hplc sunum
TRANSCRIPT
HAZIRLAYAN: Eda AÇIKGÖZDANIŞMAN: Doç. Dr. Deniz YILDIZ
MUSTAFA KEMAL ÜNİVERSİTESİ (2010)
HPLC VE
BİYOKİMYA’DAKİ KULLANIM ALANLARI
HPLC NEDİR?
Yüksek hızda gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı sıvı kromatografi sistemlerine, Yüksek Basınç Sıvı Kromatografi (HPSC) denir.
Yüksek basınç altında sıvı olan hareketli faz ile katı olan sabit faz arasında maddelerin dağılma esasına dayanan ayırma yöntemidir.
HPLC’nin Çalışma Prensibi
Ayırma prensibi, karışımdaki bileşenlerin sabit faz üzerinde farklı zaman harcaması esasına dayanır.Sadece burada dikkat edilmesi gereken noktalar;çözücülerin mutlak suretle kabarcık oluşumunu engellemek için gaz gidericiden geçirilmesi gerektiği ve pompanın basınç değişikliklerini engelleyecek şekilde çalıştırılmasıdır.
YÜKSEK PERFORMANSI ARTIRAN KRİTERLER
Yüksek basınçta kolon doldurulması
Doğru, düşük hacimli enjektör kullanımı
Duyarlı düşük hacimli dedektörler
İyi pompalama sistemlerinin kullanılması
Dar bir dağılım aralığında çok küçük partiküllerin kullanılması (Uniformgözenek boyutu ve dağılımı)
Klasik Tekniklere Göre HPLC
Partikül boyutu çok küçük(3.5-10μm) matrikslerin kullanılması
Basınca dayanıklı paslanmaz çelik kolonların kullanılması
Yüksek iç basınç ve kontrollü akış hızı sağlanması
Örnek gereksinimin az olması
Sürekli akış dedektörleri ile küçük miktarların tayinine olanak sağlanması
Otomasyona müsait
Hızlı analiz imkanı
Yüksek ayırma gücü
HPLC’NİN KISIMLARI
POMPALAR
Eluent’in; enjektör, kolon ve dedektör boyunca sürekli sabit akışının kontrolünü gerçekleştiren üniteler
Akış hızına göre Standart bore sistemleri Preperatif pompa sistemleri
Pompanın yapıldığı malzemeye göre metalik
ametalik
Şırınga tip
Mobil faz iletme mekanizmasına göre Piston pompa
Microbore Pompa Sistemleri
ENJEKTÖR
HPLC donanımını oluşturan enjektör örneğin sabit faz (kolon) öncesinde mobil faza enjekte edilmesi için kullanılır. Elle kumanda edilen manuel ve bilgisayar kumandalı oto-enjektörler olmak üzere 2 çeşidi bulunmaktadır.
KOLON Modern HPLC donanımının 4 temel yapı taşından
birisi olan kolon, karmaşık örneklerde bileşenlerin birbirinden iyi çözünürlükle ayırımından sorumlu sabit fazdır.
Kullanılacak mobil fazın ve uygulanacak HPLC metodunun özelliklerine ve analizi yapılacak örneğin bilinen kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre seçilmelidir. Seçilecek kolonun HPLC uygulamasında kullanılacak akış hızı ve dolayısıyla oluşacak basınca dayanıklı olmasına dikkat edilmelidir.
Yüzeyde bulunan porların boyutu oldukça önemlidir. Uygulanacak olan örneğe göre bunu iyi ayarlanması gerekiyor.
KOLON
Kolon uzunluğu alıkonma (retention)
Akış Hızı: kolondaki partikül boyutuna bağlı ve ters orantılı.
Akış Hızı ve Kolon Uzunluğunu Etkisi
Kolondan elüe olan örnek bileşenlerinden alınan cevap doğrultusunda sinyallerin kromatogram üzerinde pik olarak ifade edilmesini sağlayan ünitelerdir.
DEDEKTÖR
UV-Görünür Bölge Dedektörleri -Sabit Dalga Boyu -Değişebilir Dalga Boyu -DiodeArray Floresan Dedektörler Refraktif İndeks Dedektörler Elektrokimyasal Dedektörler Radyokimyasal Dedektörler KondüktümetrikDedektörler Kütle Spektrometrik Dedektörler Evaporatif Işık Saçılım Dedektörler
HPLC’DE KULLANILAN BAZI DEDEKTÖRLER
A) Normal faz (Normal phase-NP) (ilk geliştirilen teknik, kolon polar, mobil faz apolardır, kullanılan kolonlar silica gel, cyano, amino, diol veya nitro kolonlardır)
B) Ters faz (Reverse phase-RP) (en sık kullanılan teknik, kolon apolar,
mobil faz polardır, kullanılan kolonlar C18, C8, C4, phenyl, TMS, Cyano’dur)
C) Ters faz iyon çifti (Reverse phase ion pairing-IP) D) İyon değişim (Ion exchange-IC) E) Size exclusion SEC (GPC/GFC) F) Kiral ayırım (Chiral separation)
HPLC ÇEŞİTLERİ
1. Basıncın artması Sorun HPLC cihazınızın karşıt basıncı sürekli olarak artmakta ve
başlangıç değerini % 10 aşmaktadır.Nedenler
**Giriş kılcal boruları tıkalı, kolon tıkalı, Detektör hücresi tıkalı olabilir.Tıkanıklıklar şu sebeplerden kaynaklanabilir:
- Mekanik kirlenmeler, pompa contalarında aşınma, enjektör valfındaki rotor pistonunun aşınması.
- Dökülen tampon tuzlar ve numuneler. - Bakteri üremesi ve çözelti içindeki diğer kirlenmeler.
HPLC’de Olası Problemler ve Çözümleri
Tıkanmanın olduğu yeri tespit etmeye çalışın Bunun için,
Pompa çalışır halde iken Pompa ile Detektör arasındaki tüm vida bağlantılarını açın.
Vidaları açarken Detektör ile başlayıp Pompa’ya doğru ilerleyin.
Burada basıncın belirgin şekilde nerede düştüğüne dikkat edin. Gerekirse tıkalı kılcal boruları değiştirin.
Şayet sebep süzgeç veya filtreler ise, bunların yenilenmesi veya değiştirilmesi gerekir.
HPLC’de Olası Problemler ve Çözümleri
2. Çözünürlüğün azalması veya düşük ayrım etkisiSorun: Kromatogramda elde ettiğiniz çözünürlük giderek
kötüleşmekte, pikler gittikçe genişlemektedir. Pikler asimetrik bir şekil almaktadır. Çift pikler belirmektedir.
Nedenler
**Kolon, güçlü şekilde alıkonan bir madde ile kirlenmiş durumda. Çözücü maddenin veya numunenin sebep olabileceği kirlilik, numune ile kuvvetli ikincil bir etkileşime giriyor.
**Kolon içindeki dolgu maddesinde kanallar oluşmuş. Kuvvetli basınç darbeleri veya mekanik etkiler ile etkilenen dolgu yatağı, buna sebep olabilir
HPLC’de Olası Problemler ve Çözümleri
3. Kolonun ayrım performansının değişkenlik göstermesiSorun:Kolonun ayrım etkinliği sabit değil. Bir enjeksiyonda iyi bir
ayrım elde ederken bir diğerinde geniş veya üst üste binmiş pikler elde ediyorsunuz.
Nedenler: Çoğu defa sorun kolonun aşırı yüklenmesinden kaynaklanmaktadır. Bir kolonun yüklenebilirliği içerdiği durgun fazın kütlesine bağlıdır.
- Kütlesel yüklenebilirlik sınırı: 100 µg/g durgun faz- Hacimsel yüklenebilirlik sınırı: 50 µl/g durgun faz
HPLC’de Olası Problemler ve Çözümleri
HPLC’de elde edilen kromatogramda piklerin özellikleri oldukça önemlidir. Pikler ile ilgili olarak;
Parçalı pikler (Bölünmüş pikler) Piklerin Uçları Piklerin genişliği gibi özellikler önemli olup sistemdeki olası
problemler hakkında da bilgi sahibi olmamıza yardımcı olmaktadır.
** Parçalı pikler genelde kolondaki kirlilikten kaynaklanmaktadır.
HPLC’de PİKLER…
**Pik genişliğinin fazla olması
İşlemde kullanılacak olan mobil fazın pH’sını oldukça etkilidir. pH aynı zamanda örneğin kolondaki alıkonma süresini de etkilemektedir.
HPLC’de PİKLER…
** “Hayalet Pikler” : Örnek enjekte edilmediği halde görünen piklerdir
Nedeni: Mobil faz kirliği olmasından kaynaklanıyor
HPLC’de PİKLER…
Piklerin çakışması
Bileşiklerin alıkonma zamanı daha kısa alıkonma sürelerine kayması ile oluşuyor. Nedeni:
Diğer nedeni ise;
HPLC’de PİKLER…
Numunenin çözündüğü çözücünün gücü >> hareketli faz gücü
Kolon girişindeki ölü hacimdir
Piklerde asimetri**Kolonda aşırı yükleme yapınca
** Ağır metaller, kötü kolon, artık maddelerin etkisi
HPLC’de PİKLER…
HPLC günümüzde kimya, biyokimya, biyoteknoloji, farmakoloji, tıp kimyası, bitki kimyası, tarım ve kimya mühendisliğini içeren alanlarda ayırma ve analiz için vazgeçilmez bir araç olarak kabul edilmektedir. Bilhassa diğer kromatografik tekniklere uygun olmayan bileşiklerin ayrılması ve analizi için uygundur. Çevre sıcaklığında termal olarak kararsız bileşikleri ve yüksek polarlıktaki bileşikleri herhangi bir türevlendirme olmaksızın ayırabilir ve analiz edebilir.
HPLC UYGULAMALARI
HPLC UYGULAMALARI
Preparatif HPLC
Saflaştırma
İdentifikasyon
Miktar Tayini Kimyasal Ayırma
HPLC UYGULAMALARI
Günümüzde değişik alanlarda yapılan biyokimyasal çalışmalarda HPLC çok sık kullanılmaktadır. HPLC diğer kromotografik tekniklerden daha güvenilir olduğu için biyokimyasal analizlerde tercih ediliyor. Hastanelerde, Adli Tıp Kurumlarında, Gıda sektöründe ve Sanayinin birçok alt dalında biyokimyasal analizler yapıyor.
HPLC’NİN BİYOKİMYASAL UYGULAMALARDAKİ YERİ VE ÖNEMİ
Hastanelerde daha önce klasik yöntemler kullanılarak yapılan bazı analizler HPLC ile daha hızlı yapılabilmektedir. Bu analizler:
Epinefrin, Norepinefrin, Dopamin, Metanefrin, Normetanefrin, VMA, HVA , 5 HIAA, Homosistein
Klinik Biyokimyasal analizlerde HPLC
Eritrositlerdeki Glutatyon miktarı oldukça önemlidir. Daha önce kırmızı kan hücrelerinde bulunan glutatyon miktarının analizinde güçlükler yaşanıyordu. Günümüzde HPLC ile eritrositlerde toplam ve indirgenmiş glutatyon miktarı kolaylıkla analiz edilebilmektedir.
Klinik Biyokimyasal analizlerde HPLC
HPLC, hemoglobin moleküllerinin ayrıştırılması ve miktarlarının belirlenmesinde kullanılan hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Zayıf iyon değiştirici (anyon veya katyon değiştiriciler) kolonlar Hb'lerin analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca globin zincirlerinin ayrıştırılması ve miktarlarının belirlenmesinde ise reverse faz kolonlu HPLC kullanılıyor. HPLC talasemi ve anormal hemoglobinlerin saptanmasında doğru ve hassas bir metottur. Hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir olmasından dolayı talasemi taramasında tercih edilir. Prenatal ve postnatal talasemi tedavisinde çok kullanılıyor
Klinik Biyokimyasal analizlerde HPLC
Klinik Biyokimyasal analizlerde HPLC
HPLC vitamin analizlerinde de kullanılabiliyor. Vitaminler genelde kendileri ile benzer kimyasal özelliklere sahip bileşikler ile kombine halde bulunurlar. Vitamin tabletlerinde suda çözünebilme özelliğine sahip vitaminlerin belirlenmesinde kullanılabilir.
Klinik Biyokimyasal analizlerde HPLC
Özellikle suda çözünen vitamin ile ilgili yapılan analizlerde “Smartline RF-HPLC” kullanılıyor. Bunun için genellikle C16 kolonlar tercih ediliyor.
Yağda çözünen vitaminlerin (A,D,E,K) analizinde ise HPLC-ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) .
A ve E vitaminlerinin analizlerinde Flouresans dedektörlü HPLC kullanılıyor.
HPLC özellikle diyabet hastalarında HbA1c değerlerinin belirlenmesinde kullanılıyor. Kan şekeri artarsa hemoglobin şekerlenir ve buna HbA1c denir. HPLC ile plazmadaki şeker konsantrasyonu ve HbA1c değerleri çok hızlı bir şekilde belirlenebilmektedir.
Klinik Biyokimyasal analizlerde HPLC
HbA1c değerinin belirlenmesinde “Katyon değiştirici HPLC”
(CE-HPLC)’ den yararlanılmaktadır. Burada hemoglobin türleri yüklerine bağlı olarak ayrışmaktadır.
HbA1c beta zincirinin N-terminal(Valin ) amino grubuna glukoz bağlanıyor. HbA1’in diğer türleri (-) yüklü olduğu için HbA1c’ye oranla daha hızlı ayrılıyor.
Klinik Biyokimyasal analizlerde HPLC
Lipitlerin ve spesifik steroidlerin analizlerinde ise RP-HPLC-Corona CAD (Charged Aerosol Detector)
Klinik Biyokimyasal analizlerde HPLC
MEKANİZMA
HPLC mobil fazı Nitrogen gazı ile sprey hale getiriliyor
Ortam sıcaklığında solvent buharlaşıyor ve analit partikülleri oluşuyor
Yük meydana getirmek için iyonize nitrogen gazı ile karıştırılıyor
İyon Trap reaksiyona girmeyen iyon gazlarını uzaklaştırıyor
Yüklü olan partiküller bir sinyal meydana getiriyor
Oluşan sinyal elektrometre ile okunuyor.
Adli toksikoloji departmanında zehirlenmelere bağlı ölüm olaylarının aydınlatılmasında
DNA ile ilgili çalışmalarda Kan örneklerinde referans olabilecek moleküllerin
belirlenmesinde Vücut sıvılarında bulunan aminoasitlerin konsatrasyonlarının
ölçülmesinde Kandaki hemoglabin varyantlarına bakılarak ortamdaki
lekenin insan veya diğer canlılara ait olup olmadığının ortaya çıkarılmasında HPLC sistemlerinden yararlanılmaktadır
ADLİ BİYOKİMYADA HPLC
ADLİ BİYOKİMYADA HPLC
Göz Sıvısında ve Serebrospinal Sıvıda Ölüm Sebebi ve Zamanına İlişkin Serbest Aminoasit Konsantrasyonu belirlenmesinde HLPC kullanılıyor.
ADLİ BİYOKİMYADA HPLC
Serbest aminoasitler HPLC ile direkt olarak analiz edilemiyor. Reverse Faz C18 silika kolon ile ayrıştırılıyor
PTC kromofor ‘da 245 nm’de belirleme (İşlem 25-30 dk sürmektedir
ADLİ BİYOKİMYADA HPLC
1. PROTEOMİK ÇALIŞMALARDA HPLC Proteinlerin saflaştırılması ve protein çözeltisinin tuzunun
giderilmesi
Protein identifikasyonunun ilk aşamasında
DENEYSEL BİYOKİMYA ÇALIŞMALARINDA HPLC
Protein ve polipeptidlerin primer yapılarının aydınlatılmasıda
1. EDMAN degradasyonu
2. Bu yöntem otomasyona bağlı olup elde edilen PTH-AAs’ler HPLC ile ayrıştırılıp belirlenmektedir.
PROTEİNLERİN YAPISINDA BULUNAN AMİNOASİTLERİN TARAMASINDA HPLC
Monolitik , nano ve switching mode kolonlar ile daha hızlı ve etkili ayırım
MALDİ ve elektrosprey ile kombine halde bulunan dedektörlerin geliştilmesiyle ile girişim yapan pikler azaltılarak daha net verilerin elde edilmesi.
Proteomik –HPLC özellikler
Boncuklardan çok porlu kanallara sahip, HPLC’nin içinde kullanılan özel tipte kolonlardır.
Makropor yapılı(2µm) veya mesoporlu yapıda(15nm) Avantajı: düşük “multiple-path” ve üretiminin kolay olması Dezavantajı: dikkatle gerçekleştirilmesi gereken bir organik
senteze ihtiyaç duymasıdır. Monolitler **Organik polimer esaslı monolitik kolonlar Sol-gel teknolojisi ile hazırlanma Bazik çözücülerle kullanılmaz**İnorganik silika esaslı kolonlar Akrilamit, metakrilat ve stiren esaslı polimerler içermektedir Geniş pH aralığında çalışma
Monolithic Kolon-HPLC
Nano-HPLC Multidimentional HPLC sistemleri
Yüksek hassasiyet Yüksek ayırım kapasitesi ve pik kapasitesi Minimal örnek kaybı Daha az örnek ihtiyacı
Proteomik Çalışmalarında En Çok Kullanılan HPLC Sistemleri….
Nano HPLC
PTMs ( Post Translasyonel Modifikasyonlar) belirlenmesinde HPLC sisteminden yaralanabilmek için Hosoyo ve arkadaşları değişik kolonlar ve yöntemler geliştirmiştir.
Mobil faz olarak “SU” kullanmışlar. Sistemde organik solvent kullanımının minimalizasyonu Fosfopeptidlerin analizinde sorun metal yüzeylere
afinite HPLc sisteminin metal yüzeyinde kompleks oluşumu . Bu problemin çözümü
Polieter eter kolon(PEEK) ya da Titanyum injektör, filtre ve kolonların kullanılması.
PROTEOMİK-PTMs-HPLC
2. METABOLOMİK ÇALIŞMALARDA HPLC Metabolik yol izlerinin (Pathway) aydınlatılması ile ilgili yapılan
çalışmalarda kullanılıyor. Pathway’lerin belli basamaklarında oluşan maddelerin
aydınlatılması
DENEYSEL BİYOKİMYA ÇALIŞMALARINDA HPLC
Metabolomik çalışmalada HPLC tek başına kullanılmamaktadır. Diğer yöntemler birlikte kullanılarak çalışmalar yapılmakta.
HPLC-PDA-MS-SPE-NMR içeren kombine sistemler RP-HPLC kullanımı daha yaygın Çalışmalarda HPLC kolonlar analizi yapılacak çok küçük
moleküller ile istenmeyen kompleks moleküller oluşturmayacak şekilde modifiye ediliyor
En yaygın kullanılan kolon: “Xterra C18 RP column” En yaygın kullanılan dedektör: “Coulometric Array
Detector”
METABOLOMİK ÇALIŞMALARDA HPLC
Şekil: Penicillium chrysogenum’un bir straininden izole edilen sorbicillin türevli alkolloidlerin yeni bir üyesi olan Sorbicillacton-A ‘nın biyosentetik orijin ve identifikasyonu ile ilgli bir çalışmada HPLC kullanımı.
Plasmodium ‘da glutatyon metabolik yol izinin aydınlatılması
METABOLOMİK ÇALIŞMALARDA HPLC
3. TRANGENOMİK ÇALIŞMALADA HPLC
DNA ve RNA miktralarının belirlenmesinde kullanılıyor Nükleik asitlerin yapısında bulunan A,G,C,T,U gibi nükleotidler
belirlenmesi Yaklaşık olarak 50 nt uzunluğundaki oligonükleotitlerin belirlenmesinde Anyon-Exchange HPLC Reversed-Phase HPLC tercih edilmektedir
Nükleotidleri içeren mutasyonların araştrılmasında ise daha çok “DHPLC” DHPLC, tanımlanmamış mutasyonların genetik tanısında, DNA
Separation Teknolojisi ile birlikte kullanılan Transgenomik WAWE DNA Fragment Analiz Sistemidir.
DENEYSEL BİYOKİMYA ÇALIŞMALARINDA HPLC
1.AŞAMA *Amplifikasyon
* Denatürasyon
* Reanealing
2.AŞAMA
*TEAA( Trietilamonyum asetat)(+)
*ACN (Asetonitrat)
3.AŞAMA
*UV detektör
* Birden çok pik oluşumu
*Mutasyon
TRANSGENOMİK-DHPLC
RNA konsantrasyonunun belirlenmesinde HPLC
Armored RNA fosfodiesteraz ve alkalin kullanıralar kesiliyor
HPLC ile nükleositlerin oluşturduğu pikler ölçülüyor.
Armored RNA sekanslarına dayanılarak preparat içindeki RNA konsantrasyonu hesaplanıyor.
TRANSGENOMİK-HPLC
Armored RNA Quant
In vitro Armored RNA QuantificationHPLC Assay
Determination of RNA concentration by HPLC
Birçok biyokimyasal analizde HPLC kullanılabilir. HPLC’nin kullanımını yaygınlaştırabilmek ve daha iyi sonuçlar alabilmek için:
HPLC sisteminde modifikasyonların yapılması(Kolon, Detektör, Pompa…)
Yapılan değişikliklerin optimize edilmesi
Bütün yapılanların belli standardizasyonu
SONUÇ
HPLC biyokimyasal analizler için tek başına yeterli bir sistem midir?