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Identificación Genética de Desaparecidos en Argentina y

otros paises

Carlos M Vullo, PhD

LIDMO-EAAF

United Nations

Genética Forense: Aplicaciones

1. Investigación de Paternidad y Parentesco.

2. Criminalística Forense: match entre sospechoso y evidencia biológica.

3. Investigaciones históricas.

4. Investigación de desaparecidos.

5. Desastres en masa: identificación de restos.

6. DNA en FFAA: “dog tag”.

7. Bases de datos de DNA: crímenes reincidentes.

Genoma Humano: diferentes tipos de ADN

Genome 3.2Gb

Genic 25%

mtDNA 16.5kb

Coding and

Regulatory 1.5%

Repetitive 54%

Tandem repeats (VNTR) 9%

Interspersed 45%

Satellite 5% Micro-satellite 1%Mini-satellite 3%

Non-coding 24%

Extra-Genic 75%

SINE 13% LINE 21% LTR 8% DNA transposon 3%

ADN mitocondrial (mDNA)

PCR + SECUENCIACIÓN

MUCHAS COPIAS (~5000/cel)

MtDNA línea materna

♂ ♀

1ra generación

3ra generación

2da generación

desaparecido

ADN nuclear

Doble cadena.

100.000 genes.

ADN diploide. (Y haploide)

Recombinación genética.

Mutación.

2 copias por célula.

Anular de doble cadena.

37 genes.

ADN haploide (materno).

No recombinación.

Mutación (ADNmt>ADNn).

1000-10.000 copias por célula

(2-10 copias/mit y hay ≈ 1000

mt/cel

ADN mitocondrial

Autosomicos(transimitidos en parte por

ambos progenitores)

Cromosoma-Y(transmitido completo,

pero solo por hijos)

Mitochondrial (transmitido completo,

pero solo por hijas)

Marcadores de linaje

Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition, Figure 9.1, ©Elsevier Science/Academic Press

Diferentes patrones de herencia

Autosomicos STR

Polimorfismos de interés en genética forense

STR (short tandem repeats)

nDNA

SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)

mtDNA (mitocondrial)

nDNA (nuclear)

Indels (Insertion/deletions)

nDNA

POLIMORFISMOS

Secuencia (SNPs)

1. TGATTCGCCTAG

2. TGATCCGCCTAG

3. TGATACGCCTAG

4. TGATGCGCCTAG

Longitud (VNTR)

GATA

GATA GATA

GATAGATAGATA

GATAGATAGATAGATA

SNPs: ADNmtADNnuc

Short Tandem Repeat (STR)

PCR/Short Tandem Repeats (STRs)

AATG

7 repeats

11 repeats

AATG AATG

Primers fluorescentes

Homocigota = ambos alelos son de igual longitud= 1 banda o pico

Heterocigota= los alelos son diferentes = 2 bandas o picos

♂

♀

Imagen

scanneada Electroforesis capilar – EFG perfil genético

Se usa la PCR para amplificar regiones STR y marcar los

amplicones con colores usando primer específicos de locus

8 repeats

10 repeatsLocus 1

8 repeats

9 repeatsLocus 2

Detección de la muestra

CCD Panel

Separación

por color

Ar+ LASER

(488 nm)

Fluorescencia Prisma

Espectrofotográfico

Capilar o Gel

Separación por tamaño

Fragmentos de ADN

marcados (PCR)

Ventana de

detección

PRINCIPIOS DE SEPARACIÓN Y

DETECCIÓN DE FRAGMENTOS

EFG

EFG: Perfil Genético

AMEL

D3

TH01 TPOX

Penta D

Penta EFGAD21 D18

CSF

D16D7

D13D5VWA D8

Amplificación STR con multiplex

Perfil STR: pasos involucrados

Cuantificación de ADN RT-PCR

Mat Biol ADN

Genotipo

Material Biológico utilizado

Sangre

Uñas

Cabello

Hisopos

Semen

Saliva

Orina

Dientes

Hueso

TejidosTODOS PRODUCEN EL MISMO PERFIL

GENÉTICO EN UN INDIVIDUO

Muestra obtenida para ser

identificada Biología

Extracción

DNA

Cuantificac

DNA

Análisis de Multiples

Marcadores (STR)

Tecnología

Separación y Detección de los

Marcadores Analizados

(Alelos STR)

Genotipo de la

muestra

GenéticaComparación del Genotipo de

las muestras entre sí

(PA y familiar)

Si no hay match exclusión

Si hay match inclusión

Generación de Informe con

Valor de Probabilidad

Estadística

Perfil de ADN: pasos involucrados

GENETICA FORENSE

VALORACIÓN ESTADISTICA DE LA “ANALISIS DE ADN”

VALORA LA INCERTIDUMBRE DE NUESTROS

RESULTADOS

VALORACIÓN ESTADÍSTICA DE UN MATCH

ENTRE PERFILES GENETICOS

• MATCH POR

PARENTESCO

• MATCH POR

PROVENIR DEL

MISMO

INDIVIDUO

MATCH POR AZAR

X Y

LR= prob X / prob Y

Frecuencias

genotípicas en la

población

HIPÓTESIS DE FISCALIA HIPÓTESIS DE DEFENSA

a/b c/d

a/c a/d b/c b/d

a/b c/d

m/d ?Exclusión

Mutación a/bm

PA1

PA2

H

M

PATERNIDAD

Inclusión y

Exclusión

EXCLUSIÓN

INCLUSIÓN

H

M

ABO

ABA

Inclusión con

Abuelos y

Madre

Exclusión con

Abuelos

Sin madre

H

ABO

ABA

UN EJEMPLO DE INCLUSIÓN

PADRE ALEGADO: 10 / 8

HIJO: 10 / 11

MADRE: 12 / 11

X= Probabilidad que PA transmita el alelo 10 = 0,5

Y= Prob que HA transmita el alelo 10 frec f10 en poblac= 0,04

IP= X/Y= 0,5/0,04= 12,5

PP= IP/PI+1= 12,5/13,5= 0, 92 92%

IP= X/Y

INVESTIGACIÓN DE PATERNIDADPROBABILIDAD ACUMULADA EN UNA INCLUSIÓN

LOCUS IP IPAcum PP

CSF1PO 1,238 1,23 55,1 %

D12S1090 8,333 10,31 91,1 %

D13S317 1,961 20,23 95,28 %

D16S539 3,257 65,88 98,50 %

D21S11 7,813 514,79 99,80 %

D3S1744 4,484 2308,34 99,95 %

D5S818 1,355 3127,80 99,96 %

D7S820 2,941 9198,88 99,98 %

D8S1179 6,173 56784,70 99,99 %

F13A01 8,333 473186,92 99,999 %

F13B 4,132 1955208,34 99,9999 %

FGA 2,924 5717029,06 99,99998 %

LPL 2,500 71462863,36 99,99999 %

RECONSTRUCCIONES: CON HIJOS DEL

PADRE ALEGADO

1,2,3,4

1/3 2/9

1,2,3,4

2/4

7/9

?

SIN MADRE DE LOS HIJOS DEL PADRE

ALEGADO

1/2

1/3 2/9

3/4

2/4

7/9

?

CON MADRE DE LOS HIJOS DEL PADRE

ALEGADO

Inclusión con menor fuerza:

si el PA no fuera 2?

Inclusión con mayor fuerza:

el PA es 2

Complejidad en la identificación de desaparecidos

Número de individuos denunciados como desaparecidos

Número de individuos presumidos de estar desaparecidos

Número de víctimas (NMI)

Episodios “abiertos” o “cerrados” (a priori)

Condiciones de los restos (post-mortem):

Degradación / descomposición

Grado de desarticulación re-asociaciones

Restos mezclados re-asociaciones

Muestras de referencia disponibles (ante-mortem):

Pertenencias personales de la víctima (DNA match directo)

Familiares de la victima (DNA analisis de parentesco)

Enterramientos ilegales Argentina

Década del ’70.

1. 1975 – 1978: ~35 años de episodios:

• Pocos familiares del desaparecido para comparar

• Degradación del ADN por influencia del suelo en restos envejecidos

2. Fosas comunes o individuales “en tierra”

3. Universos cerrados: un evento único hipótesis fuerte

comparación directa con familiares consanguíneos.

4. Universos “abiertos”: sin hipótesis de identificación bases de datos

genéticas comparaciones masivas huesos/familiares.

Genetica Forense: procesos en la Identificación de restos

Restos humanos Recolección de muestras PM

Extracción de ADN

Cuantificacion ADN

Amplificacion ADN

Problemas en muestras PM

Problemas en muestras de Ref

Problemas para generar perfiles

en muestras óseas degradadas

Comparaciones genéticas:

• Hipótesis fuertes

• Comparaciones masivas

Conciliation de datos:

•Investigación histórica

•Antropología, otros

Evaluación estadística:

•Prior odds

•Falsos positivos

•Límite pre-acordado para ID

IDENTIFICACIÓN

ARGENTINA: Problemas con las muestras

Referencia/familiares: despues de 30-35 de los episodios⇒ pocos familiares y genealogías

escasas.

Inconsistencias debido a no-paternidad desconocida.

Múltiples desaparecidos en una misma familia.

Restos óseos: Degradación

Contaminación

Restos Mezclados

Score usado para calcular cantidad de familiares

a recolectar

Se necesitan 15 puntos.

Un progenitor/a= 10 puntos.

Un hijo/a= 10 puntos

Un hermano/a= 5 puntos.

Tíos, tías, medio-hermanos= 1.5 puntos.

Abuelo/a= 2 puntos.

Bonus si hay 4 abuelos= 2

Ejemplos:

Madre+1 hermano= 15 puntos

Tres hermanos= 15 puntos

2 Tías maternas + 2 tíos maternos + 1 hermano= 3+3+5= 11 puntos

Multiples desaparecidos en una familia

5860

35

38

3 11 14

1. Amelogenina + STR + Autosomicos + mtDNA + Y-STR

2. Antropología forense

Referencia

Desaparecido

512

?

• Padres fallecidos: 4 Hnos, uno desaparecido. Se exhuma

un resto masculino con fuerte presunción de ID.

• 15 autosomicos STRs ⇒ EXCLUSION

• Y-STR ⇒ EXCLUSION

• mtDNA= match con 1, 2 y 3 (única secuencia en la BD de

ADNmt de ~480 secuencias

• Posible genealogía errada?

• Probabilidad que 1, 2 and 3 sean Hnos Cptos= 1,6. 1012

• Se contactó a la familia para reanalizar la genealogía.

1 2 3

?

1 2 3

• La familia informó sobre una fuerte posibilidad de

medio-hermandad materna del desaparecido.

• Se analizan 23 STRs.

• LR= 15.943 y PP= 99,993% bajo la nueva

genealogía descrita.

INCONSISTENCIAS: un caso de no-paternidad

desconocida

BL-LP-A4-Esq1

PROBLEMAS EN LA MUESTRAS


pobres.

Inconsistencias debido a no-paternidad desconocida

Múltiples desaparecidos en una misma familia

Restos óseos: Contaminación

ADN degradado

Restos mezclados

Contaminación

Procesamiento para evitar contaminación



pobres.

Buenas genealogías!! Describir el vínculo siempre con respecto al MP.




ADN degradado

Restos mezclados

ADN

NUCLEAR

degradación

RESTOS BIEN PRESERVADOS:

Más posibilidades de éxito para

la tipificación de ADN

HUESOS MAL PRESERVADOS,

DELGADOS O ESPONJOSOS:

ADN degradado o en poca

cantidad

MUESTRA ÓSEA SELECCIONADA

SELECCIÓN DE MUESTRA APROPIADA

Peroné (12)= 96%

Costilla (2)= 73%

Tibia (23)= 84%

Craneo (15)= 73%

Femur (115)= 85%

Diente (109)= 82%Radio (7)= 61%

Humero (22)= 54%

Cubito (8)= 52%

Vertebra (3)= 48%

Pelvis:

(coxal/ilium/ischium)

(20) = 33%

Homoplato (3)= 15%

Porcentaje de marcadores amplificados en distintos huesos

N= 338

X=Amplif/nº muestras/15

80%

63%

50%



pobres.

Buenas genealogías!! Describir el vínculo siempre con respecto al MP.




ADN degradado

Restos mezclados

Restos mezclados: 62 piezas óseas.

12 femures derechos: NMI?

13 individuos

Fosa Común: ADN para re-asociacionesintra-esqueléticas

221306 Skeleton 1

221307 Skeleton 2

211308 Skeleton 3

221309 Skeleton 4

211310 Skeleton 5

221311 Skeleton 6

211312 Skeleton 7

221313 Skeleton 8

211314 Skeleton 9

211315 Skeleton 10

211316 Skeleton 11

211317 Skeleton 12

211318 Skeleton 13

211319 Skeleton 14

211320 Skeleton 15



Extracción de ADN

Cuantificacion ADN

Amplificacion ADN








Conciliación de datos:




•Prior odds

•Falsos positivos


IDENTIFICACIÓN

Genética: comparaciones masivas

Valores de ID “a priori”

Falsos positivos

Falsos negativos

Inconsistencias familiares

Conciliación con otras disciplinas forenses

“a priori”: episodios con pocas víctimas

Valor “a priori”:

Un accidente de avioneta con 10 personas, buscamos a Juan: la probabilidad de encontrar a Juan entre los restos es 1/10.

Resultado del ADN= 100.000/1 a favor de quees Juan.

Probab Posterior= 1/10 x 100.000/1= 100.000/10= 10.000 los resultados son 10.000 veces mas probables si los restos son de Juan (99,99%).

Desastre masivo

Se trata de un Tsunami: 10.000 víctimas.

Valor “a priori”= 10.000 de encontrar a Juan.

Resultado de ADN= 100.000/1

1/10.000 x 100.000/1 = 100.000/10.000= 10

Probabilidad Posterior: los resultados son

apenas 10 veces más probables si los restos

son de Juan (90%).

El problema de los Falsos Positivos

Presunción fuerte:

1 resto + 1 referencia= 1 comparación alta probabilidad de identificar

correctamente.

2 restos + 2 referencias= 4 comparaciones igualmente alta probabilidad de

identificar correctamente.

Sin presunción de ID:

ILID: ~1200 esqueletos x ~9,000 referencias 107 comparaciones

probabilidad de match al azar o falso positivo.

BONE

SAMPLEREFERENCE KINSHIP LR

STR

LociEXCLUDED BY

1 210330 300238 sibling 10.576 12 Y-STR

2 210479 104024 son 14.905 14 Y-STR

3 210228 101874daughter 32.382 9 mtDNA

4 210161

102865 sibling

30.000 13 Adding NON-CODIS STRs102844 sibling

102845 sibling

5 230160 301156 sibling 14.956 13 Anthropology


7 210552 301008 sibling251.18

114 Exclution by adding mother and

two sons



Falsos positivos en comparaciones genéticas masivas:

Base de datos Argentina ILID (huesos ~1200; referencias~ 9000)



Extracción de ADN

Cuantificacion ADN

Amplificacion ADN








Conciliación de datos:




•Prior odds

•Falsos positivos


IDENTIFICACIÓN

Conciliación de datos con otras disciplinas

MP1

40aRef1

MP2

20aRef2

H2 para MP2= hueso (hijo) Ref1 y (Hno cpto) de Ref2

H1 para MP1= hueso (Hno cpto) Ref1 y (tío) of Ref2

?

Resultados del ADN:

LR1= 7.258

LR2= 11.265

LR1/LR2= 0.64

~40 años

Identificación de MP1 mediante DNA + Antropología

231040

Número de muestras óseas procesadas y esqueletos

representados (re-asociaciones)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Jul-13

Skeletons

Bone samples

LIIDIncludes may 2013

IDENTIFICACIONES EAAF 1984-2012 (marz)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

901

98

41

98

51

98

61

98

71

98

81

98

91

99

01

99

11

99

21

99

31

99

41

99

51

99

61

99

71

99

81

99

92

00

02

00

12

00

22

00

32

00

42

00

52

00

62

00

72

00

82

00

92

01

02

01

12

01

2 m

arz año

N

ADN

OTROS METODOS

ADN

EAAF

ILID

PROPORCION DE DESAPARECIDOS EN ARGENTINA

POR PROVINCIA

PROVINCIAS MAYORITARIAS

38,0

20,91,8

3,2

7,3

7,5

21,3 B (Buenos Aires)

C (CF)

M (Mendoza)

S (Santa Fe)

T (Tucuman)

X (Córdoba)

Otras Provincias

EAAF – Total de identificaciones en diferentes proyectos

PAIS PROVINCIA REGION IDENTIFIC

ARG

EN

TIN

A

BUENOS AIRES

AVELLANEDA 105

GRAL LAVALLE 21

LA PLATA 22

LOMAS DE ZAMORA 35

SAN MARTIN 22

BUENOS AIRES (OTRAS) 110

CATAMARCA 3

CHACO 2

CORDOBA 16

CORRIENTES 1

ENTRE RIOS 3

MENDOZA 1

MISIONES 2

SALTA 1

SANTA FE 36

SGO DEL ESTERO 1

TUCUMAN 18

URUGUAY 10

TIMOR ORIENTAL 15

EL SALVADOR 29

BOLIVIA 14

ISLAS SALOMÓN 2

SUDÁFRICA 14

TOTAL 4832012-08-10

Proyectos para MPI donde el EAAF

trabaja con Genética Forense

America Central y SA

Argentina

Uruguay

Paraguay

El Salvador

Panama

Bolivia

Otros Países

Timor Leste

Islas Salomón

Sudáfrica

Pentridge Project (Australia)

Vietnam

Nigeria

El Salvador: Guerra Civil

Desde 1980 hasta 1992.

Ejercito gubernamental contra FMLN.

Aprox. 75.000 muertos/desaparecidos.

Aprox. 900 niños desaparecidos (huerfanos

adoptados).

Suelos ácidos, húmedos y temp templadas.

Restos esqueletizados de ~25 años PM.

El Salvador

Bolivia

Timor Leste

Guerra de Vietnam

Vietnam: mtDNA

SUDÁFRICA

Víctimas del

Apartheid

Sudáfrica - Apartheid

Apartheid: restituciones

Perspectivas Futuras (2014)

Argentina desaparecidos

Víctimas de Malvinas – Cementerio Darwin

Paraguay – Víctimas del Stronismo

Sudáfrica

Vietnam

Kenia

Nigeria

Otros…?

AGRADECIMIENTOS

EAAF

Laura Catelli

Carola Romanini

Magdalena Romero

Florencia Garrone

Alicia Borosky

Mercedes Salado Puerto

MUCHAS GRACIAS POR

SU ATENCION

identificación genética de desaparecidos en argentina y ... · se necesitan 15 puntos. un...

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