hayvan çalışmalarında planlama
TRANSCRIPT
Hayvan çalışmalarında planlama-
Uygun model ve denek seçimi nasıl yapılmalı?
Dr. Sibel Atış
Amaç ve Öğrenim Hedefleri
• Deney hayvanı kullanılarak yapılacakaraştırmaların planlanmasında; izlenecek basamaklar / dikkat edilecek püf noktalar/ karşılaşılabilecek zorluklar hakkında bilgilenmek
• deney hayvanı ve model seçiminde dikkat edilecek noktaları öğrenmek
Neler biliyoruz ?
Tarihçe-I Corpus Hippocraticum (M.Ö. 400):
İlk deney hayvanı kullanıldığını bildiren kitap; hayvanlar üzerinde yapılan incelemeler anatomik yapıyı belirlemeye yönelik
“Fransız Araştırma Okulu”nun kurulmasından sonra 19. yy.da Claude Bernard’ın çalışmaları ile deneysel tıp hız kazanmış; Fizyolojik deneyler için canlı hayvan kullanımının gerekliliği (1865).
Tarihçe-II
O zamandan beri canlı hayvanlarda deneyler biyomedikal çalışma disiplinleri (mikrobiyoloji, immünoloji, cerrahi, onkoloji ve farmakoloji) içinde gelişti.
Nobel Ödülleri
2/3’si hayvan deneylerine dayanan araştırmalar
NOBEL
Nobel ödülü sahiplerine sorulduğunda
İlerleme ve gelişme için hayvan deneyleri ön koşul olmuştur; %97
Çalışmasında hayvan kullanmış olan; %74
Hayvan deneyleri hala gereklidir; %74
Deneysel Araştırma Nedir? Herhangi bir konuyu aydınlatmak, Bir soruna çözüm geliştirmek ve Belirli kavramlara, kuramlara ya da
yasalara ulaşabilmek için yapılan
planlı ve bilimsel bir çalışmadır.
Deney Nedir? Etkisi ölçülecek işlemlerin belirli kurallar ve
koşullar altında deneklere uygulanması, deneklerin bu işlemlere verdikleri yanıtların
ölçümü ve elde edilen sonuçları karşılaştırarak karar
verme safhalarını içeren bir araştırma tipidir.
Deney Hayvanı Nedir? Hipotezi bilimsel kurallara göre
kurulmuş araştırmalarda ve biyolojik testlerde kullanılan hayvanlardır.
Kullanılan Deney Hayvanları: En Çok : Sıçan, Fare, Tavşan Orta Düzeyde: Kobay, Hamster, Köpek, Kedi, Domuz, Maymun
Deneysel Araştırmanın Safhaları:
I. Deneyin Planlanması
II. Deneyin Yürütülmesi
III. Sonuçların Değerlendirilmesi
IV. Yayınlama
I. Deneyin Planlanması Planlama; deneyin en önemli kısmıdır. Deney planı; araştırma, bilgi, beceri ve
deneyim isteyen bir süreçtir. Araştırma planı; bağımlı ve bağımsız
değişkenler arasındaki ilişkileri test etmek için düzenlenir.
Bu planda; Hangi gözlemlerin ve işlemlerin yapılacağı Nasıl yapılacağı, Bunların nasıl değerlendirileceği v.b.bilgiler bulunmalı
Deney hayvanına dayalı araştırmanın planlama süreci belli safhalardan geçer:
1. Deney konusunun seçimi 2. Gözlem 3. Bilgi Toplama 4. Orijinal fikir ya da problemin ortaya
konulması 5. Amaç 6. Değişkenlerin belirlenmesi 7. Hipotez
Rasyonellik: Seçilen araştırma konusunun ne derece rasyonel olduğu. Neden sonuç ilişkisi iyi belirlenmeli.
Ülke yararı: Yapılacağı ülkenin önceliklerine göre uygunluk taşıyıp taşımadığı
Gereklilik: Gerçekten yapılmaya değer olup olmadığı. Çıkacak sonuçların tıbba katkısının neler olabileceği
Uygulanabilirlik: Hayvanlar üzerinde elde edilecek sonuçların insana ne derece uygulanabilir olduğu
Tekrarlanabilirlik: Aynı koşulların sağlandığı tüm ortamlarda deneyin tekrarlanabilir olması
Devamlılık: O konuda yapılan çalışmanın daha sonra yapılacak çalışmalarla desteklenmesi ve devamının sağla
1. Deney konusunun seçimi:Dikkat edilmesi gereken noktalar:
2. Gözlem: Dikkatinizi çeken bir olayı ayrıntılı olarak
araştırmaya başlarsınız. Gözlemleriniz derinleştikçe sorular da artar, fakat
daha özgülleşerek zihninizde belirmeye başlar ve araştırmaya başlarsınız.
İlk adım gözlediğiniz olayı doğru bir şekilde kaydetmenizdir.
Gözlemde tamamen ön yargısız olunmalı ve olayları olduğu gibi değerlendirmek gerekir.
3. Orijinal fikir ya da problemin ortaya konulması:
Problem en basit şekli ile ortaya konulmalıdır.
Bazen problemin parçalara bölünüp ayrı ayrı cevaplanması gerekebilir.
4. Bilgi toplama: Literatür taraması- anahtar sözcükler.
Araştırmak istenilen konu ile ilgili başlangıçta yapılan literatür taraması yeterli olmamaktadır.
Bir araştırmanın planlanma ve yayın süresi arasında normalde iki yıllık bir süre geçmektedir.
Bu süre içerisinde zaman zaman o konu ile ilgili literatür taraması yapılmalı ve son gelişmeler değerlendirilmeli.
Temel bilgiler ve klasik kitaplar gözden geçirilmeli Literatür taranırken derleme yazılara da dikkat!.
5. Amaç:
Deneyin amacının özeti yapılmalı. Özellikle niçin hayvan kullanılacak? Çalışılacak konu ile ilgili alternatif
çalışmaların yetersizliği vurgulanmalı.
6. Değişkenlerin belirlenmesi:
Neden sonuç ilişkisini bulmaya çalışırsınız.
Değişkenler:1. Bağımlı değişken: deney sonunda
değiştirilmek istenen ya da değişip değişmediği gözlenen niteliktir.
2. Bağımsız değişkenler: bu deney çerçevesinde yer alan ancak bağımlı değişken dışında yer alan değişkenlerdir.
7. Hipotez kurulması:
Hipotez, bir deneyle test edilebilen sorudur. Hipotezin yeterli testler yapılmadan önce
kabul edilmesi imkansızdır. Kuracağınız hipotez, deneyle test
edilebilmeli, neden sonuç ilişkisine cevap verebilmeli ve yazı ile ifade edilebilmelidir.
Hipotezinizi test etmek için en azından bir deney yapabilirsiniz.
Deney hayvanına dayalı araştırmanın planlanması
Dikkat Edilmesi Gerekenler:1. Literatür taraması- anahtar sözcükler2. İstatistiksel danışma 3. Kontrol grubu kullanımı 4. Deneysel hayvan modeli seçimi
5. Araştırma protokolünün hazırlanması:
2. İstatistiksel Danışma: Deneyin planlanmasından önce
araştırıcı istatistiksel olarak danışmalıdır.
Uygun bir istatistik çalışma yapabilmek için her grupta yeterli sayıda ve en az hayvan kullanılmalıdır.
3. Kontrol Grubu Kullanma: Kontrol grubu kullanmanın amacı deney esnasında
bilinmeyen ya da kontrol edilemeyen değişkenlerin etkisini ve tesadüf ihtimalini ortadan kaldırmaktır.
Kontrol grubu bağımlı değişken haricinde diğer tüm değişkenler tarafından deney grubu ile aynı olmalıdır.
Deney bir cerrahi müdahalenin etkisini araştırmak üzere planlanmışsa ise kontrol grubuna aynı anestezi ve laparotomi uygulanmalıdır.
Tek bir grupta hem kontrol hem de deney olabilir. Her hayvanın cerrahi öncesi değerleri kontrol olabilir.
3. Kontrol Grubu Kullanma: Örnek
Amaç: Sigara dumanının sinekler üzerine öldürücü etkisinin olup olmadığı
Deney grubu: bir cam fanusta tutulan 100 sinekUygulama: her saat başı bir adet sigara dumanı havalandırma sistemi içinde fanusa verilmektedir. Kontrol grubu: yok Bulgu: 2 hafta sonra sineklerin 60 tanesi ölmüştür. Varılan Sonucun doğruluğu ve güvenilirliği: ??????.
Bu deneye kontrol grubu olarak 100 sinekten oluşan bir başka grup eklendiğinde (ve herhangi bir şey yapmadan 2 hafta izlendiğinde); bu gruptaki sineklerden de 62’sinin öldüğünü saptadığımızda ise;Varılan sonuç daha güvenilir ve doğru olacaktır!!!
4. Deneysel Hayvan Modeli Seçimi:
Laboratuar hayvan modeli; normal biyoloji ya da
davranışların çalışılabileceği kendiliğinden ya da indüklenmiş
bir patolojik durumun araştırılabildiği
bir biyolojik işlev yönünden insan ya da diğer hayvan türlerine benzerlik gösteren hayvanların kullanıldığı modeldir.
4. Deneysel Hayvan Modeli Seçimi:
Deneysel bir hayvan modeli oluştururken model seçimi; bu modelin insanlardaki kliniğe en iyi şekilde uyarlanabilmesi açısından oldukça önem taşır.
Deneysel araştırmada kullanılması planlanan türe ait anatomik, fizyolojik ve davranış karakterlerinin bilinmesi, araştırmanın amacına uygun olarak yapılabilmesi ve tamamlanabilmesi için mutlaka gereklidir.
4. Deneysel Hayvan Modeli Seçimi:
Hayvan modeli her zaman orijinal durumu tam olarak temsil etmez; yani model asla prototipinin aynı değildir.
Modeller asla son sözü sağlamaz, ama yaklaşık bir fikir verir.
Yeni modellerin tanımlanması için literatür araştırması yapıp, hangi modelin mümkün ve gerçekçi olduğu belirlenmelidir.
4. Deneysel Hayvan Modeli Seçimi:
Kullanılan 4 hayvan modeli vardır:
1. İndüklenmiş modeller: 2. Spontan modeller: 3. Negatif modeller: 4. Olası (Orphon) modeller:
Deneysel Hayvan Modeli Seçimi:1. İndüklenmiş modeller:
• Bu modelde amaç; cerrahi yolla ya da kimyasal maddeler ile hayvanlarda deneysel olarak oluşturulan hastalıkların hedef organizmada görülenlere benzemesidir.
• Örn: sigara dumanı ile amfizem oluşturmak• Tür seçimi yapmayı mümkün kılan tek model
çeşididir. • Genomlarına yapay olarak yerleştirilmiş DNA
içeren hayvanlarda transgenik modeller de indüklenmiş modeller grubuna girerler.
• Transgenik modellerde tercih edilen tür: fare
Deneysel Hayvan Modeli Seçimi:2. Spontan modeller: :
• Genetik olarak kendiliğinden gelişen ve insanlardaki hastalığa benzer patoloji ve semptomlar gösteren hayvanlarda geliştirilen modellerdir.
• Çeşitli hastalıklarla ilgili spontan modelleri oluşturmak için doğal olarak genetik varyantlardan yararlanılır.
• Örn: Nakavt fareler: allerjen sensitizasyon gerekmeden astım oluşabilmekte; bu yüzden intrensek astım için iyi bir model oluşturmakta
Deneysel Hayvan Modeli Seçimi:3. Negatif modeller: • Bazı hastalıkların hiç gelişmediği
hayvan türü ya da soyları vardır. • Hemen hemen spontan modellerin
zıttı bir durumdur.• Negatif modellerde hayvan bilinen bir
uyarıya reaksiyon göstermez. • Örn: Tavşanlarda gonokok
enfeksiyonu gibi özel bir durumun geliştirilemediği negatif modeller
Deneysel Hayvan Modeli Seçimi: 4. Olası (Orphon) modeller:
• Bazı hastalıklar önce hayvanlarda tanımlanmıştır.
• Olası modeller, daha sonra insanlarda benzeri tanımlanabilir amacı ile çalışılan modellerdir.
• Daha sonra benzer bir hastalık insanlarda görülürse model adapte edilir.
• Örn: - Papillomatozis - Deli dana hastalığı
Deneysel hayvan modeli oluştururken doğru model nasıl seçilir?
Aşağıdaki maddelere dikkat edilmesi gereklidir:
a) Temel anahtar sorunun iyi tanımlanması: Doğru model seçiminde ilk belirlenmesi gereken önemli noktadır.
b) Uygun Laboratuar Hayvanı Seçimi: c) Bilimsel, uygulama ve etik yönlerden
uygun bir hayvan modeli seçilmeli
b) Uygun Laboratuar Hayvanı Seçimi:
Doğru model seçiminde verilmesi gereken bir diğer önemli karar;
seçilen hayvanın türü, soyu ve cinsidir. Yapı ve fonksiyonları insana benzediği için
memeliler deneysel çalışmalarda sık kullanılır.
Sıçanlar, fare, kobay ve hamsterler küçük olmaları, yaşam sürelerinin kısalığı, manüplasyonlarının kolaylığı ve kolay
üretilebildikleri için tercih edilirler.
Hayvanda bir hastalık modeli oluştururken, hastalık patogenezi yani insanlardaki hastalık sürecine benzerlik açısından uygun hayvan türünün seçimi oldukça önemlidir.
Her bir hayvan türünün kendine göre zayıf ve güçlü yanları olup, araştırıcı bunlar arasından test edeceği hipotez açısından en uygun modeli seçebilmelidir.
b) Uygun Laboratuar Hayvanı Seçimi:
c) Bilimsel, uygulama ve etik yönlerden uygun bir hayvan modeli seçimi:
Randomize seçim olmalı Dişi ve erkek sayısı eşit En az kompleks tür En az denek sayısı
Dört R kuralı: REDUCE: hayvan sayısını azalt REFINE: (Arındırma); yöntemi ıslah et Yöntemin olumsuz yönlerini azaltma
ve verimliliği arttırma. REPLACE: ağrısız yöntemle değiştir RESPONSIBILITY: sorumluluklarını bil
c) Bilimsel, uygulama ve etik yönlerden uygun bir hayvan modeli seçimi:
5. Araştırma protokolünün hazırlanması:
a) Deneyin amacının özeti:
• Niçin hayvan kullanılacak?• Çalışılacak konu ile ilgili alternatif
çalışmaların yetersizliği vurgulanmalı b) Gereç ve yöntemlerin belirtilmesi:
• deneysel işlemler listesi• malzeme ve teknik donanım listesi• değerlendirme parametreleri
5. Araştırma protokolünün hazırlanması: Hayvanlar nasıl belirlenecek? Deneyde kullanılacak laboratuar hayvanının bu çalışma
için uygunluğunun belirtilmesi Deney öncesi hayvanlara herhangi bir özel tedavi
uygulanacak mı? Kullanılacak anestetik, analjezik ve sedatif maddelerin
tanımlanması Uygulanacak cerrahi yöntemin tanımlanması Enfeksiyon ajanı, bileşik ya da diğer maddelerin
tanımlanması
5. Araştırma protokolünün hazırlanması:
Herhangi bir fiziksel işlem (radyasyon gibi) uygulanacaksa tanımlanması
Deney esnasında hayvanlarda herhangi bir davranış değişikliği bekleniyorsa onun tanımlanması
Toplam ne kadar hayvan kullanılacağı Gruplardaki hayvan sayısının belirlenmesi Her bir deneyin süresi Deneye hayvanın verdiği cevabın değerlendirme
yönteminin belirlenmesi
Amaca uygun değerlendirme parametreleri seçilmeli:
Sürvi / mortalite Patogenez/patolojik süreçler Klinik Gözlem Bakteriyemi / Viremi Biyokimya (KC fonk., inflamasyon belirteçleri v.s) Radyolojik değerlendirme Fonksiyonel / fizyolojik değerlendirme Bir molekül veya farmakolojik bir ajanın etkinliği Aşı etkinlik değerlendirmesi
5. Araştırma protokolünün hazırlanması:
Hayvan modeli oluşturulmasında verilecek maddenin ve ilişkili sistemin seçimi oldukça önemlidir:
Ajanın verilme şekli: - İnhalasyon yolu (sadece burun, baş veya tüm vücut) - Diğer yollar (Parenteral, Oral, İntraperitoneal)
Dozu: Sensitizasyonu sağlama, letal doz bilinmeli
Ajanın cinsi veya formu:
5. Araştırma protokolünün hazırlanması:
Solunum sistemi ile ilgili deneysel bir hayvan modeli oluştururken aşağıdaki ajanlar kullanılabilmektedir:
Sensitize edici ajanlar (antijenler, allerjenler v.s) Gazlar; ozon, NO2, SO2 vb Partiküller; PM, çevresel partiküller, karbon, DEP,
nanopartiküller, asbest partikülleri vs Sigara dumanı, ürünleri Diğer toksik ajanlar Mikrobiyal ajanlar (mikrobiyal bir ajan verilecekse serotipi,
enfekte etme olasılığı v.s önemli) Lipopolisakkarit (selektif pulmoner nötrofiliye yolaçar) Çeşitli kanserojenler
5. Araştırma protokolünün hazırlanması:
DENEYİN DOĞRULUĞUNU ETKİLEYEN ETKENLER:
A- Yan tutmak
I-Deneye katılanları gruplara ayırırken yan tutma:
Bu tür kuşkuları önlemek için araştırmaya katılacak denekler, deney ve kontrol gruplarına rasgelelik yöntemiyle (randomizasyonla) ayrılır.
Araştırma sonuçlarının geçerli olabilmesi için, (benzerlik testleriyle) deney ve kontrol gruplarının benzer oldukları gösterilmelidir.
DENEYİN DOĞRULUĞUNU ETKİLEYEN ETKENLER:
A- Yan tutmak II- Araştırma uygulanırken, gözlemler ya da ölçümler
sırasında yan tutma:
Bunu önlemek için farkına vardırmama yöntemine başvurulur.
Örn: Sıçanların akciğer kesitleri incelenirken preparata bakan kişinin kesitin hangi gruba ait olduğunu bilmesi yanlış yorumlamaya neden olabilir.
DENEYİN DOĞRULUĞUNU ETKİLEYEN ETKENLER:
B- Yeter sayıda denek üzerinde çalışmamak Bir araştırmada denek sayısı ne kadar çoksa
alınan sonuç o kadar gerçeğe yakın olur. Ancak sayıyı gereksiz olarak arttırmak maliyeti
arttıracaktır. Hatta olanakların çok sayıda denek için
harcanması aşırı yoğunluk nedeniyle hata yapma riski artabilir.
Az sayıda denek alırsak tek bir rakam değişikliği bile sonuçlarımızı etkileyebilir.
DENEYİN DOĞRULUĞUNU ETKİLEYEN ETKENLER:C- Kontrol grubu kullanmamak Hemen her tip araştırmada kontrol grubuna gerek
vardır. Kontrol grubu kullanmaktan amaç; etkisi incelenen
etkenin etkisinin gerçek olup olmadığını saptamaktır. Kontrol grubu kullanılan araştırmalarda; - Bir gruba incelenecek etken etki ettirilir; deney grubu - Diğer gruba etken etki ettirilmez; kontrol grubu Deney ve kontrol gruplarındaki deneklerin araştırma
için önemli bazı değişkenler yönünden benzer olmaları (aralarında istatistiksel fark olmaması) önemlidir.
DENEYİN DOĞRULUĞUNU ETKİLEYEN ETKENLER:D- İncelenecek konunun özelliğine uygun ölçü
bulamamak İncelenen etkenin etkisini en doğru biçimde
ortaya çıkaracak ya da gösterecek ölçüte parametre adı verilir.
Parametrenin ne olacağına araştırmanın başında, planlama aşamasında karar verilmelidir.
Burada önemli olan nokta parametrenin incelenen etkiyi doğru ölçmesidir.
DENEYİN DOĞRULUĞUNU ETKİLEYEN ETKENLER:E- İncelenen bağımlı değişkene etki
edebilecek bağımsız değişkenleri iyi seçememek
İki etken (değişken) arasındaki ilişki her zaman neden - sonuç ilişkisi değildir.
İkisi de başka bir etkenin (değişkenin) etkisiyle ortaya çıkabilir.
İki değişken arasında ilişki saptandığında her iki değişkenin başka bir değişkene bağımlı olup olmadıkları incelenmelidir.
DENEYİN DOĞRULUĞUNU ETKİLEYEN ETKENLER:
F- Uygun olmayan istatistiksel teknikleri kullanmak
Bir araştırmada uygun olmayan istatistiksel tekniklerin kullanılması, elde edilen sonucun hatalı ve yanlış olmasına yol açar.
Toplanan veriye uygun olmayan önemlilik testi uygulamak, sonuçları geçersiz kılabilir.
DENEYİN DOĞRULUĞUNU ETKİLEYEN ETKENLER:
G- Karşılaştırılamayacak durumları karşılaştırarak karara varmak
DENEYİN DOĞRULUĞUNU ETKİLEYEN ETKENLER:
H- Sonuçları doğru yorumlayamamak
DENEYİN DOĞRULUĞUNU ETKİLEYEN ETKENLER:İ- Veri toplama ilkelerine ve verinin taşıması
gereken özelliklere uygun biçimde veri toplayamamak :
Veri toplama ilkelerine ve verinin taşıması gereken özelliklere uygun veri elde edilememişse araştırmanın sonucu geçersiz olacaktır. Bu nedenle veri toplanması doğru olmalıdır.
Deney hayvanına dayalı bir araştırma için çalışma planı örneği :
Karbon Monoksit (CO) Zehirlenme Modeli: CO, primer olarak doku hipoksisi yapar ve buna
bağlı tüm dokularda hasarlar meydana gelir. Bu modelde deney planı şu şekilde oluşturulur: Kullanılan ajan: Saf CO gazı Kullanılan hayvan: Rat Zehir dozu Uygulama yolu: inhalasyon Zehirlenme türü: Akut, Subakut, Kronik Hedef organ: Beyin, kalp, akciğer, ….. Tanısal test: COHb düzeyi, diğer
Deney hayvanına dayalı bir araştırma için çalışma planı örneği :
Gerekli Malzemeler: Saf CO gazı içeren CO tüpü, CO dedektörü (0-3000 ppm’e kadar ölçebiliyor), Şeffaf plastikten yapılmış bir anestezi odacığı, Oksijen maskesi ve koruyucu maske
Deney hayvanına dayalı bir araştırma için çalışma planı örneği :
Uygulama: CO gazı verilecek ratlar 60x27x27 cm ebatlarında şeffaf plastikten yapılmış bir anestezi odacığı içine alınır. Her seansta 10 rat kap içine alınır.
Ratların beş tanesi kontrol gurubu ve diğer beş tanesi deney grubu olarak randomize seçilir.
Başlangıçta CO ortam havası 1000 ppm olacak şekilde 40 dak. verilir. Sonra CO seviyesi 3000 ppm olacak şekilde yükseltilir. Bu işlemde yaklaşık 20 dak. devam
Ratların direncine göre solunum sayısı azalan ve yüzeyselleşen ratlar kaptan çıkarılır ve ortam havasına bırakılır.
SONUÇ-I Deney planı iyi bir şekilde tasarlanmalıdır. Tecrübeli bir kimse ile birlikte çalışmalı! Deneysel çalışma planı oluşturulurken
detaylı bir literatür taraması yapılmalı. Kullanılacak hayvan modeli ve metot
belirlenmeli. Çalışmanın amacına uygun bir hayvan
modeli seçilmelidir.
SONUÇ-II Seçilen hayvan modeli çok iyi
tanımlanmalıdır (soy, alt soy ve mümkünse genetik özellikleri belirtilmeli).
Uygulanacak deneysel girişimler veya maruziyetler;
Uygulama sonrası hangi organ patolojilerinin ortaya konacağı; ve
Bu patolojilerin hangi yöntemlerle değerlendirileceği belirlenmelidir.
Teşekkürler…Teşekkürler…Doç.Dr. Sibel ATIŞDoç.Dr. Sibel ATIŞ
E-mail: [email protected]: [email protected]
SorularSorular ????