Histokompatibilní Histokompatibilní systém a prezentace systém a prezentace

antigenuantigenu

MHCMHC

• Major Histocompatibility Complex (MHC) Human Leukocyte Antigenes (HLA) u

člověka - kóduje polymorfní glykoproteiny, které patří do

imunoglobulinové skupiny - hrají důležitou roli při regulaci imunitní odpovědi

organismu

HLA geny, produkty a metodiky HLA geny, produkty a metodiky detekcedetekce

DP DQ DR B C A

TNF, geny komplementu

chromosom 6

HLA II třída HLA I třída

Buněčná membrána

neshody

TcTh,Tc

sérologieDNA

CML, CTLpMLC, HTLp

DNA

STRUKTURA HLA ANTIGENŮ

• I. třída – řetězec – 45kDa, 2 mikroglobulin

• II. třída – a řetězce, 30 kDa

Pohled na HLA I. třídy „zhora“Pohled na HLA I. třídy „zhora“

Kodominantní exprese HLAKodominantní exprese HLA

• Každý jedinec má od rodičů 2 antigeny HLA-A, 2 - HLA-B, -DR atd.

VÝSKYT HLA ANTIGENŮVÝSKYT HLA ANTIGENŮ

• HLA antigeny I. třídy - A,B,C - na všech nukleárních buňkách

• HLA antigeny II. třídy - DR, DQ, DP - na antigen-prezentujících buňkách – dendritické buňky, monocyty, makrofágy, B buňky

Rozpoznání antigenu – MHC Rozpoznání antigenu – MHC restrikcerestrikce

Prezentace antigenu – I. třídaPrezentace antigenu – I. třída

Prezentace antigenu – II. třídaPrezentace antigenu – II. třída

NomenklaturaNomenklatura

Název Označuje

HLA HLA region, nebo předpona pro HLA gen

HLA-DRB1 určitý HLA gen, t.j. DRB1

HLA-DRB1*13 skupina alel, která kóduje antigen DR13

HLA-DRB1*-1301

určitá HLA alela

HLA-DRB1*-1301N

alela, která není exprimována

Asociace s některými nemocemiAsociace s některými nemocemiNemoc Asociovaný

antigenAnkylozující spondylartritida (m.

Bechtěrev)B27

Revmatoidní artritida DR4, DR1Juvenilní revmatoidní artritida DR5, DR8

Systémový lupus erythematodes DR3, DR2Insulin-dependentní diabetes mellitus DR3, DR4

Pemphigus vulgaris DR4, DR6Psoriasis vulgaris DR7

Roztroušená skleróza DR2, DR4, DR6Myasthenia gravis DR3

HLA ANTIGENYHLA ANTIGENY

• Pro transplantace orgánů typizujeme HLA antigeny A, B, (první třídy) a DR (druhé třídy)

• Pro transplantace kmenových buněk – A, B, Cw, DR, DQ

• Velmi rozdílné (polymorfní) - (přes 1000 HLA-B alel (varianta genu), více než 700 alel HLA-DR)

Frekvence některých HLA Frekvence některých HLA antigenů I. tř. v české populaciantigenů I. tř. v české populaci

• A*02 (49.1%), A*03 (11.9%), A*01 (36.4%), A*24 (12.1%)

• B*07 (31.5%), B*44 (35.7%) B*08 (29.8%)• Cw*07 (44%), Cw *0602 (26%), Cw*03 a

Cw*12 (obojí 20%)

PROČ SE PROVÁDÍ HLA PROČ SE PROVÁDÍ HLA TYPIZACE?TYPIZACE?

• Shoda v HLA antigenech mezi dárcem a příjemcem i přes velký pokrok v imunosupresivní léčbě je životně důležitá pro transplantaci kmenových buněk a má (stále) význam pro dlouhodobé přežití transplantovaných orgánů (ledviny, srdce, pankreas)

HLA typizaceHLA typizace• Sérologie - stále se používá pro typizaci

antigenů I. třídy pro orgánové transplantace • Molekulárně biologické metody - pro typizaci

antigenů I. a II. třídy pro orgánové transplantace a transplantace kmenových buněk

Izolace lymfocytůIzolace lymfocytů

Princip sérologiePrincip sérologie

Odečet cytotoxického testuOdečet cytotoxického testu

Limitace sérologieLimitace sérologie

• Antiséra a monoklonální protilátky nepokrývají všechny HLA specificity

• Potřeba živých buněk s výraznou povrchovou expresí HLA antigenů

• Sérologická křížová-reaktivita (A2 a A28, B7 a B27, B5 a B53,…)

Molekulárně genetické metody při HLA Molekulárně genetické metody při HLA typizacitypizaci

• PCR-SSP (polymerázová řetězová reakce se sekvenčně specifickými primery) - amplifikace určité sekvence specifickými primery

• PCR-SSO (polymerázová řetězová reakce se sekvenčně specifickými oligonukleotidy)

• - amplifikace celého úseku kódujícího příslušný antigen - rozlišení alel a následna hybridizace se značenými sondami

• Sekvenování HLA genů

PCR – polymerase chain reactionPCR – polymerase chain reaction

• Selektivní amplifikace (množení) specifické cílové DNA

• Nutná je předem informace o cílové sekvenci DNA

• Primery – 15-25 nukleotidů

První cyklusPrvní cyklus

• Denaturace DNA – 93-95°C

• Annealing primerů – 50°-70°

• Syntéza DNA – 70-75°C

• t° stabilní DNA-polymeráza (Taq polymeráza – Thermus aquaticus)

• Deoxynukleozid- trifosfáty

Další PCR cyklyDalší PCR cykly

• Řetězová reakce, po 25 cyklech – 105 kopií cílové sekvence

SSPSSP (sequence-specific primers) (sequence-specific primers)

• Použití primerů sekvenčně specifických pro určitou alelu

• Separace a vizualizace PCR produktů v gelu (etidium bromid)

SSOPSSOP (sequence-specific oligonucleotide (sequence-specific oligonucleotide probes)probes)• Amplifikujeme celý gen ( HLA-A,-B-DR…)• Rozlišení alel následnou hybridizací se

značenými sondami SSOP

Histokompatibilita u orgánových Histokompatibilita u orgánových transplantacítransplantací

• Ledviny – shoda HLA-A,B,DR, negativní crossmatch

• Srdce/plíce –negativní crossmatch• Ledvina/pankreas - negativní crossmatch• Játra – crossmatch nemá význam• U transplantací kmenových buněk – většinou se

připouští jedna neshoda na úrovni alel (záleží na TC)

Years Posttransplant

Perc

ent

Surv

ival

100

90

80

70

60

50

400 1 2 3

HLAMM0

1-23-45-6

0 1 2 3

Perc

ent

Gra

ft F

ailu

res

0

10

20

30

40

4,6885,67416,67

77,533

16.0

11.1

9.78.7

n T1/2

83797674

20181511

The Effect of HLA-Mismatches on Cadaver KidneyGraft Survival (UNOS 1994-1998)