ÇOCUKLARDA NEDENİ BİLİNMEYEN ÇOCUKLARDA NEDENİ BİLİNMEYEN BRONŞEKTAZİLERE KARŞI BRONŞEKTAZİLERE KARŞI

GENETİK YATKINLIKTA TAP-1 VE TAP-2 GENETİK YATKINLIKTA TAP-1 VE TAP-2 GEN POLİMORFİZMİNİN GEN POLİMORFİZMİNİN ROLÜNÜN BELİRLENMESİROLÜNÜN BELİRLENMESİ

Deniz Doğru, Filiz Özbaş Gerçeker, Ebru Yalçın, Ayşe Tana Aslan, Nazan Çobanoğlu, Uğur Özçelik, Nural Kiper

  Hacettepe Üniversitesi THacettepe Üniversitesi Tııp Fakültesi Çocuk Göp Fakültesi Çocuk Göğğüs Hastalüs Hastalııklarklarıı Ünitesi Ünitesi ve DNA Bankasıve DNA Bankası

Bronşektazi, solunum yollarının yapı ve fonksiyonlarında kalıcı değişikliklere

yolaçan kalıcı bir hastalıktır ve sık tekrarlayan akciğer enfeksiyonları ve

bronşiyal ve peribronşiyal dokunun inflamatuar harabiyeti ile karakterizedir

Çocuklarda bronşektazinin birçok nedeni bulunmaktadır; kistik fibrozis,

enfeksiyonlar, tüberküloz, primer siliyer diskinezi, konjenital immün

yetmezlikler, yabancı cisim aspirasyonları, astım, gastroözefageal reflü

Ancak bazı vakalarda birçok laboratuar testlerine rağmen bronşektaziye

yolaçan bir neden bulunamamaktadır.

HLA HLA CClass I lass I MMolekülleriolekülleri Vücutta tüm çekirdekli hücrelerin yüzeyinde değişik

düzeylerde eksprese olan polimorfik transmembran glikoproteinleridir

Bu moleküller intrasellüler antijenik peptitleri sitotoksik T lenfositlerine sunarlar ve “natural killer” hücreleri gibi HLA class I binding reseptörlere bağlanan hücrelerin aktivitelerini regüle ederler

HLA HLA CClass I lass I MMolekülleriolekülleri Biyosentezleri sırasında, HLA class I molekülleri,

endoplazmik retikulumun lümeninde 8-11 aminoasit uzun peptidi ve beta2 mikroglobülin ile ilişkilidir

Değişik HLA class I alelleri, çoğu sitozolik proteinlerin proteazom denilen büyük bir proteolitik kompleks tarafından yıkımından kaynaklanan değişik peptitlere bağlanırlar

Sitozolik proteinlerin yıkımından kaynaklanan bu peptitlerin endoplazmik retikulum içine translokasyonu ise “transporter associated with antigen presentation” (TAP) tarafından yürütülür

Transporter associated with antigen presentation

(TAP) Bir heterodimerdir

Altıncı kromozomdaki class II bölgesindeki HLA lokusunda kodlanan TAP1 ve TAP2 adı verilen iki alt gruptan oluşur

Transporter associated with antigen presentation (TAP)

TAP1 ve TAP2 proteinlerinin mutasyonu veya delesyonu, peptitlerinendoplazmik retikuluma translokasyonunu bozmaktadır

Yeni sentezlenen protein

Proteozom

Peptidler

TAP1 ve 2 subüniteleri

CD8/T hücre reseptörü

NK hücre reseptörüAğır zincir ve beta2 mikroglobulin

TAP Eksikliği Sendromu

Nadir görülen bir sendrom

Genellikle hayatın ilk 6 yılında, sinüzit, ottitis media, nazal polip, nazal septum perforasyonu ile komplike olan kronik pürülan rinit gibi üst solunum yollarının tekrarlayan bakteriyel enfeksiyonları ile bulgu verir

Alt solunum yollarında tekrar eden bakteriyel pnömoni ve bronşektazi meydana gelir

TAP Eksikliği Sendromu

H. influenzae, S. pneumonia, E. coli, P.aeruginosa gibi ajanlar sıklıkla solunum yollarından izole edilirler

Tekrar eden bakteriyel enfeksiyonlar sonucunda progresif akciğer hasarı ve ardından solunum yetmezliği ve ölüm meydana gelir

TAP Eksikliği Sendromu

Cilt Nekrotizan granülomatöz lezyonlar Lökositoklastik vaskülit Kol ve bacaklarda simetrik purpuraSantral sinir sistemi Beyin absesi EnsefalomyelitGastrointestinal Kronik gastrit Psödomembranöz kolitDiğer Nonerozif simetrik poliartrit Retinal vaskülit

TAP Eksikliği Sendromu

Tedavi Erken tanı Solunum yolları enfeksiyonlarının agressif

tedavisi ve bronşektazinin önlenmesi Antibiyotik Göğüs fizyoterapisi İntravenöz immünglobülin

Amaç

Daha önce, pansinüzit, nazal polip ve bronşektazisi olan iki kardeşte TAP2 gen mutasyonuna bağlı HLA class I antijen eksikliği saptanmış ve bu sendromun nedeni bilinemeyen bronşektazisi olan çocuklarda araştırılması önerilmiştir (Donato L, et al. J Pediatr 1995; 127: 895-900)

Ülkemizde, sıklığı bilinmese de, nedeni yapılan çalışmalara rağmen aydınlatılamamış bronşektazisi olan bir grup çocuk mevcuttur

Bu çalışmada nedeni belli olmayan bronşektazili çocuklarda TAP gen polimorfizmi ile hastalık arasında ilişki olup olmadığının ortaya konulması amaçlanmıştır

Materyal ve Metod

 Örnekler

Kontrol grup Populasyonumuzu temsil edecek şekilde TÜBİTAK

DNA/Doku Bankası’nda oluşturulmuş olan sağlıklı grup DNA paneli (n:100)

Bireylerin yaş aralığı 25-45

Kadın/erkek oranı 1:1.2

Materyal ve Metod

Hasta grubu Akciğerlerde, nedeni bilinemeyen bronşektazisi olan

toplam 44 adet çocuk hasta alındı 20 erkek, 24 kız Çalışmaya alındıkları sırada yaş: 3 - 20 yıl (ortanca

değeri 13 yıl) Hepsinde bronşektaziyi düşündürecek uzun süreli

öksürük, balgam çıkarma, tekrarlayan akciğer enfeksiyonu gibi şikayetler

Fizik muayenede akciğerde ral ve/veya ronküs ve parmaklarda çomaklaşma

19 hastanın (%43.2) anne babası arasında akrabalık var 7 hastanın (%15.9) kardeşinde benzer şikayetler var

Materyal ve Metod

Hasta grubu Tüm hastalarda bronşektazi varlığı yüksek rezolüsyonlu

toraks tomografisi ile kanıtlandı 10 hastada lobektomi materyallerinin patolojik

incelemesinde bronşektazi tanısı doğrulandı Bronşektazi yerleşimi

20 hastada sağ alt16 hastada sağ orta10 hastada sağ üst33 hastada sol alt 11 hastada sol üst

27 hastada birden çok lobda bronşektazi

Materyal ve Metod

Yüksek tuz konsantrasyonu ile DNA eldesi

EDTA’ lı tüplere alınan 10 cc. periferal kan 50 ml’ lik steril tüplereaktarılarak üzerine 40 ml steril soğuk distile su eklendi ve 1-2 dakikaeritrositleri patlatmak için tüpler aşağı-yukarı çırpıldı. Tüpler 2000 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Supernatan atıldı ve pelletin üzerine 25 ml steril soğuk distile sueklendi , pellet çözülene kadar tüpler çırpıldı. 2000 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Supernatan atıldı ve pelletin üzerine 3 ml Nüclei Lysis (pH:8.2)tamponu, 200 l Sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 150 l proteinaz Keklendi Tüpler 37C de 16 saat inkübasyona bırakıldı. 2 ml amonyum asetat eklendikten sonra tüpler 1 dakika sallandı ve

oda sıcaklığında 10 dakika bekletildi.

Materyal ve Metod

Yüksek tuz konsantrasyonu ile DNA eldesi

3500 rpm de 15 dakika santrifüj edildi

Supernatan başka bir tüpe dikkatlice toplanarak üzerine 2 hacim etanol eklendi

DNA ‘nın toplanması için yavaşça tüp aşağı yukarı sallandı. DNA bir eppendorf tüp içerisinde 500 l TE (Tris-EDTA, pH:7.4) tamponunda çözülerek –80 C de saklandı

Materyal ve Metod

TAP1 ve TAP2 gen polimorfizmlerinin analizi

PCR (Polymerase Chain Reaction) – RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism) tekniği kullanılarak

TAP 1 geninde iki polimorfizm (kodon 333 ve kodon 637)

TAP 2 geninde üç polimorfizm (kodon 379, kodon 565 ve kodon 665)

bronşektazi hastalarında ve kontrol örneklerinde çalışıldı

Materyal ve Metod

İstatistiksel analizler

TAP genlerinde birden fazla polimorfik bölgede heterozigotluk görülebileceği için allel/haplotip frekansı yerine genotip frekanslarının kullanılması tercih edildi

Hasta ve kontrol grubu için hesaplanan genotip frekansları 2X3 2 testi ile karşılaştırıldı (StatsTM, Decision Analyst, Inc. Version 1.1, Arlington).

BulgularTAP polimorfizmleri Kontrol grubu Bronşektazi

(n =100) ( %) (n = 44) ( %) 2 TAP1-333Genotipler Ile/Ile 75 75 26 59

Ile/Val 21 21 17 39 7.97Val/Val 4 4 1 2

TAP1-637Genotipler Asp/Asp 82 82 31 70 Asp/Gly 4 4 12 27 27 Gly/Gly 14 14 1 2

TAP2-379Genotipler Ile/Ile 25 25 1 2 Ile/Val 1 1 7 16 33.2 Val/Val 74 74 36 82

Bulgular

TAP polimorfizmleri Kontrol grubu Bronşektazi (n =100) ( %) (n = 44) ( %)

2  TAP2-565Genotipler Thr/Thr 1 1 0 0 Thr/Ala 4 4 2 5 anlamlı

değil Ala/Ala 95 95 42 95

 TAP2-665Genotipler Thr/Thr 99 99 13 30 Thr/Ala 1 1 15 34 104 Ala/Ala 0  0 16 36

Bulgular

Bronşektazi grubunda

TAP1-333 polimorfizmiIle/Ile genotipinde azalma Ile/Val genotipinde artış (2 = 7.97, d.f: 2, p0.025)

TAP1-637 polimorfizmiAsp/Asp ve Gly/Gly genotiplerinde azalma Asp/Gly frekansında artış (2 = 27, d.f:2, p<0.001)

TAP2-379 polimorfizmiIle/Val genotipinde artışIle/Ile genotipinde azalma (2 = 33.2, d.f:2, p<0.001)

TAP2-665 polimorfizmiThr/Thr genotip frekansında düşüşThr/Ala ve Ala/Ala genotiplerinde artış (2 = 104, d.f:2, p0.001)

Bulgular

Bronşektazi grubunda

Sadece TAP2-565 polimorfizmi için genotip frekansları kontrol ve hasta grubunda

istatistiksel olarak anlamlı bir fark göstermemektedir (2 = 1.1, d.f:2, p1).

Sonuç

Hasta ve kontrol gruplarının TAP1 ve TAP2 gen polimorfizmlerinin genotip frekanslarına bakıldığında, çalışılan 5 polimorfizmin 4’ünde hasta ve kontrol grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı farklar bulunmuştur

Bu da çalıştığımız nedeni bilinmeyen bronşektazili hasta grubunda genetik olarak TAP eksikliğine ait bulgular olabileceğini düşündürmektedir

Ülkemizde idyopatik bronşektazide genetik yatkınlıkta TAP gen polimorfizminin ilk defa araştırıldığı bu çalışmada bu genlerdeki polimorfizmin bronşektaziye yatkınlığını artırdığına dair bulgular saptanmıştır

Sonuç

Kesin yargıya varabilmek için hasta sayısının çoğaltılması, hasta ve aile içi hasta olmayan bireylerin bu açıdan karşılaştırılması gereklidir

Nedeni bulunamayan bronşektazili hastalarda tanının akılda tutulması bu hastaların erken dönemde tanınmasını ve böylece akciğere yönelik yoğun tedavinin erkenden başlanmasını sağlayacak, bu da hastaların hem hayat kalitesini yükseltecek, hem de prognoza katkıda bulunacaktır