Matthews, 1993).

4.7. ANÁLISIS MEDIANTE NANOELECTROSPRAY LC/MS DE LA NAD-GDH NATIVA. Este análisis se aplica para realizar la identificación y caracterización de proteínas mediante análisis peptídico. Se han realizado estudios de fragmentación de proteínas con proteasas con la finalidad de conocer las propiedades funcionales de la enzima original, permitiendo la identificación de dominios funcionales. Este tipo de estudio se ha llevado a cabo en la glutamato deshidrogenasa de Clostridium

symbiosum en la que se ha detectado un lazo termicamente sensible (Aghajanian y col., 2003).

Igualmente, este análisis de péptidos en diversas proteínas puede ser utilizado con la finalidad de caracterizarlas y/o identificarlas. La glutamato deshidrogenasa de Psychrobacter sp. TAD1 se ha digerido de igual forma permitiendo obtener un péptido identificativo de la GDH (Camardella y col., 2002). El análisis mediante Nanoelectrospray LC/MS de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei ha permitido confirmar que la NAD-GDH nativa y recombinante son la misma enzima.

La figura 52 muestra los espectros obtenidos en la secuenciación aminoacídica de los diferentes péptidos.


Figura 52: Se muestran los espectros de masas de cada uno de los 4 péptidos. En la parte superior de cada ventana

se observa la secuencia aminoacídica correspondiente


Figura 53: Resultados del análisis de LC/MS.


A partir de la NAD-GDH nativa purificada, se obtuvieron y secuenciaron 4 péptidos, cuya secuencia supone un 6% del total de los residuos que componen la secuencia aminoacídica de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei. Dichas secuencias peptídicas se encontraban contenidas en la secuencia de la enzima halofílica previamente depositada en las bases de datos. Además dichos péptidos parecen ser exclusivos de esta enzima, puesto que al realizar su comparación con las bases de datos disponibles, se obtuvo coincidencia unicamente con la NAD- glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei.

Se localizaron los peptidos en la secuencia conocida de la NAD-GDH como se indica en la

Figura 54.

1 MQTSEPEGSS PNTAEAASQS SEPKPASESA LETARRQLYR AADHLDIDPN 51 VVERLKHPEA VHEVTVPIER DDGSVSVYTG YRAQHDSVRG PYKGGLRYHP 101 GVTRDECVGL RMWMTWKTEV RRDGPIFGGA KGGIAVNPKD LTLDEKERLT 151 RRFTQEIRTI IGPMKDIPAP DMGTDPQTMA WVMDAYSMQE GETVPGVVTG 201 KPPIVGGSEG RDTAPGRSVA IIAREAIDYL SWDIEDTTVA VQGFGSVGAP 251 AARLLDDYGA NVVAVSDVNG AIYDPDGLDT HAIPTHEEEP EAVMTHDAPE 301 TFSNEELLEL DVDVLIPAAV GNVLTAENAD DVQANLIVEG ANGPTTSAAD 351 ANFAERGVPV IPDILANAGG VTVSYFEWLQ DINRRTWSLE RVHDELETEM 401 LNAWSVVRDE YESRDVPWRD AAYIVALSRI AAAHDARGLW P


Figura 54: Secuencia aminoacídica de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei. Los péptidos que se han identificado mediante nanoLC/MS se muestran en negrita y subrayados. Se obtuvieron cuatro mediante la digestión con tripsina de la GDH nativa, péptidos cuya secuencia aminoacídica coincide perfectamente con la de la enzima recombinante obtenida a partir del clonaje y secuenciación del gen.

En la Tabla IX se indican los péptidos obtenidos en la enzima nativa y las posiciones

correspondientes en la secuencia aminoacídica recombinante.

Tabla IX: Secuencia aminoacídica de los péptidos obtenidos mediante LC/MS y su posición correspondiente en la secuencia de la NAD-GDH recombinante de Hfx mediterranei.

Secuencia aminoacídica de los péptidos obtenidos de la NAD-GDH nativa.

Posición en la secuencia de la NAD-GDH recombinante

RFTQEIRT 152-160

KDLTLDEKERL 139-149

KDLTLDEKE 139-147

RAADHLDIDPNVVERL 39-55

Estos resultados nos permiten concluir que ambas enzimas son idénticas.


5. CONCLUSIONES. Las conclusiones del trabajo realizado en esta Tesis Doctoral son las siguientes:

• Los resultados obtenidos muestran claramente que las dos actividades de glutamato deshidrogenasa detectadas en Haloferax mediterranei, corresponden a diferentes productos génicos y no a único gen con actividad dual por el coenzima.

• Uno de estos genes se ha expresado de forma heteróloga en E. coli, correspondiendo a la actividad NAD-glutamato deshidrogenasa.

• La caracterización conjunta de ambas enzimas, nativa y recombinante, ha demostrado que presentan las mismas propiedades cinéticas y moleculares.

• Los resultados derivados del análisis de Nanoelectrospray LC/MS, han permitido confirmar que la NAD-GDH nativa y la recombinante son la misma enzima.

• El análisis comparativo de las secuencias revela que los residuos clave en el mantenimiento de las propiedades catalíticas de la enzima se encuentran en general conservados, independientemente del carácter halofílico de la enzima o del Dominio al que pertenece el organismo.

• Al igual que otras enzimas halofílicas, la NAD-glutamato deshidrogenasa de Haloferax

mediterranei posee cierto comportamiento termofílico y su composición aminoacídica presenta similitudes que están relacionadas con la termoestabilidad de las GDHs aisladas de organismos termófilos.

• Los análisis filogenéticos realizados nos permiten concluir, que la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei es una enzima perteneciente a la Familia II de las GDHs hexaméricas, encontrándose además una secuencia peptídica (EGANGPTT), entre los residuos 339 al 346, característica de esta Familia y la ausencia de las regiones peptídicas características de la Familia I de las glutamato deshidrogenasas hexaméricas.


• Los 441 residuos aminoacídicos que comprenden la cadena polipeptídica de la subunidad de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei, están localizados, según estudios de modelado molecular, en dos dominios separados por una profunda hendidura. El dominio I contiene la mayoría de los residuos responsables de las interacciones entre las subunidades del hexámero. El dominio II contiene el sitio de unión del coenzima.


6. TRABAJO FUTURO.

Realizar estudios de cristalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa recombinante para poder determinar la estructura tridimensional mediante cristalografía de Rayos X.

Realizar estudios de mutagénesis dirigida encaminados a adaptar la estabilidad de la enzima en

diferentes entornos.

Determinación completa de la secuencia aminoacídica del gen que codifica la GDHII y expresión del gen para verificar si se trata de otra glutamato NAD-dependiente o si por el contrario se trata de la NADP-glutamato deshidrogenasa.


7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

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8. APÉNDICE I.

• SOLUCIONES EMPLEADAS EN ELECTROFORESIS DE AGAROSA:

Tampón TAE 10X:

Ajustar el pH a 8,4

Tampón de carga 6X:

0,25 % Azul de bromofenol

0,25 % Xileno cianol

40 % Sacarosa

Tris-Acetato 0,4 mM

EDTA 10 mM

Ácido acético 0,2 M


• MEDIOS DE CULTIVO:

SOC 1L

20 g Triptona

5 g Extracto de Levadura

0,6 g NaCl

0,2 g KCl

2,05 g MgCl2

2,45 g MgSO4

3,6 g Glucosa

Ajustar el pH a 7 y autoclavar

LB (Luria Bertani) 1L

10g Bacto Triptona

5g Extracto de Levadura

10 g NaCl

Ajustar el pH a 7,5 con 1M NaOH y autoclavar


- SOLUCIONES SDS-PAGE:

Tampón de muestra (2X Sample Buffer):

Ajustar el pH a 6,8

Preparación del gel separador y del concentrador

Gel Separador

4 mL 30% Acrilamida/Bisacrilamida

2,5 mL Tris-HCl 1,5 M pH 8,8

3,35 mL Agua destilada

100 μL SDS 10%

50 μL Sulfato amónico 10%

5 μL TEMED

80mM Tris-HCl

100mM DTT

2% SDS

0,006% Azul de Bromofenol

15% Glicerol


Gel concentrador

1,3 mL 30% Acrilamida/Bisacrilamida

2,5 mL Tris-HCl 0,5 M pH 6,8

6,10 mL Agua destilada

100 μL SDS 10%

50 μL Sulfato amónico 10%

10 μL TEMED

Tampón de recorrido 5X, 1 L:

15g Tris-HCl

72g Glicina

3g SDS

Ajustar el pH a 8,3 con HCl

Azul Coomassie 0,1 %:

Diluir 0,2g de Azul Coomassie R-250 en 200 mL de la solución 40% metanol, 10% ácido acético.


- SOLUCIONES DE HIBRIDACIÓN:

20XSSC

3 M NaCl

0,3 M Na3Citrato.2H2O

Ajustar el pH a 7,0 con HCl

Solución Bloqueante

Blocking Reagent (Roche Molecular Biochemicals) 10% (p/v) en tampón 1. Se disuelve calentando

Esterilizar y guardar a 4°C

Tampón 1

0,1 M Acido maleico

0,15 M NaCl

Ajustar el pH a 7,5 con NaOH y esterilizar


Solución de Desnaturalización

0,5 N NaOH

1,5M NaCl

Solución de Neutralización

1 M Tris-HCl pH 7,5

1,5M NaCl

Solución de Hibridación

5XSSC

Blocking Solution 10% (v/v)

N-Laurilsarcosina 10% (p/v)

SDS 0,02%

- VARIOS:

- X-Gal 2% (Stock): Disolver 0,10 g de X-Gal en 5 mL de dimetilformamida (Preparar en

vidrio). - IPTG 0,1 M (Stock): Disolver 0,141 g de IPTG en 5 mL de agua ultrapura y filtrar. - Glicerol 80% 100 mL Medir 80 mL de glicerol y llevar hasta un volumen de 100 mL con

agua destilada y después autoclavar.


- TAMPONES

PBS (Phosphate buffered saline) 1L

8g NaCl

0,2g KCl

1,44g Na2HPO4

0,24g KH2PO4

Ajustar el pH a 7,4 con HCl y autoclavar.

Tampón SM

0,6% NaCl

0,2% MgSO4

5% (v/v) Tris-HCl 1 M pH 7,5

2% (v/v) gelatina

Esterilizar


9. APÉNDICE II. Índice de tablas y figuras

- Tabla I: Purificación de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei . - Tabla II: Frecuencia de uso de codones en la NAD-GDH de Hfx. Mediterranei. - Tabla III: Porcentaje de residuos aminoacídicos de diversas GDHs pertenecientes a la Familia II. - Tabla IV: Predicción de la termoestabilidad para diferentes glutamato deshidrogenasas mediante

el índice BDC. - Tabla V: Etapas de purificación para la NAD-glutamato deshidrogenasa recombinante de Hfx

mediterranei. - Tabla VI: Comparación de masas moleculares de glutamato deshidrogenasas de diversas

fuentes. - Tabla VII: Parámetros cinéticos para la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y recombinante. - Tabla VIII. Estudios de estabilidad para la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa y

recombinante. - Tabla IX: Secuencia aminoacídica de los péptidos obtenidos mediante LC/MS. - Figura 1: Representación esquemática del árbol filogenético universal. - Figura 2: Filogenia del Dominio Archaea.

- Figura 3: Esquema de la localización de genes en una genoteca de fago λ.

- Figura 4: Programa de amplificación de PCR con los oligonucleótidos Nad-gdhFOR y Nad-gdhREV.

- Figura 5: Mapa del vector de clonaje pCR 2.1. - Figura 6: Esquema de la ligación del plásmido pCR2.1 y el producto de PCR. - Figura 7: Sitios de corte de las enzimas de restricción NdeI y BamHI. - Figura 8: Mapa del vector de expresión pET3a. - Figura 9: Cromatografía en Sepharosa-4B. - Figura 10: Electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% en presencia de SDS.


- Figura 11: Electroforesis en gel de agarosa al 1%, en el que se muestran las diferentes amplificaciones a distintas temperaturas.

- Figura 12: Programa de PCR para amplificar el producto utilizado como sonda. - Figura 13: Electroforesis en gel de agarosa al 1%. - Figura 14: Estimación del marcaje de la sonda.

- Figura 15: Búsqueda en la genoteca de DNA genómico de Hfx. mediterranei en fago λ con la

sonda de 203 pb. - Figura 16: Electroforesis en gel de agarosa de 2 de los fagos aislados del segundo screening. - Figura 17: Secuencia de la NAD-glutamato deshidrogenasa en bases y en aminoácidos. - Figura 18: Secuencia de la glutamato deshidrogenasa (GDHII) amplificada de DNA genómico y

que se corresponde con el producto de PCR. - Figura 19: Comparación de las dos secuencias de las glutamato deshidrogenasas encontradas

en Hfx. Mediterranei. - Figura 20: Comparación de los residuos implicados en la unión del coenzima de la nueva GDH

(GDHII). - Figura 21: Repetición de residuos acídicos en la región N-terminal de la NAD-glutamato

deshidrogenasa de Hfx. Mediterranei. - Figura 22: Secuencias N-terminales de GDHs de organismos Halofílicos. - Figura 23.: Comparación de las secuencias correspondientes al N-terminal de diferentes

glutamato deshidrogenasas halofílicas. - Figura 24: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas procedentes de organismos de distintos

Dominios. - Figura 25: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas procedentes de organismos halofílicos

de Bacteria y Archaea. - Figura 26: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas NAD-dependientes. - Figura 27: Alineamiento de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei con GDHs

NAD(P)-dependientes.


- Figura 28: Alineamiento de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei con GDHs NADP-dependientes.

- Figura 29: Alineamiento de glutamato deshidrogenasas de organismos del Dominio Archaea. - Figura 30: Alineamiento de GDHs procedentes de organismos de distintas familias

representadas en el árbol. - Figura 31: Árbol filogenético para diversas DGS. - Figura 32: Predicción de la estructura secundaria de la NAD-GDH de Hfx. Mediterranei. - Figura 33: Imagen tridimensional del motivo de unión del 2-oxoglutarato en la NAD-GDH de

Hfx. Mediterranei. - Figura 34: Modelado molecular para el monómero de la NAD-GDH de Hfx. Mediterranei. - Figura 35: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la PCR de amplificación. - Figura 36: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los plásmidos aislados del vector pCR2.1. - Figura 37: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la digestión con NdeI y BamHI. - Figura 38: Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los plásmidos aislados del vector de

expresión pET3a + NAD-GDH. - Figura 39: Expresión de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei en E. coli. - Figura 40: Efecto del tipo de tampón usado en la disolución de renaturalización. - Figura 41: Renaturalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa en presencia de NaCl y KCl. - Figura 42: Efecto de la concentración de sales en la renaturalización de la NAD-glutamato

deshidrogenada. - Figura 43: Renaturalización de la NAD-GDH en presencia/ausencia de EDTA. - Figura 44: Purificación de la NAD-GDH recombinante. - Figura 45: Determinación de la masa molecular de la NAD-glutamato mediante tamizado

molecular. - Figura 46: Gel de electroforesis en condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS. - Figura 47: Determinación de la masa molecular de la subunidad de la NAD-glutamato

deshidrogenasa nativa.


- Figura 48: Efecto de la concentración de NaCl y de KCl en la actividad de la NAD-glutamato deshidrogenada.

- Figura 49: Efecto de la concentración de sal en la estabilidad de la NAD-glutamato deshidrogenada.

- Figura 50: Efecto de la temperatura en la actividad enzimática. - Figura 51: Efecto del pH en la actividad de la NAD-glutamato deshidrogenada. - Figura 52: Espectros de masas de cada uno de los 4 péptidos. - Figura 53: Resultados del análisis de LC/MS. - Figura 54: Secuencia aminoacídica de la NAD-GDH de Hfx. mediterranei en la que se marcan

los péptidos obtenidos mediante nanoLC/MS.


10. APÉNDICE III. Abreviaturas. ADP: Adenosín difosfato ATP: Adenosín trifosfato BSA: Albúmina de suero bovino CAT: ciclo de los ácidos tricarboxílicos col. : colaboradores CTAB: Bromuro de cetilmetilamonio CSPD: 3-(4-metoxispiro-[1,2-diaminociclohexano-3-2’-(5’-cloro) triciclo [3.3.1.13,7] decano]-4-il) fenil fosfato desódico ddNTPs: didexosinucleótido trifosfato, dATP, dCTP, dTTP, dGTP. dITP: 2’-desoxiinositol DMSO: Dimetil sulfóxido DO600: Densidad óptica a 600nm DTT: Ditiotreitol EDTA: Ácido etilen diamino tretaacético FISH: hibridación in situ con fluorescencia GCG: Genetics computer group GdnHCl: Cloruro de guanidinio GDH: Glutamato deshidrogenasa GDHs: Glutamato deshidrogenasas GOGAT: glutamato sintasa GS: glutamina sintetasa Har.: Haloarcula

Hbt.: Halobacterium Hfx.: Haloferax

IPTG: isopropilo-β-D-galactósido


Kav: constante de reparto Km: constante de Michaelis-Menten LB: Medio de cultivo Luria-Bertani Mr: masa molecular NAD+: Nicotín adenín dinucleótido oxidado NADH: Nicotín adenín dinucleótido reducido NADP+: Nicotín adenín dinucleótido fosfato oxidado NADPH: Nicotín adenín dinucleótido fosfato reducido N-ter: Secuencia del extremo amino terminal pb.: pares de bases PBS: Tampón fosfato salino PCR: reacción en cadena de la polimerasa PHA: polihidroxialcanoato PMSF: Phenyl methyl sulfonyl fluoride (fluoruro de fenil metil sulfonilo) PVDF: polyvinylidene fluoride (polifluoruro de vinilideno) Rf: distancia electroforética relativa SDS: Sodio dodecil sulfato SDS-PAGE: Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS SSC: Dodecil sulfato sódico T: Temperatura TAE: Tris-Acetato-EDTA TEMED: N, N, N’, N-tetrametiletilen diamina Tm : Melting temperature (temperatura de fusión de la doble hebra de DNA) TRIS: Tris (hidroximetil) aminometano Vapp: Velocidad aparente Ve: volumen de elución Vo: volumen muerto Vt: volumen total

X-Gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-galactósido


AMINOÁCIDOS

SÍMBOLO AMINOÁCIDO CODONES

A Ala Alanina GCA/GCC/GCG/GCT

C Cys Cisteina TGC/TGT

D Asp Ácido aspártico GAC/GAT

E Glu Ácido glutámico GAA/GAG

F Phe Fenilalanina TTC/TTT

G Gly Glicina GGA/GGC/GGG/GGT

H His Histidina CAC/CAT

I Ile Isoleucina ATA/ATC/ATT

K Lys Lisina AAA/AAG

L Leu Leucina TTA/TTG/CTA/CTC/CTG/CTT

M Met Metionina ATG

N Asn Asparagina AAC/AAT

P Pro Prolina CCA/CCC/CCG/CCT

Q Gln Glutamina CAA/CAG

R Arg Arginina AGA/AGG/CGA/CGC/CGG/CGT

S Ser Serina AGC/AGT/TCA/TCC/TCG/TCT

T Thr Treonina ACA/ACC/ACG/ACT

V Val Valina GTA/GTC/GTG/GTT

W Trp Triptófano TGG

Y Tyr Tirosina TAC/TAT

Codones de terminación TAA/TAG/TGA

haloferax mediterranei : clonaje, secuenciación y...

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