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HLA-A2 supertype에 제한적인

CD8+ T세포의 보호면역반응을

효율적으로 유도하는 결핵균

펩티드 항원결정기의 동정

연세대학교 대학원

의 과 학 과

최 주 영

HLA-A2 supertype에 제한적인

CD8+ T세포의 보호면역반응을

효율적으로 유도하는 결핵균

펩티드 항원결정기의 동정

지도교수 조 상 래

이 논문을 석사 학위논문으로 제출함

2006년 12월 일


의 과 학 과

최 주 영

최주영의 석사 학위논문을 인준함

심사위원 인

심사위원 인

심사위원 인


2006년 12월 일

감감감감사의사의사의사의 글글글글

많은 분들의 도움으로 2년 동안의 석사과정을 마치게 되었습니다. 많이

부족한 저에게 기회를 주시고 항상 모범을 보여주신 조상래 교수님께

진심으로 감사를 드립니다. 석사과정동안 저에게 많은 것을 가르쳐 주시고

이끌어주신 조성애 선생님께 깊은 감사를 드립니다. 바쁘신 가운데

논문지도 해주시고 많은 조언 해주신 임종백 교수님께 감사를 드립니다.

교실세미나를 통해 많은 것을 가르쳐 주신 박전한 교수님, 최인홍 교수님,

이원영 교수님, 김세종 교수님, 이봉기 교수님, 김종선 교수님, 신전수

교수님, 이재면 교수님께 진심으로 감사를 드립니다. 항상 친철하게

설명해 주시고 웃음으로 대해 주시는 한미영 박사님, 늘 관심을 가지고

지켜봐 주시는 이종석 박사님, 송택선 박사님께 감사 드립니다. 실험에

대해 많은 조언을 해주신 고시환 선생님과 항상 웃으시면서 많은 도움을

주시는 김일휘 선생님께도 깊은 감사를 드립니다. 무엇보다도 실험에 대해

아무것도 모르는 저에게 기초부터 차근차근 가르쳐준 성희와 옆에 있어서

항상 든든했던 정 많은 장은 선생님께 진심으로 감사를 드립니다. 제게

항상 힘을 주는 어리지만 생각이 깊은 귀여운 수연이, 석사과정 동안 많은

것을 함께하며 항상 힘이 되어준 동기 정연이, 실험실의 분위기를 밝게

해주는 막내 민경이, 이제 곧 이쁜 아기의 엄마가 될 참한 은희, 배려심

많은 미진 선생님, 마냥 어려 보이는 선화, 항상 흔쾌히 T세포를

제공해주는 이쁜 지영이와 아름이, 즐겁게 실험실 생활을 하는 진영

선생님, 지연이, 아름이, 남진 선생님, 승모 선생님, 특히 제 실험 때문에

채혈하느라 정말 고생 많이 하신 영미 선생님께 진심으로 감사를 드립니다.

그리고 제 실험을 위해 귀한 T세포를 제공해 주신 많은 선생님들과

연세대학교 학생들, 세브란스 병원 임상병리사 선생님들께 깊은 감사의

말씀을 드립니다. 같은 분야의 실험을 하면서 조언도 많이 해주고

누구보다도 많은 의지가 되었던 혜원 언니에게도 마음 깊이 고맙다는 말을

전하고 싶습니다. 마지막으로, 철없는 막내딸을 항상 믿고 아껴주시는

사랑하는 우리 부모님, 언니, 오빠, 형부, 곧 우리 가족이 될 문숙 언니,

귀여운 조카 경민이와 유찬이, 그리고 항상 한결 같은 모습으로 곁에서

힘이 되어주는 제 오랜 친구이자 연인인 상큼이에게 진심으로 감사의

마음을 전합니다.

2006년 12월. 저자씀.

i

차차차차 례례례례

그림 및 표 차례

국문 요약 ................................................1

ⅠⅠⅠⅠ. . . . 서서서서 론론론론

1. 결핵 문제의 현황 ......................................3

2. 결핵균 감염에 대한 CD8+ T세포의 면역반응 ..............4

가. 결핵균 감염에 대한 면역반응에서의 CD8+ T세포 ........4

나. MHC class Ⅰ restricted CD8+ T세포의 면역기능 ......5

다. MHC class Ⅰ pathway에 의한 결핵균 항원 처리 .......6

3. CD8+ T세포에 대한 항원결정기를 이용한 백신 개발 .......9

가. BCG 백신의 문제점 ..................................9

나. 특정 MHC type에 대한 항원결정기 ...................10

4. 연구목적 .............................................11

ⅡⅡⅡⅡ. . . . 재료재료재료재료 및및및및 방법방법방법방법

1. HLA-A typing .........................................14

2. 펩티드 합성 ..........................................14

3. 말초 혈액 분리 .......................................14

4. IFN-γ Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) .....15

5. IFN-γ Enzyme-linked immunospot (Elispot) assay ......16

6. 세포 배양 ............................................17

7. Short-term cell line의 intracellular IFN-γ staining ..18

8. PPD+인 개체로부터 기억세포 독성 반응의 유도 ..........19

9. CTL assay ............................................19

ii

10. In vitro immunization에 의한 CTL line의 유도 ........20

11. 대식세포 감염실험 ...................................20

12. ELISA를 이용한 펩티드에 특정한 항체 측정 ............21

13. Reverse transcriptase polymerase chain reaction ......22

ⅢⅢⅢⅢ. . . . 결결결결 과과과과

1. 연구 대상자들의 HLA-A genotype ...................... 25

2. CD8+ T세포의 IFN-γ 분비를 효율적으로 유도하는 펩티드

선별 ............................................... 27

3. 후보 펩티드에 특정한 CD8+ T 세포의 세포독성반응 ...... 32

가. 후보 펩티드에 특정한 CD8+ T세포의 기억세포 독성

반응 유도 (recall CTL) ............................ 32

나. In vitro immunization 방법에 의해 생성된 후보

펩티드에 특정한 CD8+ T cell line의 세포독성반응 ... 39

4. 후보 펩티드들의 유전자 발현 ......................... 43

5. In vitro immunization 방법에 의해 생성된 T cell line의

결핵균에 감염된 대식세포에 대한 세포독성반응 ........ 47

ⅣⅣⅣⅣ. . . . 고찰고찰고찰고찰 ................................................ 49

ⅤⅤⅤⅤ. . . . 결론결론결론결론 ................................................. 53

참고문헌 ................................................. 55

영문요약 ................................................. 66

iii

그림그림그림그림 차례차례차례차례

그림 1. HLA-A2 supertype인 건강한 개체의 말초혈액으로부터

IFN-γ 분비를 효율적으로 유도하는 펩티드들의 동정 ....... 29

그림 2. HLA-A2 supertype인 건강한 개체의 CD4+ T 세포가

제거된 말초혈액으로부터 IFN-γ 분비를 효율적으로 유도하는

펩티드들의 동정 ......................................... 30

그림 3. HLA-A2 supertype인 건강한 개체와 결핵 환자의 CD8+ T

세포로부터 IFN-γ 분비를 효율적으로 유도하는 후보 펩티드 31

그림 4. PPD+이며 HLA-A*0201인 건강한 개체로부터 recall CTL

반응 유도에 의해 생성된 T cell line의 세포독성반응 ...... 35





그림 7. HLA-A2 supertype인 결핵환자로부터 recall CTL 반응

유도에 의해 생성된 T cell line의 세포독성반응 ........... 38

그림 8. PPD-인 건강한 개체들로부터 in vitro immunization방법에

의해 생성된 후보 펩티드에 특정한 CD8+ T cell line의

세포독성반응. ........................................... 41

그림 9. RT-PCR을 통한 후보 펩티드의 유전자 발현 측정 ...... 45

그림 10. In vitro immunization 방법에 의해 생성된 후보

펩티드에 특정한 CD8+ T cell line의 결핵균에 감염된

대식세포에 대한 세포독성반응. ........................... 48

iv

표표표표 차례차례차례차례

표 1. 항원결정기 후보 펩티드의 아미노산 서열 ............. 23

표 2. Reverse transcriptase polymerase chain reaction을

위한 primer 염기서열 ................................ 24

표 3. 연구 대상자들의 HLA-A genotype ...................... 26

표 4. Serum IgG ELISA를 이용한 결핵환자 혈청 내 후보

펩티드를 포함하는 단백질에 대한 항체의 정량 측정 .... 46

1

국문요약국문요약국문요약국문요약

HLA-A2 supertype에 제한적인 CD8+ T세포의 보호면역반응을

효율적으로 유도하는 결핵균 펩티드 항원결정기의 동정

결핵은 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)에 의하여 유발되고,

호흡기를 통해 전염되는 질병이다. 결핵 발병률은 효율성이 높은

항 결핵치료제의 개발로 계속 감소 추세에 있었으나, 최근 사람

면역결핍 바이러스와의 동시감염과 다제내성 결핵의 증가 등의

원인으로 인해 그 발병률이 전 세계적으로 다시 증가하고 있다.

BCG는 현재 유일하게 사용되고 있는 결핵 예방백신이다. 그러나 그

효율성이 0-80%로 매우 다양하므로 더 효과적인 결핵 백신 개발이

절실히 요구되고 있다.

여러 연구들에 의해 BCG는 주로 CD4+ T세포의 면역반응을

유도함이 확인 되었다. 한편, 많은 논문들을 통해, 결핵균 감염에

대한 보호면역에서 CD8+ T세포 면역반응의 중요성이 강조되었다.

그러므로, 결핵균에 특정한 MHC class Ⅰ restricted CD8+ T세포의

면역반응을 효율적으로 유도할 수 있는 항원결정기의 동정은 BCG를

보강할 수 있는 백신 개발과 결핵에 대한 CD8+ T세포의 보호면역

반응 연구에 많은 도움을 주리라고 기대된다. 이를 위해, 본

연구에서는 이전 연구에서 선별된 soluble HLA-A*0201와 결합

친화력이 높은 결핵균 펩티드 64개의 세포면역반응의 유도기능을

분석하여, CD8+ T세포의 주 기능인 IFN-γ 분비와 세포독성능을

유도하는 HLA-A*0201에 제한적인 항원 결정기를 찾고자 하였다.

2

그리고, 본 연구에서 동정된 결핵균의 항원결정기 펩티드들이

대식세포내의 결핵균의 genome에서 실제로 전사되고 표현되는지

증명하고자 하였다.

본 연구 결과, 64개의 펩티드 중 CD8+ T세포의 IFN-γ 분비를

효율적으로 유도하는 6개의 펩티드를 선별하였고, 그 중 4개의

펩티드들이, HLA-A*0201을 표현하는 개체뿐만 아니라 HLA-A*0206,

HLA-A*0207을 표현하는 PPD+인 건강한 개체들과 결핵환자의

말초혈액에서 세포독성능을 유도함을 확인하였다. 이로써, 이

펩티드들은 HLA-A2 supertype인 개체에서 면역반응을 유도하는

항원결정기라고 할 수 있다. 그리고, in vitro immunization

방법에 의해 생성된, 4개의 후보 펩티드들에 특정한 CD8+ T cell

line은 각 펩티드를 제시하고 있는 표적세포에 대해 세포독성능을

나타내었고, 그 중에서도 19번과 28번 펩티드에 특정한 CD8+ T

cell line은 각 펩티드를 제시하는 표적세포뿐만 아니라 결핵균에

감염된 대식세포에 대해서도 세포독성능을 나타내었다.

이러한 연구결과로써, HLA-A2 supertype인 개체들에서 결핵균에

대한 CD8+ T세포의 보호면역반응을 유도할 수 있는 결핵균의

새로운 항원결정기 2개가 본 연구에서 동정되었으며, 이들은 HLA-

A2 supertype을 표현하는 개체들을 대상으로 하는 subunit 백신

개발에 기여할 수 있다고 기대된다.

핵심되는 말 : 결핵균, CD8+ T세포, HLA-A2 supertype, 세포독성능,

항원결정기, IFN-γ

3

HLA-A2 supertype에 제한적인 CD8+ T세포의 보호면역반응을

효율적으로 유도하는 결핵균 펩티드 항원결정기의 동정

<지도교수 조상래조상래조상래조상래>

연세대학교 대학원 의과학과

최최최최 주주주주 영영영영

ⅠⅠⅠⅠ. . . . 서론서론서론서론

1.1.1.1. 결핵결핵결핵결핵 문제의문제의문제의문제의 현황현황현황현황

결핵은 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis, MTB)에 의하여

유발되고, 호흡기를 통해 전염되는 질병이다. 전 세계 인구의

3분의 1이 보균자로 추정되어 있으며, 그 중 5-10%에서 질병이

야기된다고 보고되고 있다1,2. 세계보건기구 (World Health

Organization; WHO)의 2002년 통계자료에 의하면 매년 약 880만

명의 새로운 환자가 발생하며, 매년 200만 명 정도의 환자가

결핵으로 사망하고 있다고 보고되어 있는데, 이는 전염성

질환으로서는 가장 높은 사망률을 보인다3. 우리나라의 경우는

세계보건기구의 2004년 자료에 의하면 새로운 결핵환자가 35,000명

정도로 이는 미국에 비해 12배, 일본에 비해 3배 정도 높고

경제협력개발기구 (Organization for Economic Cooperation and

Development; OECD) 가입국 중에서 가장 높은 수치를 보인다4.

4

그 동안 효율성이 높은 항 결핵치료제의 개발로 결핵의 발병률이

감소되어 왔으나, 최근 사람 면역결핍 바이러스 (human

immunodeficiency virus; HIV)의 동시감염과 항 결핵치료제에

내성이 생긴 다제내성 결핵 (multidrug-resistant tuberculosis;

MDR-TB)의 증가로 인해 결핵이 다시 증가하면서 전 세계적으로

심각한 문제로 대두되고 있다5,6.

프랑스의 과학자 Calmette와 Guerin에 의해 개발된, 현재

유일하게 사용되고 있는 예방 백신인 bacille Calmette-Guerin

(BCG)는 그 효율성이 0-80%로 매우 다양하므로 효과적인 예방

백신의 개발이 절실히 요구되고 있다7.

2.2.2.2. 결핵결핵결핵결핵균균균균 감염감염감염감염에에에에 대한대한대한대한 CD8+ TCD8+ TCD8+ TCD8+ T세포의세포의세포의세포의 면역반응면역반응면역반응면역반응

가. 결핵균 감염에 대한 면역반응에서의 CD8+ T세포

결핵균 감염에 대한 인체의 보호면역은 주로 세포매개 면역반응

(cell-mediated immunity)에 의해 일어난다. 이는 결핵균이 세포

내에서 증식하는 세포 내 병원균이기 때문이다. 결핵균은 호흡기를

통해 체내로 들어와 대식세포에 의해 포식된다. 포식된 결핵균은

대식세포내의 포식소체 (phagosome) 내에서 번식하는데, 이때

분비되는 결핵균의 항원들은 주조직적합성 복합체 (major histo-

compatibility complex; MHC) class Ⅱ pathway를 거쳐서 처리되고

CD4+ T세포에 제시된다. 지금까지의 많은 실험들을 통해 CD4+

T세포가 결핵에 대한 보호면역에 중요한 역할을 한다는 것이

5

확인되었다8,9. 그러나, 최근에는 결핵균의 항원들이 MHC class Ⅰ

pathway를 거쳐서도 처리될 수 있다는 것이 보고되면서, CD8+

T세포에 의한 면역반응 또한 많이 연구되고 있다10,11. 마우스

모델에서 β2-microglobulin (β2m)의 유전자를 삭제하면 MHC class

Ⅰ-restricted cytotoxic T lymphocytes (CTL)의 발달이 저해되고,

결핵균의 증식이 빠르게 진행되는 것이 관찰되었다12. 그리고

transporters associated with antigen processing (TAP)의 기능이

결여된 마우스에서는 결핵균 감염에 대한 면역 반응이 현저히

감소하는 것이 보고 된 바 있다13. 또한, 결핵균에 감염된

마우스에서 많은 결핵균 항원에 특이적인 CD8+ T세포가 높은

빈도로 관찰되었다14. 이렇게 결핵에 대한 보호 면역 반응에서 MHC

class Ⅰ restricted CD8+ T세포의 중요성은 여러 연구결과에서

증명되어왔다.

나. MHC class Ⅰ restricted CD8+ T세포의 면역 기능

결핵균 감염에 대한 면역반응에서 CD8+ T세포는 IFN-γ를

생산하는 기능과 세포독성 기능, 이렇게 크게 두 가지의 기능을

가진다15,16. CD8+ T세포에 의해 분비되는 IFN-γ는 결핵균으로

감염된 대식세포를 활성화 시키고, 활성화된 대식세포로 하여금

반응성 산소 중간물질 (reactive oxygen intermediates), 산화질소

(nitric oxide), 리소좀 효소 (lysosomal enzymes) 등을 분비하여

세포 내의 포식소체에서 자라는 결핵균을 죽이고17, Th-1 세포의

분화를 촉진시키는 IL-12를 생산할 수 있게 한다18,19. 결핵균에

6

감염된 마우스의 폐에서 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T세포의 수가

증가 된 것이 확인 되었다20,21. CD8+ T세포는 granule exocytosis

(perforin, granzyme, granulysin)와 Fas-Fas ligand pathway에

의해 독성 기전을 나타내어 감염된 세포를 죽일 수 있을 뿐만

아니라, granulysin을 이용하여 세포내의 감염된 결핵균도 죽이는

것이 관찰되었다22,23. Granulysin은 CD8+ cytotoxic T lymphocytes

(CTL)와 natural killer (NK) cell의 granules 안에 존재하는

단백질로서, 결핵균을 죽일 수 있는 항 세균 물질이다. 이러한

granulysin을 결핵균에 처리하면 결핵균의 세포벽 등이 손상되어

죽게 되는 것이 보고 된 바 있다24,25. 마우스 모델에서, CD8+ T

세포의 세포독성 기능을 상실한, perforin, granzyme, 그리고 Fas-

Fas ligand pathway knockout 마우스는 정상 마우스보다 결핵균

증식이 빠르게 증가됨이 관찰되었다26,27.

다. MHC class Ⅰ pathway에 의한 결핵균 항원 처리

결핵균의 항원들이 MHC class Ⅰ pathway를 거쳐서도 처리될 수

있다는 것이 보고되면서 그와 관련된 많은 연구들이 진행되고 있다.

지금까지의 연구 결과들을 토대로 결핵균 항원 처리를 위한 MHC

class Ⅰ pathway는 크게 cytosolic pathway와 vacuolar (non-

cytosolic) pathway로 나뉘어진다28.

Cytosolic pathway에서, 포식소체 내에 있는 결핵균 항원들은

세포질로 빠져나간다. 결핵균의 항원들이 어떻게 포식소체 내에서

세포질로 빠져나가게 되는지는 아직 알려지지 않고 있다. 다만,

7

여러 실험들을 통해 살아있는 결핵균의 감염이 포식소체 내에 있는

결핵균 항원들이 세포질로 빠져나가는데 영향을 준다는 것이

확인되었다. 예를 들어서, 살아있는 결핵균으로 감염된 대식세포는

TAP에 의존적인 방법으로 MHC class Ⅰ pathway를 통해 포식소체

내로 침투된 soluble ovalbumin (OVA)을 처리하고 CD8+ T세포에

제시하였지만, 열처리된 결핵균으로 감염된 대식세포는 soluble

OVA을 CD8+ T세포에 제시하지 못하였다29. 이와 비슷하게, 살아있는

결핵균을 포함하고 있는 대식세포의 포식소체는 70 kDa 이하의

분자들이 통과할 수 있는 구멍을 형성하였고, 열처리된 결핵균을

포함하고 있는 대식세포의 포식소체는 그런 침투성을 보이지

않았다30. 세포질로 빠져 나온 결핵균의 항원들은 proteasome의

단백분해 효소에 의해 펩티드로 분해된 후, TAP에 의해 세포질에서

내형질세망(endoplasmic reticulum)으로 운반된다. 내형질세망으로

운반된 펩티드는 β2m-MHC class Ⅰ 분자와 결합하게 되고, 펩티드

와 결합된 MHC class Ⅰ 분자는 안정화 되어 골지복합체를 거쳐

분비소포에 의해 세포표면으로 이동하여 CD8+ T세포에 의해 인식

된다15. 결핵균의 분비단백질 중의 하나인 CFP10 (10kDa culture

filtrate protein)의 펩티드는 결핵균에 감염된 수지상 세포

내에서 proteasome, TAP 그리고 내형질세망-골지복합체 운반에

의존적인, 즉 cytosolic MHC class Ⅰ pathway를 통해 CD8+ T세포

에 제시됨이 확인되었다31.

다음으로 vacuolar pathway는 다시 recycled MHC에 의존하는

vacuolar pathway와 cross-presentation이라고 불리는 vacuolar

pathway로 나누어 지는데, recycled MHC에 의존하는 pathway에서

8

포식소체 내에 있는 결핵균 항원들은 포식소체 내의 단백질

분해효소 중의 하나인 카텝신S에 의해 MHC Ⅰ 분자와 결합할 수

있는 형태의 펩티드로 분해되고, 세포표면에서 recycle된 MHC Ⅰ

분자와 결합하고 세포표면에서 제시되어 CD8+ T세포에 의해

인식된다32. 또 다른 vacuolar pathway인 cross-presentation

에서는 포식소체 내에 있는 결핵균의 지질류는 작은 분비소포

(exosome)에 의해 세포 밖으로 분비되거나, 결핵균의 감염으로

세포사멸 (apoptosis)이 유도될 때 분비소포나 apoptotic body는

근처의 수지상 세포에 의해 포식되어 proteasome과 TAP에 독립적인

방법으로 CD8+ T세포에 결핵균 항원을 제시한다33. 결핵균의 세포

벽 성분들을 포함한 지질 소포체가 결핵균에 감염된 대식세포와

세포 밖, 그리고 근처에 있는 감염되지 않은 수지상 세포 안에

존재함이 확인되었다34. 결핵균 항원인 19-kDa lipoprotein 또한

분비소포에 의해 세포 밖으로 빠져나가고, TAP에 독립적인 방법

으로 CD8+ T세포에 제시됨이 확인되었다35.

지금까지의 결핵균 항원의 처리와 제시에 관한 여러 연구

결과들은, 결핵균 항원들이 각자의 물리 화학적인 특징에 의해

서로 다른 pathway를 통해 처리될 것이라는 가능성을 제시한다.

현재까지의 연구결과들을 기초로 보면, 낮은 분자량과 상대적인

친수성을 가지고 있는 결핵균의 분비 단백질들은 우선적으로

cytosolic pathway에 의해 처리될 가능성이 높고, 결핵균의 소수성

단백질들과 지질류들은 vacuolar pathway를 통해 처리될 가능성이

높다31.

9

3.3.3.3. CD8+ TCD8+ TCD8+ TCD8+ T세포에세포에세포에세포에 대한대한대한대한 항원결정기를항원결정기를항원결정기를항원결정기를 이용한이용한이용한이용한 백신백신백신백신 개발개발개발개발

가. BCG 백신의 문제점

현재 유일하게 사용되고 있는 결핵 예방 백신인 BCG는 그

효율성이 평균 50% 정도로 그 신뢰도가 점점 낮아지고 있는

실정이다. 지금까지 170여 개의 백신이 개발되어 왔으나, BCG보다

효율성이 높은 백신은 아직 개발이 되어 있지 않다. BCG를 대신할

새로운 백신의 개발보다는 BCG를 보충할 백신 개발이 더 효율성이

높은 백신으로 사용될 수도 있다고 기대된다. 여러 연구들에 의해,

BCG는 주로 CD4+ T세포의 면역 반응을 유도함이 확인되었다36.

그러나 CD4+ T세포의 세포독성은 Fas-FasL 작용을 기초로 이루어

지고, 감염된 세포는 죽이나, 세포 내의 결핵균을 죽이지는 못하는

반면, CD8+ T세포의 세포독성은 Fas-Fas ligand pathway와 granule

exocytosis (perforin, granzyme, granulysin)을 이용하여 감염된

세포도 죽이고, 감염된 세포내의 결핵균도 죽이는 것이 관찰되

었다37. 그리고 많은 논문들을 통해, 결핵균 감염에 대한 보호

면역에서 CD8+ T세포 면역반응의 중요성이 강조되었다37,38. 그러

므로, CD8+ T세포의 면역을 유도하는 항원결정기의 동정은 BCG를

보충할 효율적인 결핵 백신 개발에 많은 도움을 줄 것이다.

10

나. 특정 MHC type에 대한 항원결정기

CD8+ T세포의 면역작용이 활성화되기 위해서는 CD8+ T세포가

항원을 인식해야 하는데, T세포는 항원 자체를 그대로 인식하지는

못하고, 항원제시세포 (antigen presenting cell; APC)라고 부르는

세포들에 의해 처리되고 제시된 항원만을 인식하게 된다. 항원

제시세포의 MHC class Ⅰ 분자에 의해 CD8+ T세포에 제시된 항원이

CD8+ T세포를 활성화 시켜서 IFN-γ 분비와 세포독성 기능을 유도

하게 될 때, 이 펩티드들을 항원결정기라 한다39. 최근 여러 실험들

에서는, MHC class Ⅰ restricted CD8+ T세포의 면역반응을 유도

하는 CD8+ T세포에 특정한 결핵균 펩티드 항원 결정기들을 동정

하여 발표하고 있다. 지금까지 발표된, 결핵균에 존재하는 CD8+

T세포의 여러 항원결정기들은 ESAT-6 protein (early secretory

protein), Ag85A, 19-kDa lipoprotein, 38-kDa protein, 65-kDa

heat shock protein 등에서 동정되었다37-42.

T세포의 T세포 수용체 (TCR)가 항원을 제시하고 있는 MHC 분자와

결합을 하게 될 때, MHC와 항원결정기의 결합 친화력에 따라서

T세포의 활성화 정도가 달라진다15. MHC 분자는 사람마다 그 종류가

매우 다양하다. 한 항원결정기에 대해서도 다양한 MHC 분자들은

다양한 결합 친화력을 가진다고 보고되었는데, 특정한 펩티드들은

여러 가지 다른 MHC subtype에 의해 제시될 수 있다는 연구 결과가

밝혀졌다. 이들을 묶어 MHC supertype이라고 정의한다. 즉, 하나의

supertype에 속하는 MHC subtype들은 정도의 차이는 있으나 같은

11

항원결정기를 T세포에게 제시하여서 세포 매개 면역반응을 유도할

수 있다43.

CD8+ T세포에 의한 항원인식은 MHC class Ⅰ 유전자의 다양한

대립유전자에 의해서 조절되기 때문에 효율성이 높은 백신

후보물질의 동정은 다수의 사람들에게서 존재하고 있는 MHC에

반응하는 항원결정기로 이루어져야 한다44. 가장 빈번한 HLA (human

leukocyte antigen) type 중 하나인 HLA-A2 supertype은 동양인과

서양인에게서 모두 40-50% 정도 발현되며, A*0201, A*0202, A*0203,

A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*6802, A*6901 등이 포함된다45.

많은 HLA type들 중에서 HLA-A*0201에 대한 연구가 가장 활발히

진행되고 있는데, 지금까지 발견된 CD8+ T세포의 HLA-A*0201에

대한 결핵균 항원결정기들은 antigen 85A, antigen 85B, 19kD-

lipoprotein, esat-6 protein, thymidylate synthase, RNA

polymerase-β subunit, putative phosphate transport system

permease protein A-1 등에서 발견되었다40,41,46.

4444. . . . 연구목적연구목적연구목적연구목적

BCG는 현재 유일하게 사용되고 있는 결핵 예방백신이다. 그러나

그 효율성이 0-80%로 매우 다양하므로 더 효과적인 결핵 백신

개발이 절실히 요구되고 있다. 여러 연구들에 의해 BCG는 주로

CD4+ T세포의 면역반응을 유도함이 확인되었다. 그리고 많은

논문들을 통해, 결핵균 감염에 대한 보호 면역에서 CD8+ T세포의

면역반응의 중요성이 강조되었다. 따라서 본 연구에서는, BCG를

12

보강할 수 있는 효율성이 높은 백신 개발과 결핵에 대한 CD8+ T

세포의 보호면역 반응 연구에 기여하기 위해, 가장 빈번한 HLA

type의 하나인 HLA-A*0201을 대상으로 CD8+ T세포의 면역반응을

효율적으로 유도하는 결핵균의 펩티드 항원결정기를 찾고자 하였다.

이를 위해, 이전 연구에서 MTB genomic DNA-phage display library

를 이용하여 soluble HLA-A*0201와 결합 친화력이 높은 결핵균

펩티드 64개 중 CD8+ T세포들의 면역반응, 즉 IFN-γ 분비와 세포

독성능을 효율적으로 유도하는 항원결정기 펩티드를 찾고자 하였다.

이를 위한 세부적인 연구 목적은 다음과 같다.

(1) 64개의 펩티드 중, HLA-A*0201을 표현하는 개체에서 분리된

CD8+ T세포의 IFN-γ 분비를 효율적으로 유도하는 펩티드를 선별

하고자 하였다.

(2) 선별된 후보 펩티드에 의해 세포독성능이 효율적으로

유도되는지 확인하기 위하여, 후보 펩티드에 특정한 CD8+ T세포의

세포독성능을 조사하고자 하였다. PPD+인 개체들에 대해서는

펩티드에 대한 기억세포가 있는지 확인하고, PPD-인 개체들에

대해서는 특정 펩티드에 대한 CD8+ T cell line을 만들어 세포

독성능이 유도되는지 규명하고자 하였다.

(3) 후보 펩티드들이 HLA-A*0201뿐만 아니라 HLA-A2 supertype

member인 A*0206, A*0207에서도 면역반응을 유도하는 HLA-A2

supertype epitope peptides인지 증명하고자 하였다.

13

(4) 이를 통해 동정된 후보 펩티드들이 결핵균의 genome에서

실제로 전사되고 표현되는지 증명하고자 하였다.

(5) 동정된 결핵균 펩티드에 특정한 CD8+ T세포들이 결핵균으로

감염된 대식세포들에 대해서 세포독성능을 보이는지 확인하고자

하였다.

이렇게 해서 동정된, MHC class Ⅰ restricted CD8+ T세포의

면역 반응을 효율적으로 유도하는, 항원결정기는 효율성이 높은

결핵 백신 개발과 결핵에 대한 CD8+ T세포의 보호면역 반응 연구에

많은 도움을 주리라고 기대된다.

14

ⅡⅡⅡⅡ. . . . 재료재료재료재료 및및및및 방법방법방법방법

1. HLA1. HLA1. HLA1. HLA----A typingA typingA typingA typing

건강한 개체에게서 말초 혈액을 채취하여, DNA sequencing

방법을 통해 HLA-A type을 확인하고 (한림의대 유전체연구소),

HLA-A2 supertype인 개체들을 선택하여 PPD (purified protein

derivative) tuberculin test를 하였다.

2. 2. 2. 2. 펩티드펩티드펩티드펩티드 합성합성합성합성

이전 연구에서 MTB genomic DNA-phage display library를 이용해

HLA-A*0201와 결합친화력이 높은 펩티드 64개를 선별하였다. 본

연구에서는 9개 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 선별된 64개의

펩티드들을 제작하였다. 이 펩티드들은 펩트론사 (대전)에서 합성

하였으며, HPLC에 의해 75~85%의 순도를 보였다. HLA-A*0201-

binding epitope으로 잘 알려져 있는 influenza A virus matrix

protein (flu,NP58-66; GILGFVFTL)는 양성 대조군으로 사용하기

위해 합성되었다. 64개의 펩티드 중 본 연구를 통해 선별된 4개

후보 펩티드들의 아미노산 서열은 표 1에 요약되어 있다.

3. 3. 3. 3. 말초말초말초말초 혈액혈액혈액혈액 분리분리분리분리

HLA-A2 supertype인 건강한 개체들로부터 100 ㎖ 또는 400 ㎖의

15

혈액을 채취하여 RPMI 1640 medium (GIBCO, Grand Island, Ny.,

USA)과 1:1로 희석하였다. Ficoll-Paque plus (Amersham

Bioscience, Uppsala, Sweden)와 희석된 혈액의 비율이 1:2가

되도록, Ficoll 15 ㎖ 위에 RPMI 1640 medium으로 희석된 혈액

30㎖을 서로 섞이지 않게 얹었다. 원심분리한 후 buffy coat층을

얻었다.

4. IFN4. IFN4. IFN4. IFN----γ Enzymeγ Enzymeγ Enzymeγ Enzyme----linked immunosorbent assay (ELISA) linked immunosorbent assay (ELISA) linked immunosorbent assay (ELISA) linked immunosorbent assay (ELISA)

합성된 64개의 펩티드들에 대한 T세포의 IFN-γ 생산량을

측정하기 위해서, 96-well plates에 HLA-A2 supertype인 건강한

개체들로부터 분리한 말초 혈액 (2×105 cells/well)과 phyto-

hemaglutinin (PHA; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA),

MTB culture filtrate protein (CFP), 펩티드들을 10 μg/ml 넣고

3일 동안 배양하였다. Culture media는 2 mM L-glutamine, 1 mM

sodium pyruvate, 100 units/ml penicillin/streptomycin (GIBCO,

Grand Island, Ny., USA)이 첨가된 RPMI 1640 medium와 10% fetal

bovine serum (FBS, GIBCO)를 사용하였다. 배양 후 상층액을

모아서 -20℃에 보관한 뒤 sandwich ELISA를 이용해 IFN-γ

생산량을 측정하였다. ELISA 실험에 사용되는 monoclonal antibody

(Ab)는 BD Biosciences (San Jose, Calif., USA)에서 판매하는 BD

OptTM Set Human IFN-γ를 사용하였다. 96 well ELISA plates

(EIA/RIA plate; Costar, Ny., USA)에 coating buffer (Na2CO3,

NaHCO3)로 희석된 capture antibody (1/250으로 희석)를 100 ㎕씩

16

첨가하고 humid box에 넣어 4℃에서 18시간동안 흡착 시켰다.

다음날, 흡착이 안 된 항체를 제거하기 위해서 phosphate buffered

saline (PBS) + 0.05% Tween20 (PBST)로 씻어주고, PBS+10% FBS를

200 ㎕ 첨가한 후 1시간 동안 37℃에서 blocking 시켰다. 1시간 후

PBST로 3번 씻어주고, 항원으로 자극을 주어 얻어낸 상층액과

standard solution을 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응

시켰다. PBST로 5번 씻어준 뒤 10% FBS + PBS에 1/250으로 희석된

detection Ab와 avidin enzyme을 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서

1시간동안 반응시켰다. 1시간 후 PBST로 7번 씻어준 다음,

기질용액 (CPB 25 ml + OPD 10 mg + H2O2 10 ㎕) 100 ㎕를 넣고

어두운 실온에서 약 5분간 반응시킨 후 반응을 정지시키기 위해

2.5 N H2SO4 용액 100 ㎕를 넣었다. ELISA reader기로 490 nm에서

흡광도를 측정하였다.

5. IFN5. IFN5. IFN5. IFN----γ Enzymeγ Enzymeγ Enzymeγ Enzyme----lilililinked immunospot (Elispot) assaynked immunospot (Elispot) assaynked immunospot (Elispot) assaynked immunospot (Elispot) assay

96 well elispot plate (Millipore, Molsheim, France)에 human

IFN-γ capture antibody (BD Pharmingen, San Jose, Calif.,

USA)를 coating buffer (PBS)에 200분의 1로 희석한 다음 well 당

100 ㎕씩 넣고 4℃에서 18시간동안 흡착 시켰다. 다음날 차가운

PBS로 4번 씻어주고 10% FBS + RPMI 1640을 200 ㎕ 첨가한 후

1시간 동안 37℃에서 blocking 시켰다. 1시간 후, Dynabeads

(Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway)에 의해 CD4+ T세포가 제거된

말초혈액과 PHA, flu, 펩티드 (10 ㎕/ml)를 각 well에 넣고 37℃,

17

5% CO2 상태에서 2일 동안 배양하였다. 이때, CD4+ T세포가 제거된

상태이므로, 10 U/ml의 recombinant human IL-2 (rhIL-2, R&D

systems, Minneapolis, Mn., USA)를 넣어주었다. 2일 후

biotinylated anti-Human IFN-γ detection antibody (BD

Pharmingen)를 100 ㎕ 넣고 4℃에서 24시간동안 배양하고, 다음날

streptavidine-HRP (BD Pharmingen)를 100 ㎕ 넣고 어두운

실온에서 2시간동안 배양하였다. 2시간 후 기질용액 (ELISPOT AEC

substrate set, BD Pharmingen)을 넣고 30분간 발색 시킨 후

반응을 정지하기 위해 물로 씻어준 다음 건조 시켰다. ELISPOT

plate reader기를 사용하여 spot의 수를 측정하였다.47

6. 6. 6. 6. 세포세포세포세포 배양배양배양배양

.221A2 (Robert DeMars 제공, University of Wisconsin-

Madison)는 HLA antigens이 제거되고, 그 다음 HLA-A*0201으로

transfect된 Epstein-Barr virus (EBV)-transfected B cell

line이다. 이 cell line을 CTL assay에 표적세포로서 사용하였다.

HLA-A*0201외에 A*0206, A*0207 개체의 표적세포도 필요하므로,

HLA-A*0206, A*0207의 B lymphoblastoid cell line (B-LCL)을 얻기

위해 HLA-A*0206, A*0207 개체의 말초혈액 5X105을 B95.8의

상층액에 포함된 EBV로 transfect 시켰다. 14일 후, transfect된

cells 은 10% FBS + RPMI에서 확장되었다48. cell line은 T75

tissue culture flask에서 배양되었다. Culture media는 100

18

units/ml penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamine, 1 mM

sodium pyruvate가 첨가된 RPMI와 10% FBS를 사용하였다.

7. short7. short7. short7. short----term cell lineterm cell lineterm cell lineterm cell line의의의의 iiiintracellular ntracellular ntracellular ntracellular IFNIFNIFNIFN----γγγγ ststststainingainingainingaining

HLA-A2 supertype인 PPD+ 개체의 말초혈액 1 X 107을 Iscove's

modified Dulbecco's medium (IMDM, GIBCO) 1 ml에 펩티드 (50

㎕/ml)와 함께 넣어 37℃에서 90분간 배양하였다. 90분 후, RPMI로

씻어주고 3X106 cells/well과 10 ng/ml recombinant human IL-7

(rIL-7, R＆D systems, Minneapolis, MN, USA)을 10% pooled human

serum이 첨가된 RPMI 1640에 넣어 24 well plate에서 10일간

배양하였다. 3일마다 rhIL-2 (R＆D systems, Minneapolis, MN,

USA) 10 U/ml을 첨가해주었다. 10일째 되는 날, EBV B cell

line은 6 well plate에서 각 펩티드 (10 ㎕/ml)와 함께 7-

8시간동안 배양되었다. 7-8시간 후, short-term cell line과 EBV

cell line은 그 비율을 2:1로 하고 1 ㎍/ml brefeldin A (BFA,

Sigma Chemical Co.)와 함께 12시간 동안 배양되었다. 양성대조군

(positive control)으로 사용하기 위해, EBV cell line으로 자극을

주는 대신 50 ng/ml phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, Sigma

Chemical Co.)로 자극을 주었다. 12시간 후, anti-CD3 mAb PerCP-

conjugate와 anti-CD8 mAb FITC-conjugate (BD, Mountain View,

Calif., USA)로 상온에서 15분간 staining하고 FACS buffer로

씻었다. Cytofix/Cytoperm kit (BD Pharmingen)을 사용해 anti-

IFN-γ mAb PE-conjugate (BD)로 상온에서 15분간 intracellular

19

staining을 하였다. FACS buffer로 씻어준 다음, 2% paraform-

aldehyde (Sigma Chemical Co.)로 고정시킨 후, FACScalibur

(Becton Dickinson, San Jose, Calif., USA)로 분석하였다49.

8. PPD+8. PPD+8. PPD+8. PPD+인인인인 개체로부터개체로부터개체로부터개체로부터 기억세포기억세포기억세포기억세포 독성독성독성독성 반응반응반응반응의의의의 유도유도유도유도

HLA-A2 supertype인 PPD+ 개체의 말초혈액을 24 well plate에 각

well 당 3X106씩 넣고, 펩티드 (10 ㎕/ml)로 자극을 주었다. 배지는

10% pooled human serum이 들어간 RPMI 1640을 사용하였다.

3일마다 rhIL-2 (R&D systems, Minneapolis, MN, USA) 10 U/ml을

첨가해 주면서 일주일간 배양하였다. 일주일 후, irradiation

(3,000 rad)된 동일한 개체의 말초혈액을 펩티드 (10 ㎕/ml)와

함께 2% human serum medium에서 2시간 동안 배양하면서 항원제시

세포들을 plate에 붙였다. 2시간 후, plate에 붙지 않은 세포들은

버리고, 일주일동안 배양한 CTL을 첨가해서 CTL에 두 번째 자극을

주었다. rhIL-2를 첨가해주면서 일주일간 다시 배양하였다. 일주일

후, 51Cr release CTL assay 방법으로 세포독성능을 시험하였다.

9. 9. 9. 9. CTL assayCTL assayCTL assayCTL assay

세포독성능은 51Cr release CTL assay를 사용해 측정하였다.

표적세포 (.221A2 또는 대식세포) 2×106을 각 펩티드 (10 ㎕/ml)로

18시간동안 pulsing시키고, 그 후 표적세포들은 한시간 동안

100μCiNa51CrO4 (NEN, Boston, MA, USA)로 labeling 되었다. Wash

20

후에 표적세포는 T세포의 다른 비율과 함께 10% FBS + RPMI에서 96

well plate에 배양되었다. 4시간 후, 각각의 well로부터 100 ㎕의

상층액을 취하고, 이들의 radioactivity는 γ counter로 측정

하였다. Specific lysis(%)는 100 × (experimental release-

spontaneous release) / (maximal release-spontaneous release)의

공식으로 계산되었다. Maximal release는 1% Triton X-100의

첨가에 의해 용해되는 표적세포로부터 측정되었고, spontaneous

release는 배지만으로 배양되는 표적세포로부터 측정되었다50.

10. 10. 10. 10. IIIIn vitron vitron vitron vitro immunization immunization immunization immunization에에에에 의한의한의한의한 CTL line CTL line CTL line CTL line의의의의 유도유도유도유도

HLA-A2 supertype인 개체의 말초혈액을 IMDM에서 90분간

펩티드로 pulsing 시키고, 10% pooled human serum이 들어간 RPMI

1640에서 well 당 3 X 106씩 rhIL-7 (10 ng/ml, R&D systems),

keyhole limpet hemocyanin (5 ㎍/ml, Sigma Chemical Co.)와 함께

배양하였다. 3일마다 rhIL-2를 첨가해주고, 일주일마다 동일한

개체의 말초혈액으로 re-stimulation 주면서 4-5주 배양하였다. 그

후에 51Cr release CTL assay를 통해 특정 펩티드에 대한 세포

독성능을 측정하였다.

11111111. . . . 대식세포대식세포대식세포대식세포 감염실험감염실험감염실험감염실험

In vitro immunization 방법에 의해 생성된 CD8+ T cell line의

세포독성능 시험에는, 결핵균으로 감염된 대식세포들을 표적세포로

21

이용하였다. 동종 대식세포를 10 MOI (multiplicity of infection)

의 결핵균 H37Rv (ATCC 27294)으로 4시간 동안 감염시킨 후,

탐식되지 않은 결핵균은 배지로 3번 씻어 제거한 후, 3일간

배양하였다. 3일 후에, 51Cr release CTL assay 방법을 이용해 이

대식세포를 표적세포로 CD8+ T cell line의 세포독성능을 시험

하였다.

12121212. ELISA. ELISA. ELISA. ELISA를를를를 이용한이용한이용한이용한 펩티드에펩티드에펩티드에펩티드에 특정한특정한특정한특정한 항체항체항체항체 측정측정측정측정

각 항원들을 (38 kDa 1 μg/ml, 21 kDa culture filtrate

protein 1 μg/ml, 후보 펩티드(표1) 10 μg/ml) coating buffer

(Na2CO3, NaHCO3)에 희석하여 96 well ELISA plates에 100 ㎕씩

첨가하고 4℃에서 18시간동안 흡착 시켰다. PBS + 0.05% Tween20

(PBST)로 4번 씻어준 후, PBST + 5% normal goat serum (NGS,

GIBCO)를 200 ㎕ 첨가한 후 1시간 동안 37℃에서 blocking 시켰다.

1시간 후 PBST-NGS를 씻어서 제거하고, PBST-NGS에 희석된 1st

antibody (결핵환자 혈청)를 100 ㎕씩 넣고 (1st antibody: PBST-

NGS = 1:300) 90분 동안 반응시켰다. 이때 음성 대조군으로 환자

혈청을 넣지 않은 PBST-NGS를 사용하였다. 반응이 끝난 후, PBST로

4번 씻어주고, PBST-NGS에 희석된 enzyme-labelled antibody

(IgG)를 100 ㎕씩 넣고 1시간 동안 반응시켰다 (IgG: PBST-NGS =

1: 10000). 1시간 후 PBST로 4번 씻어준 다음, 기질용액 100 ㎕를

넣고 어두운 실온에서 약 15분간 반응시킨 후 반응을 정지시키기

22

위해 2.5 N H2SO4 용액 100 ㎕를 넣었다. ELISA reader로 490nm에서

흡광도를 측정하였다.

13. RT13. RT13. RT13. RT----PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction)PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction)PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction)PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction)

결핵균 H37Rv (ATCC 27294)는 7H9 (Difco, Detroit, MI, USA)

액체배지에서 10일 동안 shaking culture되었다. Trizol (Gibco

Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)과 RNeasy mini kit (Qiagen,

Germany)을 사용해 배양된 결핵균의 RNA를 추출하고, 추출된 RNA

(2 ㎍)는 0.25 ㎍ random hexamer (Gibco Invitrogen), 200 unit

murine molony leukemia virus reverse transcriptase (MMLV-RT,

Gibco Invitrogen)와 함께 cDNA로 역전사되었다. 합성된 cDNA는

0.2 units Taq polymerase (Takara, Seoul, Korea)와 각 펩티드에

대한 primer (10 pmole)를 사용해 30 cycles (30초/94℃, 30초/60-

68℃, 1분/72℃)동안 thermocycler (PerkinElmer, USA)에서 PCR

amplification 되었다. PCR 산물은 1% agarose gel에서 전기영동

되었다. Housekeeping gene으로는 MT10Sa를 사용하였다51. 본

연구에서 사용된 primers의 염기서열은 표2에 요약되어 있으며,

대전에 있는 ㈜제노텍에서 합성되었다.

23

표표표표 1. 1. 1. 1. 항원결정기항원결정기항원결정기항원결정기 후보후보후보후보 펩티드의펩티드의펩티드의펩티드의 아미노산아미노산아미노산아미노산 서열서열서열서열

펩티드펩티드펩티드펩티드 번호번호번호번호 아미노산아미노산아미노산아미노산 서열서열서열서열

#19 ALTGDNLPA

#28 SVAAGEPHV

#49 GLGVLGWGV

#59 AIHISSIPPV

#19-20mer AIAMELALTGDNLPAALTGDNLPAALTGDNLPAALTGDNLPAERAHE

#28-20mer ACAAELSVAAGEPHVSVAAGEPHVSVAAGEPHVSVAAGEPHVVSPRV

#59-20mer AMAESAIHISSIPPVAIHISSIPPVAIHISSIPPVAIHISSIPPVPGKFY

* #19-20mer, #28-20mer, #59-20mer 펩티드들은 후보 펩티드를

포함하는 결핵균 단백질에 대한 항체의 정량 측정 (표4)에서 사용

하기 위해 합성.

24

표표표표 2. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT 2. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT 2. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT 2. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT----

PCR)PCR)PCR)PCR)을을을을 위한위한위한위한 primer primer primer primer 염기서열염기서열염기서열염기서열

GeneGeneGeneGene Primer Primer Primer Primer 염기서열염기서열염기서열염기서열

MT10Sa1

Rv02222

Rv3242c3

Rv01924

Forward 5’-AGGGCCAGGTCGGTGGC-3’

Reverse 5’-AGATCCGGACGATCGGC-3’

Forward 5’-GAAAGCGACGCAGCCAACAC-3’

Reverse 5’-TGAACACCGGCACCAGGATC-3’

Forward 5’-GTGTGCCGCCTGTGCCG-3’

Reverse 5’-CCCGACCCGTGATGTTGC-3’

Forward 5’-CATCGTTTGTTGGCCCGC-3’

Reverse 5’-CGGTCAACTTGTAGCCTTGGG-3’

1 MT10Sa는 housekeeping gene으로 사용.

2 Rv0222는 펩티드 #19를 포함하고 있는 결핵균 단백질의 유전자.

3 Rv3242c는 펩티드 #28을 포함하고 있는 결핵균 단백질의 유전자.

4 Rv0192는 펩티드 #59를 포함하고 있는 결핵균 단백질의 유전자.

25

ⅢⅢⅢⅢ. . . . 결과결과결과결과

1. 1. 1. 1. 연구연구연구연구 대상자들의대상자들의대상자들의대상자들의 HLA HLA HLA HLA----A genotype A genotype A genotype A genotype

총 41명의 건강한 개체들의 말초 혈액을 채취하여, 우선 anti-

HLA-A2 monoclonal antibody를 사용한 flow cytometry analysis에

의해 HLA-A2 supertype인 개체들을 선별하였다. 41명 중 20명

(48.8%)에서 HLA-A2 supertype이 확인되어, 이 20명의 개체들을

연구 대상자로 선정하였다. 연구 대상자들의 HLA-A type은 표

3에서 제시한 바와 같이 여러 HLA-A2 subtype 중 HLA-A*0201, 0203,

0206, 0207만을 보였다. 연구 대상자들의 HLA-A2 subtype의 빈도를

살펴보면, HLA-A*0201은 20명 중 10명 (50%)에서 나타났고, HLA-

A*0203는 1명 (5%), HLA-A*0206는 3명 (15%), 그리고 HLA-A*0207은

6명 (30%)에서 나타났다. N326, N329, N330 개체들은 anti-HLA-A2

monoclonal antibody를 사용한 flow cytometry analysis에 의해

HLA-A2 supertype임이 확인되었으나, 아직 DNA sequencing 방법에

의한 HLA-A2 subtype 분석은 진행되지 않았다.

26

표표표표 3. 3. 3. 3. 연구연구연구연구 대상자들의대상자들의대상자들의대상자들의 HLA HLA HLA HLA----A genotype A genotype A genotype A genotype

연구연구연구연구 대상자대상자대상자대상자 HLAHLAHLAHLA----A typeA typeA typeA type 연구연구연구연구 대상자대상자대상자대상자 HLAHLAHLAHLA----A typeA typeA typeA type

N301 HLA-A*0201/0207 N319 HLA-A*0201/1101

N304 HLA-A*0201/1101 N320 HLA-A*0206/3001

N305 HLA-A*0207/2402 N321 HLA-A*0207/1101

N308 HLA-A*0201/3101 N322 HLA-A*0201/0206

N310 HLA-A*0201/0261 N323 HLA-A*0201/2402

N311 HLA-A*0201/2402 N324 HLA-A*0207/2402

N314 HLA-A*0203/0207 N325 HLA-A*0206/0206

N316 HLA-A*0201/3303 N326 HLA-A2+

N317 HLA-A*0207/0101 N329 HLA-A2+

N318 HLA-A*0201/1101 N330 HLA-A2+

27

2. CD8+ T2. CD8+ T2. CD8+ T2. CD8+ T세포의세포의세포의세포의 IFN IFN IFN IFN----γγγγ 분비를분비를분비를분비를 효율적으로효율적으로효율적으로효율적으로 유도하는유도하는유도하는유도하는 펩티드펩티드펩티드펩티드 선별선별선별선별

이전 연구를 통해 선별된 HLA-A*0201과 결합친화력이 높은

64개의 결핵균 펩티드 가운데, HLA-A2 supertype인 건강한

개체들에서 CD8+ T세포의 IFN-γ 분비를 효율적으로 유도하는

항원결정기를 찾고자 하였다. 먼저 HLA-A2 supertype인 세 명의

건강한 개체들로부터 말초혈액을 분리하여 각 펩티드로 3일 동안

자극시키고, 그 상층액에 있는 IFN-γ 분비량을 IFN-γ ELISA를

통해 측정하였다(그림 1). 세 명의 개체 중 두 명 이상에서 IFN-γ

분비량이 150 pg/ml이 넘을 경우, 그 펩티드들을 IFN-γ 분비를

효율적으로 유도하는 후보 항원결정기로서 선별하였다. 결과로써,

HLA-A2 supertype인 개체들의 말초혈액의 IFN-γ 분비를

효율적으로 유도할 수 있는 20개의 후보 펩티드 (13, 19, 21, 28,

29, 36, 37, 39, 44, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 56, 57, 58, 59,

61번 펩티드)들이 선정되었다. 이 실험에서는 20개의 후보

펩티드에 대한 말초혈액의 IFN-γ 분비가 CD8+ T세포에 의한

것인지 CD4+ T세포에 의한 것인지 확인할 수가 없다.

본 연구에서는 CD8+ T세포에 의한 면역반응을 연구하고 있으므로

다시 이 20개의 후보 펩티드에 대해 CD4+ T세포가 아닌, CD8+

T세포에 의한 IFN-γ 분비 유도 능력을 확인해 보고자 하였다.

HLA-A2 supertype인 개체의 말초혈액에서 CD4+ T세포를 제거하고,

20개의 후보 펩티드로 3일간 자극시킨 후, IFN-γ ELISA를 통해

IFN-γ 분비량을 측정하였다(그림 2). 이번에는 IFN-γ 분비량이

10 pg/ml이 넘을 경우 그 펩티드를 후보 펩티드로 선별하였다.

28

20개의 펩티드 중, 총 6개의 후보 펩티드 (13, 19, 28, 49, 51,

59번 펩티드)가 선별되었다.

이 6개의 후보 펩티드가 CD8+ T세포의 IFN-γ를 효율적으로

유도하는지 IFN-γ ELISPOT과 intracellular staining을 통해 다시

한번 확인하였다(그림 3). 13, 19, 28 그리고 51번 펩티드의

자극에 대해 HLA-A*0201인 건강한 개체의 CD4+ T세포를 제거한

말초혈액으로부터 IFN-γ 분비가 유도됨이 확인되었고(그림 3A),

HLA-A2 supertype인 결핵환자의 CD4+ T 세포를 제거한 말초혈액

또한 19, 28 그리고 59번 펩티드의 자극에 대해 IFN-γ를

분비하였다(그림 3B). 그리고, HLA-A2 supertype인, PPD+인 건강한

개체의 말초혈액을 28, 49번 펩티드와 rIL-7으로 자극시키고

10일간 배양해 각 펩티드에 대한 short-term cell line을 만들어

intracellular IFN-γ staining을 한 결과(그림 3C), 28번

펩티드에 대해서는 말초혈액 중 4%의 CD8+ T세포가 IFN-γ를

분비하였고, 49번 펩티드에 대해서는 2.6%의 CD8+ T세포가 IFN-

γ를 분비함이 확인되었다. 이로써, 6개의 후보 펩티드들은 HLA-A2

supertype인 개체들에서 IFN-γ 분비를 효율적으로 유도할 수 있는

후보 펩티드들로서 동정되었다.

29

N301 (A*0201/0207) N308 (A*0201) N310 (A*0201) N301 (A*0201/0207) N308 (A*0201) N310 (A*0201) N301 (A*0201/0207) N308 (A*0201) N310 (A*0201) N301 (A*0201/0207) N308 (A*0201) N310 (A*0201)

그림그림그림그림 1. HLA 1. HLA 1. HLA 1. HLA----A2 supertypeA2 supertypeA2 supertypeA2 supertype인인인인 건강한건강한건강한건강한 개체의개체의개체의개체의 말초혈액으로부터말초혈액으로부터말초혈액으로부터말초혈액으로부터 IFN IFN IFN IFN----

γγγγ 분비를분비를분비를분비를 효율적으로효율적으로효율적으로효율적으로 유도유도유도유도하는하는하는하는 펩티드들의펩티드들의펩티드들의펩티드들의 동정동정동정동정. . . . HLA-A2

supertype인 3명의 건강한 개체의 말초혈액 (2×105)을 각 펩티드

(10 ㎍/ml)로 3일간 자극시킨 후, IFN-γ ELISA를 통해 그 상층액

내의 IFN-γ 분비량을 측정하였다. 세 명의 개체 중 두 명

이상에서 IFN-γ 분비량이 150 pg/ml이 넘을 경우, 그 펩티드를

항원결정기의 후보로서 선별하였다.

0000

100100100100

200200200200

300300300300

400400400400

500500500500

600600600600

700700700700

800800800800

1111 2222 3333 4444 5555 6666 7777 8888 9999 10101010 11111111 12121212 13131313 14141414 15151515 16161616 17171717 18181818 19191919 20202020 21212121 22222222

0000

100100100100

200200200200

300300300300

400400400400

500500500500

600600600600

700700700700

800800800800

23232323 24242424 25252525 26262626 27272727 28282828 29292929 30303030 31313131 32323232 33333333 34343434 35353535 36363636 37373737 38383838 39393939 40404040 41414141 42424242 43434343 44444444

0000

100100100100

200200200200

300300300300

400400400400

500500500500

600600600600

700700700700

800800800800

45454545 46464646 47474747 48484848 49494949 50505050 51515151 52525252 53535353 54545454 55555555 56565656 57575757 58585858 59595959 60606060 61616161 62626262 63636363 64646464

IFN

IFN

IFN

IFN-- --γγ γγ (pg/ml)

(pg/ml)

(pg/ml)

(pg/ml)

펩티드펩티드펩티드펩티드 번호번호번호번호

30

N311 (HLAN311 (HLAN311 (HLAN311 (HLA----A*0201)A*0201)A*0201)A*0201)

그림그림그림그림 2. HLA 2. HLA 2. HLA 2. HLA----A2 supertypeA2 supertypeA2 supertypeA2 supertype인인인인 건강한건강한건강한건강한 개체의개체의개체의개체의 CD4+ T CD4+ T CD4+ T CD4+ T세포가세포가세포가세포가 제거된제거된제거된제거된

말초혈액으로부터말초혈액으로부터말초혈액으로부터말초혈액으로부터 IFN IFN IFN IFN----γγγγ 분비를분비를분비를분비를 효율적으로효율적으로효율적으로효율적으로 유도하는유도하는유도하는유도하는 펩티드들의펩티드들의펩티드들의펩티드들의

동정동정동정동정. . . . HLA-A*0201인 건강한 개체의 CD4+ T세포가 제거된 말초혈액

(2×105)을 20개의 후보 펩티드 (10 ㎍/ml)로 3일간 자극시킨 후,

IFN-γ ELISA를 통해 그 상층액 내의 IFN-γ 분비량을 측정하였다.

20개의 후보 펩티드 중 IFN-γ 분비량이 10 pg/ml이 넘는 펩티드를

다시 후보 펩티드로 선별하였다.

IFN

IFN

IFN

IFN-- --γγ γγ (pg/ml)

(pg/ml)

(pg/ml)

(pg/ml)

펩티드펩티드펩티드펩티드 번호번호번호번호

0000

10101010

20202020

30303030

40404040

50505050

60606060

70707070

80808080

90909090

100100100100

110110110110

120120120120

13131313 19191919 21212121 28282828 29292929 36363636 37373737 39393939 44444444 46464646 47474747 48484848 49494949 51515151 52525252 56565656 57575757 58585858 59595959 61616161

31

그림그림그림그림 3. HLA 3. HLA 3. HLA 3. HLA----A2 supertypeA2 supertypeA2 supertypeA2 supertype인인인인 건강한건강한건강한건강한 개체와개체와개체와개체와 결핵결핵결핵결핵 환자의환자의환자의환자의 CD8+ T CD8+ T CD8+ T CD8+ T

세포로부터세포로부터세포로부터세포로부터 IFN IFN IFN IFN----γγγγ 분비를분비를분비를분비를 효율적으로효율적으로효율적으로효율적으로 유도하는유도하는유도하는유도하는 후보후보후보후보 펩티드펩티드펩티드펩티드. . . .

선별된 6개의 후보 펩티드에 대해 HLA-A2 supertype인 건강한 개체

(A)와 결핵환자 (B)의 CD4+ T세포가 제거된 말초혈액에서 IFN-γ를

분비한 세포 수 (SFC: Spot Forming Cell)를 IFN-γ ELISPOT을

통해 측정하였다. (C)HLA-A2+인 건강한 개체의 말초혈액을 후보

펩티드로 10일간 자극을 준 후, 다시 각 펩티드와 brefeldin A로

12시간 처리하고 intracellular IFN-γ staining을 하였다. CD3+

(PerCP)로 gating한 후 IFN-γ+ (PE)를 분비하는 CD8+ (FITC)

T세포의 비율을 분석하였다.

SFC

s/1

X10

SFC

s/1

X10

SFC

s/1

X10

SFC

s/1

X1066 66 P

BM

C P

BM

C P

BM

C P

BM

C

N310 (A*0201)N310 (A*0201)N310 (A*0201)N310 (A*0201)

0000

10101010

20202020

30303030

40404040

50505050

60606060

70707070

# 13# 13# 13# 13 # 19# 19# 19# 19 # 28# 28# 28# 28 # 51# 51# 51# 51

AAAA

SFC

s/1

.5X10

SFC

s/1

.5X10

SFC

s/1

.5X10

SFC

s/1

.5X1066 66 P

BM

C P

BM

C P

BM

C P

BM

C

TB1 (A2+)TB1 (A2+)TB1 (A2+)TB1 (A2+)

0000

5555

10101010

15151515

20202020

25252525

30303030

# 19# 19# 19# 19 # 28# 28# 28# 28 # 59# 59# 59# 59

BBBB

CCCC

IFN

IFN

IFN

IFN

-- --γγ γγ-- --PE

PE

PE

PE

CD8CD8CD8CD8----FITCFITCFITCFITC

0.130.130.130.13%%%%

No peptideNo peptideNo peptideNo peptide

2.602.602.602.60%%%%

#49 #49 #49 #49

4.00%4.00%4.00%4.00%

#28 #28 #28 #28

N329 (A2+)N329 (A2+)N329 (A2+)N329 (A2+)

32

3. 3. 3. 3. 후보후보후보후보 펩티드에펩티드에펩티드에펩티드에 특정한특정한특정한특정한 CD8+ T CD8+ T CD8+ T CD8+ T세포의세포의세포의세포의 세포독성반응세포독성반응세포독성반응세포독성반응

앞서 HLA-A2 supertype인 개체를 대상으로 CD8+ T세포의 IFN-

γ를 효율적으로 유도하는 6개의 후보 펩티드들을 선별하였다.

CD8+ T세포의 항원결정기는 IFN-γ 분비뿐만 아니라 세포독성능

또한 효율적으로 유도한다10. 따라서, 이 후보 펩티드가 CD8+

T세포의 세포독성능을 유도할 수 있는지 각 펩티드에 특정한 CD8+

T cell line을 만들어 세포독성능을 측정하고자 하였다. CD8+ T

cell line을 만들기 위해서는 많은 사람들의 혈액을 요구한다.

사람의 혈액을 제공받는 데는 많은 한계가 있으므로, 본 연구

에서는 선별된 6개의 후보 펩티드 중 가장 가능성 있다고 판단되는

19, 28, 49 그리고 59번 펩티드만을 선별해 CD8+ T cell line을

만들어 세포독성능 실험에 들어갔다. 나머지 후보 펩티드들은

추후의 실험들에서 유용하게 사용될 것으로 생각된다.

가가가가. . . . 후보후보후보후보 펩티드에펩티드에펩티드에펩티드에 특정한특정한특정한특정한 CD8+ T CD8+ T CD8+ T CD8+ T세포의세포의세포의세포의 기억세포기억세포기억세포기억세포 독성반응독성반응독성반응독성반응 유도유도유도유도

(recall CTL)(recall CTL)(recall CTL)(recall CTL)

PPD+인 개체들과 결핵환자들은 결핵균에 대한 기억세포가

존재한다10. 그러므로 이들에게서 이번 연구에서 선별된 결핵균

펩티드인 후보 펩티드에 대한 기억세포 또한 존재하는지 확인하기

위하여, 각 후보 펩티드에 특정한 기억세포를 재활성화 시켜 CD8+

T cell line을 만들어 각 펩티드에 대한 세포독성능을 측정해

보았다. 먼저, HLA-A*0201인 건강한 개체의 말초혈액 (3×106)을 19,

33

28, 59번 펩티드로 자극시키면서 2주간 배양하여 각 펩티드에

특정한 recall CD8+ T cell line을 만들었다. 이렇게 만들어진

cell line의 세포독성능은 각 펩티드에 pulsing된 .221A2 (B

lymphoblastoid cell line)를 표적세포로 51Cr release cytotoxi-

city assay 방법을 통해 측정하였다 (그림 4). Specific lysis

(%)는 100 × (experimental release-spontaneous release)

/(maximal release-spontaneous release) 공식에 의해 계산하였다.

표적세포 (target)와 T세포 (effector)의 비율은 각각 1:10, 1:30,

1:60이었다. 양성 대조군으로는 HLA-A*0201에 제한적인 CD8+ T

세포의 항원결정기로 잘 알려져 있는 influenza A virus matrix

protein (flu)의 펩티드를 사용하였다. 결과로서, 19번 펩티드에

특정한 CD8+ T cell line은 19번 펩티드에 pulsing된 표적세포에

대해 15.5%의 세포독성능을 보였고, 59번 펩티드에 특정한 CD8+ T

cell line은 59번 펩티드에 pulsing된 표적세포에 대해서, 어떤

펩티드에도 pulsing되지 않은 표적세포에 비하여 28.1%의

세포독성능을 보였다. 반면, 28번 펩티드에 특정한 CD8+ T cell

line은 상대적으로 낮은 세포독성능을 보였다. 이로써, HLA-

A*0201인 건강한 개체에서 19, 59번 펩티드에 대한 기억세포가

존재하고 각 펩티드로 자극을 주었을 때 기억세포가 활성화되어

세포독성능을 보임을 확인하였다.

그림 5는 PPD+이며 HLA-A*0207인 건강한 개체로부터 그림 4와

같은 방법으로 각 후보 펩티드에 대한 기억세포가 존재하는지

확인해 보았다. 19번 펩티드에 특정한 CD8+ T cell line은 19.5%의

세포독성능을 보였고, 28번 펩티드에 특정한 cell line은 13.6%의

34

세포독성능을 보였다. 반면, 49번 펩티드에 특정한 cell line은

6.4%의 낮은 세포독성능을 보였고, 59번 펩티드에 특정한 cell

line은 59번 펩티드에 pulsing된 표적세포와 펩티드에 pulsing되지

않은 표적세포에 대한 세포독성능에 별다른 차이를 보이지 않았다.

이렇게 HLA-A*0207인 건강한 개체에서 19번 펩티드와 28번

펩티드에 대한 기억세포가 존재함이 확인되었다.

PPD+인, HLA-A*0206인 건강한 개체도 이와 유사하게 그림 6의

실험을 통해 19, 28번 펩티드에 특정한 cell line에서 각각 9.0%,

9.4%의 세포독성능을 보이면서 두 펩티드에 대한 기억세포가

존재함을 보였다. 마지막으로 결핵환자에서의 후보 펩티드에 대한

기억세포 존재 여부를 확인해 보았다 (그림 7). 결핵환자의

말초혈액이 부족하여 49번 펩티드에 대한 세포독성능 유도는

확인하지 못했지만 19, 28, 59번 펩티드에 대해서 기억세포가

존재하고, 각각 9.3%, 9.3%, 16.1%의 세포독성능을 나타냈다.

따라서, 이들 펩티드들은 HLA-A2 supertype에서 CD8+ T세포의

보호면역반응을 유도하는 A2 supertype 펩티드라고 정의할 수 있다.

35

그림그림그림그림 4. PPD+ 4. PPD+ 4. PPD+ 4. PPD+이며이며이며이며 HLA HLA HLA HLA----A*0201A*0201A*0201A*0201인인인인 건강한건강한건강한건강한 개체로부터개체로부터개체로부터개체로부터 기억세포기억세포기억세포기억세포 독성독성독성독성

반응반응반응반응 유도유도유도유도(recall CTL)(recall CTL)(recall CTL)(recall CTL)에에에에 의해의해의해의해 생성된생성된생성된생성된 T cell line T cell line T cell line T cell line의의의의 세포독성반응세포독성반응세포독성반응세포독성반응. . . .

PPD+이며 HLA-A*0201인 건강한 개체 (N319)의 말초혈액을 (A) 19번,

(B) 28번, (C) 59번, (D) flu 펩티드로 자극시키고 3일마다 rIL-

2를 첨가 시켜주었다. 그리고 일주일 후에 다시 각 펩티드로

pulsing된 자가 항원제시세포 (APC)로 자극을 주고 2주째 51Cr

release cytotoxicity assay를 통해 세포독성능을 측정하였다.

표적세포는 각 펩티드로 pulsing 되거나 pulsing

되지않은 .221A2를 사용하였다. 가로축은 표적세포에 대한 T

세포의 비율을 나타낸다. Specific lysis(%)는 100×(experimental

release-spontaneous release)/ (maximal release-spontaneous

release)로 계산하였다.

0000

10101010

20202020

30303030

40404040

50505050

60606060

10101010 60606060

#59#59#59#59

no pepno pepno pepno pep

Effector: target ratioEffector: target ratioEffector: target ratioEffector: target ratio

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

CCCC

0000

20202020

40404040

60606060

80808080

10101010 30303030 60606060

fluflufluflu



Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

DDDD

0000

5555

10101010

15151515

20202020

25252525

10101010 30303030 60606060

#28#28#28#28



Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

BBBB

0000

5555

10101010

15151515

20202020

25252525

30303030

10101010 30303030 60606060

#19#19#19#19



Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

AAAA

36



PPD+이며 HLA-A*0207인 건강한 개체 (NN317)의 말초혈액 (3×106)을

(A) 19번, (B) 28번, (C) 49번, (D) 59번 펩티드로 자극시키고

3일마다 rIL-2를 첨가 시켜주었다. 그리고 일주일 후에 다시 각

펩티드로 pulsing된 자가 항원제시세포 (APC)로 자극을 주고 2주째

51Cr release cytotoxicity assay를 통해 세포독성능을 측정하였다.

0000

10101010

20202020

30303030

40404040

50505050

10101010 50505050 100100100100

#19#19#19#19



Sp

Sp

Sp

Specific

lysis

(%)

ecific

lysis

(%)

ecific

lysis

(%)

ecific

lysis

(%)

A

0000

10101010

20202020

30303030

40404040

50505050

10101010 50505050 100100100100

#28 #28 #28 #28



Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

BBBB

0000

5555

10101010

15151515

20202020

25252525

30303030

10101010 50505050 100100100100

#49#49#49#49



Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

CCCC

0000

10101010

20202020

30303030

40404040

50505050

10101010 50505050 100100100100

#59#59#59#59



Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

DDDD

37



PPD+이며 HLA-A*0206인 건강한 개체 (N320)의 말초혈액 (3×106)을

(A) 19번, (B) 28번, (C) 49번, (D) 59번 펩티드로 자극시키고

3일마다 rIL-2를 첨가 시켜주었다. 그리고 일주일 후에 다시 각

펩티드로 pulsing된 자가 항원제시세포 (APC)로 자극을 주고 2주째

51Cr release cytotoxicity assay를 통해 세포독성능을 측정하였다.

0000

5555

10101010

15151515

20202020

25252525

30303030

10101010 50505050 100100100100

#19#19#19#19


Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)


AAAA

0000

5555

10101010

15151515

20202020

25252525

30303030

10101010 50505050 100100100100

#28#28#28#28


Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)


BBBB

0000

5555

10101010

15151515

20202020

25252525

30303030

10101010 50505050 100100100100

#49#49#49#49


Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)


CCCC

0000

10101010

20202020

30303030

40404040

50505050

10101010 50505050 100100100100

#59#59#59#59


Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)


DDDD

38

그림그림그림그림 7. HLA 7. HLA 7. HLA 7. HLA----A2+A2+A2+A2+인인인인 결핵환자로부터결핵환자로부터결핵환자로부터결핵환자로부터 기억세포기억세포기억세포기억세포 독성반응독성반응독성반응독성반응 유도유도유도유도 (recall (recall (recall (recall

CTL)CTL)CTL)CTL)에에에에 의해의해의해의해 생성된생성된생성된생성된 T cell line T cell line T cell line T cell line의의의의 세포독성반응세포독성반응세포독성반응세포독성반응. . . . HLA-A2+ 인

결핵환자의 말초혈액 (3×106)을 (A) 19번, (B) 28번, (C) 59번

펩티드로 자극시키고 3일마다 rIL-2를 첨가 시켜주었다. 그리고

일주일 후에 다시 각 펩티드로 pulsing된 자가 항원제시세포

(APC)로 자극을 주고 2주째 51Cr release cytotoxicity assay를

통해 세포독성능을 측정하였다.

0000

5555

10101010

15151515

20202020

25252525

30303030

10101010 30303030 60606060

＃＃＃＃19191919


Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)


AAAA

0000

5555

10101010

15151515

20202020

25252525

30303030

10101010 40404040 80808080

＃＃＃＃28282828


Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)


BBBB

0000

5555

10101010

15151515

20202020

25252525

30303030

10101010 40404040

＃＃＃＃59595959



Spe

Spe

Spe

Specific

lysis

(%)

cific

lysis

(%)

cific

lysis

(%)

cific

lysis

(%)

CCCC

39

나나나나. . . . InInInIn vitro vitro vitro vitro immunization immunization immunization immunization 방법에방법에방법에방법에 의해의해의해의해 생성된생성된생성된생성된 후보후보후보후보 펩티드에펩티드에펩티드에펩티드에

특정한특정한특정한특정한 CD8+ T cell line CD8+ T cell line CD8+ T cell line CD8+ T cell line의의의의 세포독세포독세포독세포독성반응성반응성반응성반응

앞의 실험을 통해, HLA-A2 supertype인, PPD+인 건강한 개체들과

결핵환자로부터 후보 펩티드에 대한 기억세포가 존재하고, 각 후보

펩티드의 자극에 의해 기억세포가 다시 활성화되어 세포독성능을

보임을 확인하였다. 이는, 이 후보 펩티드들이 HLA-A2 supertype인,

PPD+인 건강한 개체들과 결핵환자에서 결핵균에 대한 면역반응으로

CD8+ T세포의 면역반응을 유도하는 항원결정기로서 작용했음을

나타낸다. 따라서, 본 연구에서는 이 펩티드들이 PPD-인 건강한

개체들에서 naïve T세포를 각 펩티드에 특정한 CD8+ T세포로

분화시켜 효과적인 면역반응을 유도할 수 있는지 확인해 보고자

하였다.

PPD-인, HLA-A2 supertype인 건강한 개체의 말초혈액을 각 후보

펩티드로 pulsing시키고, recombinant IL-7과 KLH를 첨가하고 4-

6주간 배양하여 각 펩티드에 특정한 CD8+ T cell line을 만들었다.

이렇게 생성된 각 펩티드에 특정한 CD8+ T cell line이 각

펩티드로 pulsing된 표적세포에 대해 세포독성능을 보이는지 51Cr

release cytotoxicity assay를 통해 측정해 보았다 (그림 8). HLA-

A2+인 두 개체에서 19번 펩티드에 특정한 CD8+ T cell line이

생성되었고 펩티드에 pulsing된 표적세포에 대해, 펩티드에

pulsing되지 않은 표적세포에 비해서 각각 17.0%와 8.4%의

세포독성능을 보였다 (그림 8A). HLA-A*0207인 개체에서 생성된

28번 펩티드에 특정한 CD8+ T cell line은 28번 펩티드에

40

pulsing된 표적세포에 대해 20.5%의 세포독성능을 보였다 (그림

8B). HLA-A2+와 HLA-A*0207인 개체에서 49번 펩티드에 특정한 CD8+

T cell line이 생성되었고, 각각 28.1%와 14.4%의 세포독성능을

보였다 (그림 8C). 59번 펩티드에 대해서도 HLA-A*0207과 HLA-

A*0203/0207인 개체에서 CD8+ T cell line이 생성되었고, 각각

15.8%와 19.5%의 세포독성능을 보였다 (그림 8D). 이렇게 후보

펩티드들은 PPD-인 개체들의 말초혈액으로부터 in vitro

immunization 방법에 의해서 펩티드에 특정하게 세포독성능을

나타내는 CD8+ T cell line을 유도하였다.

41

그림그림그림그림 8. 8. 8. 8. PPDPPDPPDPPD----인인인인 건강한건강한건강한건강한 개체들로부터개체들로부터개체들로부터개체들로부터 in vitroin vitroin vitroin vitro immunization immunization immunization immunization방법에방법에방법에방법에

의해의해의해의해 생성된생성된생성된생성된 후보후보후보후보 펩티드에펩티드에펩티드에펩티드에 특정한특정한특정한특정한 CD8+ T cell line CD8+ T cell line CD8+ T cell line CD8+ T cell line의의의의

세포독성반응세포독성반응세포독성반응세포독성반응. . . . PPD-이며 HLA-A2 supertype인 건강한 개체의

말초혈액을 후보 펩티드와 rIL-7, KLH로 자극시킨 후, 매주 각

펩티드로 pulsing된 항원제시세포로 자극을 시키면서 4-6주간

배양하여 각 펩티드에 특정한 CD8+ T cell line을 만들어,

펩티드에 pulsing된 표적세포에 대해 세포독성능을 보이는지 51Cr

release cytotoxicity assay를 통해 측정해 보았다. (A)는 19번

펩티드, (B)는 28번, (C)는 49번, (D)는 59번 펩티드에 특정한

cell line의 세포독성반응 결과이다.

0000

5555

10101010

15151515

20202020

25252525

30303030

10101010 40404040 80808080

#19#19#19#19



Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

HLAHLAHLAHLA----A2+ (N329)A2+ (N329)A2+ (N329)A2+ (N329)

0000

10101010

20202020

30303030

40404040

50505050

10101010 60606060

#19#19#19#19



Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

HLAHLAHLAHLA----A2+ (N326)A2+ (N326)A2+ (N326)A2+ (N326) AAAA

0000

10101010

20202020

30303030

40404040

50505050

10101010 50505050 100100100100

#28#28#28#28


Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)


HLAHLAHLAHLA----A*0207 (N305)A*0207 (N305)A*0207 (N305)A*0207 (N305) BBBB

42

그림그림그림그림 8. 8. 8. 8. PPDPPDPPDPPD----인인인인 건강한건강한건강한건강한 개체들로부터개체들로부터개체들로부터개체들로부터 in vitroin vitroin vitroin vitro immunization immunization immunization immunization방법에방법에방법에방법에

의해의해의해의해 생성된생성된생성된생성된 후보후보후보후보 펩티드에펩티드에펩티드에펩티드에 특정한특정한특정한특정한 CD8+ T cell line CD8+ T cell line CD8+ T cell line CD8+ T cell line의의의의

세포독성반응세포독성반응세포독성반응세포독성반응. . . . PPD-이며 HLA-A2 supertype인 건강한 개체의

말초혈액을 후보 펩티드와 rIL-7, KLH로 자극시킨 후, 매주 각

펩티드로 pulsing된 항원제시세포로 자극을 시키면서 4-6주간

배양하여 각 펩티드에 특정한 CD8+ T cell line을 만들어,

펩티드에 pulsing된 표적세포에 대해 세포독성능을 보이는지 51Cr

release cytotoxicity assay를 통해 측정해 보았다. (A)는 19번

펩티드, (B)는 28번, (C)는 49번, (D)는 59번 펩티드에 특정한

cell line의 세포독성반응 결과이다.

0000

5555

10101010

15151515

20202020

10101010 40404040 80808080

#49#49#49#49


HLAHLAHLAHLA----A*0207 (N305)A*0207 (N305)A*0207 (N305)A*0207 (N305)


Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

0000

10101010

20202020

30303030

40404040

50505050

60606060

10101010 50505050 100100100100

#49#49#49#49


HLAHLAHLAHLA----A2+ (N329)A2+ (N329)A2+ (N329)A2+ (N329)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)


CCCC

0000

5555

10101010

15151515

20202020

25252525

10101010 50505050 100100100100

#59#59#59#59



Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

0000

10101010

20202020

30303030

40404040

10101010 40404040 80808080

#59#59#59#59


HLAHLAHLAHLA----A*0207 (N324)A*0207 (N324)A*0207 (N324)A*0207 (N324)


Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

DDDD HLAHLAHLAHLA----A*020A*020A*020A*0203/0207 (N314)3/0207 (N314)3/0207 (N314)3/0207 (N314)

43

4. 4. 4. 4. 후보후보후보후보 펩티드들의펩티드들의펩티드들의펩티드들의 유전자유전자유전자유전자 발현발현발현발현

후보 펩티드들은 PPD-인 개체의 naïve T세포를 각 펩티드에

특정한 CD8+ T cell line으로 분화시켜 펩티드에 pulsing된 표적

세포에 대한 세포독성능을 유도하였다. 이에 최종적으로, 이 후보

펩티드에 특정한 CD8+ T cell line들이 실제 결핵균에 감염된

대식세포에 대해서도 세포독성능을 보이는지 확인해 보고자 하였다.

이 실험에 앞서, 이 논문에 사용된 펩티드들은 결핵균의 genomic

DNA-phage display library를 이용해 선별된 펩티드들이다. 이들은

genomic DNA상에서 임의적인 open reading frame을 정의한 펩티드

배열에서 선별되었으므로 실제로 이들이 결핵균의 genome에서

전사되고 발현되는지는 확인되지 않았다. 그러므로, 결핵균에

감염된 대식세포에 대한 세포독성능을 확인하기 전에, 이

펩티드들이 실제로 전사, 발현되는지 RT-PCR과 ELISA를 통해

확인해 보고자 하였다. 또한, 10일간 배양된 결핵균으로부터 RNA를

분리하여 RT-PCR을 통해 후보 펩티드를 포함한 유전자의 전사

여부를 확인해 보았다 (그림 9). 결핵균의 유전자 데이터 베이스

검색 결과, 19번 펩티드는 Rv0222 유전자에 포함되어 있었고, 28번

펩티드는 Rv3242c에, 그리고 59번 펩티드는 Rv0192 유전자에

포함되어 있었다. 49번 펩티드의 경우, 이 펩티드를 포함하는

유전자들이 database에 많아서 False positive 결과를 우려하여

유전자 발현 실험에서 제외되었다. MT10Sa는 결핵균의 house-

keeping gene으로서 양성 대조군으로 사용되었다. 결과로서, 19,

44

28, 59번 펩티드를 포함하는 Rv0222, Rv3242c, Rv0192 유전자 모두

결핵균에서 발현되고 있음이 확인되었다.

이번에는 ELISA를 이용해 결핵환자 혈청 내 후보 펩티드를

포함하고 있는 단백질에 대한 항체를 측정함으로써, 후보 펩티드를

포함하는 단백질들의 발현 여부를 확인해 보고자 하였다 (표 4).

총 100명의 결핵환자 혈청으로 실험한 결과, 19번 펩티드를

포함하고 있는 단백질에 대한 항체는 11명에서 양성이 나왔고,

28번 펩티드를 포함하고 있는 단백질에 대한 항체는 2명에서

양성이 나왔다. 이 두 실험 결과를 통해 19번, 28번 후보

펩티드들을 포함하는 결핵균 항원들이 결핵에 감염된 환자들에서도

실제로 발현되고 있음이 확인되었다.

45

그림그림그림그림 9. RT 9. RT 9. RT 9. RT----PCRPCRPCRPCR을을을을 통한통한통한통한 후보후보후보후보 펩티드의펩티드의펩티드의펩티드의 유전자유전자유전자유전자 발현발현발현발현 측정측정측정측정. . . . DNA

상에서 선별된 후보 펩티드들이 실제로 발현되는지 확인하기 위해,

10일간 배양된 결핵균의 RNA를 분리하여 RT-PCR을 통해 후보

펩티드를 포함하고 있는 유전자의 발현여부를 확인해 보았다. 19번

펩티드를 포함하고 있는 유전자는 Rv0222이고, 28번 펩티드는

Rv3242c에 포함되어 있고, 59번 펩티드는 Rv0192 유전자에

포함되어 있다. 49번 펩티드는 포함되어 있는 유전자들이 많은

관계로 유전자 발현 실험에서 제외되었다. MT10Sa는 housekeeping

gene으로 사용되었다. PCR 조건은 재료 및 방법에 명시되어있다.

#59

(RT-) (RT+)

#19

(RT-)

MT10Sa

(RT+) (RT-) (RT+) Marker

(100bp) #28

(RT-) (RT+) Marker

(100bp)

709 bp

151 bp

501 bp 437 bp

46

표표표표 4. Serum IgG ELISA 4. Serum IgG ELISA 4. Serum IgG ELISA 4. Serum IgG ELISA를를를를 이용한이용한이용한이용한 결핵환자결핵환자결핵환자결핵환자 혈청에서혈청에서혈청에서혈청에서 후보후보후보후보 펩티드를펩티드를펩티드를펩티드를

포함하는포함하는포함하는포함하는 단백질에단백질에단백질에단백질에 대한대한대한대한 항체의항체의항체의항체의 정량정량정량정량 측정측정측정측정

* 38 kDa, CFP 21: * 38 kDa, CFP 21: * 38 kDa, CFP 21: * 38 kDa, CFP 21: 양성양성양성양성 대조군으로대조군으로대조군으로대조군으로 사용된사용된사용된사용된 결핵균결핵균결핵균결핵균 단백질단백질단백질단백질

O.D.O.D.O.D.O.D.값이값이값이값이 0.2 0.2 0.2 0.2이상일이상일이상일이상일 때때때때, , , , 양성양성양성양성....

samplesamplesamplesample 38kDa38kDa38kDa38kDa #19#19#19#19 #28#28#28#28 #59#59#59#59 CFP21CFP21CFP21CFP21 samplesamplesamplesample 38-kDa38-kDa38-kDa38-kDa #19#19#19#19 #28#28#28#28 #59#59#59#59 CFP21CFP21CFP21CFP21

1111 0.844 0.032 0.028 0 0.653 51515151 1.321 0.053 0.144 0 0.640

2222 0.289 0.038 0.031 0 0.429 52525252 0.047 0.164 0.022 0 0.361

3333 0.070 0.024 0.039 0 0.585 53535353 0.268 0.476 0.013 0 0.702

4444 1.281 0.003 0.033 0 0.152 54545454 2.504 0 0 0 1.502

5555 0.132 0.029 0.002 0 1.886 55555555 3.346 0 0 0 2.811

6666 0.533 0.024 0.007 0 0.506 56565656 1.376 0 0 0 2.565

7777 0.085 0.012 0.006 0.001 0.052 57575757 1.766 0 0 0 0.234

8888 0.189 0.023 0.052 0.009 1.231 58585858 0.831 0 0 0 1

9999 1.295 0.028 0.014 0 0.409 59595959 1.88 0 0 0 2.23

10101010 0.838 0.667 0.032 0.021 0.558 60606060 2.638 0 0 0 1.458

11111111 0.734 0.011 0.024 0 0.380 61616161 1.995 0 0 0 0.573

12121212 0.083 0 0 0 0.358 62626262 1.684 0 0 0 1.339

13131313 0.149 1.254 0.027 0 0.106 63636363 3.096 0.062 0 0 2.469

14141414 0.468 0.067 0.241 0 0.874 64646464 3.033 0 0 0 1.728

15151515 0.374 0.089 0.022 0 1.955 65656565 3.029 0 0 0 3.025

16161616 0.076 0 0 0 0.485 66666666 2.252 0 0 0 1.226

17171717 0.564 0.031 0.025 0 0.466 67676767 2.794 0 0 0 2.603

18181818 0.636 0.004 0.023 0 0.627 68686868 1.877 0 0 0 2.538

19191919 0.142 0.418 0 0 2.716 69696969 2.075 0 0 0 1.972

20202020 0.183 0.023 0.008 0 0.121 70707070 2.401 0 0 0 3.178

21212121 1.452 0.339 0.010 0 0.821 71717171 2.157 0 0 0 1.136

22222222 0.817 0 0.001 0 2.182 72727272 0.979 0 0 0 1.341

23232323 0.190 0.029 0.019 0 1.257 73737373 1.508 0 0 0 1.625

24242424 0.181 0 0 0 2.673 74747474 0.662 0 0 0 1.615

25252525 0.201 0 0.016 0 0.267 75757575 1.35 0 0 0 1.017

26262626 3.187 0 0 0 1.236 76767676 0.354 0.018 0.088 0 1.731

27272727 3.242 0 0 0 0.747 77777777 0.553 0 0.018 0.001 2.483

28282828 0.251 0.039 0.002 0.01 0.137 78787878 0.977 0.576 0.03 0.026 0.678

29292929 2.8 0.048 0 0 1.778 79797979 2.354 0 0 0 1.592

30303030 1.69 0 0 0 2.98 80808080 0.332 0 0.005 0.001 0.51

31313131 3.44 0 0 0.011 2.064 81818181 1.311 0.257 0.001 0.002 1.776

32323232 2.528 0 0 0 2.633 82828282 0.355 0.523 0 0 1.333

33333333 1.848 0 0 0 2.39 83838383 1.002 0.006 0 0.002 0.515

34343434 1.692 0 0 0 2.705 84848484 1.412 0 0 0 1.886

35353535 1.927 0 0 0 1.876 85858585 1.018 0.083 0 0 1.128

36363636 3.577 0 0 0 3.135 86868686 2.788 0.049 0 0 2.51

37373737 0.815 0 0 0 0.848 87878787 0.984 0.008 0 0 0.75

38383838 2.887 0.015 0 0 0.396 88888888 0.341 0 0 0 2.868

39393939 2.663 0 0 0 0.416 89898989 0.668 0.05 0 0.006 3.245

40404040 1.037 0.003 0 0 0.377 90909090 3.161 0 0.004 0 1.928

41414141 0.584 0.041 0 0 0.52 91919191 0.237 0.885 1.083 0 0.122

42424242 2.163 0 0 0 1.173 92929292 2.102 0.035 0 0 2.352

43434343 3.338 0 0 0.002 0.461 93939393 1.228 0 0 0 2.968

44444444 2.579 0 0 0 2.561 94949494 1.122 0 0 0 1.61

45454545 2.978 0 0 0 0.598 95959595 1.233 0 0 0 2.61

46464646 2.146 0 0 0.037 1 96969696 3.171 0 0 0 2.704

47474747 1.275 0 0.029 0.008 2.988 97979797 2.47 0 0 0 2.074

48484848 1.039 0 0 0.011 2.741 98989898 2.908 0 0 0 1.247

49494949 0.436 0.104 0 0 2.681 99999999 1.595 1.272 0 0 0.473

50505050 0.649 0.279 0.016 0.021 0.57 100100100100 0.574 0 0 0 0.114

47

5.5.5.5. In vitro In vitro In vitro In vitro immunization immunization immunization immunization방법에방법에방법에방법에 의해의해의해의해 생성된생성된생성된생성된 T cell line T cell line T cell line T cell line의의의의

결핵균에결핵균에결핵균에결핵균에 감염된감염된감염된감염된 대식세포에대식세포에대식세포에대식세포에 대한대한대한대한 세포독성반응세포독성반응세포독성반응세포독성반응

앞의 결과들에 따르면, 후보 펩티드들은 naïve T세포를 각

펩티드에 특정한 CD8+ T cell line으로 분화시켜 세포독성능을

유도할 수 있었다. 이렇게 생성된 CD8+ T cell line들이 실제

결핵균에 감염된 대식세포에 대해서도 세포독성능을 보이는지

확인해 보고자 하였다. 연구대상자의 혈액에서 분리한 CD8+

T세포를 in vitro immunization 방법으로 후보 펩티드에 특정한

CTL로 분화시킨 다음 결핵균에 감염된 대식세포에 대한 세포독성

반응을 51Cr release cytotoxicity assay 방법을 통해 측정하였다

(그림 10). HLA-A*0201인 건강한 개체로부터 in vitro immuni-

zation 방법에 의해 생성된 19번 펩티드와 28번 펩티드에 특정한

CD8+ T cell line은 결핵균에 감염된 대식세포에 대해, 결핵균에

감염되지 않은 대식세포에 비하여 각각 7.6%, 16.6%의

세포독성능을 보임을 확인하였다. 이로써, 19번, 28번 펩티드는

결핵균에 감염된 대식세포 내에서 항원처리과정을 통해 CD8+ T

세포에 제시되고, 이 펩티드를 인지한 CD8+ T 세포를 naïve T

세포에서 CTL로 분화시킴으로써 결핵에 대한 면역반응을 유도할 수

있으며, 또한 이렇게 유도되는 CD8+ T세포는 감염된 대식세포를

파괴하고 제거함으로써 결핵균에 대한 보호면역반응에 기여할 수

있다는 것을 확인할 수 있었다.

48

그림그림그림그림 10. 10. 10. 10. IIIIn vitron vitron vitron vitro immunization immunization immunization immunization방법에방법에방법에방법에 의해의해의해의해 생성된생성된생성된생성된 후보후보후보후보 펩티드에펩티드에펩티드에펩티드에

특정특정특정특정한한한한 CD8+ T cell line CD8+ T cell line CD8+ T cell line CD8+ T cell line의의의의 결핵균에결핵균에결핵균에결핵균에 감염된감염된감염된감염된 대식세포에대식세포에대식세포에대식세포에 대한대한대한대한

세포독성반응세포독성반응세포독성반응세포독성반응. . . . In vitro immunization 방법에 의해 생성된 (A)

19번 펩티드와 (B) 28번 펩티드에 특정한 HLA-A*0201인 개체

(N310)의 CD8+ T cell line의 결핵균에 감염된 대식세포에 대한

세포독성반응을 51Cr release cytotoxicity assay 방법을 통해

측정하였다. 대식세포는 10 multiplicity of infection (MOI)의

결핵균으로 2일 동안 감염된 후 표적세포로 사용되었다.

0000

10101010

20202020

30303030

10101010 30303030 60606060

MTB-infe cte d MΦuninfe cte d MΦ


Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

#19#19#19#19 AAAA

0000

10101010

20202020

30303030

40404040

10101010 40404040 80808080

MTB-infecte d MΦun infe cte d MΦ

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)

Specific

lysis

(%)


#28#28#28#28

BBBB

49

ⅣⅣⅣⅣ. . . . 고고고고 찰찰찰찰

결핵에 대한 보호면역반응은 주로 세포매개 면역반응에 의해

일어난다. 그 중, CD4+ T세포는 결핵에 대한 면역반응에서 아주

중요한 역할을 한다는 것이 많은 실험들을 통해 확인되었고10~14,

오랫동안 결핵에 대한 보호면역반응 연구는 CD4+ T세포를 중심으로

진행되어왔다. 그러나, 최근에는 결핵균의 항원들이 MHC class Ⅰ

pathway를 거쳐서도 처리될 수 있다는 것이 보고되면서18, CD8+

T세포에 의한 면역반응에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

그리고 많은 연구들을 통해 결핵균에 대한 보호면역반응에서 CD8+

T세포 또한 중요한 역할을 하고 있음이 확인되었다30-33. 낮은

효율성으로 논란이 되고 있는, 현재 유일하게 사용되고 있는 결핵

백신인 BCG는 주로 CD4+ T세포의 면역반응을 유도함이 여러

논문들을 통해 보고되었다38. BCG를 보강할 더 효과적인 백신개발을

위해서는 BCG에 부족한 CD8+ T세포의 면역반응을 효율적으로

유도할 수 있는 항원결정기가 큰 도움을 주리라고 기대한다.

이에, 본 연구에서는 가장 빈번한 HLA type 중 하나인 HLA-A2

supertype인 개체들을 대상으로 결핵균 펩티드 중 CD8+ T세포의

면역반응을 효율적으로 유도하는 항원결정기를 동정하고자 하였다.

IFN-γ ELISA, IFN-γ ELISPOT, intracellular cytokine staining

을 통해 이전 실험에서 선별된 64개의 결핵균 펩티드 중에 HLA-A2

supertype인 개체들의 CD8+ T세포의 IFN-γ 분비를 효율적으로

유도하는 6개의 후보 펩티드들을 선별하였다. 연구 대상자들의

말초혈액 제공의 한계에 의해 6개의 펩티드 중 4개의 펩티드만을

50

선별하여 각 펩티드에 특정한 CD8+ T cell line을 만들어 세포

독성능을 측정하였다. 이 실험에서 제외된 나머지 후보 펩티드들

또한 추후에 다른 연구에 사용될 가치가 충분히 있다고 판단된다.

PPD+인 건강한 개체들과 결핵환자로부터 4개의 후보 펩티드에

특정한 기억세포를 활성화시켜 51Cr release cytotoxicity assay를

통해 각 펩티드로 pulsing된 표적세포에 대해 세포독성능을 보임을

확인하였다. 또한, PPD-인 건강한 개체들에서는 각 후보 펩티드로

4-6주 동안 자극시킨 후에 naïve T세포를 각 펩티드에 특정한

CTL로 분화시켜 세포독성능을 보임을 확인하였다. 그리고, 마지막

으로, 이렇게 생성된 각 펩티드에 특정한 CD8+ T cell line이 실제

결핵균으로 감염된 대식세포에 대해서도 세포독성능을 보이는지

조사한 결과, 19번 펩티드와 28번 펩티드에 특정한 CD8+ T cell

line이 결핵균에 감염된 대식세포에 대해 세포독성능을 보임을

확인하였다. 이 결과는 결핵균에 감염된 대식세포 내에서 19번,

28번 펩티드들은 항원처리과정을 통해 CD8+ T세포에 제시될 수

있고, 이를 인지한 naïve CD8+ T세포들을 CTL로 분화시켜 결핵균에

대한 보호면역반응을 유도할 수 있음을 보여준다.

본 연구의 항원결정기 동정 실험에 사용된 결핵균 펩티드는,

이전 연구에서 MTB genomic DNA-phage display library를 이용하여

soluble HLA-A*0201와 높은 결합 친화력을 보인 64개의 결핵균

펩티드이다. 지금까지 보고된 많은 결핵균 항원결정기 동정에 대한

실험들은 대부분 ESAT-6, Ag85A, 19-kDa lipoprotein, 38-kDa

protein, 65-kDa heat shock protein, CFP10과 같은 결핵균의

분비단백질로부터 그 후보 펩티드들을 선별하고 동정하였다39-44.

51

높은 면역반응을 유도하는 결핵균의 분비 단백질로부터 항원결정기

를 동정하는 방법이 가장 효과적인 면역반응을 유도하는 항원

결정기를 찾는 방법일 수 있겠지만, 이 접근에서는 결핵균 밖으로

분비되지 않는, 결핵균의 물질대사 등에 관여하는 결핵균 세포내의

단백질에 존재하는 항원결정기들은 제외될 수 있다.

이에 본 연구에서는 결핵균의 genomic DNA에서 표현되는 HLA-

A*0201과 높은 결합 친화력을 보인 후보 펩티드를 사용하였고, RT-

PCR과 ELISA를 이용해 그 펩티드들을 포함하고 있는 유전자들이

실제로 결핵균에서 전사, 표현되고 있음을 확인하였다. 19번

펩티드는 Rv0222 유전자에 포함되어 있고, 28번 펩티드는 Rv3242c,

59번 펩티드는 Rv0192 유전자에 포함되어 있다. 이 세 유전자들은

그 기능이 잘 알려져 있지 않은 유전자들이다. 49번 펩티드는

결핵균뿐만 아니라 Pseudomonas mendocina, Eudromia elegans,

Salinispora tropica 등 다른 박테리아들의 많은 유전자에

포함되어 있어서 그 펩티드에 특정한 결과를 얻기 어렵다고 판단해

유전자 발현 검증 실험에서는 제외시켰다. 49번 펩티드에 특정한

CD8+ T cell line을 이용한 세포독성능 실험에서도 결과가

결핵균에만 국한된다고 말하기 어렵다. 그러나 한편으로는 이 49번

펩티드에 의해 유도된 CD8+ T세포의 면역반응이 다른 박테리아에

감염된 세포에도 적용된다면 이는 결과적으로 인체에서 여러

병원균에 대한 면역반응을 유도할 수 있으므로 백신으로의

효율성이 더 높은 항원결정기가 될 수 있는 가능성이 있다고

판단된다.

52

본 연구의 후보 펩티드들은 soluble HLA-A*0201과의 결합 친화

도에 의해 선별되었다. HLA-A*0201과 특이 결합부위를 공유하는

HLA subtype들을 묶어 HLA A2 supertype이라고 한다. HLA A2

supertype에는 A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206,

A*0207, A*6802 그리고 A*6901이 속한다45. HLA A2 supertype에

속하는 HLA subtype들은 정도의 차이는 있으나 같은 항원결정기를

CD8+ T세포에게 제시하여 세포 매개 면역반응을 유도할 수 있다47.

그러므로, 본 논문에서는 HLA-A2 supertype을 대상으로 실험을

진행하였다. 본 논문의 대상이 된 HLA-A2 subtype은 HLA-A*0201,

HLA-A*0203, HLA-A*0206, HLA-A*0207이었다.

본 연구를 통해 선별된 네 개의 후보 펩티드들은 항원결정기를

이용한 백신에 사용될 가능성을 가지고 있지만38, 좀 더 많은

연구가 요구된다. 더 많은 연구대상자들을 확보하여 각 후보

펩티드에 특정한 CD8+ T cell line의 세포독성능을 측정하여 더

신뢰도가 높은 결과를 얻을 필요가 있다. 여러 반복 실험의 결과에

의해 얻어진, CD8+ T세포의 면역반응을 효율적으로 유도하는

항원결정기는 추후에 BCG를 보강할 효율성이 높은 결핵백신 개발에

사용될 수 있을 뿐만 아니라, 결핵에 대한 CD8+ T세포의 보호면역

반응 연구에 기여할 수 있을 것이다.

53

ⅤⅤⅤⅤ. . . . 결결결결 론론론론

본 연구에서는, BCG를 보강할 수 있는 효율성이 높은 백신

개발과 결핵에 대한 CD8+ T세포의 보호면역 반응 연구에 기여하기

위해, 가장 빈번한 HLA type의 하나인 HLA-A2 supertype을

대상으로 CD8+ T세포의 면역반응을 효율적으로 유도하는 결핵균의

펩티드 항원결정기를 찾고자 하였다. 이전 연구에서 MTB genomic

DNA-phage display library를 이용하여 선별된 soluble HLA-

A*0201와 결합 친화력이 높은 결핵균 펩티드 64개를 가지고 본

연구의 항원결정기 동정을 시작하였다. 이 64개의 펩티드 중 CD8+

T세포들의 면역반응, 즉 IFN-γ 분비와 세포독성능을 효율적으로

유도하는 펩티드를 찾고자 하였고, 그 결과는 다음과 같다.

1. HLA-A*0201과 결합 친화력이 높은 64개의 결핵균 펩티드 중에서

HLA-A2 supertype (HLA-A*0201, 0203, 0206, 0207)인 건강한

개체들과 결핵환자로부터 CD8+ T세포의 IFN-γ 분비를 효율적으로

유도하는 6개의 펩티드 (13, 19, 28, 49, 51, 59번 펩티드)를

선별하였다. 그 중, 4개의 펩티드 (19, 28, 49, 59번 펩티드)에

대해 다음 실험을 진행하였다.

2. HLA-A2 supertype을 표현하며 PPD+인 건강한 개체들과

결핵환자의 말초혈액에서 4개의 후보 펩티드의 자극에 의해 각

펩티드에 대한 기억세포를 활성화 시켰고, 활성화된 CD8+ T cell

54

line들이 각 펩티드로 pulsing된 표적세포에 대해 세포독성능을

나타내었다.

3. In vitro immunization 방법에 의해 생성된 각 후보 펩티드에

특정한 HLA-A2 supertype을 나타내며 PPD-인 건강한 개체들의 CD8+

T cell line은 각 펩티드로 pulsing된 표적세포에 대해 세포독성능

을 나타내었다.

4. MTB genomic DNA-phage display library로부터 선별된 후보

펩티드들은, 각 후보 펩티드가 포함된 결핵균 유전자의 RNA 분석과

각 후보 펩티드가 포함된 결핵균 단백질에 대한 항체 분석에 의해

실제로 결핵균에서 전사, 발현되고 있음이 확인되었다.

5. In vitro immunization 방법에 의해 생성된 19번, 28번

펩티드에 특정한 CD8+ T cell line은 결핵균에 감염된 대식세포에

대해서 세포독성능을 보임을 확인하였다. 이는 두 펩티드가

결핵균에 감염된 대식세포 내에서 항원처리과정을 거쳐 CD8+

T세포에 제시될 수 있고, 두 펩티드를 인지한 CD8+ T세포를 두

펩티드에 특정한 CTL로 분화 시킬 수 있음을 나타내었다.

6. 결과적으로 두 펩티드에 특정한 CD8+ T세포들이 결핵균으로

감염된 대식세포를 죽임으로써 두 펩티드는 보호면역반응에 기여할

수 있으며, HLA-A2 supertype (HLA-A*0201, 0203, 0206, 0207)을

대상으로 하는 subunit 백신에 사용될 수 있음을 제시하였다.

55

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ABSTRACTABSTRACTABSTRACTABSTRACT

Identification of Mycobacterium tuberculosis driven

epitope peptides inducing protective immune responses

by HLA-A2-restricted CD8+ T cells

Ju Young Choi

Department of Medical science

The Graduate School, Yonsei University

(Directed by professor Sang-Nae Cho)

Tuberculosis (TB), a chronic infectious disease caused by

Mycobacterium tuberculosis (MTB), is one of the major public

health problems in the world. The importance of cytotoxic T

lymphocytes (CTLs) in protective immunity against MTB is

supported by their presence in mycobacterium-infected animals

and by their ability to prevent bacillary dissemination in

these animals. CD8+ T cell-deficient mice showed enhanced

susceptibility to TB. In humans infected with MTB, CD8+ T

cells recognize mycobacterial antigens, lyse MTB-infected

monocyte-derived macrophages and alveolar macrophages, and

directly kill MTB by secreting the antimicrobial peptide,

granulysin. CD8+ T cell epitopes are recognized in the context

67

of major histocompatibility complex (MHC) class I molecules,

and human leukocyte antigen (HLA)-A2 supertype is a class I

allele that is expressed at high frequency in individuals of a

variety of ethnic backgrounds. The HLA-A2 supertype is a

family of HLA subtypes that share specificities for a

degenerate ligand with HLA-A*0201. The A2 supertype includes

the A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206 and A*0207,

A*6802 and A*6901 types, and A2 supertype epitope peptide can

bind to the HLA molecules of supertype members. Therefore,

identification of MTB peptides that are recognized by HLA-A2

supertype is important for vaccine development.

In order to identify MTB derived epitopes eliciting

efficient MHC class Ⅰrestricted CD8+ T cell immune responses,

in our previous approach, we screened a phage display library

exposing MTB peptides encoded from whole genome by using

soluble HLA-A*0201 molecules as tools. The selection of MTB

peptides on the surface of phages with soluble HLA-A*0201

molecules suggest that these selected peptides have high

binding affinities to HLA-A*0201 molecules. As a result, we

identified 64 9-10-mer peptide epitopes which contain binding

motifs for HLA-A*0201 molecules. These peptides were screened

to test the immuno-dominance. As a result, we identified four

candidate epitope peptides specific for HLA-A2+-restricted

CD8+ T cells. These epitope peptides are derived from

68

uncharacterized hypothetical proteins from MTB. We observed

the CD8+ T cell lines specific for these epitope peptides

showed the cytotoxic activity and produced IFN-gamma in

response to these epitope peptides pulsed target cells. And

the CD8+ T cell lines specific for two epitope peptides showed

the cytotoxic activity against MTB infected macrophages

generated from HLA-A*0201 subjects. In addition, the

expression of hypothetical proteins encoding these epitope

peptides was verified using TB patients and RT-PCR analysis.

These peptides are likely to represent promising components

for future subunit vaccine against human TB.

Key words : Mycobacterium tuberculosis (MTB), CD8+ T cells,

Epitope peptide, HLA-A2 supertype, Cytotoxicity, IFN-γ

hla-a2 supertype 에 제한적인 - yonsei university › bitstream › 22282913 › 123599 ›...

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