1

1

Hyphenated techniques

Jan Preisler

312A14

preisler@chemi.muni.cz

http://bart.chemi.muni.cz

„Hyphenated techniques“

„multidimensional analyses“

„life science research”

„omics“

genomics

proteomics

organellomics

metabolomics

cellomics

3

„Hyphenated techniques“

hyphen - spojit spojovníkem (dvě slova)

hyphen - spojovací čárka (spojovník)

hyphen - pomlčka

hyphen - označit čárkou

hyphen - rozdělit slovo (čárkou)

hyphen - spojovací

hyphen - rozdělovací čárka

hyphen - rozdělovací znaménko

hyphen - spojovník

hyphenate - spojit

hyphenate - rozdělit čárkou

hyphenate - spojit spojovníkem

hyphenate - rozdělit spojovníkem

4

Hyphenated techniques

Definice

“the marriage of two separate analytical techniques via appropriate

interfaces, usually with the backup of a computer tying everything

together”

Analytical Chemistry (Wiley-VCH, 1998)

“Hyphenated separation techniques refers to a combination of two

(or more) techniques to detect and separate chemicals from

solutions. Most often the other technique is some form of

chromatography. A slash is sometimes used instead of hyphen,

especially if the name of one of the methods contains a hyphen

itself.

Wikipedia (2007)

5

Hyphenated techniques

... zpravidla sestava některé separační techniky kombinovaná s

jinou separační/detekční technikou, např. MS detekcí

... specifičtější multidimenzionální analýza

... odstranění vzájemných rušení a překryvů signálu

Co ještě je a co už není „hyphenated technique“?

• LC – UV @ 254 nm záznam absorbance při zvolené l

• LC – DAD diode array detector, záznam spektra

Více detekčních technik: „hypernated techniques“

6

Hyphenated techniques

Současnost

• kapilární separační techniky + vysoce citlivé detekční techniky

(hmotnostní spektrometrie ESI a MALDI, elektrochemické aj.)

• kombinace vysoké selektivity a vysoké citlivosti dovoluje

jednoznačné stanovení analytů ve stopových množstvích

Rozhraní (interface)

• zachování separační účinnosti

• zachování citlivosti (minimalizace ztrát analytů)

Aplikace

• multidimensionální analýza komplexních směsí: proteomika,

dopingové testy, toxiny, pesticidy, speciační analýza polutantů...

2

7

MS IR OES AAS NMR Fluo UV/Vis

GC *** *** ** * ** *

LC *** ** ** ** ** *** ***

SFC * * **

CE ** * * *** ***

TLC * ** *** ***

GE *** ** *** ***

Typy spojení

*** komerčně dostupné a v praxi používané

** komerčně dostupné, ale méně v praxi využívané

* ve výzkumném stadiu, ale komerčně nedostupné

8

Klasifikace spojení

Sběr eluentu• diskrétní frakce (fraction collector)• spojitý tok

Režim• on-line• off-line• in-line

Využití vzorku• beze ztráty vzorku• se ztrátou vzorku (splitter)

Separátor (splitter)

• rozdělení eluentu mezi více technik

• miniaturizace, kapilární kolony

9

Spojení separace a selektivní detekce

Proč separace?

... nutnost analýzy velmi složitých vzorků, směsí mnoha analytů

Když specifická detekce není dostatečně specifická:

• vysoká pravděpodobnost výskytu 2 nebo více analytů se stejným

spektrem

• vzájemné rušení analytů

• omezený dynamický rozsah detektoru, nemožnost současné

analýzy minoritních a majoritních složek

• odstranění nečistot

• zdroj dalších informací o analytech

10

Př.: vzájemné rušení MALDI MS signálu

směsi peptidů

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

AI

AIII

AG 1-14

AF 1-7

AF 3-8

AII

AII (off scale)

m/z

Ion I

nte

nsity (

V)

c(peptidů) = 1 mM

c(peptidů) = 1 mM

kromě c(AII) = 50 mM

11

Nejčastěji používané „hyphenated“ techniky

všechny techniky spojené s MS, UV, Fluo

Př.:

• HPLC, CE – MS

• GC-MS

• GC-FTIR

• LC-GC

• GC-AES

• LC-AAS

• LC-ICP MS

• LC-elektrochemické detektory

12

HPLC-TLC (MALDI-TOF MS)

• Probot

3

13

LC-GC

14

GC-AES

15

LC-MS

16

LC-AAS

17

ICP-MS

18

4

19 20

HPLC–NMR–MS analysis of a commercial dye sample. A: HPLC (UV) spectrum at

254 nm. B: Photodiode array contour plot. C: Total ion chromatogram under

negative ion electrospray conditions. D: Density plot of the negative ion

electrospray mass spectra. E: 1H NMR spectra of peaks 1, 3 and 5 of the HPLC

chromatogram in A

21 22

This example is for a 14C-labeled-blocker dosed to a rat.

NMR and MS data for the minor hydroxyglucuronide metabolite clearly enables the

structure to be determined. In addition, the drug was dosed as the racemate, but the

NMR spectrum clearly shows that the metabolism (or excretion) was enantioselective

based on the slightly different intensities of the anomeric proton resonances of the two

diastereoisomeric glucuronides.

23

Typy interface pro MS

Plyn vakuum

tryskový separátor pro obohacení ABC v nosném plynu (particle beam)

membránové interface

kapilární kolona (místo klasické kolony se splitrem)

Kapalina vakuum

API ionizační metody (ionizace přímo z kapaliny za atmosferického tlaku)

Průtokové sondy (FAB)

Nanesení vzorku na tuhý nosič (terčík)

pohyblivý pás (naneseni při atmosferickém tlaku – přenos, diferenciální pumpování - ionizace)

Sběr frakcí

24

Příklad: spojení separace s MALDI MS

Off-line

- Sběr frakcí. Terčíky s hydrofilními místy (anchorchip)

- Vyříznutí a extrakce skvrny z GE

- Mikrometody používající piezoelektrické pipetory a mikroterčíky

On-line

- Průtoková sonda s fritou/bez frity

- Zmlžovač pro tvorbu aerosolu

In-line

- Interface ROBIN

- Nanášení vzorku na povrch ve vakuu, moving belt interface

Off-line vs. on-line

- Oddělení separace od hmotnostní analýzy

- Možnost archivování vzorku

5

25

Automatizovaný sběr frakcí (off-line)

Např.: Probot (zdroj: www.lcpackings.com)

26

Průtoková sonda (on-line)

Whittal, R. M., Russon, L. M., Li, L. J. Chromatogr. A 1998, 794, 367-375.

27

Fei, X., Wei, G., Murray, K. K. Anal. Chem. 1996, 68, 1143-1147.

Zmlžovač pro tvorbu aerosolu (on-line)

28

Moving belt interface (in-line)

• Rozhraní pro kontinuální zavádění netěkavého vzorku v těkavějším

solventu do hmotnostního spektrometru

• McFadden W. H., Schwartz H. L. and Evans S. J. Chromatogr. 122, 389,

1976.

k vakuovým pumpám

IR vyhřívání

horký N2 LC eluent

vyhřívací

elementštěrbiny

pohybující se polyimidový pás

iontový

zdroj

29

Orsnes, H., Zenobi, R. Chem. Soc. Rev. 2001, 30, 104-112.

ROBIN (rotating ball inlet), in-line

30

source chamber (p ~ 10-6 Torr)

probe withcapillary

interface flange

sourcecoil

repeller

repeller center(tape guide)

depositionsupport

propelledshaft

targetcoil

rubberwheel

2ND GENERATION VACUUM DEPOSITION INTERFACE

atmosphericpressure

Mylar tape

Nanášení vzorku ve vakuu (in-line)

6

CE - MALDI/MS směsi peptidů

VACUUM

(SOURCE CHAMBER)

buffer

vials

interface

flange

flight tube

detector2nd extraction grid

1st extraction grid

repeller

scanning mirror

infusion

capillaries

ATMOSPHERIC

PRESSURE

MULTIPLEX MALDI/TOF MS

tape

desorption laser beam

Multiplex: CAE – MALDI MS

33

Multiplex: CAE – MALDI MS

myoglobin fetuin b-lactoglobin b-casein

cytochrome carbonic anhydrase bovine serum albumin ribonuclease b

1 2 3 4

5 6 7 8

Capillary Array Electrophoresis - MALDI MS osmi proteinových digestů

separace (CE) kapalinové spojení

subatmosferická

nanášecí komora

(20 kPa)

broušená

špička pokrytá

PTFE

UV detekce

nanášecí kapilára

terčík

Au-PETG

Off-line CE – MS

34

UV detektor: Ryvolová, M.; Preisler, J.; Krásenský, P.; Foret, F.; Hauser,

P.C.; Paull, B.; Macka, M. Anal. Chem. 2010, 82, 129-135

Subatmospheric Deposition of CE Effluent

35

separační kapilára

vialky s pufrem a

vzorkem

terčík MALDI

subatmosferická komora

kapalinové spojení

infúzní kapilára

nanášecí sonda

VN

vzorek: 100 mM Cr3+(EDTA) a 100 mM CrO42- , BGE: 10 mM HCOOH,

kapilára: 20/26 cm, 10 kV, dávkování: Dh = 2 cm, 5 s (200 fmol),

detekce: absorbance při 214 nm/SALD ICP MS @ 53 (LOD ~ 10 fmol)

CrIII(EDTA)

CrO42-

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

0 30 60 90 120 150

A (

a.u

.)

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

inte

gra

ted I

CP

MS

sig

nal (a

.u.)

×1

06

time (s)

CE – UV & SALD ICP MS of Cr specií

CrIII(EDTA)

CrO42-

Peš, O.; Jungová, P.; Vyhnánek, R.; Vaculovič, T.; Kanický, V.; Preisler, J.

Anal. Chem. 2008, 80, 8725–8732 36

7

37

Terčík MALDI : multidetekční platforma

vzorek,

separační eluent,

tkáň

terčík MALDI

MALDI MS

ICP MS

laserem

buzená

fluorescence

MALDI MS/MS reakce

na terčíku

Archivování/reanalýza/expozice jiným detekčním technikám

Metaloproteomická aplikace

vzorek separace

ICP MS

ESI MS

vzorek separace ICP MS

vzorek separace ESI MS

dělič toku nebo duální přístroj

Kolonové separace – hmotnostní spektrometrie

- prvková analýza: ICP MS

- molekolová analýza: elektrosprej (ESI) MS

- kolonová separace + ICP MS/ESI MS

nebo

38

Modifikovaný terčík (destička)

Substrát

- polyethylen tereftalát glykol (PETG)

- nanovrstva Au: 5 nm pro kompatibilitu

s MALDI a SALD

destička Au-PETG

se záznamem separace

před a po SALD ICP MS

destička Au-PETG

na terčíku MALDI

39

CE(UV)-MALDI MS/SALD ICP MS

40

-0,1

0,1

0,3

0,5

0,7

0,9

1,1

1,3

1,5

1,7

7 8 9 10 11 12

Ab

so

rba

nce

(a

.u.)

0

100 000

200 000

300 000

400 000

500 000

600 000

7 8 9 10 11 12

11

1C

d S

AL

D IC

P M

S

sig

na

l (a

.u.)

tmig at liquid junction (min)

6000

6100

6200

6300

6400

6500

7 8 9 10 11 12

m/z

MALDI MS:

MT apoformy

SALD ICP MS:

kovy (Cd)

MT-1

MT-2

0

100 000

200 000

300 000

400 000

500 000

600 000

7 8 9 10 11 12

11

1C

d S

AL

D IC

P M

S

sig

na

l (a

.u.)

UV

To

ma

lová

, I.;

Fo

ltyn

ová

, P.; K

an

ický, V

.; P

reis

ler, J

.

An

al. C

he

m.2

01

4,8

6,6

47

−6

54

.

• CHCA/TFA: apoformy proteinů

• DHB/NH3: komplexy proteinu s kovy

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

7 8 9 10

inte

grat

ed S

ALD

IC

P M

S si

gnal

[a.

u.]

*10

6

tmig[s]

62

15

.2

61

45

.2

62

41

.3

0

200

400

600

800

1000

Sign

al in

ten

sity

[a.

u.]

6000 6200 6400 6600 6800 m/z

CHCA/TFA

[M-

5H

+3C

d]+

[M-7

H+

4C

d]+

0

500

1000

1500

[M-3

H+

2C

d]+

[M-H

+C

d]+

[M+

H]+

DHB/NH3

MALDI MS

SALD ICP MS

(111Cd)

Detekce formem proteinů MALDI MS

41