halogénation des acides nucléiques: vi. ioduration des nucléosides en milieu diméthylformamide

BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA [3

BBA 95902

HALOGt~NATION DES ACIDES NUCLI~IQUES

VI. I O D U R A T I O N DES NUCLt~OSIDES EN MILIEU DIMI~THYLFORMAMIDE

HIROSHI YOSHIDA*, JACQUES DUVAL' " ET J E A N - P I E R R E E B E L

Laboratoire de Chimie Biologique, Facultd des Sciences, Strasbourg (France)

(Re~u le 22 janvier, I968)

SUMMARY

Halogenation o/nucleic acids. VI. Iodination o/nucleosides in dimethyl/ormamide The reaction of ICI on the nucleosides dissolved in dimethylformamide has been

studied. Uridine is transformed mainly into 5-iodo-6-hydroxy-5,6-dihydrouridine because of the presence of traces of water remaining in the organic solvent, and into smaller amounts of 5-iodouridine. Similarly cytidine gives 5-iodo-6-hydroxy-5,6- dihydrocytidine and 5-iodocytidine. Guanosine gives small amounts of 8-iodoguanosine. Adenosine is not modified by ICl. The reactivity decreases in the following order: U > C ~ G.

The iodination of a certain number of minor nucleosides shows that the deriv- atives of uridine having C-5-C-6 double bond can react, whereas dihydrouridine remains intact. Inosine is not iodinated.

INTRODUCTION

Dans des t ravaux ant6rieurs, nous avons 6tudi~ la bromuration en milieu dim6thylformamide des nucl6osides 1, des acides ribonucl6iques 2 et d6soxyribonu- cl~iques 3A, ainsi que la chloruration dans le m~me milieu organique des acides ribo- nucl6iques 5,6. Une ~tude comparable de l ' ioduration des acides ribonucl6iques 7 nous a conduit ~ effectuer un travail pr6alable sur l ' ioduration des nucl6osides libres dissous dans le dim6thylformamide. Lorsque nous avons entrepris ce travail, nous ne disposions que de quelques informations fragmentaires concernant notamment la caract6risation de ddriv6s pyrimidiques iod6s s-l°. LIPKIN et al. n, au m6me moment, ont d6crit l ' ioduration des nucl6osides libres dissous en milieu organique. Ils ont pu montrer notamment que IC1 r6agissait sur l 'uridine et la cytidine en donnant leurs 5-iodo-d6riv6s. Notre 6tude montrera que la r6action est en fait plus complexe.

Nous nous sommes attach6s plus particuli~rement aux nucl~osides maieurs (uridine, cytidine, guanosine, ad6nosine), mais 6galement ~ un certain nombre de nucl6osides mineurs trouvds fr6quemment dans les tRNA (pseudouridine, thymidine, dihydrouridine, inosine).

* Adresse actuelle: Depar tmen t of Chenlistry, Facul ty of Science, Universi ty of Tokohu, Katahiracho, Sendal, Japan.

** Adresse actuelle: Laboratoire de Chimie Biologique, Faeult6 des Sciences, Rennes, France.

Biochim. Biophys. Acta, 161 (1968) 13-22

14 H. YOSHIDA, J. DUVAL, J-P. EBEL

MATI~RIEL ET MI~THODES

Pr@aration du monochlorure d'iode Nous avons utilisd la technique de VOGEL12; on fait passer un courant de chlore

gazeux sec dans 127 g d'iode, sous agitat ion magndtique, jusqu'5_ ce que le poids du m41ange r4actionnel augmente de 34-5 g. Ce m41ange r4actionnel est ensuite distill6 et IC1 (fraction lO2 5_ lO5 °) est recueilli.

Ioduration des nucldosides ma/eurs Technique d'ioduration. Le dim4thylformamide employ6 a 4td prdalablement

distill4 3 fois et ne contenait plus que de 0.002 ~ 0.003 % d'eau. Chaque milieu r4actionnel contenait , darts un volume final de I hal de dim~thyl-

formamide, 2.5 #moles de nucl6oside et une quanti td variable de IC1 dans les propor- tions suivantes: IC1/nucldoside = I, 2, 4 et IO. Dans le cas de la guanosine, la quanti td de nucl4oside dissoute dtait seulement de 1.25/~mole en raison de sa faible solubilit4. La r4action a 4td effectu6e ~ o ° pendant 5 rain.

Chromatographie du milieu rdactionnel. Des aliquotes de o.I ml du milieu r4actionnel ont 4t4 chromatographi4es sur papier W h a t m a n No. I. Dans le cas de l 'addnosine, de la guanosine et de la cytidine, le papier a 6t6 pr6alablement lay4 avec une solution de (NH4)~SO 4 5_ i / iodine de saturation. Les solvants utilis4s out dt6 les suivants: (I) (NH4)2SO 4 5_ sa tura t ion-c i t ra te trisodique I 1Vf-isopropanol (80 :18 :2 , v/v/v). Chromatographie ascendante, dur4e 20 h; (II) 4thanol 95 % - e a u (80 : 20, v/v). Chromatographie descendante, dur4e 15 h (bibl. 13).

Dans ce dernier cas, on a laiss4 4couler le solvant pour obtenir une meilleure s@aration. Les nucldosides iodds sent done caractdrisds par leur distance de migra- t ion relative 5 celle du nucldoside normal.

Les produits out dt4 r4v41ds par absorption darts l 'ultraviolet, 5_ l 'aide d 'un Chromatovue (Ultra-Violet Products Inc.). Ils out 4td dlu4s par HC1 o.I IV[ pendant une nuit 5_ 37 °. Le dosage des compos4s a 4t4 effectu4 en utilisant les coefficients d 'ext inct ion sp6cifique e indiqu4s par CHANG ET WELCH 9 et LIPKIN et al. ~.

Recherches compldmentaires sur l'ioduration de l'uridine L'4tude pr4c4dente nous ayant laiss6 entrevoir la possibilitd de formation de

plusieurs d4riv6s r4sultant de l ' iodurat ion de l 'uridine, nous avons entrepris une 6rude plus d4taill4e de cette r6action en utilisant no tamment d 'autres techniques analytiques.

Chromatographie sur papier. Nous avons utilis6 le papier W h a t m a n No. i. En plus du solvant (I), les solvants employ~s sent les suivants: ( I I I ) butanol satur6 d 'eau, chromatographie descendante, dur6e 24 h; (IV) bu tanol -m~thyld thy lc6 tone- eau-acide formique (44 :44 :11 :o .26 , v/v/v/v) , ascendante, durde 15 h; (V) acide isobutyrique eau -ammoniaque (66 : 33 : I, v/v/v), ascendante, dur~e 24 h.

Rdvdations par rdactions colordes. Nous avons r~v~ld le ribose ~ l 'aide d 'une mdthode d6rivant de celle de CIFONELLI ET SMITHI4: le chromatogramme est asperg6 avec une solution aqueuse i~ o.I o/ de mdtapfr iodate de sodium puis, 6tant encore /o humide, avec la solution de benzidine suivante: o. 4 g de chlorhydrate de benzidine

]3iochim. t3iophys. Acta, I6I (I908) I3--22

IODURATION DES ACIDES RIBONUCLEIQUES 15

dans 8o ml d'dthanol 95 % + 7 o ml d ' e a u + 3 o ml d'ac6tone. Le ribose donne une tache blanche sur fond bleu.

Les cycles pyrimidiques ~ liaison C-5-C-6 saturde ont 6td r6v616s par la mdthode de FINK et al. 15, c'est-~-dire pulv6risation d'une solution acide de p-dim~thylamino- benzald6hyde apr~s avoir trait6 le chromatogramme par une solution de NaOH 0.5 M. Les d6riv6s satur6s donnent une tache jaune.

Utilisation de monochlorure d'iode radioacti/. Nous avons utilis6, d'une part , une solution de 1~5IC1 dans le dim6thylformamide, d'activit6 sp6cifique o.15 mC/ mmole (le 1~5IC1, en solution dans l '6thanol et d'activit6 spdcifique 2 mC/mmole, provenait de Nuclear Consultants, U.S.A.).

Nous avons utilis6, d 'autre part, une solution de I36C1, d'activitfi sp6cifique 0.025 mC/mmole, raise ~ notre disposition par M. le Professeur Lieser, Darmstadt , Allemagne.

Le comptage des ~chantillons a 6t~ effectu6 ~ 1'aide du compteur ~ scintillation Tri-Carb Packard. Le scintillateur utilis~ avait la composition suivante: 4 g de BBOT (2,5 bis-(5'-tert.-butylbenzoxyazolyl (2'))-thioph~ne), 80 g de naphtal~ne, 600 ml de tolu&ne et 400 ml de m6thylcellosolve.

Pour l 'dtude par autoradiographie, le chromatogramme a 6t6 laiss6 en contact avec le film radiographique Kodak sans dcran pendant une semaine.

Ioduration des nucldosides mineurs Les conditions d'ioduration et d'analyses ont 6t6 les m~mes que pour les nu-

cl6osides majeurs. Les solvants utilis6s pour les chromatographies ont 6t6 les solvants I, II, I I I et IV ddcrits plus haut.

RESULTATS

Ioduration des nucldosides ma]eurs Ioduration de l'addnosine. Nous avons utilis~, pour la chromatographie de l'ad6-

nosine, le solvant r l I . Dans ce cas, on constate que quelle que soit la quantit6 de [C1, il n 'apparal t aucune tache nouvelle. L'ad6nosine reste pratiquement intacte puisque l'on retrouve entre 95 et IOO % de l'ad6nosine introduite dans le milieu r6actionnel (Fig. Ia).

Ioduration de la guanosine. Nous avons utilis6, pour la chromatographie, le solvant II. L'action des quantit6s croissantes de IC1 se traduit par une disparition tr~s faible de la guanosine, tandis que l'on volt apparaltre une tache nouvelle qui migre un peu plus vite que la guanosine (R G ~ 1 . 2 ) .

distance de migration de la tache nouvelle~. (ko

distance de migration de la guanosine Le spectre d 'absorption dans l 'ultraviolet de ce produit poss~de un maximum

aux environs de 26o m/,, mais sa caract6risation d'une mani~re prdcise n'6tait pas possible sur la seule base du spectre d'absorption, en raison de sa faible quantit6. Nous avons alors compar6 son comportement chromatographique avec celui de la 8-iodoguanosine tdmoin pr@ar6e par la m6thode de LIPKIN et al. 11. Nous awms ainsi pu l'identifier sans ambiguRd/~ la 8-iodoguanosine et le closer en utilisant le coefficient

Biochim. Biophys. Acla, 161 (1968) 13 22

Ib

1 0 0

o/o

5 0

o o

a

I I

2 ~

o 10

o /

5

~ 0~0,....,..~0 ~

b

_+,._._,~~'~ 1 2 4 10

H. YOSHIDA, J. DUVAL, J-P. EBEL

o o

0 0 1 2 4

10C

°/o

ICt /nucl6oside

Fig. i . I o d u r a t i o n des nucldosides. Abscisses , IC1/nucldoside; ordonndes , p o u r c e n t a g e de la quan - t i td ini t ia le de n u c l d o s i d e . - O - , Nucldoside r e s t a n t ; - × , nucldoside iodd; - A - , s o m m e nucldoside r e s t a r t t + n u c l d o s i d e iodd; a, addnosine; b, guanos ine ; c, ur idine; d, cyt idine .

d'ext inct ion sp6cifique donn~ par ces derniers auteurs (eM & 26O mff = 17 9oo). Les r6sultats sont reprdsentds sur la Fig. lb.

Ioduration de l'uridine. Nous avons utilis6, pour la chromatographie de l 'uridine, le solvant I. L 'ur idine disparalt progressivement lorsque la quanti t6 de ICl augmente dans le milieu rdactionnel, tandis qu 'appara l t une tache nouvelle de RF = o.31 (RF uridine = 0.58). Par comparaison des spectres d 'absorpt ion en milieu acide

(2max = 290 raft; A~50 mr/A260 m# : 0.64; Aa8 o m#/A260 mff 2.02) et en milieu alcalin (2max = 280 raft) A ceux de la 5-iodouridine d6crits par CHANG ET WELCH 9 et BERENS ET SHUGAR 10, nous pouvons conclure que le produit form~ est la 5-iodouridine.

Les taux de 5-iodouridine sont ddterminds en utilisant em& 289 m# = 8020 (bib1. 9). Les r6sultats sont reprdsent6s sur la Fig. IC. On constate que le taux de 5-iodouridine crolt faiblement, alors que la somme uridine in tac te+5- iodour id ine ne correspond pas A la quantit~ initiale de nucldoside, n y a donc probablement appari- t ion d 'un autre compos6 n 'absorbant pas dans l 'ultraviolet, donc non ddcelable directement sur le chromatogramme. Ce compos6 pourrai t ~tre un d6riv~ de l 'uridine ayan t la double liaison C-5-C-6 saturde. Ce compos6 sera identifi~ un peu plus loin.

Ioduration de la cytidine. Nous avons utilis6, pour la chromatographie de la cytidine, le solvant I I I . Comme l 'uridine, la cytidine disparalt progressivement lorsque la quanti t6 de IC1 augmente dans le milieu rdactionnel. I1 apparalt , par contre, une tache nouvelle de R c = 1. 9

distance de migrat ion de la tache nouvelle). (& distance de migrat ion de la cytidine

Nous l 'avons identifi4e ~t la 5-iodocytidine par comparaison de ses spectres d 'absorption en milieu acide (2 . . . . = 31o mff) et en milieu alcalin (2ma~ = 295 raft) k ceux ddcrits par CHANG ET "~VELCH 9.



En utilisant eM ~ 309 m f f = 828o, (bibl. 9) nous avons d6termin~ les taux de 5-iodocytidine. Les r6sultats sont repr6sent6s sur la Fig. Id. La somme cytidine intacte+5-iodocytidine ne correspond pas ~ la quantit6 initiale de nucl6oside. I1 s'ensuit que, comme dans le cas de l'uridine, nous avons probablement formation d'un compos6 n'absorbant plus dans l'ultraviolet et ayant la double liaison C-5-C-6 saturfie.

Recherches compldmentaires sur l'ioduration de l'uridine Mise en dvidence d'un ddrivd iodd saturd. Nous avons r6alis6 l'ioduration de l'uri-

dine dans les conditions suivantes, pour un volume r6actionnel de 0.56 ml: 2.5/,moles d'uridine environ+I3.5 ffmoles de l~alC1 (environ 2 #C).

3 aliquotes de o.I ml ont 6t6 immddiatement pr61evdes et analys~es par chromatographie bidimensionnelle avec les solvants IV (I6re dimension) et V (2~me dimension). Apr~s r6vflation des produits par absorption darts l'ultraviolet, les chroma- togrammes ont 6t~ soumis respectivelnent & l'autoradiographie, /~ la r6v6lation du ribose et ~ la r6vdlation des cycles pyrimidiques ~t liaison C-5-C-6 satur6e.

' l e~

0

0 0

b <7 ~Z~' b~

• , " , / / / / , c

I er solvont

("'." ".',) ~ , b c

Fig. 2. C b r o m a t o g r a p h i e du mi l ieu d ' i o d u r a t i o n de l 'u r id ine , a, a b s o r p t i o n in t ense en u l t r av io l e t ; b, a b s o r p t i o n fa ible en u l t r a v io l e t ; c, zone de r ad ioac t iv i td .

La somme de ces r6sultats est repr6sent6e sur la Fig. 2, et les caract6ristiques des divers produits sont indiqu6es dans le Tableau I.

L'61ution des divers compos6s par l'eau, nous a permis de caractfiriser et de doser les compos6s A et C qui sont respectivement l'uridine et la 5-iodouridine. Le produit B, qui est positif ~ tous les tests effectu6s et qui ne poss~de pas de maximum d'absorption au-del& de 24o m#, est donc un d6riv6 iod6 satur6.

T A B L E A U I

CARACTI~RISATION CHROMATOGRAPHIQUE DES DI~RIVI~S RI~SULTANT DE L'IODURATION DE L'URIDINE

Produi t R F U V Radioaclivitd Ribose Cycle salurd

z~re dimension 2~me dimension

A 0.36 0.42 + -- + -- B 0.57 o.4o + + + + C 0.58 0.45 + + + + + --

Biochim. Biophys . Acta, 161 (1968) 13 2z

I8 H. YOSHIDA, J. DUVAL, J-P. EBEL

Par comptage de la radioactivit6 et en utilisant l 'activit6 spdcifique obtenue pour la 5-iodouridine, nous avons ddtermin6 la quantit6 de d6riv6 satur6 en supposant qu 'un seul atome d'iode 6tait fix6. Nous avons constat6 que la somme des concentra- tions de A + B + C ne correspond pas exactement ~ la quantit6 d'uridine introduite dans le milieu r6actionnel. Ceci provient probablement d'une d6gradation partielle du d6riv6 iodd satur6 au cours de la migration du Ier solvant. En effet, l 'autoradio- gramme montre une trainde de radioactivit6 de ce solvant.

Iden~i/ication d~ ddrivd iodd saburd de l'uridine. Le processus de la saturation du cycle pyrimidique peut ~tre ddcompos6 en deux 6tapes: d 'abord at taque 61ectro- phile de la position C-5 par l 'a tome d'iode de IC1 polaris6 et ensuite at taque nucl6o- phile de C-6 par un ion ndgatif, n y a deux types d'ions ndgatifs possibles: ce sont, d'une part, les ions C1- ddrivant de IC1 et, d 'autre part, les ions O H - qui peuvent provenir de l 'eau rdsiduelle du solvant.

Ioduration avec Ia~Cl. Afin de d6terminer si C1- peut ~tre fix6, nous avons repris l'exp6rience prfc6dente en utilisant I36C1 et nous avons pu constater qu'il n 'y avait aucune radioactivit6 au niveau du d4riv6 satur6. I1 s'ensuit donc qu'il n 'y a pas fixation de CI en position C-6.

Caractdrisation de la 5-iodo-6-hydroxy-5,6-dihydrouridine. Pour caract~riser le produit iod6 satur6, nous avons utilis6 deux techniques: d 'abord une comparaison de son comportement chromatographique avec celui de la 5-bromo-6-hydroxy- 5,6-dihydrouridine pr6parde selon la technique de MOORE ET ANDERSON 16 et d 'autre part une suite de transformations chimiques qui conduit/~ plusieurs produits obtenus dans les m4mes conditions ~ partir de la 5-bromo-6-hydroxy-5,6 dihydrouridine.

Les R~ de l'uridine, de la 5-iodouridine, du ddriv6 iod4 satur6 et de la 5-bromo- 6-hydroxy-5,6-dihydrouridine , correspondant aux solvants II, I r I et 1v, sont repr6sentds dans le Tableau II . On constate que le produit iod6 satur6 se comporte, dans les trois solvants, d 'une mani6re analogue au d6riv6 brom6 satur6 tfmoin.

En s'inspirant de la technique de WANG 17, nous avons d 'abord transform6 la 5-bromo-6-hydroxy-5,6-dihydrouridine en 5,6-dihydroxy-5,6-dihydrouridine par t rai tement avec NaHCOa o.I M (pH 8.5) pendant 4 h ~ la temp6rature ambiante. Par chauffage ult6rieur pendant 15 rain ~t ioo °dans HC1 I M, le dernier produit se transforme en 5-hydroxyuridine.

Nous avons effectu6 la m~me sdrie de rdactions sur le d6riv6 iod6 satur6 et nous avons pu constater qu'il rdagissait exactement de la m~me mani6re que le d6riv6 brom6 satur6.

TABLEAU 1[

GARACTI~RISATION CHROMATOGRAPHIQUE DU DI~RIV]~ IODI~ SATURt~ DE L'URIDINE

Ddrivd RF dans les solvanls:

I I i I I I V

Uridine 0.48 0.36 0.42 5-Iodouridine o.62 o.58 o.45 iod6 satur6 o.56 0.57 o.4o 5-Bronlo-6-hydroxy- 5,6-dihydrouridine o.57 o.6o o.4 °



Iu =:>

U ,:=::> ~ b c d i ~ bcd

~ a d d d o ad

@ cd @ cd

2 3 1' 2' 3' 4

a b c d

Fig. 3. C o m p o r t e m e n t c h r o m a t o g r a p h i q u e compard des d6riv6s de b r o m u r a t i o n et d ' i o d u r a t i o n de l 'ur id ine , a, abso rp t ion in t ense en u l t rav io le t ; b, a b s o r p t i o n faible en u l t rav io le t ; c, zone pos i t ive ~ la r6v41ation du cycle sa tu rn ; d, zone pos i t ive ~ la r6v61ation du ribose, i, Der iv6 iod6 sa tur6 ; 2, p rodu i t / I) t ra i td pa r NaHCOa; 3, p rodu i t (2) trait@ pa r HC1 i M; i ' , 2', 3', m&mes s ign i f ica t ions ~ pa r t i r du d6riv4 brorn6 sa tur6 ; 4, 5 - h y d r o x y u r i d i n e t4moin.

Les r6actions ont 6t6 suivies par chromatographie avec le solvant II, en utilisant les r6v61ations ~t la lumi6re ultraviolette et les r6actions color6es du ribose et du cycle satur6. L'ensemble de ces rdsultats est repr6sent6 sur la Fig. 3.

Nous remarquons que la 5,6-dihydroxy-5,6-dihydrouridine donne deux taches correspondant aux deux conformations cis et trans (le compos6 cis ayant le R Fle plus faiblelS). La 5-hydroxyuridine a 6t6 identifi6e par comparaison avec un 6chan- tillon commercial.

Nous pouvons donc sch6matiser le processus comme suit:

0 0 0 II II II

~C~ -X bIN C~H NaHCOa HN~C~c< ON N N'/CN'~C ~OH I I ~ o . o.~.8.5M I I o . .C[ ,M I II

o ~ C ~ N / C ~ ' N temperature o / / C ~ N / ¢ ' < H . o//C ~N./C~- H I I ~oo. I R ambiante R R

X-Br ou I R = rlbose

De cet ensemble d'6tudes, nous pouvons conclure que le d6riv6 iod6 satur6 provenant de Faction de IC1 sur l'uridine en milieu dim6thylformamide est la 5-iodo- 6-hydroxy-5,6-dihydrouridine.

Ioduration des nucldosides mineurs L'6tude pr6c6dente nous ayant montr6 que l'uridine 6tait particuli6rement

sensible/~ l'ioduration par IC1, nous avons 6tudi6 le comportement de la pseudouridine, de la thymidine et de la dihydrouridine vis-a-vis de cet agent d'ioduration. Nous avons de plus 6tudi6 Faction de IC1 snr l'inosine qui semble ~tre une base mineure importante puisqu'elle entre dans la composition de certains anticodons. Notre but 6tant de d6terminer quels 6taient les nuc16osides mineurs susceptibles de r6agir, nous ne nous sommes pas attach6s ~ identifier les divers produits de r6action.


:20 H. Y O S H I D A , J . D U V A L , J - P . E B E L

Ioduration de la pseudouridine. Nous avons utilisd pour la chromatographic de ce nucldoside le solvant II. La pseudouridine disparalt au fur et ~ mesure que la quantit6 de IC1 ajout6e augmente (Fig. 4), tandis que l'on volt apparMtre en faible

100 ~ ~ o %

5 0 - ~ ~ x

&

ICl/nucl6oslde

Fig. 4. Iodurat ion des nuclGosides mineurs. - × - , Pseudouridine; - A - , thymidine; - 0 - , hlosine.

quantit6 une nouvelle tache (R~ = 1.5). Cette derni~re poss@de en milieu acide un spectre d'absorption dans l'ultraviolet voisin de eelui de la pseudouridine (~t ..... --~ 265 m/~). Nous n'avons pas cependant d6termin@ la nature de ce d@riv~ suppl@men- taire.

Ioduration de la thymidine. Nous avons effectu@ l'ioduration sur la thymidine (ddsoxyribosylthymine) dont la r~activit@ vis-a-vis de l'agent d'ioduration doit ~tre voisine de celle de la ribosylthymine. Nous avons utilis~ le solvant I pour l'6tude de ce nucl~oside. Comme le montre la Fig. 4, ICI r@agit avec la thymidine. I1 n'apparalt aucune tache absorbant en ultraviolet et nous n'avons, de ce fait, caract@ris~ aucun produit de r@action.

Ioduration de la dihydrouridine. En ce qui concerne ce compos~, nous n'avons pas rdalis6 l'dtude quantitative mais qualitative, car nous ne poss~dions pas de mdthode suffisamment pr@cise qui permette de le doser apr@s localisation sur le chromatogramme. Nous avons donc employ@ pour la chromatographic deux solvants (III et IV) et effectu@ la r~vdlation par r@action colorde sp@cifique des cycles pyrimidiques ~ liaison C-5-C-6 satur@e. Dans les deux solvants, nous n'avons rdvdl@ qu'une seule tache au niveau de la dihydrouridine t~moin dont l'intensit6 restait inchangde quelle que soit la quantit6 de IC1.

I1 semble donc bien que la dihydrouridine soit inerte vis-/~-vis de l'agent d'ioduration, ce que l'on pouvait esp6rer vu que la liaison C-5-C-6 est ddi~ satur@e.

Ioduration de l'inosine. Nous avons utilis@ pour la chromatographic de ce com- posd le solvant II. Une seule tache est r6v616e par absorption ultraviolette. I1 s'agit de l'inosine ainsi que nous avons pu le d~terminer par son spectre d'absorption. On constate sur la Fig. 4 que le taux d'inosine reste constant, quelle que soit la quantit@ de IC1 ajoutGe au milieu r6actionnel.

DISCUSSION

Nous avons pu constater que l'ioduration de l'uridine libre en milieu dim6thyl- formamide conduit ~ la formation de 5-iodouridine et de 5-iodo-6-hydroxy-5,6- dihydrouridine.

Biochim. Biophys. z~cta, ~6 i (1968) 13 22


Le m6canisme d'action de IC1 dans le dim6thylformamide sur l'uridine (I) pourrait ~tre imagin6 comme suit: il y aurait d'abord attaque 61ectrophile de IC1 sur C-5 activit~ par le doublet 6lectronique de N-I pour donner l'interm6diaire (II). I1 y aurait ensuite deux r6actions comp6titives: d'une part l'61imination du proton fix6 sur le C-5 pour donner la 5-iodouridine ([[I) et d'autre part l 'attaque de C-6 par OH- provenant de l'eau, d'ofl saturation de la double liaison C-5-C-6 (IV). Le dim6thylformamide contient toujours une quantit6 d'eau r6siduelle (o.oo2 & o.oo3 %) suffisante pour permettre cette r6action, bien que ce solvant soit distill~ et recueilli sur tamis mol6culaires (Molecular Sieves, Union Carbide Co.). La 5-iodo-6-hydroxy- 5,6-dihydrouridine (IV) ainsi form6e est instable en milieu acide et redonne progressivement l'intermddiaire (II). Ce dernier perd soit l'iode, soit le proton fix6 sur le C-5 avec une probabilit6 sensiblement 6gale pour donner l'uridine (I) et la 5- iodouridine (III).

. - - ~ H

HN ]~

A. _ O ~ ~ N " ~'H R

i

¢ o o

HN~H O ~ ~ I R R

(I) ~ (~r)¢l

f - H

HN I [ o H

(x)

\ o

R . (~SZ)

~H +

La r6action d'ioduration 6volue donc de mani~re sensiblement diff6rente de la rdaction de bromuration. Nous avons pu montrer, en effet 1, que la bromuration de l'uridine dans les mSmes conditions conduisait presque exclusivement ~ la 5- bromouridine, la formation du ddrivd bromfi satur6 6tant tr~s faible (inf~rieure & IO %). Dans le cas de la bromuration, l'interm6diaire (II) 6volue donc probablement plus rapidement vers le d~rivd (III), l'~limination du proton fix6 sur le C-5 6tant plus rapide que l 'attaque du C-6 par OH-.

Nous n'avons pas effectu6 une 6tude aussi d6taill~e du m~canisme d'action de IC1 sur la cytidine; cependant nous pouvons imaginer la m~me suite de r6actions que dans le cas de l'uridine. I1 semble donc bien qu'il y ait ~galement formation de 5-iodo-6-hydroxy-5,6-dihydrocytidine, mais elle est beaueoup moins importante que dans le cas de l'uridine (Fig. I).


22 tr. YOSFflDA, J. DUVAL, J-P. EBEL

Nous avons pu constater d 'autre part, que la guanosine 6tait faiblement touchfe par IC1 en donnant la 8-iodoguanosine alors que l'ad6nosine restait intacte.

En ce qui concerne les nucl6osides mineurs, il apparait que IC1 r6agit avec les d6riv6s de l'uridine, m4me ceux substitu6s en C-5, tant que la liaison C-5-C-6 garde sa nature de double liaison. Cependant, il faut noter que la r6activit6 de ces ddriv6s vis&-vis de IC Ie s t plus faible que celle de l'uridine (comparer les Figs. ic et 4).

REMERCIEMENTS

Ce travail a 6t6 effectu6 dans le cadre d'une Convention de la D616gation G6n6rale 5~ la Recherche Scientifique et Technique (Biologie lVfol6culaire) e t a b6nd- fici6 de l 'aide de la Recherche Coopdrative sur Programme (No. 79) (Centre National de la Recherche Scientifique).

R~SUM~

L'action de IC1 sur les nucl6osides dissous dans le dim~thylformamide a 6t6 dtudi6e. L'uridine est transform6e principalement en 5-iodo-6-hydroxy-5,6-dihydrouridine en raison de la pr6sence d'eau rdsiduelle dans le solvant organique, et en une quantit6 plus faible de 5-iodouridine. La cytidine donne de mfime la 5-iodo-6- hydroxy-5,6-dihydrocytidine et la 5-iodocytidine. La guanosine donne naissance /t une faible quantit6 de 8-iodoguanosine. L'ad4nosine n'est pas touch6e par IC1. La r6activit6 d6croit dans l'ordre: U > C ~ G.

L'ioduration d 'un certain nombre de nucl6osides mineurs montre que les d6riv6s de l'uridine possddant leur double liaison C-5-C-6 sont susceptibles de r6agir, tandis que la dihydrouridine demeure inchang6e. L'inosine n'est pas iod6e.

B I B L I O G R A P H I E

I J. DUVAL ET J. P. EBEL, Bull. Soc. Chim. Biol., 46 (1964) lO59. 2 J. DUVAL ET J. P. EBEL, Bull. Soc. Chim. Biol., 47 (1965) 787 . 3 D. LONDOS, J. DUVAL, G. AUBEL-SADRON ET J. P. EBEL, Bull. Soc. Chim. Biol., 49 (1967) 739. 4 D. LONDOS-GAGLIARDI, G. AUBEL-SADRON ET J. P. EBEL, Bull. Soc. Chim. Biol., 5 ° (1968)

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halogénation des acides nucléiques: vi. ioduration des nucléosides en milieu diméthylformamide

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