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HinweisBei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll, das einen Vortrag im Rahmendes Chemielehramtsstudiums an der Uni Marburg referiert. Zur besserenDurchsuchbarkeit wurde zudem eine Texterkennung durchgeführt und hinter daseingescannte Bild gelegt, so dass Copy & Paste möglich ist – aber Vorsicht, dieTexterkennung wurde nicht korrigiert und ist gerade bei schlecht leserlichenDateien mit Fehlern behaftet.

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Dr. Ph. Reiß, im Juli 2007

Ga rb a ra Frintrop

2. Lehr Hm t s vortr ag v om 2 0 .2 .8 0

E ~; 2 Y f·i [== == == == = ===

A. Vo r k omm en vo n Enzy mRn

~ ~J~~~~ : Demon str ation z u r Ein fUhrun g in d as Thema

In 5 Re agen zglä s er n ( Re) befin den s i c h j eweil s r ohe K ~r

t off eln ( 2m al), g e k oc h t e Ka r tof f e l n , Le bor und Br a uns t r i n .

In d as 1. RG g ebe ich ~as se r ; o i e rohe Kartoff el z e ig t

ke i rie Re 2ktion mit Ua s s e r , ZII .Jo n f olg end e n RG ge be ic h

v erdUnnt es was serstoff pero xid. Ei ne Gasent wicklung kann

in a I lp n RC beob acht et wer de n - bis a uf d as RG mit dpr ge

k ~r. h ten Ka r t of fe l .

2 H2 02 -------~ 2 H2 0 + 02 ~ H= -1 97,8 kJ/Mol

In d e r Kart o f f el sowi e i n der Leber befi nde t s i ch d e s

En z ym Kc t e La s e , ue Lch c s b r. f ä h ig t i st H2 02 ' d a s e i n Ze l l

gift d Hrst ellt, ab z ub a ue n . Ka t a I asp be fin det s i c h sowohl

im p f Lr.n z Li c he n (Kartof f el) wi e e uc h im ti erisch en (L F' tJ er)

Org a ni s mus; sow i e i m mens c hl i c he n Org a n is mus .

En z ym e k omme n som it in a l l e n l e ben den Ur g 2n ism e n vor. Si e

t. t " 1. 1c r: ~ i e wicht i g s t on \.J i r ks t 0 f f e de r Ze l l e d a r .

Che mi sc i,e Ums e t z unq e n , di e im Org ani smu s st att find en, sind

Fast auss c hl ie ßl i c h e n z ymati sch er Nat ur .

6. Che mi s ch er ChRr a ktor von Enzy men

'-../ C11 e m.iis c h ge s e he n geh ö r , n [nz ymez u den Pro t e in e n 0 der

Pr oteid en. Protei de e nt ha l te n noch a nd e r e 8es t a nd t e i l e

a uße r Eiwei ßen.

~ ~I~~~~: Proteinnachweis f Ur d 2s En z ym ~-A m yl ase

Den Pr o t einn achw ei s f Ur d as Enz ym K- Amyl as e, d as St ä r ~ e in

ihre Unte r e i nhe i te n s palt et, wird mit Coomas sie Brill~nt

Glue durchgefUhrt. Es ist e i n Farbsto ffn a chw r.is, der bei

A n w~ s e n hp i t v on P r otein e n nach bl au umschl ägt.

In ein RG ge be ich 2ml ~- Am yl Ds el ~ sung und tropfe Coom2ssie

hinzu. f s ist ein bl au er Farbu mschl Dg sicht bar. Zum Farb

ve r g l e i c h z ei ge ich die g elbe Cooma ss i e-L~sungo

Auf e i ne r Folie (1) habe ic h d i e St r uk u r f o r me l von

Coomassie Brill ant Blue a u f g e t r age n und di e Oi nd ungs s te l l e n

z um Pr ot ein markierto Es s i nd ~ ies die S03--Cruppen von

Coomas sie und die prot oniert en Aminogrupp en d e s Pro te i ns o

Chemie in der Schule: www.chids.de

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- 2 -

Um die Wirkung von Enzymen zu verstehen,

gehe ich zunächst auf die Stru~tur der Proteine ein.

Proteine sind MakromolekUle, die aus vielen peptidartig

verknUpfter ~Aminosäuren bestehen. Die Peptidbindung

entsteht durch Reaktion der Aminogruppe einer Aminosäure

mit der Carboxylgruppe einer anderen unter Wasserabspaltung.

Mit Hilfe der Peptidbindung sind Aminosäuren zu langen

Ketten verbunden. Dies ist die Sequenz oder Primär-

struktur von Proteinen, in denen Proteine abev nicht

vorliegen. Vielmehr nehmen sie unter Ausbildung von

Wasserstoff-Brückenbindungen die Gestalt ein es Faltbl attes

(Folie 2) oder einer~Helix an; di e S8kundärstruktur.

(Folie 3).

Unter Tertiärstruktur versteht man die St abilisierung

der r äumlichen Anordnung durch Disulfidbindungen, sowie

Ionenbindungen und hydropho ben Bindungen (rolie4).

Enzyme sind wie ges agt entweder Proteine oder

Proteide. Die Proteide bestehen au s einem Eiweißanteil

und einem Nichteiweißanteil, der an das Proteinmolekül

mehr oder weniger fest gebunden ist. I st eine solche

Gruppe reversibel gebunden, so nennt man sie Coenzym undCo

das Prote in Apoenz yrn , Apo- und ~enz ym bilden die

funktionelle Einheit des Holoenzyms. Nu r als solches ist

d as En zym wirks am (Folie 5 ).

rUr die Wirksamkeit des Enzyms ist das aktive Zentrum

verantwortlich, das aus bestimmten Teilen der Polype ptid

kette besteht. Durch die Tertiärstruktur k~nnen Ami no

säuren, di e sonst im ge strs cken Zustand weit vonein

ander liegen, d as aktive Zentrum bilden (Folie 5).

Aus der Demonstration l äßt sich die Prot einnatur

der Enzyme nochmals veransch aulich en. Die g ~ kochte Kar

toffel zeigte keine Reaktion mit H202• Proteine werden

durch Hitze einwirkung denaturiert; d.h. die Tertiärstruk

tur der Proteine ist verändert worden. Die Wirks amkeit

der Enzyme geht verloren.

c. Kat alyti s ch e Funktion von Enzyme n

1. Herabsetzung der Aktivierungs en ergie

Ein weiterer Versuch aus der Demonstr~tion verdeutlicht

die Wirksamkeit der Enzyme. Bei Anw esenheit von Mn0 2wird H40~zersetzto


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-3-

In der Anorganik haben wir Braunstein in der funktion

als Katalysator kennengelernt. Katalysartore,n sind Stoffe,

die eine Reaktion beschleunigen indem sie die Aktivierungs

energie herabsetzen. Sie gehen unver~ndert aus der Reaktion

hervor. Katalysatoren beschleunigen die Einstellung des

Gleichgewichts, nicht jedoch seine Lage o

Da für die Aktivierung vieler o r q an i s che r VerlJindungen

recht hohe Energiebeträge erforderlich sind, wEndet die

Zelle das Prinzip der Katalyse an. Die Biokatalysatoren

der Zelle sind dIe Enzyme.

~~~~~~Q: Her ab s et z e n der Ak t Lvi.e r unc s c ne r q i e bei der

Harnstoffzersetzung durch das Enzym Urease

In 2 RG habe ich 25ml H3rnstofFl~sung(1%) gegeben. Ich

versetze diese mit dem Indikator Phenolphthalein. Ein RG

dient mir als Korrt r oLl.v e r su ch , In das 2.RG gebe ich O,5ml

Ureaselösung hinzu. Der bei der Harnstoffhydrolyse ent

stehende Ammoniak verursa~ht eine pH-Wert-Erh~hung und

somit das Umschlagen des Indikators nach rot-violett.

Bei dem Kontrollversuch ist kein Farbumschlag zu erwarten.

Um zu demonstrieren wie groß die Energie sein muß, um eine

Spaltung von Harnstoff zu erzwingen, führe ich zu festem

HarnstoFf Hitze zu. Ammoniak f' a r b t Indikatorpapier blau.

Oie Aktivierungsenergie wird somit von Enzymen sow~~t

herabgesetzt, daß die Reaktion schon bei Zimmertemperatur

abl~uft, die sonst nur durch Hitzezufuhr erzwingt wird.

Auf einer Folie (6) habe ich die katalytische

tJirkung der Enzyme anhand eines Energiediagramms veran

schaulicht. Enzymatische Reaktionen sind im allgemeinen

mehrstufig und folgen diesem Reaktionsschema:

E. + S ~ ES 1 ~ [52 ~ EP =: E + P

D2s Enzym verbindet sich vorübergehend mit dem Substrat-

molekUl und bildet ein Enzym-Substrat-Komplex. [nzym

Substrat-Komplexe können verschiedene Zwischenverbindungen

eingehen (E5'1/[52),

die sich durch geringe Aktivierungs

energien auszeichnen. Die Aktivierungsenergie fUe den

langsamsten Schritt der Reaktion erscheint als hoher

Energie~erg, dessen Gipfel als Ubergangszustand bezeichnet

I

If

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I


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LLn k D.. -ta.. ey s i e: y i:e: 'K e a. t< 1= i 0 h :


- 4 -

wird. Hier findet die chemische Umsetzung statt o Zu

n~chst entsteht ein Enzym-Produkt-Komplex, der sofort

wieder in Enzym und. Produkt zerfällt. Uamit Ls t das

Enzym regeneriert. Das Energiediagramm e irie r unk at a I y e

tischen Reaktion zeigt, daß die Aktivierungsenergie

erheblich grUßer ist als f~r j8den Einzelschritt der

katalytischen Re~ktion.

2. Enzymkinetik

In diesem Zusarnmenh8ng gehe ich kurz' auf die Enzymkine-'

tik ein,die durch die Michaelis-Menten(M~I) Gleichung

bestimmt ist. Die MM Gleichung ist aus dem Massen

wirkungsgesetz abgeleitet; wobei KM die Gleigewichts-

'V k 0 n s t a n ted a r s tell t ( M1"1 - K0 n 5 t an t e ). 0 i e (VI 1"1 Clei c h un9

gibt die Bez Le hz nq zwichen ,Reaktionsgeschwindigkeit

und Substratkonzentration mit konstenter Enzymmenge an.

(Folie 7) Die Wirksamkeit eines Enzyms ermittelt man

2US der Arjangsgeschwindigkeit der enzymatischen Re

aktion bei variabler 5ubstratkonzentration. Die Funk

tion zeigt, daß sich die Anfangsgeschwindigkeit bei un

endlich hoher Suustratkonzentration assymptotisch einem

HöchstwErt nähert. Uas Enzym ist an Substrat gesättigt,

W~hr8nd im vorderen Bereich die Reaktionsgeschwindig

keit von der Substratkonzentration abh~ngig ist.

Die fUr die Erreichung der halbmaximalen Geschwindig

keit benötigte Substratkonzentration ist zahlenmäßig

mit dem KM-Wert identisch. DerKM-Wert ist eine charak

teristische Größe für ein Enzym und ein Substrat. Bei

kleinem KM-Wert genUgt bereits eine kleine Menge an

Substrat zur Enzymsättigung. Ist der KM-Wert groß, so

braucht das Enzym viel Substrat zur 5~ttigung; die

Affinit~t des Enzyms zum Substrat ist gering.

3. Spezifität der Enzyme

Das Zusammenspiel der Enzyme in einer Zelle wird durch

die Kompartimentierung der Zelle gew~hrleistet und

durch die 5pezifit~t der Enzyms o

Enzyme vermögen einerseits nur ganz bestimmte Reaktionen

zu kat a Ly s ic r cn (lJirkungsspe ifität)und ariue r e r s e i t s


Äb h 0:~5 \~ 1t.e.i t. (1.1.... 6c.s.e.k~' "" Oll~ le.a.i t ~; ""e.~ <l."'~J"'-' -ko..-tet f.y Sit.,y-k.", ~Ie..-I--io~ VOk Q..er 5u..bs.L-voA.. koll\. cQM.-tyo"4-\O~

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- 5 -

nur g a n z be stimmte Sub strate umsetzen (substr at spe zifit ät).

~f:E~H~~: Spezifit ät d e s En z yms Ur e as e in Be z ug auf di e

Su bs tr a t e Harnsto ff und N- N-Dim ethyl harnstofF

Zu je 1ml Harnstofflösung+ bzw. N- N-Di meth ylh arnst off

,( 25mM ) g ebe ich O, 5ml Ure as e + . Ei nemf<ontr oll versuch ver-

Se t ze ic h ke i ne Ureas e . O S~ durch die Re ak t i on f r eiwerdende

NH3

wird mit der Reaktion nach Oe r t he l ot n ach ~eui e s en

(Foli e 8). NH3 r e a g i ert z u n ~ ch st mit Hypochlorit unt er

Bi ld ung v on Chl or omin, au s de m mit Ph en ol und O2 para

Chi n on- Chl o r i mi n g e b i l de t wird;un t er Zug ab e des Ka t a l ys a

tors Nit f r op ru ss i d- Ne . Dur c h wei te re Reak t i on mi t Phen ol

Ent st eht ein I nd op he n ol far bst of f, der in a l ka l i s c he r Lö

su ng b la u e r s c he i n t .

Di e in ku bi er t en Lös un g e n g eb e ich in Er l e nm e yer-Kol b en und

f Ul l e j e wei l s 25ml Phen ol +N i t rop r us s id -N a und 25ml NaOH +

N a O C I ~ Die ti ef bl aue ~ a r b e z ei gt si ch nac h ei n i g e r Ze i t

nur i n der mit Urea se versetzt e n Ha r ns to f fl ös ung . De r

Kontro l lve r s uc h b l e ib t f ar bl os ; so wie di e mit Ur e as e ver

se tz te N- N- Di mFet h yl ha r ns t of f l ös ung , d a di e s e von d e m En z ym

nic ht abg eb a ut wi rd .

D i ~ Sp ezif it ä t de r Enz yme wird oft mit e i ne m Sc h l oß ver-

9 I i ch c n, z u we 1 e he m nur LIe n i ge 5 eh 1 üs s e L pas s e n , [) i e

Sch l ijss ' ' --Sch loß - Th e or i e beru ht a uf ei nem s pe zi fisc hen

Passe n d e s S ub s t r ats zum .a kt i ve n Ze nt r um des En z ymsCFolie9).

f ür viel e En zyme t rif ft e he r die In du c e d- Fi t-Th e or i Q z u .

Dan ac h i st d as S ub s t ra t in der La ge be i d e r Bi nd ung an d as

En z ym e i ne St ru ktur ä nd e rung im Enz ym zu in d uz ieren <Fo l i e 9 ) .

D. Ab hä ng ig kEi t de r E n z y m a k t i vit ~t v on ä uße re n Fakt o r en

1. Temper a tu rab hä ng i g koit

~ .?; I ~ J:!~~ : Te mp E' I' a t LJ r a b h ij ng ig k e i t de r «. - Amy I 2 ~: e

Vor Vers uch sb e g i nn ha b e ic h zu 3 RG j ewe i l s 3 0ml d e s t .

lJ8 S S e r und 1ml S t ä r k e Ls q , (1 7n 9 e 9 e b an , Ein r :': b 1 i c b b e i,

Zi fll mer t Emper a t u r s t e hen, e i ne s im Ei s b ad und e i nes i m

Hi t zeb 2cJ . J e t zt g eb e i c h z u j eJ em ;, C 1ml Arny lase l s g . h i n-

z u .

3 E' i der e nz yma t i s e he n Au f s pa l t LJ n9 des S t ii r ke m0 18 kü1SE nt St e

hen DI s p r i msi r e Sp a l tpr od ukt e Dex tr in e ( 6-8 Gucosee inheit en),

d ie be i ue.i t.e r e r Einwi r kun i;] d e : Enzy ms zu [Vjal t os e a bqn b a ut

W f~ r d e n , Al s Na c huc is dr r En z ymr e ak t i on d .i c nt mi I' J 2 / ":; L a l s

+ Lös LJ n9 e n au s LJ ein 11D r r:::, t 0 f r .;T .:J t v on lJ0 e h r i ng e rChemie in der Schule: www.chids.de

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Sc he~.~5. ee- 'sc.-h eO.(i- Theo~ie

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- 6 -

Reagenz, das mit St~rke ein blaUE EinschluOv8rbindung

bildet. Da Cextrine kürzere KettE'r1 darstellen, ver-

s c h i e b t sie h die F a r b.ein den Rot. I) e r e ich. ( F 01 i e 1 0 )

Zu den RG gebe ich nun J 2/ J K.

Zimmerternp.

Eisbad

HitzeLJad

gelb

blau

blau

kein

kE;in

5tärkeabbau

""

stärkeabbau

+++

++++++

+++

Das Ergebnis verdeutlicht die Folie (11). Die ReaktionST

geschwindigkeit nimmt mit zunehmender Temperatur zu. Im

h~heren Bereich gewinnt die Inaktivierungskurve fUr Pro

teine immer mehr Einfluß. Uiej8n~ye Temperatur, bei der

das Enzym seine h~ch~te Aktivit~t entfaltet bezeichnet

man als Temperatur-Optimum.

2. pH-Wertauhängigkeit

~~~~~~Q: pH-Wert-Abhängigkeit derJV-Amylase

Zu 9 RG gebe ich jeweils 30rnl Ph os phat p uf'f e r mi t unter-

s chi e rj 1 ich e n PH- Wert e nun d j 8 Weil s 1m1st ~~ r ke l s 9 • ( 1:~.~). 8 e i

Versuchsbeginn gebe ich 1ml Amylaselsy. hinzu. Zur Ermitt

lung der unterschiedlichen Reaktionsgeschwindigkeiten wird

wieder J 2/JK zugegeben.

Ergebnis: pH Farbe

3,2 blau4,0 blau4,8 violett5,5 rot

pH-Optimum ----.-'IC 6,2 gelb_6,9 gelb

7,5 rot8,0 violett8,6 blau

Aus der Folie (12) geht hervor, daß die Abh~ngigkeit vom

pH-Wert die Resultierende von zwei anderen Abh~ngigkeits

verhältnis~en ist. 1. die Dissoziationskurve für saure

Gruppen. und 2. die für alkalische Gruppen. Oi8 pH-

Wert-Abhängigkcitskurve stellt somit die Jissoziations

kurve fUr einen Ampholyten dar.

3. Abhängigkeit von Effektoren

Zum Schluß gehe ich auF die Regulierung der Enzymaktivit~t

mit Hilfe von Aktivatoren und Inhibitor8n(=Effektoren)~ein.


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A. Am(jeose

-0 oH OH H OH

-0 0

0#1 CHI

c.k.z.OH ,c.H02- Clfj. o«

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3 : pH- Ab'" tth~;9l<e.jbL<u..y-v-e..


Farbe

rot

- 7 -

~E~~~~~: Hemmung der Urease mit Thioharnstoff

In 2 RG gebe ich jeweils O,2ml Ureaselsg. und 1ml Harnstoff

lsg •• In das 2.HG gebe ich zusätzlich O,5ml 50m~'1 Thioharn

stofflsg •• ~ach 2 min versetze ich beide L~sungen mit den

Re ag e nt i 8 n n a eh Be r t helot. 0 i e Lös u n g mit dem He mms t 0 f f

Thioharnstoff zeigt eine geringere Blaufärbung als die ohne

Hemmstoff.

Es handekt sich hierbei um eine kompetitive Hemmung, An das

aktive Zentrum können anstelle des Normulsubstrates auch

~hnlich gebaute MolekUle angelagert werden, Je nach ihrer

Affinit~t zum Enzym verm~gen sie dadurch das Substrat m8~r

oder weniger zu verdrängen. Da der Hemmstoff nicht umgeaizt

LJird, blockiert er das aktive Zentrum. Es. handelt sich hier

um eine reversible 3indung , durch Erhöhung der 5ubstrat-

k on z e n t r n t i on u ird der, Hemmstoff z ur üc kqo or änj t , Di.8 volle

Aktivtt~t d8~ [n7yms kann wieder hergestHllt werden.

Von größere Uedeutung fUr die Regulierung der

Enzymtätigkeit im Organismus ist jedoch die allosterische

Hemmung und diE allosterische Aktivierung, bei der das

Enzym noch ein zweites Zentrum besitzt. An dieses kann sich

der Effektor anlagern. Es handelt sich um eine reversible

Bindung. Oie Anlagerung des Effektors verursacht eine Kon

formationsänderung der Substratbindungsstelle (Folie13).

~~J~~~Q: Ak t i v i e r unq der "V-Amylase

Z u 2 RG g·ebei eh 30m 1 des t , LJ ass e run d 1 rn ISt ä r k e 1 s 9 • ( 1j;) •

in ein RG gebe ich zus~tzlich einige Tropen NaCl-Lsg.(1%)

als Aktivator. 1ml Amylaselsg. werden zu beiden Re ge

~Fben. kurz darauf J~/JK.L

E. r 9 e b n i s : Akt i v a tor

ohne

mit gelb


11"",,,, "'V/sm bJeic.hkeite.",

e" ~.J"" a.l<f:i v; t:&:c

Ak-f: i vi f!.v u. '" ~

.,+ /


Barba:ra rrintrop1. Leh r amt.s v o r t.raq vom 13.12.79

Nachtrag zu

Katalase-Test

KAT A L Y S E=================-=

I''V

I

rolgen,der Agar uurde he r q s s t e Ll t z Tryptic Soy Agar

Die s i nz e Lnan Substanzen (17'g T:rypton, 39 So yt on , 59 NaCl,

15g Agar) werden geltist, gemischt und der pH-Wert von 7,3

eingestellt. Erst jetzt wird der Agar zugegeben und durch

Aufkochen gelöst, d arra ch wird er' aut ok l sv Le r t , Nach Abkühlen

im Wasserbad auf 5SoC gießt man den Agar in Petrischalen

aus , Di.e Platt-sn ue r de.n zum Elrs.,tarren aufgestapelt.

Escherichia coli wird mit der ImpfBse auf dem Agar ausge-

~;t;i;h;~=-öi;-I~k.ubationerfo§,t im Brutraum bei :noc , 1 Tag

lango

10%ige H2B2-Lösung wird mit einer Pateur~Pipette auf die

Kolonien, q e t r-ä uf el t, Eine Gas ant.v.i ck Lunc ist s Lch tb s r ,

In fast allen: ae r oban BaktslLie.n sind Ka ta Las.a-Enz yme vor

handen, die dem Abbau des toxischen H20 2 dienen.


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