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効率的なHPLCメソッドの開発手法‐ 基礎から最新手法まで

アジレント・テクノロジー（株）

LC Method Dev/JAIMA Show 2008

Sep/3/2008

HPLCメソッド開発の流れ

メソッドのゴールを決める

メソッドのパラメータをスクリーニングするカラム-固定相の選択移動相-有機溶媒、緩衝液とpH、組成グラジエント条件カラム温度ラ温度検出条件

スクリーニング結果をもとにメソッドを最適化クリング結果をもとにソッドを最適化

メソッドの頑健性を評価

メソッドバリデーション


Sep/3/2008

HPLCメソッド開発で遭遇する問題

カラム、移動相のスクリーニングに時間がかかる

分離、感度、併行精度はOKでも、堅牢性（室内/室間再現性）でNG→スクリーニングのやり直し

経験が頼り

効率的なHPLCメソッド開発のために、

ロジカルにスクリーニングを行なうことは可能か？

カラム、移動相のスクリーニングに必要な基礎知識について

スクリーニングやメソッド最適化を自動化できないか？

メソッド開発を支援する最新技術について


Sep/3/2008

メソッド開発を支援する最新技術について

HPLCメソッド開発のパラメータ（分離条件）

カラム

• 分離モード

結合相

移動相

• 緩衝液のpH• 結合相

• 充てん剤の粒径

• 内径、長さ

• 有機溶媒

• 添加剤

サンプル

•測定対象化合物の性質

溶解性

イオン性イオン性

分子量

•マトリックス


Sep/3/2008

移動相条件のスクリーニング（分離条件）

選択性保持時間の再現性ピーク形状

カラム

• 分離モード

結合相

移動相

• 緩衝液のpH• 結合相


• 内径、長さ

• 有機溶媒

• 添加剤

サンプル


溶解性


分子量



Sep/3/2008

pHによるイオン性化合物の保持の調節－メソッド開発のキーポイント－メソッド開発のキポイント

荷を持な合物解離な合物く保持されす• 電荷を持たない化合物（解離していない化合物）は、よく保持されます

(低pHでの酸性化合物や高pHでの塩基性化合物）。

• シリカゲル表面のシラノールは中性領域で解離し、塩基性化合物の保持

を強めます（イオン交換相互作用）を強めます（イオン交換相互作用）。

• 保持と選択性を最適化するために、移動相のpHとカラムを選択します。保持と選択性を最適化するために、移動相のpHとカラムを選択します。


Sep/3/2008

移動相のpHによる溶出挙動化合物の特性による違い

イオン性化合物は、pHにより電荷状態が変化-疎水

性が変す保持‐化合物の特性による違い

非極性極性イオ性

性が変化するため、保持が変化する。

非極性極性イオン性naphthalene benzyl alcohol benzoic acidacenaphthene nitrobenzene benzanilide

pH 3

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8

pH 7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Time (min) Time (min) Time (min)


Sep/3/2008

シラノール基とイオン性化合物の相互作用

イオン交換

SiO_ Na+ + R3NH+ SiO_･･･+NHR3 + Na+

解離したシラノール (SiO-) はプロトン化した塩基 (R NH+) とイ解離したシラノール (SiO ) は、プロトン化した塩基 (R3NH+) とイ

オン交換相互作用を示し、塩基性化合物のテーリングや分析精度の低下をもたらします。この現象は、シラノールが解離している中性領域の移動相でよくおこりまする中性領域の移動相でよくおこります。

SiOH + RCOO_ SiO_･･･H+

･･･_OOCR

水素結合

解離した酸はシラノールと水素結合による相互作用を示します。


Sep/3/2008

スクリーニングのスタートに最適な低pH移動相そのメリット- そのメリット

• 酸性化合物は解離していないため、保持が強くなります。

• シラノール基が解離していないため、塩基性化合物とのイ

オン交換相互作用が小さくなります。

良好なピーク形状

優れた再現性

• 利用しやすい緩衝液、添加剤が多くあります。

緩衝能のある移動相を使用して緩衝能のある移動相を使用して

低pHの移動相から検討を開始しましょう


Sep/3/2008

低pHの移動相による固定相の2次相互作用の低減－塩基性化合物の分離塩基性化合物の分離

カラム：ZORBAX Eclipse XDB-C8, 4.6 x 150 mm, 5μm 移動相：25 mM Na2HPO4/ACN = 85/15 流量： 1.0 mL/min, カラム温度： 35℃試料試料：1. Phenylpropanolamine 2. Ephedrine 3. Amphetamine

4. Methamphetamine 5. Phenteramine

11

pH 3.0USP TF (5%)

4 1 33

pH 7.0USP TF (5%)

4 2 3532

1

54

32

4. 1.33 4. 2.3554

Ti ( i )0.0 2.5 5.0

Ti ( i )0.0 2.5 5.0

Time (min)Time (min)

移動相のpHを下げるとピークテーリングの原因となるシラノール基との相互作用を低減できます。


Sep/3/2008

シラノル基との相互作用を低減できます。

低pHの移動相による固定相の2次相互作用の低減－酸性化合物の分離酸性化合物の分離

pH 4 4 pH 3 0C(CH3)HCOOH

pH 4.4 pH 3.0

f

CH2CH(CH3)2

IbuprofenpKa = 4.4

Time (min)0 2 4 6 8 10

Time (min)0 2 4 6 8 10

カラム：ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 μm移動相：5 mM KH2PO4 / ACN = 40/60流量：１.0 mL/min


Sep/3/2008

中性領域の移動相を用いるメソッド

中性領域の移動相を検討するケースは

• 対象化合物が低pHで不安定なとき

• サンプルの溶解性が中性領域で改善されるとき

塩基性化合物の保持を大きくしたいとき• 塩基性化合物の保持を大きくしたいとき

• pH 3 – 8で選択性が改善されるとき

残存シラノールが完全に解離していることを忘れずに！


Sep/3/2008

中性領域の移動相による分離の改善

ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4.6 x 75 mm, 3.5 μm

pH 33

pH 7

1 34

21

24

0 1 2 3 4 5Time (min)

0 5 10 15 20Time (min)

移動相：20 mM phosphate buffer/MeOH 80/20 流量：1.0 mL/minカラム温度：室温検出：UV 254 nm 試料 1 Nizatidine 2 Famotidine 3 Cimetidine 4 Pirenzipine

Time (min) Time (min)

試料： 1. Nizatidine 2. Famotidine 3. Cimetidine 4. Pirenzipine


Sep/3/2008

高pHの移動相を用いるメソッド

高pHの移動相を検討するケースは

• 対象化合物が酸性、中性では溶解しないとき

• 対象化合物が酸性、中性では不安定なとき

• 塩基性化合物を遊離塩基として分析し保持を大きくしたいとき

• 選択性を改善したいとき

適用可能な充てん剤が限定されます


Sep/3/2008

高pHの移動相による保持の増加と選択性の改善抗ヒスタミン剤の分析‐ 抗ヒスタミン剤の分析 ‐

カラム： ZORBAX Extend-C18, 4.6 x 150 mm, 5 μm 移動相：図中流量 1 0 mL/min カラム温度室温検出 UV 254 nm

pH11で連続使用可能なシリカ系ODS

流量：1.0 mL/min カラム温度：室温検出：UV, 254 nm 試料： 1. Maleate 2. Scopolamine 3. Pseudoephedrine

4. Doxylamine 5. Chlorpheniramine 6. Triprolidine7. Diphenhydramine

pH 7, 20 mM Na2HPO4/MeOH=30/70 pH 11, 20 mM TEA/MeOH=30/70

2 34 7 4 7

12,3

51

3

5tR = 8.5 tR = 11.45

6 26

サンプル中の塩基性化合物の保持は高pHで増大し、選択性も変わります

0 5Time (min)

0 5 10Time (min)


Sep/3/2008

サン中塩基性化合物保持高p 増大、選択性も変わります

移動相（緩衝液）のpH安定した保持時間と

充てん剤の

耐アルカリ性

BC

間

安定した保持時間と良好なピーク形状

耐アルカリ性に留意

B保

持時

間

pKa ± 1.5

A

化合

物の

• 保持時間が変動しやすくなります• ピーク形状が悪くなることがあります

塩基

性化

pKa

pH2 3 4 5 6 7

弱

pH

対象化合物のpKaを考慮して、

十分な緩衝能をもつ緩衝液を選択することが重要で


Sep/3/2008

十分な緩衝能をもつ緩衝液を選択することが重要です

有機溶媒の選択

カラム： ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18, 4.6 x 50 mm, 1.8 μm 移動相：A； 25 mM NaH2PO4 , pH 3.0 B；有機溶媒流量： 2.0 mL/min カラム温度：30℃ 検出：UV 240 nm 試料：1 Pindolol 2 Disopyridamide 3 Propranolol 4 Diltiazem 5 Dipyridamole

mAU

100

120

140

3 4

試料：1.Pindolol 2. Disopyridamide 3.Propranolol 4.Diltiazem 5. Dipyridamole

5

1

20

40

60

80 250% MeOH (2,3), (3,4), (4,5)の分離度が良好

ピーク 5の選択性がACNと異なる

1 2 3-20

0

mAU140 1 3

45

60

80

100

120

140

30% ACN1

2

3(1,2)の分離度が良好

有機溶媒を変えると溶出力だけでなく

-20

0

20

40

60 有機溶媒を変えると、溶出力だけでなく選択性も変化します


Sep/3/2008

1 220

移動相のスクリーニングでのポイント

• 化合物の性質‐イオン性の有無、pKa、溶解性、安定性を考慮します。

• イオン性のある化合物では、残存シラノール基との相互作用を考慮して

移動相のpHを検討します。

• 測定する化合物のpKa ±1.5の範囲内のpHでは、保持時間の変動や

ピーク形状の変化が起こりやすくなります。

• 有機溶媒の種類は、溶出強度だけでなく選択性にも影響します。


Sep/3/2008

カラムのスクリーニング

選択性分析時間耐久性

ト間再現性カラム

• 分離モード

結合相

移動相

• 緩衝液のpH

ロット間再現性

• 結合相


• 内径、長さ

• 有機溶媒

• 添加剤

サンプル


溶解性


分子量



Sep/3/2008

シリカベースのカラムの耐久性と移動相のpH

シリカベースの逆相カラムの劣化メカニズムは移動相のpHで異なります

低pH領域

• 化学結合相が加水分解により脱落していきます化学結合相が加水分解により脱落していきます。加水分解は高温でより早く進行します。

加水分解はアルキル鎖の短い化学結合相（C3, CN, Ph)でより早く進

行します。

中性領域から高 H領域中性領域から高pH領域

• シリカが溶解します。溶解はシラノル基が起点となります溶解はシラノール基が起点となります。

移動相のpH範囲で最も耐久性のあるカラムを選ぶことが重要です


Sep/3/2008

移動相 p 範囲最も耐久性あるラを選ぶ重要す

逆相系化学結合相の選択

C18 大きな保持を示し、広範囲な化合物に適合します。大きな保持を示し、広範囲な化合物適合します。

C8 C18に比べて保持は弱いですが、多くの場合選択性は非常に似ています C18よりも迅速な分析が可能非常に似ています。C18よりも迅速な分析が可能。

Phenyl 保持はかなり弱いですがπ-π相互作用による特異的な選択性が期待できますな選択性が期待できます。

C3 疎水性の弱い化合物やC18, C8で回収率の悪い化合プ物など（タンパク質、ペプチドの一部）に向いています。

CN 保持はかなり弱く、アルキル基の結合相とは異なる選択保持り弱、結合相異選択性を示します。


Sep/3/2008

逆相系化学結合相の選択

シールド型充てん剤ドが• 極性基（アミド基など)を含む化学結合相が用いられています。

• 塩基性化合物のテーリングが小さい特性があります。

• C18、C8とは異なる選択性を有しています。C18、C8とは異なる選択性を有しています。

AQタイプ• 化学結合相もしくはシリカ表面に特殊な処理を行い、高親水性化合物を

保持しやすくしています。

• 水もしくは緩衝液100%で使用可能です• 水もしくは緩衝液100%で使用可能です。

• 極性が大きく異なる化合物の混合物をバランスよく溶出させられます。


Sep/3/2008

化学結合相による選択性の違い

1 2ZORBAX Eclipse XDB-CN 移動相：水/ACN = 65/35

min0 5 10 15 20

3 4 56 7

移動相：水/ACN 65/35カラムサイズ： 4.6 x 150 mm, 5 μm流量：2 ml/min試料注入量：2 μLカラム温度： 25℃

12

3

4,5

6 7

ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl 移動相：水/ACN = 52/48

カラム温度： 25℃検出：UV, 210 nm

試料：

0 5 10 15 2051 2

346 7

ZORBAX Eclipse XDB-C8 移動相：水/ACN = 46/54

1. Estriol (0.00130 μg/μl), 2. b-Estradiol (0.00130 μg/μl), 3. Ethinyl Estradiol (0.00147 μg/μl), 4. Dienestrol (0.00123 μg/μl),

0 5 10 15 20

6 7

4

1 23 5 ZORBAX Eclipse XDB-C18

5. Diethylstilbestrol (0.00128 μg/μl) 6. Ethynylestradiol 3-methyl ether (0.00103 μg/μl) 7. Ethynodiol Diacetate (0.00139 μg/μl)

0 5 10 15 20

1 26 7移動相：水/ACN = 40/60


Sep/3/2008

高速HPLCを利用したメソッド開発の迅速化/コストダウンZORBAXのスケラビリティZORBAXのスケーラビリティ

ZORBAX RRHT （粒径 1.8 μm）で迅速なメソッド探索ZORBAX RRHT SB-C18, 4.6 mm × 50 mm, 1.8μmZORBAX RRHT SB C18, 4.6 mm × 50 mm, 1.8μm

コンベンショナルLC用のカラム（粒径 5 μm）に変換コンベンショナルLC用のカラム（粒径 5 μm）に変換ZORBAX SB-C18, 4.6 mm × 150 mm, 5 μm

粒径だけが異なるイプをも粒径だけが異なるラインアップをもつカラムファミリーが有効です


Sep/3/2008

カラムのスクリーニングでのポイント

• 測定する化合物の性質を考慮します。

• スタートはC18から行なうのが一般的です。

• シラノール基との相互作用が考えられる場合はエンドキャップさ• シラノール基との相互作用が考えられる場合は、エンドキャップされている充てん剤か、シラノール基との相互作用が起こらない移動相条件で安定な充てん剤を選択します。

• 化学結合相の種類により選択性を大きく変えることが可能です。

高速分析用カラムを利用することで所要時間の短縮が可能です• 高速分析用カラムを利用することで所要時間の短縮が可能です。ただし、カラムの圧損、スケーラビリティに注意が必要です。


Sep/3/2008

サンプル調製でのポイント

• 固形物は必ずろ過してください。

• 必要な定量下限（検出下限）が満足できる範囲でできるだけ少量のサンプルを注入してください。のサンプルを注入してください。

サンプルの過負荷はカラム効率の低下を招きます

サンプルは移動相か移動相にできるだけ近い組成の溶媒に溶解• サンプルは移動相か移動相にできるだけ近い組成の溶媒に溶解してください。

サンプル溶媒の組成によってはピークの変形などが起こります溶媒組成ク変な起りす

• 温度や光に敏感な化合物には温度管理や遮光が必要です。


Sep/3/2008

注入サンプルの溶媒効果

カラム：ZORBAX SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 μm 移動相：水/ACN＝82/18カラム ZORBAX SB C8, 4.6 x 150 mm, 5 μm 移動相水/ACN 82/18試料注入量：30 μL 試料：1. Caffeine 2. Salicylamide

溶解相溶解

1

A. 100%ACNに溶解したサンプルを注入

B. 移動相に溶解したサンプルを注入

2

1

2

0 10Ti ( i )

0 10Ti ( i )

移動相より溶出力の強い溶媒で溶解したサンプルを注入するとピーク割れやピークのブロードニングような問題が生じます。

Time (min) Time (min)


Sep/3/2008

ク割クグうな問題す。

メソッド開発で遭遇する問題の解決


できます！できます！

– メソッドの基本要素‐カラム、移動相、サンプルの特性を理解しておくことがポイント解しておくことがポイント

スクリーニングやメソッド最適化を自動化できないか？スクリーニングやメソッド最適化を自動化できないか？

スクリーニング：検討するパラメータ数が多い

時間がかかる作業です時間がかかる作業です

メソッドの最適化：条件を変えながら分離度を確認し進めていく

経験が必要な上に時間がかかります経験が必要な上に時間がかかります

堅牢性試験：試験するパラメータが多い

内容は単純ですが時間がかかります


Sep/3/2008

内容は単純ですが時間がかかります

Agilent 1200 LC Method Development Solution


Sep/3/2008

Agilent 1200 LC Method Development Solutionシステムの概要‐ システムの概要

最大12種類の緩衝液を選択可能最大8種類のカラムを選択可能

最大3種類の有機溶媒を選択可能

最大288条件を設定可能で最大288条件を設定可能で、分析条件のスクリーニングを自動化！


Sep/3/2008

さらに進んだメソッド開発の自動化

カラム、移動相のスクリーニングが終わったら

• スクリーニングの結果から選んだメソッドの最適化

• 最適と判断したメソッドの頑健性試験

これらを自動化できれば、メソッド開発のほとんどを自動化できます

Agilent 1200 Method Development Solutionは下記ソフトウェアとg p連携し、さらに進化したメソッド開発の迅速化、自動化を実現します。

ChromSword Auto AutoChrom


Sep/3/2008

ChromSword Autoの概要

最高の分離メソッドを自動で開発（Autoモード）

最適な系を探す最適な系を探す分析カラム移動相(pH,有機溶媒,温度・・）

スクリーニング（迅速）

最適な組み合わせを判断

オプティマイズ（詳細）

メソッド最適化アイソクラティック 5～25回グラジェント 6～10回

クロマトグラムの予測（Off Li モド）

グラジェント 6～10回

クロマトグラムの予測（Off -Lineモード）

• 化合物の構造式＋カラムデータベースから• 予備試験結果から Distributed by


Sep/3/2008

予備試験結果から Distributed by

ChromSword AutoとAgilent 1200 HPLC

HPLCコントロール分析実行分析実行

データ取得

ド自動開発

デタ取得

A il t 1200 HPLCメソッドの自動開発：ChromSword Auto 3.5頑健性の自動評価：AutoRobust

Agilent 1200 HPLC

Distributed by


Sep/3/2008

Distributed by

ChromSword Auto－オプティマイズの一例

Distributed by分析時間が短くより堅牢なメソッド


Sep/3/2008

Distributed by分析時間が短く、より堅牢なメソッド

ChromSword Auto

利点

メソッド開発にかかる時間を劇的に短縮（1日）

より多くのピークを分離最高の分離メソッドより多くのピークを分離、最高の分離メソッド

開発過程の報告書を自動作成（Word形式）

注意点

メソッド開発の基礎は必要です

メソッド開発者による最終的な判断は必要ですメソッド開発者による最終的な判断は必要です

Distributed by


Sep/3/2008

Distributed by

メソッド開発で遭遇する問題の解決


できます！

– メソッドの基本要素‐カラム、移動相、サンプルの特性を理解しておくことがポイント

スクリーニングやメソッド最適化を自動化できないか？

できます！

– Agilentが最新のソリューションでバックアップ


Sep/3/2008

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