high pressure liquid chromatography high performance liquid...

HPLC

High Pressure Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography

고성능액체크로마토그래프

기기분석기기분석__액체액체크로마토그래피크로마토그래피(HPLC)(HPLC)

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고성능액체크로마토그래프

HPLC system기기분석기기분석__액체액체크로마토그래피크로마토그래피(HPLC)(HPLC)

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(a) 시료의 분류ⓐ 비극성 물질 : 포화, 불포화 탄화수소, 고분자 물질, 지방ⓑ 극성 물질 : 작용기를 갖는 유기화합물, alcohol, amideⓒ 이온형 물질 : 염기, 산, 핵산, 아미노산ⓓ 이성질체 : 구조 이성질체, 광학 이성질체ⓔ 생화학 물질 : 단백질, 효소, 핵산

(b) 시료의 처리


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(b) 시료의 처리ⓐ 무게를 달고 용매에 녹인 후 희석 (20㎍/100㎖)ⓑ 안전하게 보관 후 분취하여 시료로 사용

(c) 분석방법ⓐ 분석은 체계적으로 할 것ⓑ 여러 종의 물질이 섞여 있을 경우 한 번에 분리하지 말고 단계별로 분리 하고

다시 분리 할 것ⓒ 관심 있는 부분만 중점적으로 분리 할 것

탈기 장치 (Degasser)송액 장치 (Solvent Delivery systems : pump)시료 주입기 (Injectors)컬럼 (Columns)


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컬럼 (Columns)컬럼 온도 조절기 (Thermostatted Column Compartment)검출기 (Detectors)


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탈기(Degassing)1. 목적 : 이동상의 용존 산소, 질소 및

기포 등을 제거한다.

2. 방법 : * He sparging* Vacuum(filtration)* Ultrasonication

이동상의 조건

1. Column 의 특성을 바꾸어서는 안된다.

2. 검출기에 적절해야한다

3. 시료를 녹일 수 있어야 한다

4. 점도가 낮아야 한다

5. 시료의 회수가 용이해야한다

6. 순도가 높고 오염물이 없어야 한다

7. 가격이 저렴하고 구입이 용이해야 한다.


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* Ultrasonication* On-line Degassing

Special plastic membrane tubing

Solvent reservoir

To pump

Vacuum chamber

Solvent Delivery System(Pump)

1. 역할 : 이동상을 이동상 저장용기에서 끌어들여 시료 주입 기로

연속적으로 밀어 준다.

2. 요건 : 일정한 유속과 압력을 유지할 것.

다양한 용매를 사용할 수 있을 것.


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다양한 용매를 사용할 수 있을 것.

3. Isocratic 및 Gradient

* Isocratic - 분석시간 동안 이동상 조성의 변화가 없다.

* Gradient - 분석시간 동안 이동상 조성이 시간의 흐름에 따라 변한다.

이중 피스톤 왕복 펌프


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4중 펌프 시스템 (고압 기울기)기기분석기기분석__액체액체크로마토그래피크로마토그래피(HPLC)(HPLC)

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Sample: Synthetic peptide: Column: Sephasil Peptide C18 5 μm ST 4.6/100Eluent A: 0.06% trifluoroacetic acid (TFA), pH 2.5Eluent B: 84% acetonitrile in 0.055% TFAGradient: (A) 0 - 60% (B) 10 - 35%Flow: 1 ml/min


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시료 주입기 (Injectors)

1. 역할 : 분석하고자 하는 시료를 용매의 흐름에 실어 준다.

2. 종류 : * 수동 (Manual Injection Valve)* 자동 (Auto Injector)


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시료 주입기 (Injectors)기기분석기기분석__액체액체크로마토그래피크로마토그래피(HPLC)(HPLC)

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• 컬럼의 기계적 구조• 내부는 유리 또는 PEEK(polyether-etherketone)

로 코팅되어 있음

컬럼 (Column)기기분석기기분석__액체액체크로마토그래피크로마토그래피(HPLC)(HPLC)

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• 분석용 칼럼 : 4.6 mm 일반적, 유속 : 0.5-2 mL/min소구경(narrow bore, 2-4 mm), 마이크로구경(microbore, 1-2 mm),

• 충전모세관(packed capillary, 0.1-1 mm) : 유속 수 mL/분으로 특수펌프와 검출기가 필요하며 컬럼 내 확산이 감소되어 분리능이 향상됨, 감도향상으로 HPLC/MS로의 연결이 가능함

• 칼럼의 수명연장을 위해 전치(pre) 또는 보호(guard) 칼럼을 두기도 하


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• 칼럼의 수명연장을 위해 전치(pre) 또는 보호(guard) 칼럼을 두기도 하며 시료 용액을 pore 사이즈 0.4-0.5 mm 필터를 통과시켜 주며 칼럼을보호함

• 컬럼은 일반적으로 항온장치내에 두어 분석의 재현성 및 효율 증가시킴

Type 컬럼 내경 길이 유속

일반 컬럼

(Conventional) 4.0 – 4.6 mm 15 – 30 cm 1 – 2 ml/min

고속분리용

(High Speed)

4.0 – 4.6 mm 4 – 10 cm 2 – 4 ml/min

컬럼 (Column) 종류기기분석기기분석__액체액체크로마토그래피크로마토그래피(HPLC)(HPLC)

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Microbore - 2 2.0 mm 15 – 30 cm 0.5 – 1 ml/min

Microbore - 1 1.0 mm 15 – 100 cm 0.03–0.06 ml/min

Capillary

(Packed) 0.2 – 0.5 mm 10cm – 2 m

0.001–0.010

ml/min

Capillary

(Open Tubular) 0.04 – 0.08 mm 1 – 2 m < 0.001 ml/min

컬럼의 내경 Large, 길이 Short, 유속 Fast : 분석 속도를 빠르게 할 수 있다.

무기 세라믹 소재 또는 고분자 합성물질이 충진

혼합성분들을 각각의 단일성분으로 분리시키는 기능

어떤 물리적, 화학적 변화도 잘 적응 할 수 있어야 함

일반적으로 컬럼 안에 있는 물질들을 충진제 라 함


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일반적으로 컬럼 안에 있는 물질들을 충진제(packing material)라 함

[ 실리카(silica), 알루미나(alumina) 합성 고분자(organic polymer)]

Silica

- 가장 많이 사용되는 물질

- 약산성의 성질 (사용 가능한 범위 – pH 2~8)- 역상 컬럼(Reverse phase), 이온교환(Ion-exchange), 친수성 작용 (Hydrophilic-interaction), 소수성 작용(Hydrophobic-interaction) 및 크기배제(Size-Exclusion)

Silica Stylene-Divinylbenzen Methacrylate

유기용매Very Good Good Good

컬럼 (Column) 충진물질기기분석기기분석__액체액체크로마토그래피크로마토그래피(HPLC)(HPLC)

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유기용매(Organic solvent)

Very Good Good Good

pH영역 (pH range) Bad (pH 2~8) Very Good(pH 1~13) Good(pH 2~11)

지지체 강도(Swelling/Shrinking)

Very Good Good Good

물리적 특성(Pressure capacity)

High pressure stable

0~3,000psi

High pressure stable0~1,500psi

Middle pressure0~800psi

표면 가공(Surface chemistry)

Very Good Good Very Good

분리 효율(Efficiency) Very Good Good Good

• 염기 촉매 가수분해 반응으로 에멀션 형태의 알콕시실리케이트(alkoxysilicate)와 테트라에톡시실레인(tetraethoxy silane)을 솔-겔(sol-gel) 중합하여 제조함


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• 실리카 겔의 특성은 내부 구조, 입자 크기, 다공성, 비표면적, 내구성, 극성 등의 여러 변수에 따라 달라짐

• HPLC용 실리카 겔은 mm2 당 약 5개의 실란올 기를 가지며 비표면적은35 m2/g이며 다공성 혹은 비 다공성일 수 있음

• 제조용 컬럼 (prep-column)은 무정형으로서 분석용과는 다르게 만듦


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Si 실리카 (Silica) 구조식 : Si-OH전통적인 순(정)상 (Normal Phase) 물질로, 비 이온성(non-ionic)을 가진 비극성(none polar)이나극성(polar)인 유기물질을 분석하는데 주로 이용됨

C18 옥타데실 (ODS, RP-18, LC18, Octadecyl) 구조식 : Si- C18H37전통적인 역상 물질이며, 비극성 시료에 대해 잘 머무르는 기능을 가지고 있으며, 매우탁월한 이온 조절 (Ion-pairing)크로마토그래피로 사용이 매우 좋음


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탁월한 이온 조절 (Ion-pairing)크로마토그래피로 사용이 매우 좋음환경물질, 지방산, 비타민, 약물, 생물 등의 다양하게 활용됨

NH2 아민(Amino, APS, Amino Propyl Silyl) 구조식 : Si- C3H6NH2역상, 순상 및 약 음이온교환 물질로 활용이 가능하다. 역상: 당 분석용으로 많이 사용되며,순상: 실리카 컬럼을 대체 할 수 있으며, 작은 양의 물에도 반응하지 않는 장점이 있다.이온 교환: 완충 용액을 사용하여 약 음이온 교환 기능을 가진 컬럼으로 활용이 가능하며,음이온, 유기산 분석에 좋다.

역상 컬럼(reversed phase column)이 좋은 이유

역상 크로마토그래피의 좋은점

* 역상컬럼 : 고정상(비극성) / 이동상(극성) -- 극성물질 먼저 용리


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1. 같은 종류의 컬럼과 이동상으로 비이온성, 이온성 화합물을 분리할 수 있음2. 역상 크로마토그래피 컬럼은 비교적 안정하여 별다른 주의가 필요없음

(단 PH는 7이 넘지 않도록 주의)3. 역상 크로마토그래피에서 사용되는 이동상은 저렴하고 쉽게 구할 수 있음4. 시료의 비극성이 증가 할수록 머무름 시간이 증가하므로 혼합물의 분리되는

순서를 쉽게 예측할 수 있음5. 컬럼의 평형이 빨리 이루어지므로 기울기 용리시 용매 조성 변화를 빨리 바꿀

수 있고 분석이 끝나면 빨리 초기화 시킬 수 있음

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