hodowle tkankowe, komórki macierzyste
DESCRIPTION
Hodowle tkankowe, komórki macierzyste. Typy hodowli. Pierwszorzędowe = pierwotne Wtórne Linie komórkowe Linie unieśmiertelnione telomeraza onkogeny onkowirusy nowotworowe. Pojęcia. Medium = pożywka Zdefiniowane Niezdefiniowane Bezsurowicze Skład: - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/1.jpg)
Hodowle tkankowe,komórki macierzyste
![Page 2: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/2.jpg)
Typy hodowli
Pierwszorzędowe = pierwotneWtórneLinie komórkoweLinie unieśmiertelnione telomerazaonkogenyonkowirusy nowotworowe
![Page 3: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/3.jpg)
PojęciaMedium = pożywka Zdefiniowane Niezdefiniowane Bezsurowicze
Skład: Aminokwasy – 9 egzogennych (His, Ile, Leu, Liz, Met, Phe,
Thr, Trp, Val); dodatkowo Cys, Gln, Tyr Witaminy Sole,glukoza Surowica – zawiera insulinę, transferynę Czerwień fenolowa Dodatki: IL-2 dla limfocytów T, erytropoetyna dla erytrocytów
![Page 4: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/4.jpg)
Warunki hodowli
Temperatura
Tlen, dwutlenek węgla
pH
Wilgotność powietrza
![Page 5: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/5.jpg)
Laboratorium
![Page 6: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/6.jpg)
Hodowle imitujące warunki fizjologiczne
• ko-kultury
• hodowle podtrzymujące z ang. „feeder layers”
• hodowle 3D na odpowiednich matrycach
• hodowle uniemożliwiające adhezję
![Page 7: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/7.jpg)
Izolacja komórekOddzielenie od macierzy międzykomórkowej i rozbicie
na pojedyncze komórki
rozdrobnienie mechaniczne tkanki
trawienie enzymami proteolitycznymi
traktowanie EDTA –wiąże jony wapnia potrzebne do kontaktu komórka-komórka
Rozbicie komórek
szok osmotyczny
ultradźwięki
przecieranie przez sita
homogenizacja
![Page 8: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/8.jpg)
Rozdział frakcji
Cytometr przepływowy z sorterem
Chemotaksja
Adhezja
Wirowanie
Obecność markerów – antygenów powierzchniowych
Tworzenie CFU
![Page 9: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/9.jpg)
Cytofluorymetria przepływowa z sorterem
![Page 10: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/10.jpg)
MACS – rozdział immunomagnetyczny
![Page 11: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/11.jpg)
Schemat izolacji immunomagnetycznej
Selekcja pozytywna
Selekcja negatywna
![Page 12: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/12.jpg)
Komórki jednojądrowe ze szpiku kostnego
Medium HGF
Izolacja chemotaktyczna
SDF-1 LIF
![Page 13: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/13.jpg)
Wirowanie
W gradiencie gęstości: frakcje wędrują w zależności
od rozmiaru i kształtu gdy użyje się niskiego gradientu cukru (5-20%);
w zależności od gęstości frakcji, gdy użyje się wysokiego gradientu cukru (20-70%)
W gradiencie prędkości: frakcje wędrują w zależności
od ciężaru – im mniejsza frakcja tym większej prędkości trzeba użyć
![Page 14: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/14.jpg)
Liczenie komórek
cytometr
Komora Burkera
Średnia ze zliczeń
Gęstość komórek /cm3: C=n* 105
n- ilość zliczonych komórek
![Page 15: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/15.jpg)
Określenie żywotności
Błękit trypanu – martwe-niebieskie jądraBromek etydyny – martwe-jądra czerwoneJodek propydyny- martwe – jądro czerwoneDwuoctan fluoresceiny – żywe – zielona fluorescencja cytoplazmy
![Page 16: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/16.jpg)
Komórki macierzyste
TypyEmbrionalne ESCSomatyczne Z krwi pępowinowej
![Page 17: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/17.jpg)
Cechy komórki macierzystej
Nieograniczona ilość podziałów
Zdolność do różnicowania
Zdolność samoodnawiania
Świat nauki 05/2002
![Page 18: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/18.jpg)
Podziały
Bardzo rzadkie
Symetryczne
Asymetryczne
Regulacja
Świat nauki 07/1999
![Page 19: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/19.jpg)
Typy komórek macierzystych
Totipotencjalne
Pluripotencjalne
Multipotencjalne
Unipotencjalne
www.wi.mit.edu
![Page 20: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/20.jpg)
Blastocysta
Blastocysta =
trofoblast + węzeł zarodkowy
Trofoblast tworzy łożysko
Komórki węzła zarodkowego tworzą 3 listki zarodkowe
www.kumc.edu
![Page 21: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/21.jpg)
Blastocysta
0,1 –0,2 mm średnicy
100 –150 komórek
www.kumc.edu
![Page 22: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/22.jpg)
Hodowla
Komórki węzła zarodkowego
Warstwa odżywcza z inaktywowanych fibroblastów mysich
Surowica bydlęca
Świat nauki 06/1999
![Page 23: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/23.jpg)
Różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych
MSC Osteoblasty Osteoklasty
![Page 24: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/24.jpg)
zwiększenie aktywnościalkalicznej fosfatazy
tworzenie ognisk mineralizacji
zmiana morfologii i gromadzenie kropli tłuszczu
zmiana morfologii i odkładanie proteoglikanów
![Page 25: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/25.jpg)
ESC
ZALETY:
Pluripotencjalne
Zgodność antygenowa – brak odrzutu
WADY:
Trudna hodowla Nieprzewidywalny
kierunek różnicowania
Potworniaki 20% Problemy etyczne
![Page 26: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/26.jpg)
Klonowanie terapeutyczne
Jądro komórki somatycznej wprowadzane do pozbawionego jądra oocytuCytoplazma oocytu „odmładza” jądroEmbrion hodowany do stadium blastocysty
www.biochem18.stanford.edu
![Page 27: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/27.jpg)
Problemy
Źródło oocytów
Nieznana wydajność tej techniki
Wydajność 14% -na 1 linię 280 oocytów
Oocyty zwierzęce
www.lef.org
![Page 28: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/28.jpg)
Partenogeneza
Niezapłodniony oocyt pobudzany do rozwoju
Podwójny zestaw chromosomów dawcy oocytu
Komórki pluripotencjalne
www.bedfordresearch.org
![Page 29: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/29.jpg)
Odróżnicowanie
Izolacja enzymów oocytu „odmładzających” jądro
Iniekcja do komórki hematopoetycznej
Komórki odzyskują pluripotencjalność
www.ohsu.edu
![Page 30: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/30.jpg)
Płodowe komórki macierzyste FSC
5-9 tygodniowe płody
Izolacja komórek linii płciowej
Pierwotne komórki zarodkowe EG
www.molbio.princeton.edu
![Page 31: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/31.jpg)
Migracja ESC do organizmu matki
Zaostrzenie chorób autoimmunolo – gicznych
Migracja do miejsca uszkodzenia i regeneracja tkanek – ochrona matki
Świat nauki 12/2005
![Page 32: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/32.jpg)
Krew pępowinowa
Alternatywne źródło krwiotwórczych SC
Przeszczepy autogeniczne i allogeniczne
Możliwość bankowania
130 tys. porcji zbankowanych
3500 przeszczepów
www.hemastem.com
![Page 33: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/33.jpg)
Krew pępowinowa
ZALETY:Dostępność i czas
Bezpieczna metoda pobrania
Większa pula dostępnych dawców
Młode SC
Mniej nasilone GvH
Minimalne ryzyko zakażenia CMV
Brak dylematów moralnych
WADY:Porcja 100 ml bezpieczna dla biorcy 30 kg
Opóźnione zasiedlanie szpiku
Ryzyko obciążeń genetycznych
Nieznany wpływ bankowania
Mniej SC niż w szpiku i krwi mobilizowanej
![Page 34: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/34.jpg)
Możliwości zastosowania krwi pępowinowej
Leczenie białaczek
Leczenie pacjentów po chemioterapii lub radioterapii
Uzyskanie komórek nerwowych
Uzyskanie komórek mezenchymalnych, trzustkowych i hepatocytów
www.waisman.wisc.edu
![Page 35: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/35.jpg)
Banki krwi pępowinowej
PUBLICZNE:
Krew sklasyfikowana pod względem HLA
Przeszczepy allogeniczne
Ponoszą wszystkie koszty
Ogólnodostępny rejestr dawców
Dowolny biorca
KOMERCYJNE:
Przeszczepy autogeniczne lub w obrębie rodziny
Nie ponosi kosztów
Ryzyko zakończenia działalności i zniszczenia komórek
![Page 36: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/36.jpg)
Somatyczne komórki macierzyste
Niezróżnicowane
Ograniczona proliferacja
Liczba z wiekiem maleje
Efekt starzenia
Dostosowanie do niszy tkankowej
Nie tworzą potworniaków
Stan uśpienia
www.rsna.org
![Page 37: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/37.jpg)
Występowanie somatycznych SC
szpik
mięśnie – komórki satelitarne
skóra
jelito
wątroba
mózg
![Page 38: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/38.jpg)
Wykorzystanie somatycznych SC
ZALETY:
Brak dylematów etycznych
Nie tworzą się potworniaki
WADY:
Trudność pozyskania
Brak zgodności tkankowej
Efekt starzenia
W stanach chorobowych lub martwicy mniejsza liczba
![Page 39: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/39.jpg)
Przeszczepy
Autologiczne
Allogeniczne
Ksenogeniczne
Narządów
Tkanek
komórek
![Page 40: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/40.jpg)
Możliwości wykorzystania
Badania embriogenezy
Badania nieprawidłowego rozwoju
Badania działania genów
Testowanie leków
Badanie teratogenów
Zastosowania medyczne
www.kumc.edu
![Page 41: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/41.jpg)
Ograniczenia
Możliwość odrzutu przeszczepu allogenicznegoLinie hodowane na mysich fibroblastach i surowicy cielęcej – możliwość transmisji patogenów SC pobierają mysie białko i prezentują je na swojej powierzchni – odrzucenie przeszczepuTrudności uzyskania, hodowli i różnicowaniaKontrowersje etyczne
www.zaman.com
![Page 42: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/42.jpg)
Oparzenia
Skóra wyhodowana in vitro dostępna komercyjnie
Przeszczep odtwarza włosy i gruczoły łojowe
Prawidłowy układ strefy wzrostu
www.times.hankooki.com
![Page 43: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/43.jpg)
Zawał serca
W Polsce 100 tys. rocznie
Nekroza kardiomiocytów
Blizna łącznotkankowa
Przebudowa ściany
Świat nauki 12/2004
![Page 44: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/44.jpg)
SSC w terapii pozawałowej -próby przedkliniczne
Myszy, szczury, owce, świnie
Poprawa kurczliwości
Indukcja angiogenezy
Prawidłowe ułożenie
Ochrona przed dalszą degeneracją
Po miesiącu 38% blizny zastąpione tkanką mięśniową
www.worldhealthspecialists.org
![Page 45: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/45.jpg)
Badania kliniczne
Poznań i Paryż
Podanie podczas bypassów lub przezskórnie
Makrofagi + SC
Większość komórek nie przeżywa
Zwiększenie frakcji wyrzutowej z 35% do 42%
www.dir.nhlbi.nih.gov
![Page 46: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/46.jpg)
Cukrzyca typu ISSC trzustkowe
Różnicowanie ESC w komórki wysepek trzuskowych
Produkcja insuliny
Możliwy przeszczep w nie fizjologicznej lokalizacji – pod torebkę nerki
www.stemcells.nih.gov
![Page 47: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/47.jpg)
Uszkodzenia wzroku
Stosowana terapia
SSC z rąbka rogówki
In vitro hodowana błonka wszczepiana w miejsce uszkodzenia
Oparzenia rogówki
www.stemcell.umn.edu
![Page 48: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/48.jpg)
Choroba Parkinsona
ok. 300 pacjentów
ESC lub SSC
Tworzyły połączenia neuronalne, produkcja dopaminy
50% redukcja objawów
Efekt utrzymywał sięprzez 5-10 lat
90-95% komórek zamiera po przeszczepie
Na 1 pacjenta potrzeba 6 płodów
www.stemcells.nih.gov
![Page 49: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/49.jpg)
Udar mózgu oraz uszkodzenia rdzenia
kręgowegoPodanie dożylne
Angiogeneza, neurogeneza, regeneracja funkcjonalna
Wydzielają czynniki neuropoezy www.rsna.org
![Page 50: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/50.jpg)
Zęby
Badania na myszach
SC z miazgi zębów mądrości
15 – 20% miało prawidłowy układ tkanek
Ograniczenia: Źródło Rozwój w szczęce
dorosłego Tworzenie korzeni Przewidywalna wielkość
i kształt
Świat nauki 9/2005
![Page 51: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/51.jpg)
Hodowla narządów
Nerka: Autologiczna Na kolagenowym
rusztowaniu Po 12 tygodniach
produkowała mocz
Wątroba
Pęcherz moczowy
www.obgyn.net
![Page 52: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/52.jpg)
CD34+ 2,5% marker SCCD133+ 1,1% marker SCCD33+ 45% marker komórek
hematopoetycznychCD71+ 6% marker limfocytówCD105+ 0,7% marker komórek
szpikuCD19+ 24% marker limfocytów BCD14+ 7,8% marker monocytówCD3+ 34% marker limfocytów T
![Page 53: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/53.jpg)
![Page 54: Hodowle tkankowe, komórki macierzyste](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081503/5681472c550346895db465f6/html5/thumbnails/54.jpg)