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Identificando a programação genética da célula através do
uso dos microchips de DNA
Ana Carolina DeckmannLaboratório de Genômica e Expressão
Depto. Genética e Evolução - Instituto de Biologia - Unicamp
Minicurso “Da Genômica à Biotecnologia” - Minicurso “Da Genômica à Biotecnologia” - IV Semana de Química/ 2004IV Semana de Química/ 2004
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Projetos Genoma: o que nos dizem?
• Projetos Genoma: deciframento das sequências de DNA, sua organização e estrutura.
• Ao decifrar um genoma, resta a dúvida: se todas as células de um organismo carregam o mesmo genoma, O QUE as torna diferentes umas das outras???
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Estudos funcionais
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Introdução aos chips de Introdução aos chips de DNADNA
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• Os chips de DNA fornecem um método conveniente para explorar o genoma em um nível molecular.
• Análise de milhares de informações genéticas em um único experimento.
• A utilização desta técnica suporta muitas possibilidades e novas aplicações surgem diariamente.
Os Biochips e sua importância
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Atualmente, as principais aplicações são:
• Genômica funcional (um genoma)
• Genômica comparativa (vários genomas)
• Genotipagem (SNPs)
• Estudo da cromatina (ChIP-ON-CHIP)
Os Biochips e sua importância
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Fundamentos teóricosFundamentos teóricos
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•PROPRIEDADE 1) a estrutura em dupla hélice é mantida unida pela complementariedade entre as bases nucleotídicas.
Fundamentos Teóricos
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Fundamentos Teóricos
• Consequência: hibridização
DNA fita dupla
DNA desnaturado
hibridização
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• PROPRIEDADE 2) a produção de proteínas depende de etapas intermediárias em que o DNA é transcrito em moléculas de RNAm COMPLEMENTARES à sequência do gene!
Fundamentos Teóricos
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR
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• Consequência: a função gênica pode ser estudada através das etapas de transcrição!
• COMO?
• Medindo quantos híbridos se formam entre DNA e mRNA, e assim quantificando a expressão gênica numa situação de interesse, p.ex., câncer!
• COMO QUANTIFICAR A FORMAÇÃO DE HÍBRIDOS?
Fundamentos Teóricos
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transcrição reversa na presença de bases marcadas
CGATTAGC
cDNA marcado
genoma
gene A
transcrição
expressão do gene A
DNACGATTAGC
RNAmGCUAAUCG
transcrição reversa
cDNACGATTAGC
tradução
Proteína A
Fundamentos Teóricos
célula
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• DNA marcado por radioatividade
Estudos clássicos de expressão gênica (caso a caso). Ex: Northern blotting.
Fundamentos Teóricos
1) isolar as mensagens produzidas em uma célula (mRNA) e imobilizá-las em um suporte sólido.
2) marcar a sequência do gene de interesse durante a reação de polimerização.
3) Hibridizar!
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C 1h 3h 6h 12h 48h
Gene -MHC
rRNA 28S
rRNA 18S
Northern blotting
Fundamentos Teóricos
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1) isolar um grande número de genes (BIBLIOTECA DE cDNA) e organizá-los lado a lado em um suporte sólido.
2) marcar as mensagens produzidas em uma célula com radioatividade ou fluorescência durante a reação de transcrição reversa.
3) Hibridizar!
Fundamentos Teóricos
• DNA marcado por fluorescência: macro- e microarrays
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Chip Cp Chip Rn
Fundamentos Teóricos
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Fabricação dos biochips Fabricação dos biochips de DNAde DNA
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BIBLIOTECA DE cDNA
Placas 384 fita molde
fita molde
produtos
X ciclos
AMPLIFICAÇÃO
Eletroforese dos insertos da biblioteca de cDNA de coração de rato.
PRODUÇÃO DOS MICROARRANJOS
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Fonte: Genomics Solutions. http://www.genomicsolutions.com
Flexys Robot (Perkin Elmer)
Deposição automatizada dos clones em posições pré-determinadas.
ESPOTAGEM
Organização da biblioteca em microplacas 384.
PRODUÇÃO DOS MICROARRANJOS
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SÍNTESE DAS SONDAS FLUORESCENTES
MARCAÇÃO DAS SONDAS
C 1 3 6 12 48
RNA total
RNA[controle]
Cy3
Cy5
x RNA[exp]
PRODUÇÃO DOS MICROARRANJOS
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MICROARRANJO
HIBRIDAÇÃO
SPOT
DNA fita simples Hibridação com as sondas
desnaturadas
SCANNER
GeneTAC 2000 (Perkin Elmer)Fonte: Genomics Solutions. http://www.genomicsolutions.com
GRADE
PRODUÇÃO DOS MICROARRANJOS
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EXCITAÇÃO DAS SONDAS E CAPTURA DOS SINAIS
fonte de luz
570nm
670nm
absorção emissão
550nm
Cy3
649nm
Cy5
PRODUÇÃO DOS MICROARRANJOS
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Esquema do endereçamento dos pontos na imagem.
abcd
ef
gh
ij
k
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4PROCESSAMENTO DA IMAGEM
A1.a2
Estimativa computacional das intensidades de fluorescência emitidas por Cy3 e por Cy5 e cálculo da razão.
Address
Total Intensity (Cy3)
Total Intensity (Cy5) Ratio
Plate Name
Plate Well
A1.a1 40032 44144 1.86 1 A1A1.a10 1355840 537744 0.67 2 I17A1.a11 17600 38712 3.71 1 A1A1.a2 1309408 329272 0.42 2 I17A1.a3 106576 29248 0.46 2 A21A1.a5 35560 33472 1.59 1 A1A1.a6 1269856 505080 0.67 2 I17A1.a7 117472 5912 0.08 2 A21A1.a8 64224 18032 0.47 3 I17A1.a9 107552 20904 0.33 2 A21
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
A1.a7
PRODUÇÃO DOS MICROARRANJOS
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Geração de dados de Expressão Gênica
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intensidade Cy5 intensidade Cy3 = razão de expressão
Razão > 1(gene induzido Cy5)
Razão = 1 Razão < 1(gene induzido Cy3)
Geração de dados de Expressão Gênica
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Data miningData mining
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• Ao considerar cada um dos n chips produzidos como uma das n observações para um dado gene, é possível aplicar técnicas de análise multivariada para extrair significados biológicos dos experimentos de microarranjos de DNA.
• Clustering algorithms: reconhecer padrões nas distribuições de dados, normalmente através de métricas de distância.
• Tipos:• Aglomerativos: Hierarchical• Divisivos: k-means, SOMs• Outros: Principal Component Analysis (PCA)
Data mining
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Data mining
• A representação gráfica assume a forma de uma curva normal. • A transformação logarítmica permite representar repressões e induções de igual magnitude como valores numericamente iguais mas de sinais diferentes.•Eisen e col. (1998): LOG positivo = vermelho (gene induzido) LOG negativo = verde (gene reprimido)
Razão 0,5 ------ Log0,5 = -1 Razão 1,0 ------ Log1 = 0
Razão 2,0 ------ Log2 = 1
Distância=0,5
Distância=1,0
Distância=1,0
Distância=1,0
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Data mining
Gen
e 1
Gen
e 2
Gen
e 3
Gen
e 4
Gen
e 5
Gen
e 6
Gene1 0 1.5 1.2 0.25 0.75 1.4
Gene2 1.5 0 1.3 0.55 2.0 1.5 Gene3 1.2 1.3 0 1.3 0.75 0.3Gene4 0.25 0.55 1.3 0 0.25 0.4 Gene5 0.75 2.0 0.75 0.25 0 1.2 Gene6 1.4 1.5 0.3 0.4 1.2 0
• Após o cálculo da distância, o ponto de partida dos algoritmos de clustering é gerar uma matriz de distância.
• Os elementos da matriz são distâncias entre pares (pairwise distance).
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Aplicações
Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.
PNAS, 95 (1998)
Michael B. Eisen, Paul T. Spellman, Patrick O. Brown, and David Botstein
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The Transcriptional Program of Sporulation
in Budding Yeast
Science, 282 (1998)
S. Chu, J. DeRisi, M. Eisen, J. Mulholland, D. Botstein, P. O. Brown, I. Herskowitz
Aplicações
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Molecular Classification of
Cancer: Class Discovery and Class Prediction by Gene
Expression Monitoring.
Science, 286 (1999)
T. R. Golub, D. K. Slonim, P. Tamayo, et al.
Aplicações
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Biochips de Biochips de oligonucleotídeosoligonucleotídeos
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• Principais áreas em que a aplicação dos chips de oligonucleotídeos podem acelerar os estudos em genômica:
•Expressão gênica
•Genotipagem
•Mapeamento de bibliotecas genômicas
Biochips de Oligonucleotídeos
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Técnica de microimpressão: Técnica de microimpressão: FOTOLITOGRAFIAFOTOLITOGRAFIA
• Esta técnica de fabricação in situ foi desenvolvida pela empresa americana Affymetrix, que utiliza para fabricar os GeneChips.
Biochips de Oligonucleotídeos
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Biochips de Oligonucleotídeos
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Biochips de Oligonucleotídeos
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Biochips de Oligonucleotídeos
• Diferenciais:
1) alta densidade permite representação de genomas completos.
2) refinamento da técnica de microimpressão permite criar mutações (mismatchs) de sequências conhecidas.
3) quantificações mais precisas/ alta sensibilidade.
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Biochips de Oligonucleotídeos
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Biochips de Oligonucleotídeos
Extração DNA
cromossômico
Gene A
Amplificação por PCR na presença de fluoróforo
Cópias marcadas do
gene AHibridização com chip de
oligos
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Biochips de Oligonucleotídeos
Gene A
MISMATCH SINALMISMATCH SINAL1A 1A C G G T A C T C G G T A C T aa G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T gg G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T cc G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1T 1T C G G T A C T C G G T A C T tt G A G G A G G C T A G C T A 0 0 ++ ++
1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T T aa A G A G G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T T gg A G A G G C T A G C T A 0 0 ++ ++1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T T cc A G A G G C T A G C T A 1 1 + +1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T T tt A G A G G C T A G C T A 1 1 + +
1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T G T G aa G G G C T A G C T A 0 0 ++ ++1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T G T G gg G G G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T G T G cc G G G C T A G C T A 1 1 + +1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T G T G tt G G G C T A G C T A 1 1 + +
1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A aa G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A gg G C T A G C T A 0 0 ++ ++1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A cc G C T AG C T A 1 1 + +1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A tt G C T A G C T A 1 1 + +
Padrão normalPadrão afetado
1 2 3 4
AGCT
Pessoa 1: normal
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Biochips de Oligonucleotídeos
Gene A
MISMATCH SINALMISMATCH SINAL1A 1A C G G T A C T C G G T A C T aa G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T gg G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T cc G A G G A G G C T A G C T A 0 0 ++ ++1T 1T C G G T A C T C G G T A C T tt G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +
1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T T aa A G A G G C T A G C T A 2 2 - -1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T T gg A G A G G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T T cc A G A G G C T A G C T A 2 2 - -1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T T tt A G A G G C T A G C T A 2 2 - -
1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T G T G aa G G G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T G T G gg G G G C T A G C T A 2 2 - -1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T G T G cc G G G C T A G C T A 2 2 - -1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T G T G tt G G G C T A G C T A 2 2 - -
1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A aa G C T A G C T A 2 2 - -1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A gg G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A cc G C T AG C T A 2 2 - -1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A tt G C T A G C T A 2 2 - -
Padrão normalPadrão afetado
AGCT
1 2 3 4
Pessoa 2: afetada
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ChIP-on-CHIPChIP-on-CHIP
Chromatin Chromatin Imunnoprecipitation Imunnoprecipitation
microarraysmicroarrays
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Chromatin Imunnoprecipitation microarrays
• Normalmente, nos biochips estão representadas as partes codificantes do genoma (ESTs, cDNAs).
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Chromatin Imunnoprecipitation microarrays
• Objetivo: identificar no DNA genômico os sítios de ligação a TFs, histonas e polimerases.
• Biochips de oligonucleotídeos longos (60 pb) de ORFs e regiões intergênicas.• Representação de genomas completos (~40Mb)• Sondas: DNA imunoprecipitado x controle (precipitação sem anticorpo)
Maior sinalconfirmação
da especificidade
da ligação!
mais fragmentos do DNA
correpondente ligados nas proteína de interesse
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Chromatin Imunnoprecipitation microarrays
(~1kb)(~1kb)
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Projetos em andamento
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LGE
Estudo do perfil da expressão gênicaglobal em leucemias linfóides agudas de
linhagens de células B e T
Aluna : Diana Azevedo QueirozOrientador: Prof. Dr. Gonçalo A. G. Pereira
Laboratório de Genômica e Expressão – Departamento de Genética e Evolução – Instituto de Biologia - Unicamp
Dissertação de Mestrado em Biologia Funcional e Molecular
Análise do Perfi l de ExpressãoGênica de Mediadores
I nflamatórios em CélulasMononucleares de Pacientes
com Trombose Venosa Prof undaAlunaAluna: Michelle: Michelle Servais Rubin Servais Rubin
OrientadoraOrientadora: J oyce Maria: J oyce Maria Annichino Annichino--BizzachiBizzachi
HEMOCENTRO
UNICAMP
ESTUDO DA EXPRESSAO GENICAGLOBAL ENVOLVIDA NA PROTECAO
CARDIACA INDUZIDA PORPRECONDICIONAMENTO
ISQUEMICO E PORCOMPOSTOS QUINAZOLINICOS
Aluna : Ana Carolina Deckmann *Orientador: Prof. Dr. Kleber Gomes Franchini
* Laboratório de Genômica e Expressão – Departamento de Genética e Evolução – IB/ Unicamp Departamento de Clínica Médica – Faculdade de Ciências Médicas – Unicamp;
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LGE
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LGE
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Perspectivas LGE
Implementar ferramenta que faça o caminho inverso.
Consolidar procedimentos para produção de chips para screening e chips para investigação direcionada.
Definir protocolos alternativos para marcação das sondas.
Implementar sistema de Facility.