HPLC 기초개론

Contents

Ⅰ. HPLC 기초 이론

Ⅱ. HPLC 시스템의 구성

Ⅲ. 분리모드에 따른 컬럼 선택

Ⅳ. 이동상 용매

(용매의 선택 및 준비)

Ⅰ. HPLC 기초 이론

Chromatography

Chromatograph

Chromatogram

System / Instrument System / Instrument

Chemical separation technique Chemical separation technique

Electronic results of chromatographic separation

Electronic results of chromatographic separation

Chromos (colour) + graphein (write) : in Greek

Chromatography…

혼합된 시료성분이 이동상 과 고정상 사이를 흐르면서 흡착, 분배, 이온교환

또는 분자크기 배제작용 등에 의해 각각의 단일 성분으로 분리되는 것을

말한다. 분리, 정성, 정량 등의 분석목적과 분리, 정제, 분취 목적에 이용된다.

cba

abacbc ccbbaa

Injection Interaction Elution

Mobile Phase – carries the sample through the stationary phase as it moves through the column

Stationary Phase – the phase which remains fixed in the column, e.g. C18, Silica

flow

History of Chromatography

Separations

Separation 은 고정상과 이동상 사이에서의 이동의 차이에 의해서 이루어진다.

Chromatography의 분류

Chromatography

Gas Chromatography Liquid Chromatography Supercritical Fluid Chromatography

Gas-Solid Gas-Liquid

Adsorption Partition Ion Exchange Size Exclusion Affinity

Gel Filtration Gel Permeation

Separation Technique

I have two separation techniques in my lab,

High Performance Liquid Chromatography and Gas Chromatography. Which should I use?

HPLC?GC?

Comparison of HPLC and GC

Comparison of HPLC and GC

HPLC GC

Volatility- 휘발성이 요구 되지 않음- 샘플은 이동상에서 용해성을 가져야 함

휘발성

Polarity 극성 및 비극성 화합물의 분리 비극성 및 극성 화합물

ThermalLability 분석은 상온에서 일어남 고온의 주입구 및 컬럼에서 열적 안정성을 가져야 함

MolecularWeight이론적인 한계치 없음 (실제적으로, 용해성에 제한됨)

분석 가능 Mw의 범위가 좁다 : < 500 amu

Preparation샘플은 필터해야하고, 이동상과 같은 용매에 녹아야 함

용매는 휘발성을 가져야 하며, 일반적으로 분석대상물질보다 B.P 가 낮아야 함.

Size 샘플량은 컬럼의 내경에 따름 일반적으로 1~5 uL

Separation Mechanism 고정상과 이동상 사이에서 일어남. - 이동상은 단지 샘플을 이동시키는 역할- 고정상과 샘플의 친화력

Detectors 일반적으로 UV-VIS 검출기 사용 일반적으로 FID 를 비롯하여, 대부분의 유기물 분석

Modes of High Performance Liquid Chromatography

흡착(Adsorption) : Normal phase

분배(Partition) : Reverse phase, Normal phase

이온교환(Ion exchange) : Ion Exchange

분자체(Size exclusion) :

Gel Permeation Chromatography(GPC)

Gel Filtration Chromatography(GFC)

Modes of High Performance Liquid Chromatography

Types of Compounds Separated

Mode Stationary Phase Mobile Phase

NaturalsWeak AcidsWeak Bases

Reversed-Phase C-18, C-8, C-4, C-2 Water/Organic Phase

Ionics, Bases,Acids

Ion-Pair C-18, C-8 Water/Organic Ion-Pair Reagent

Compounds insoluble in water, Organic Isomers IonicsInorganic ions

Normal-Phase Silica, Amino, Cyano, Diol Organics

IonicsInorganic ions

Ion ExchangeAnion or CationExchange Resin

Aqueous/BufferCounter Ion

High MW Compounds Polymers Size Exclusion

SilicaStyrene

Divinylbenzene

Gel Filtration-Aqueous Gel Permeation-Organic

Normal Phase Liquid Chromatography

Functional groups의 polarity에 의한 분리 작용

일반적으로 비수용성, 비극성 용매를 사용하며 극성이 낮은 시료부터 용리

고정상으로 사용되는 고체 흡착제의 표면과 이동상으로 사용되는 액체에 대한

친화력의 차이가 분리를 좌우

Si-OH

Si-OH--OH

O

Hexane

polar

극성 컬럼 극성 높은 시료

극성 낮은 시료

Normal Phase Liquid Chromatography

Columns

Silica(Adsorption)

Cyano(Bonded Phases)

Amino

Diol

Mobile Phase

Organic Solvents

Good For

Mixtures of structural isomer compounds not readily soluble in organic/water mobile phases

Normal Phase Liquid Chromatography –separation principles

Reverse Phase Liquid Chromatography

가장 일반적인 chromatography technology

고정상으로 사용되는 고체 지지체의 표면 액상과 이동상으로

사용되는 액체에 대한 분배력의 차이에 따라 분리되는 원리

Bonded phase의 개발로 고정상에 대한 이동상의 조성변화,

이동상 변형제 첨가 등 다양한 응용상의 변화가 가능하게 됨으로써

널리 사용하게 됨.

Reverse Phase Liquid Chromatography

Columns

C8-Octyl Silyl

C18-Octadecyl Silyl

Cyanopropyl

Aminopropyl

Polymer-based

Mobile Phases

water with:

Methanol

Acetonitrile

Isopropanol

Tetrahydrofuran

Partitioning mechanism related to analyte solubility in mobile & stationary phase

Less water soluble more retention

As the number of carbon atoms increases more retention

Unsaturation decreases retention

용출순서

Polar Non-polar compound

Reverse Phase Liquid Chromatography

Bonded compound (C18, C8, CN, Ph)와

분석 물질간의 상호작용에 의한 분리

고정상은 다공성 지지체에 화학적으로 결합되어 있음

일반적으로 극성 용매 사용하며 비극성이 큰 물질이 나중에 용리됨

-Si-O-Si-C18 -

OH

Acetonitrile(CH3CN-H2O)

non-polar

Reverse Phase Liquid Chromatography –Predict the Elution Order

1. benzene2. benzoic acid3. toluene4. phenol

2 1 43

1. n-hexanoic acid2. propionate3. n- butyric acid4. valeric acid

12 3 4

Useful Solvents for Reversed-Phase Chromatography

Reverse phase 에서 이동상으로 사용되는 용매

- Water

- Methanol

- Acetonitrile

- Isopropanol

- Dioxane

- Tetrahydrofuran

- Mixed Solvents(from above)

Elution Strength

Increase the Organic Modifier Content to Decreases Retention

Ion Exchange Chromatography

이온화도 차이에 의한 분리

이온성 화합물 및 무기이온의 분리에 사용

Electrostatic force 이용

Polystyren or Silica gel 표면에 이온성을 가진 화합물을

화학적으로 결합한 고정상 사용

이동상으로 완충액(Buffer solution) 사용

시료의 분리는 pH, 이온 세기, 이동상에 포함된 이온 종류의

영향을 받음

Ion Exchange Chromatography

+

+

+

++

-- -

-- --

counter ion

sampleResin

이온 친화력에 의하여 분리하며 용매의 농도에 따라 분리도가 달라짐.

Ion Exchange Chromatography

Separation of Weak Acids

Ion-Pair Reversed-Phase HPLC for Strong Acids and Bases

Buffer Solution의 사용 목적

• 이온성 시료일 때 이온억제 및 이온쌍 형성

• 생리 활성물질의 순수 분리, 정제 시 pH조절

• 이온성 물질 분리 시 이온강도 조절

Size Exclusion Chromatography

Mechanism:

Elution order is a function of molecular size

Stationary Phases

Cross-linked gels with defined pore size

Be certainly non-interactive with sample

Mobile Phases

Aqueous solvents - Gel Filtration

Organic solvents - Gel Permeation

Size Exclusion Chromatography

충전제 : Styrene, divinylbenzene

일정크기의 pore를 가진 충전물을 사용

분리원리

- 물리적인 분리방법

- 경로차에 의한 분리

- 큰 분자가 먼저 용출되고 작은 분자가 나중에

용출됨

응용 : 고분자의 분자량 및 분자량 분포도를

구함

Molecular Weight Determination by Size Exclusion

Separation Parameter

컬럼 고정상의 선택

컬럼 길이와 직경

이동상 조성

온도

유속

샘플량

Chromatography parameter

t2R

t1R

t’1Rt0

△t

W1 W2Inject

K’ = t’1R

t0

α = t’2R t’1R

R =2 △t

W1 +W2

t’2R

The Goal of separation – Resolution between sample components

tR(B)

tR(A)

t’R(B)t0

△t

WA WB

분리도는 두 피크의 분리된 정도를 간단히 표시해 주는 값

Baseline에서 분리되는 경우 R값은 1.5

피크간 머무름 시간 차이가 클수록, 띠 폭의 평균값이 작을수록 R 값 증가

△tW

△t

2/(WA + WA)

2△tWA + WA

= =

Factors Influencing Resolution

Selectivity Efficiency Capacity

K’

1+K’

α-1

α(N)R =

t2R

t1R

t’1Rt0

△t

W1 W2Inject

t’2R

α =

t’2R t’1R

Chromatographic Parameter : Selectivity Factor

=

t2R – t0

t1R – t0

Selectivity Factors: 컬럼에서 용출되는 각 성분의 분리의 차이

선택성을 바꾸기 위해서는..

이동상 조성의 변화

다른 이동상 종류 선택

이동상의 pH 변화

컬럼 온도 변화

이동상 첨가제 첨가

고정상의 변화

t’2R t’1R

a > 1.2 : 분리능이 있다.a = 1 : 분리능이 없다.

Parameters which will affect selectivity

용매세기가 센 이동상은 분석물질을 컬럼에서 빨리 용출시킴

용매세기가 약한 이동상은 분석물질의 분리를 향상시킬 수 있으나,

분석물질은 컬럼에서 오래 머무르게 됨.

Chromatographic Parameter : Capacity Factor

t2R

t1R

t’1Rt0

△t

W1 W2Inject

t’2R

K’ = t’1R

t0

Capacity Factor

K’은 시료의 머무름을 나타내는 지표

(시료와 고정상이 얼마나 강하게 상호작용 하는가를 나타냄)

단일 용매를 이용한 분석인 경우 K’은 2~10, 보통 2~6이 최적값

용량인자(R)은 이동상 조성, 온도 및 컬럼의

종류에 따른 특정 성분의 특성임.

t’1R t0

=

Capacity Factor

피크의 용량인자를 변화할 수 있는 가장 좋은방법은 이동상 조성의 변화

이동상의 세기를 증가시키면 용리액의

용량인자는 감소함.

역상에서, 유기용매의 10% 증가는 피크의

용량인자를 2배 혹은 3배 감소시킨다.

Chromatographic Parameter : Efficiency

Calculating Efficiency

N(Theoretical plate)은 이론단수라 함. 컬럼의 효율을 의미함

HETP(the Height Equivalent to a Theoretical Plate)

- 이론단해당높이. 시료분자가 이동상과 고정상 사이에서 평형에 도달하는데 필요한 컬럼의 길이임.

- 낮은 값을 가질수록 컬럼 효율 높음

N = 16( )2tRWb

=tRW1/2

HETP = L/N

Ⅱ. HPLC System의 구성

TCC

HPLC System의 구성

Injector Column DetectorData

SystemPumpDegasser

1. 탈기장치(Degasser)

2. 펌프(Pump)

3. 시료주입기(Injector)

4. 컬럼(Column)

5. 컬럼 온도 조절기(TCC: Thermostatted Column Compartment)

6. 검출기(Detector)

TCC

탈기(Degassing)

1. 목적 : 이동상 중의 용존 산소, 질소,

기포 등을 제거

2. 방법 : He sparging

Vacuum (Filtration)

Ultra-sonication

On-line Degassing

Vacuum pump

Vacuum Chamber

Solenoid Valve

Control Assembly

A B C D

On-line Degasser의 원리

Solvent 가 membrane tube 를 지나면서 gas는제거하고, liquid는 통과시키면서 일정한 진공 상태를 유지함

Pump

1. 역할 : 이동상을 이동상 저장용기에서 끌어내어

시료 주입기로 연속적으로 밀어주는 역할

2. 요건 :

- 일정한 유속과 압력을 유지할 것

- 다양한 용매를 사용할 수 있을 것

3. Isocratic 및 Gradient

- Isocratic : 분석시간 동안 이동상 조성의 변화 없음

- Gradient : 분석시간 동안 이동상 조성이 시간의

흐름에 따라 변함

Isocratic pump

To ALS and

Column

Waste

Purge valve

Outlet valve

ActiveInlet valve

Damper

QA/QC의 응용에 맞는 설계

Binary pump

Inlet valve

Inlet valve

Outlet valve

Outlet valve

Damper

Waste

Purge valve Mixer

High-pressure 혼합 원리에 의해 설계

Quaternary pump

용매 혼합의 최고의 유연성을 제공

Vacuum chamber

Proportioning valve

Inlet valve

Waste

DamperPurge valve

Solvent bottles

Injector

1. 역할 : 분석하고자 하는 시료를 용매의 흐름에 실어 준다.

2. 종류

• 수동(Manual Injection Valve)

• 자동(Auto Injector)

Manual Injector

Autosampler – Mechanical Design

Robotic armwith vial gripper

Sample tray

Metering device

Sample loop

Injection valve

100 x 2ml vials tray

15 x 6ml vials tray

40 x 2ml vials tray

Auto Injector

From pumpTo column

Metering device

6-port valve

Sampling unit

To waste

Vial gripper

Standard loop volume : 300 µlTotal delay volume : 300 µl + VinjMinimal (bypass) delay volume : 6.2 µl

Widest dynamic injection range : 0.1 µl ~ 1.8 ml

Auto Injector

컬럼 온도 조절기(Thermostatted Column Compartment)

역할 : 분리능 향상 및 분석 결과의

재현성 보장을 위해 컬럼 온도를

적절하게 설정, 유지 한다.

컬럼 온도 조절기(Thermostatted Column Compartment)

Detector의 역할

역할 : 컬럼에서 분리된 시료가 일정한 간격으로

검출기를 통과할 때 시료의 존재 및 양을

일정한 규칙에 의해 인식하여 전기적인 신호

로 바꾸어 준다.

Detector의 종류

다파장 검출기(Multi Wavelength Detector)

가변파장 검출기(Variable Wavelength Detector)

다이오드어레이 검출기(Diode-Array Detector)

형광 검출기(Fluorescence Detector)

굴절률 검출기(Refractive Detector)

전기화학 검출기(Electrochemical Detector)

전도도 검출기(Conductivity Detector)

UV/vis DetectorUV/vis Detector

Agilent HPLC DetectorAgilent HPLC Detector

HPLC Detector의 특징

Detector Type SensitivitySelectivity Useful % of compoundsAdvantagesVWD ng/pg - 80 Low costDAD ng/pg ++ 80 Peak confirmationFluorescence pg/fg ++ 10 High sens.

Electro-chemical pg/fg + >20

High sens.

Conductivityng/pg - 10

Ion Chrom.

Refractive Index ug/ng - 100

Universalresponse

Mass Spectrometer ng/pg ++

UV/VIS Detector(VWD, MWD, DAD) 검출 원리

I0 I

Detector Cell

I0 = 입사광의 세기 ε = 몰 흡광도

I = 투과된 빛의 세기 b = 광로의 길이

A= 흡광도 c = 시료 농도

photodiode에 도달하는 특정파장의 빛의 양과 시료의 농도 사이의

관계를 나타내면,

Log I0/I = A = εbc

대표적인 발색단

Chromophore Structure λmax(nm)

Amine -NH2 195

Ethylene -C=C- 190

Ketone =C=O 195

Ester -COOR 205

Aldehyde -CHO 210

Carboxyl -COOH 200-210

Nitro -NO2 310

Phenyl 202, 255

Naphthyl 220, 275

UV/VIS Detector 종류와 구조

Variable Wavelength DetectorVariable Wavelength Detector

(VWD)(VWD)

Multi Wavelength DetectorMulti Wavelength Detector

(MWD)(MWD)

Diode Array DetectorDiode Array Detector

(DAD)(DAD)

UV/VIS Detector 종류와 구조

Variable Wavelength Detection(VWD) type

- 190~600 nm 사이의 모든 파장 중에서 원하는 파장을 지정하여 사용한다.

UV/VIS Detector 종류와 구조

Diode Array Detection(DAD) type

- 190~950 nm 의 전 파장을 동시에 scan 한다.

More uptime

Long life deuterium lamp

Extended Wavelength

Range

More Uptime

Fast Optimization of sensitivity and

resolution

Excellent wavelength resolution

Automated wavelength

verification & Calibration

Optical Design:Conventional vs. Diode-array Detector

Conventional Scanning Detector Diode-array Detector

Source Entrance slit

Concave grating

DAD

Flow cell

Source

Entrance slitExit slit

Flow cell

Detector

Concave grating

DAD 장점

신속한 전파장 스펙트럼 확인

다파장 검출

탁월한 파장 재현성

기기의 신뢰성

Fast scan

UV/VIS Detector 응용분야

Drugs : Amide(Quinidine)

Foods : Fatty Acid

Flavor : Flavone

Peptide & Protein

Vitamins : Retinol

Fluorescence Detector(FLD) 검출 원리

원리

- Excitation filter를 통과한 빛은 sample cell에 존재하는

시료 분자를 들뜬 상태로 만들어 주고 바닥상태로 떨어

지면서 흡수한 파장보다 긴 파장의 빛을 방출함

- 빛의 발광량 : 시료 농도에 비례

- 시료 : 분자 구조가 형광을 띠거나 형광 유도체를 만들었을 때

검출 가능

형광 물질

- Benzene 고리 치환물 중 작용기가 -OH, -OCH3, -H2, -F,

-NH(CH3), -N(CH3)2, -CO 등인 화합물

Fluorescence Detector 구조

Fluorescence Detector 응용분야

제약/임상 : 혈액 중 Quinidine과 그 대사물

생명과학 : 유도체화된 아미노산

환경 : Polynuclear aromatic hydrocarbons(PAH), carbamates

식품 : 비타민, Mycotoxin - Aflatoxin

Refractive Index Detector(RID) 검출 원리

원리

- 시료의 농도 변화에 따른 굴절률을 측정

- Cell은 sample cell과 reference cell로 구성되며

reference cell 은 이동상으로 채워지고 분석시간동안 이동상은

sample cell만을 통과하면서 흐름

응용 범위

- 굴절률에 의하여 분석하므로 거의 모든 물질에 사용할 수 있으나

주로 고분자, 당 등의 분석에 이용

- 일반적으로 UV/ Visible, Conductivity 검출이 어려운 시료에 이용

1. Flow in

2. Heater

3. Heater exchanger

4. Sample cell

5. Purge valve

6. Recycle valve

7. Waste container

8. Reference cell

9. Solvent bottle

Refractive Index Detector 구조

Optical Unit Design : RID

Tungsten lamp

Zero glassHeat exchangers

Flow cells

Mirror

Diodes

Refractive Index Detector 응용 분야

일반 화합물의 비선택적 검출

식품 분석 (예: 당, 지방 등)

폴리머 분석 (GPC)

Ⅲ. 분리모드에 따른 컬럼 선택

Columns

구성 :

- 관 모양의 용기에 충전제를 채워서 사용

- 분석하고자 하는 시료의 종류에 따라 컬럼의 크기 및

충전제의 종류를 선택하여 사용

역할 : 혼합 상태의 시료를 화학적 또는 물리적 특성에 따른

머무름 정도의 차이에 의해 분리

HPLC Column은?

여러 가지 물질을 각각의 성분으로 분리시키는 곳

입자 크기

1.8㎛, 3.5㎛, 4㎛, 5㎛, 6㎛, 7㎛, 10㎛, 37㎛, 55㎛, 75㎛

재질

Silica, Alumina, Silica-Bonded, Polymer(resin)-Bonded

형태 : Spherical, irregular

Pore 크기 : 50 Å ~ 300 Å

컬럼 선택 시 고려사항

화학적 요소 (선택인자 (a), 용량인자 (k))

• 충전제의 표면성질

• 이동상의 조성

물리적 요소 (이론단수(N))

• 충전용기의 내경, 길이, 재질

• 충전제의 입자 크기

• 충전제의 분포상태

HPLC에 사용되는 컬럼의 내경

Type 컬럼 내경(mm) 길 이(cm) 유 속(ml/min)

일반컬럼(Conventional)

4.0 – 4.6 15 – 30 1 – 2

고속분리용

(High Speed)4.0 – 4.6 4 – 10 2 – 4

Microbore – 2 2.0 15 – 30 0.5 – 1

Microbore – 1 1.0 15 – 100 0.03 – 0.06

Capillary

(Packed)0.2 – 0.5 10 – 200 0.001 – 0.01

컬럼 충전제의 종류

Base Material Examples/Varieties 사용비율

Silica gel

Polymer

Alumina

Others

High Surface area, wide pore

PolymethacrylatesPS-DVBPolyethyleneglycolPolydextrans

NeutralAcidic

Graphitized Carbon,Zirconia

75%

20%

2%

3%

Silica Column의 구조

Column

역상 크로마토그래피

ZORBAX C18(ODS)

ZORBAX C8

ZORBAX phenyl

고정상(비극성) 이동상(극성) 대상시료

C18, C8, C4, phenyl

-물

-물과 섞이는 이동상,

변형제

중성, 약산 및 염기성

용질 등

역상 크로마토그래피의 장점

이동상에 완충염(Buffer Salts), 이온쌍 시약과 같은 다양한 첨가제를

적절히 추가함으로써 비이온성, 이온성, 또는 이온화 가능한 시료를 분리

할 수 있음

소수성 결합상 컬럼(Hydrophobic Bonded Phase Column)은

재현성이 좋으며, 안정함

대부분의 유기화합물 분석이 가능

수용성 용매에 녹아 있는 시료는 직접 주입 가능

분리하고자 하는 시료 분자의 소수성 정도에 따라 용리 순서의

예측이 용이

순상 크로마토그래피

고정상(극성) 이동상(비극성) 대상시료

- 흡착

: Silica Gel,

Alumina

- 결합상

: Amino, Cyano,

Diol

- Hexane,

Methylene chloride,

Organic

- Steroid

- Aflatoxin

- Vitamin, fat-soluble

ZORBAX Rx-SIL

ZORBAX CN

ZORBAX NH2

이온 교환 크로마토그래피

고정상(극성) 이동상(비극성) 대상시료

- 음이온 또는 양이온

교환 수지

- Aqueous/ Buffer

Counter Ion

- 이온성 화합물 및

무기 이온류

ZORBAX SAX

ZORBAX SCX

ZORBAX WAX

크기 배제 크로마토그래피

겔침투

(Gel Permeation)

겔여과

(Gel Filtration)

고정상 : 다공성 Polystyrene, Silica Gel

• 이동상 : 지용성 • 이동상 : 수용성

• 응용 : 고분자 화학Alkyds Epoxies

Natural Rubber

Polystyrenes Silicones

Polyvinylchlorides

• 응용 : 생물 약품 화학Peptides

Structural proteins

Enzymes Lipids

Nucleic acids

HPLC Column Selection

컬럼의 취급과 보관법

Wash the column after use with selected solvents;

Flush highly retained sample components from the column.

Do not store the column in 100% water. Microbes may grow

and clog the column.

Don’t open the column and repack the material if you want to maintain

performance.

Use the column at its optimal flow rate - avoid high flow rate.

Do not operate silica or bonded phases for extended periods at high

temperature.

Keep the pH of the mobile phase in an appropriate range for the column.

Ⅳ. 이동상 용매(용매의 선택 및 준비)

용매 조건

모든 이동상 용매는 HPLC grade를 사용

초순수(18 ㏁이상)을 사용

측정하고자 하는 파장보다 낮은 UV cutoff를 가진

용매 사용

용매간 섞임성(miscibility No. 차 15미만)

분리하고자 하는 시료를 녹일 수 있어야 함

모든 용매는 반드시 여과 및 탈기하여 사용

낮은 점도

이동상은 고정상을 변화시키면 안됨

UV Cutoff of Common Solvents

Solvent UV Cutoff(nm) Solvent UV Cutoff(nm)

Water 180 N-Heptane 197

Methanol 210 Cyclohexane 200

N-Propanol 205 CCl4 265

Acetonitrile 190 Chloroform 245

THF 230 Benzene 280

Acetone 330 Toluene 235

Methyl acetate 260 Methylene chloride 232

Ethyl acetate 260 Tetrachloro-ethylene 280

Nitromethane 380 1,2-Dichloroethane 225

Solvent Miscibility

XyleneW

aterTolueneTetrahydrofuranPentaneM

ethanolIsopropanolIsooctanehexaneethanolEthyl acetatedioxaneDim

ethyl sulfoxideDiisopropyl etherDiethyl etherDichlorom

ethane1,2-dichlorom

ethaneCyclopentaneCyclohexaneChloroformCarbon tetrachloridet-B

utylmethyl ether

BenzeneAcetonitrileAcetoneAcetic acid

Acetic acidAcetoneAcetonitrileBenzenet-Butylmethyl etherCarbon tetrachlorideChloroformCyclohexaneCyclopentane1,2-dichloromethaneDichloromethaneDiethyl etherDiisopropyl etherDimethyl sulfoxidedioxaneEthyl acetate immisibleethanolhexaneIsooctaneIsopropanolMethanolPentaneTetrahydrofuranTolueneWaterXylene

immiscible

이동상 제조(I)

용매 준비

- HPLC grade의 용매

- 초순수(비저항값 ;18 ㏁)

- 계량 시 부피비로 계량 후 혼합

- 용매 성질에 따라 흡열, 발열 반응 가능

- 시일 경과 시 혼합 용매의 부피비가 달라질 수 있다.

• Filter– 수용성 필터(PVDF 재질)

• 물로 활성화한 후 사용– 지용성 필터(PTFE 재질)

• MeOH/적합한 용매로 활성화한 후 사용

이동상 제조(II)

이동상 제조(III)

탈기

이동상에 녹아있는 공기, 산소, 기포 제거

– Vacuum Degassing(진공탈기)

• 여과 + 탈기

– Helium Sparging

• 직접 이동상에 sparging

– Ultrasonication(초음파 파쇄)

– Online Degasser

HPLC 기초개론ContentsⅠ. HPLC 기초 이론Chromatography…History of ChromatographySeparationsChromatography의 분류Separation TechniqueComparison of HPLC and GC Modes of High Performance Liquid ChromatographyModes of High Performance Liquid ChromatographyNormal Phase Liquid ChromatographyNormal Phase Liquid ChromatographyNormal Phase Liquid Chromatography � –separation principlesReverse Phase Liquid Chromatography Reverse Phase Liquid Chromatography Reverse Phase Liquid Chromatography Reverse Phase Liquid Chromatography � –Predict the Elution OrderUseful Solvents for Reversed-Phase ChromatographyIncrease the Organic Modifier Content to � Decreases Retention Ion Exchange ChromatographyIon Exchange ChromatographyIon Exchange ChromatographySeparation of Weak Acids Ion-Pair Reversed-Phase HPLC � for Strong Acids and BasesBuffer Solution의 사용 목적Size Exclusion ChromatographySize Exclusion ChromatographyMolecular Weight Determination by Size ExclusionSeparation ParameterChromatography parameterThe Goal of separation � – Resolution between sample components Factors Influencing ResolutionChromatographic Parameter : Selectivity FactorSelectivity FactorsParameters which will affect selectivityChromatographic Parameter : Capacity FactorCapacity FactorCapacity FactorChromatographic Parameter : EfficiencyCalculating EfficiencyⅡ. HPLC System의 구성HPLC System의 구성탈기(Degassing)On-line Degasser의 원리PumpIsocratic pumpBinary pumpQuaternary pumpInjector Manual Injector Autosampler – Mechanical DesignAuto InjectorAuto Injector 컬럼 온도 조절기�(Thermostatted Column Compartment)컬럼 온도 조절기�(Thermostatted Column Compartment)Detector의 역할Detector의 종류HPLC Detector의 특징UV/VIS Detector�(VWD, MWD, DAD) 검출 원리대표적인 발색단UV/VIS Detector 종류와 구조 UV/VIS Detector 종류와 구조 UV/VIS Detector 종류와 구조 Optical Design:�Conventional vs. Diode-array DetectorDAD 장점 UV/VIS Detector 응용분야Fluorescence Detector(FLD) 검출 원리Fluorescence Detector 구조Fluorescence Detector 응용분야Refractive Index Detector(RID) 검출 원리Refractive Index Detector 구조Optical Unit Design : RIDRefractive Index Detector 응용 분야Ⅲ. 분리모드에 따른 컬럼 선택ColumnsHPLC Column은?컬럼 선택 시 고려사항HPLC에 사용되는 컬럼의 내경컬럼 충전제의 종류 Silica Column의 구조 Column역상 크로마토그래피역상 크로마토그래피의 장점순상 크로마토그래피이온 교환 크로마토그래피크기 배제 크로마토그래피HPLC Column Selection컬럼의 취급과 보관법Ⅳ. 이동상 용매�(용매의 선택 및 준비)용매 조건UV Cutoff of Common Solvents Solvent Miscibility이동상 제조(I)이동상 제조(III)