idiotypic mimicry supra molecular structure antibody taxol tubulin--microtubule

8/6/2019 Idiotypic Mimicry Supra Molecular Structure Antibody Taxol Tubulin--microtubule

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 9 1 , p p . 1 0 6 9 0 - 1 0 6 9 4 , O c t o b e r 1 9 9 4I m m u n o l o g y

I d i o t y p i c m i m i c r y a n d t h e a s s e m b l y o f a s u p r a m o l e c u l a r s t r u c t u r e :An a n t i - i d i o t y p i c a n t i b o d y t h a t m i m i c s t a x o l i n i t st u b u l i n - - m i c r o t u b u l e i n t e r a c t i o n s( I n t e r n a h n a g e / k d " t y p . ce t w o r k / o d r u g / p e p t i d o m l m c t l c s )

J Y H - G A N G L E U * , B I - X I N G C H E N t , ANDREW W. D I A M A N D U R O S t , AND BERNARD F . E R L A N G E R t *D e p a r t m e n t s o f * P h a r m a c o l o g y a n d t M i c r o b i o l o g y , C o m p r e h e n s i v e C a n c e r C e n t e r , C o l u m b i a U n i v e r s i t y , 7 0 1 W e s t 1 6 8 S t r e e t , Ne w Y o r k , NY 1 0 0 3 2C o m m u n i c a t e d b y N i e l s K . J e r n e , J u l y 2 0 , 1 9 9 4ABSTRACT T a x o l , r i i y e x t r c e d f r o t h e b a r k o ft h e w e s t e r n y e w , T a x u s b r e n f o l i a , i s r e p o r t e d l y t h e f i r s t o f an e w c l a s s o f a n t i - c a n c e r a g e n t . I t a c t s b y p r o m o t i n g a n dI r r e v e r s i b l y s t a b i l i z i n g m i c r o t u b u l e a s s e m b l y , t h u s I n t e r f e r i n gw i t h t h e d y n a m i c p r o c e s s e s r e q u i r e d f o r c e l l v i a b i l i t y a n dm u l t i p l i c a t i o n . . W i t h t h e a i m o f u s i n g immuno l t e c h -n i q u e s t o s t u d y t h e m ism o f a c t i o n o f t a x o l , a m o n o c l o n a la n d a i d l o t y p i c a n t i b o d y t h a t m i m i c s t a x o l w a s p r e p a r e d , u s i n ga n a u t o - a n t i - i d l o t y p i c s t r a t e g y . I t a n d i t s F a b f r a g e n t i n h i b -i t e d t h e b i n d i n g o f [ 3 H b t a x o l t o m i c r o t u b u l e s . M o r e o v e r , l i k et a x o l , b o t h p r o m o t e d t h e embl o f t u b u l i n I n t o m i c r o t u -b u l e s . T h e s e fi p r o v i d e a n e x a m p l e o f a n a n d t i - I o t y p i ca n t i b o d y c a p a b l e o f e mblig a n oraied s u p r a m o l e c u l a rs t r u c t u r e f r o m s o l u b l e c e l u l r c o m p o n e n t s . I n a d d i t i o n , i tf u r n t h e r ables t h e a b i l i t y o f a n i - i d d o t y p i c a n t i b o d i e s t o b ef i n c t i o n a l m i m i c s o f l i g a n d m o l e c u l e s b e a r i n g n o s t r u c t u r a ls i m i l a r i t t o immu l o b . T h e v a r i a b l e r e g i o n s o f t h ea n t i b o d y h a v e b e e n s e q u e n . W i t h t h e e x c e p t i o n o f t h ec o m p l e m e n t a f r t y - d e t e r m i n i n g r e g i o n 3 , t h e s e q u e n c e o f t h eh e a v y c h a i n v a r i a b l e r e g i o n i s s i m i l a r t o t h a t o f a na n t - i d l o t y p i c a n t i b o d y r a i s e d t o a n t - i n s u l i n . T h e f i n d i n g t h a ta p o l y p e p t d c a n m i m i c t a x o l r a i s e s t h e p o s s i b t h a t t a x o la c t s a s a p e p t i d o m m e d c c o m p o u n d t h a t i n t e r f e r e s w i t h t h ef l n c t i o n o f a n e n d o g e n o u s p o l y p e p t i d e .T a x o l , r e p o r t e d l y t h e f i r s t o f a new c l a s s o f a n t i - c a n c e ra g e n t s , w a s o r i g i n a l l y e x t r a c t e d f r o m t h e b a r k o f t h e w e s t e r ny e w , T a x u s b r e v i f o l i a ( 1 ) . I n v i v o , i t p r e v e n t s t h e d i s a s s e m b l yo f m i c r o t u b u l e s , c a u s i n g t h e a r r e s t o f c e l l s a t t h e G 2 / M s t e po f t h e c e l l c y c l e ( 2 ) . I t s m e c h a n i s m d i f f e r s f r o m t h a t o f o t h e ra n t i - c a n c e r a g e n t s t h a t h a v e t u b u l i n a s t h e i r t a r g e t , s u c h a sc o l c h i c i n e , p o d o p h y l l o t o x i n , o r v i n b l a s t i n e , w h i c h i n h i b i tt u b u l i n p o l y m e r i z a t i o n ( 3 ) . T h e s i t e o f a c t i o n o f t a x o l o nt u b u l i n i s b e i n g i n v e s t i g a t e d i n s e v e r a l l a b o r a t o r i e s . P h o t o -a f f i n i t y - l a b e l i n g e x p e r i m e n t s i m p l i c a t e t h e N - t e r m i n a l r e g i o no f ( 3 - t u b u l i n a s t h e s i t e o f a t t a c h m e n t ( 4 , 5 ) .W i t h t h e a i m o f u s i n g i m m u n o l o g i c a l t e c h n i q u e s t o i n v e s t i -g a t e t h e a c t i o n o f t a x o l , we s o u g h t t o p r e p a r e a n a n t i - i d i o t y p i ca n t i b o d y t h a t m i m i c s t a x o l , u s i n g a n a u t o - a n t i - i d i o t y p i c s t r a t e g y( 6 , 7 ) . We h a v e s uc c e e d e d i n o b t a i n i n g a n a n t i b o d y , 8 2 H , t h a t ,a s i n t a c t a n t i b o d y o r F a b f i a g m e n t , m i m i c s t a x o l i n i t s t u b u l i n -m i c r o t u b u l e i n t e r a c t i o n s t o t h e e x t e n t t h a t i t c a n c a u s e t u b u l i nt o a s s e m b l e i n t o m i c r o t u b u l e s .

MATERIALS A ND METHODSP r e p a r a t i o n o f a n d S c r e e n i n g f o r A n t i - I d i o t y p i c A n t i b o d i e s .T h e o b j e c t w a s t o s c r e e n f o r m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t h a ts h o w e d t a x o l - i n h i b i t a b l e b i n d i n g t o F a b f r a g m e n t s o f a f f i n i t y -p u r i f i e d r a b b i t a n t i - t a x o l a n t i b o d y R 5 8 5 ( 8 ) .

P r e p a r a t i o n o f F a b f r a g m e n t s o f R 58 5 . R a b b it a n t i - t a x o la n t i s e r u m R 5 8 5 ( 8 ) w a s a f f i n i t y - p u r i f i e d a s f o l l o w s . Twoa f f i n i t y c o lu m n s w e r e p r e p a r e d . E i t h e r 1 0 mg o f b o v i n es e r u m a l b u m i n ( B S A ) o r 1 0 mg o f t a x o l c o v a l e n t l y l i n k e d t or a b b i t s e r u m a l b u m i n ( t a x o l - R S A ) ( 8 ) w a s d i s s o l v e d i n 1 m lo f 0 . 1 M 2 - ( N - m o r p h o l i n o ) - e t h a n e s u l f o n i c a c i d ( M e s ) b u f f e r( p H 4 . 8 ) a n d a d d e d t o 2 m l o f A f f i - G e l 1 0 ( B i o - R a d ) . T h em i x t u r e s w e r e r o c k e d g e n t l y o v e r n i g h t a t 4 0 C . T h e g e l s w e r et h e n w a s h e d w i t h s e v e r a l c o l u m n v o l u m e s o f p h o s p h a t e -b u f f e r e d s a l i n e ( P B S , pH 7 . 3 ) a n d w i t h 0 . 2 M g l y c i n e h y d r o -c h l o r i d e b u f f e r ( p H 2 . 5 ) a n d t h e n e q u i l i b r a t e d w i t h P B S . S i xm i l l i l i t e r s o f R 5 8 5 a n t i s e r u m w a s f i r s t r e c i r c u l a t e d t h r o u g ht h e t a x o l - R S A - A f f i - G e l 1 0 c o l u m n o v e r n i g h t a t 4 0 C a t a r a t eo f 0 . 2 m l / m i n . T h e c o l u m n w a s t h e n e x t e n s i v e l y w a s h e d w i t hPBS a t a r a t e o f 1 . 0 m l / m i n t o r e m o v e a l l n o n s p e c i f i c a l l yb o u n d p r o t e i n s . T h e a n t i b o d i e s w e r e t h e n e l u t e d w i t h 0 . 2 Mg l y c i n e h y d r o c h l o r i d e ( p H 2 . 5 ) a t a r a t e o f 0 . 5 m l / m i n . T h ee l u t e d a n t i b o d i e s w e r e i m m e d i a t e l y n e u t r a l i z e d w i t h 2 M T r i sb a s e a n d d i a l y z e d a g a i n s t PBS a t 4 0 C o v e r n i g h t . On t h ef o l l o w i n g d a y , t h e e l u t e d a n t i b o d i e s w e r e r e c y c l e d t h r o u g ht h e B S A - A f f i - G e l 1 0 c o l u m n a t 4 0 C o v e r n i g h t t o r e m o v eB S A - b i n d i n g a n t i b o d i e s . T h e e f f l u e n t , w h i c h c o n t a i n e d a n t i -t a x o l a n t i b o d i e s i n P B S , w a s c o l l e c t e d a n d c o n c e n t r a t e d b ya C e n t r i p r e p - 1 0 c o n c e n t r a t o r ( A m i c o n ) t o a v o l u m e o f 1 - 2 m l .F a b f r a g m e n t s w e r e p r e p a r e d f r o m t h e a f f i n i t y - p u r i f i e d a n -t i b o d i e s a s d e s c r i b e d ( 9 ) .S c r e e ni ng f o r a n t i - i d i o t y p i c a n t i b o d i e s . A c o m p e t i t i v eELISA w a s u s e d t o a s s a y f o r t a x o l - i n h i b i t a b l e b i n d i n g t o t h eF a b f i a g m e n t s o f a f f i n i t y - p u r i f i e d R 5 8 5 . T h e ELISA w a s r u na s d e s c r i b e d f o r t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n t i - t a x o l a n t i b o d i e s( 8 ) e x c e p t t h a t t h e 9 6 - w e l l p l a t e w a s c o a t e d b y F a b f r a g m e n t s .T h e t a x o l s t o c k s o l u t i o n w a s 1 0 mM i n d i m e t h y l s u l f o x i d e( D M S O ) . T h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f DMSO i n a s s a y s w a s1 % .I n h i b i t i o n o f B i n d i n g o f [ 3 H J T a x o l t o M i r o t u b u l e . A n t i -b o d y 8 2 H w a s p u r i f i e d b y a p r o t e i n A - S e p h a r o s e 4 B c o l u m na s d e s c r i b e d ( 1 0 ) . F a b f r a g m e n t s w e r e p r e p a r e d f r o m a f f i n i t y -p u r i f i e d 8 2 H b y a p r e v i o u s l y d e s c r i b e d p r o c e d u r e ( 1 1 ) . M i -c r o t u b u l e s w e r e p r e p a r e d f r o m f r e s h c a l f b r a i n a c c o r d i n g t ot h e p r o c e d u r e o f S h e l a n s k i e t a l . ( 1 2 ) . T h e i n h i b i t i o n a s s a yw a s a c c o r d i n g t o P a r n e s s e t a l . ( 1 3 ) w i t h m i n o r m o d i f i c a t i o n st o a c c o m m o d a t e t h e a n t i b o d y . T u b u l i n w a s f r e s h l y p r e p a r e df r o m a m i c r o t u b u l e p e l l e t b y s u s p e n d i n g i t i n Me s b u f f e r ( 0 . 1M M e s / 0 . 5 mM M g C 1 2 / 1 mM E G T A , pH 6 . 6 ) p l u s 3 mM GTPf o r 3 0 m i n a t 4 0 C t o i n d u c e d e p o l y m e r i z a t i o n . T h i s w a sf o l l o w e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 0 , 0 0 0 x g f o r 2 0 m i n a t 4 0 C .T h e c l a r i f i e d s u p e r n a t a n t w a s a s s a y e d f o r p r o t e i n c o n t e n t b yt h e B r a d f o r d p r o c e d u r e ( 1 4 ) a n d u s e d i n t h e a s s a y .T h e t u b u l i n s o l u t i o n ( 4 0 0 p A , 1 . 5 m g / m l ) w a s i n c u b a t e d a t3 7 T C f o r 4 0 m i m i n Mes b u f f e r / 3 mM GTP t o r e g e n e r a t e t h eA b b r e v i a t i o n s : V , v a r i a b l e ; J , j o i n i n g ; CDR, c o m p l e m e n t a r i t y -d e t e r m i n i n g r e g i o n ; B S A , b o v i n e seru m a l b u m i n .t T o whom r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .

1 0 6 9 0

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .


2/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 1 ( 1 9 9 4 ) 1 0 6 9 1T a b l e 1 . J - r e g i o n p r i m e r s f o r m u r i n e h e a v y c h a i n a n d K c h a i n V r e g i o n a m p l i f i c a t i o n ( 3 ' a n t i s e n s e )

H e a v y c h a i nMJH1 3'-GTCCCTGGTGCCAGTGGCAGAGGAGTCGATCGTTA-5'MJH2 3'-GGTTCCGTGGTGAGAGTGTCAGAGGAGTCGATCGTTA-5'MJH3 3'-GGTTCCCTGAGACCAGTGACAGAGACGTCGATCGTTA-5'MJH4 3'-CAGTTCCTTGGAGTCAGTGGCAGAGGAGTCGATCGTTA-5'K c h a i nM J K 1 3'-CACCTCCGTGGTTCGACCTTTAGTTTGCATTCAGCTGTCT-5'M J o c 2 3'-CTCCCCCCTGGTTCGACCTTTATTTGCATTCAGCTGTCT-5'M J ~ O 4 3'-CCGAGCCCCTGTTTCAACCTTTATTTTGCATTCAGCTGTCT-5'M J K 5 3'-ACGACCCTGGTTCGACCTCGACTTTGCATTCAGCTGTCT-5'm i c r o t u b u l e s . S e r i a l d i l u t i o n s o f t h e a n t i b o d y o r t a x o l a n d i t sa n a l o g u e s i n P B S / 0 . 1 % NaN3 ( 3 5 0 p 4 ) w e r e a d d e d t o t h em i c r o t u b u l e p r e p a r a t i o n s . A f t e r i n c u b a t i o n a t 3 7 0 C f o r 3 0m i n , 5 0 A d o f [ 3 H ] t a x o l i n M e s b u f f e r / 3 mM GTP w a s a d d e dt o e a c h t u b e , f o l l o w e d b y i n c u b a t i o n a t 3 7 0 C f o r 4 5 m i n . T h em i c r o t u b u l e s w e r e c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 0 , 0 0 0 x gf o r 2 0 m i n a t 3 0 0 C , w a s h e d o n c e w i t h 1 m l o f Mes b u f f e r / 1 0 % 6s u c r o s e a t 3 7 0 C , a n d d i s s o l v e d i n 4 0 0 p 1 o f 0 . 1 M N a O H , a n dr a d i o a c t i v i t y w a s c o u n t e d i n a s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r .P o l y m e r i z a t i o n o f T u b u l i n t o M I c r o t u b u l e s b y 8 2 1 a n d i t sF a b F r a g m e n t . T h e t u r b i d i m e t r i c a s s a y o f P a r n e s s e t a l . ( 1 3 )w a s u s e d t o f o l l o w f o r m a t i o n o f m i c r o t u b u l e s , e x c e p t t h a t t h ea n t i b o d y o r t a x o l , i n 4 8 0 p l o f P B S / 0 . 1 % N a N 3 , w a s a d d e dt o 1 mg o f t u b u l i n p e r m l i n 6 2 0 M l o f Mes b u f f e r . T h e f i n a l pHw a s 6 . 7 5 .E l e c t r o n M i c r o s c o p y o f M i c r o t u b u l e S o . A d r o p o ft h e s u s p e n s i o n p r o d u c e d b y t h e a c t i o n o f 8 2 H o n t u b u l i n w a sp u t o n t o a c o p p e r g r i d ( c o a t e d w i t h 0 . 5 % F o r m v a r s o l u t i o n )a n d a l l o w e d t o r e m a i n t h e r e f o r 1 5 s e c . E x c e s s f l u i d w a sw i t h d r a w n u s i n g a f i l t e r p a p e r w i c k , a n d o ne d r o p o f 1%u r a n y l a c e t a t e w a s a d d e d t o t h e g r i d . E x c e s s u r a n y l a c e t a t ew a s i m m e d i a t e l y d r a w n o f f w i t h f i l t e r p a p e r , a n d t h e g r i da l l o w e d t o a i r d r y f o r s e v e r a l h o u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e a n de x a m i n e d w i t h a J o e l 1 2 0 0 E X e l e c t r o n m i c r o s c o p e .S e q u e n d n g t h e V a r i a b l e ( V ) R e g i o n s o f 8 2 H . H y b r i d o m ac e l l s w e r e c u l t u r e d i n 7 5 - c m 2 c u l t u r e f l a s k s ( F a l c o n 3 0 8 4 ) w i t hI s c o v e ' s m o d i f i e d D u l b e c c o ' s m e d i u m ( I M D M , G I B C O ) a n d5% f e t a l c a l f s e r u m . T h e t o t a l RNA w a s p u r i f i e d f r o mh y b r i d o m a c e l l s b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y Z o v i c h e t a l .( 1 5 ) .T o a m p l i f y a n d c l o n e cDNA e n c o d i n g t h e V r e g i o n s o f t h ea n t i b o d i e s , t h e m e t h o d s d e s c r i b e d b y C o l o m a e t a l . ( 1 6 , 1 7 )a n d L e u n g e t a l . ( 1 8 ) w e r e p e r f o r m e d w i t h m o d i f i c a t i o n s . T h ef i r s t s t r a n d cDNA w a s s y n t h e s i z e d i n t h e p r e s e n c e o f 2 0 1 d( 4 0 p i g ) o f p u r i f i e d t o t a l RNA i n H 2 0 a n d 1 p i ( 3 0 0 n g ) o f e a c hj o i n i n g ( J ) - r e g i o n p r i m e r ( T a b l e 1 ) f o r e i t h e r h e a v y c h a i n o r K

c h a i n ( f o u r p r i m e r s e a c h ) . T h e m i x t u r e ( 2 4 p 1 ) w a s i n c u b a t e df o r 5 0 m i n a t 6 5 0 C t o a n n e a l RNA w i t h t h e p r i m e r s a n d t h e nc o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 0 m i n . S y n t h e s i s o f t h ecDNA w a s p e r f o r m e d i n a 5 S - p l r e a c t i o n v o l u m e i n t h ep r e s e n c e o f 2 3 p A o f a n n e a l i n g m i x t u r e , 1 0 A o f 5 x e l o n g a t i o nb u f f e r ( P r o m e g a ) , 0 . 5 p 1 o f 1 0 mM d N T P s , 1 p 1 o f R N a s ei n h i b i t o r ( P r o m e g a ) , 3 p l o f r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e ( 2 0 0 u n i t s /p 1 ) , a n d 1 2 A 1 o f d i s t i l l e d H20 a t 3 7 0 C f o r 3 h r .T h e P CR w a s p e r f o r m e d i n a v o l u m e o f 1 0 0 p 1 i n t h ep r e s e n c e o f 2 A ( 6 0 0 n g ) o f e a c h l e a d e r r e g i o n ( 1 6 ) a n dJ - r e g i o n p r i m e r s ( T a b l e 1 ) , 1 5 p 1 o f cDNA f r o m t h e p r e v i o u ss t e p , 2 p 1 o f 1 0 mM d N T P s ( P r o m e g a ) , 1 0 p 1 o f l O x PCRb u f f e r ( P r o m e g a ) , 5 8 p 1 o f d i s t i l l e d H 2 0 , a n d 1 p 1 o f T a qp o l y m e r a s e ( 5 0 0 0 u n i t s / m l ) ( P r o m e g a ) . T h e P CR p r o d u c t w a sp u r i f i e d b y e l e c t r o p h o r e s i s i n a n e t h i d i u m b r o m i d e - s t a i n e d3% l o w - m e l t i n g TAE ( 4 0 mM o f T r i s a c e t a t e / 2 mM o f EDTA,pH 8 . 5 ) a g a r o s e g e l . T h e s i n g l e b a n d w i t h a l e n g t h b e t w e e n4 0 0 a n d 5 0 0 n u c l e o t i d e s w a s e x c i s e d a n d m e l t e d a t 6 5 C .A f t e r c o o l i n g t o 4 2 0 C , t h e PCR p r o d u c t w a s c l o n e d b y a TAc l o n i n g k i t ( I n v i t r o g e n , V e r s i o n 2 . 0 ) a c c o r d i n g t o t h e m a n u -f a c t u r e r ' s p r o t o c o l . W h i t e c o l o n i e s i n LB a g a r w i t h 5 - b r o m o -4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l 3 - D - g a l a c t o s i d e w e r e p i c k e d u p f o r c o n -t i n u o u s c u l t u r e , a n d t h e DNA o f e a c h c o l o n y w a s a n a l y z e d( 1 9 ) .T h e p l a s m i d s o f t h e c o l o n i e s w i t h c o r r e c t i n s e r t s w e r ep u r i f i e d f o r s e q u e n c i n g u s i n g a p l a s m i d p r e p a r a t i o n k i t ( Q i a -g e n , C h a t s w o r t h , C A ) a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s p r o -t o c o l . S e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d b y t h e d i d e o x y n u c l e o t i d ec h a i n - t e r m i n a t i o n m e t h o d w i t h a S e q u e n a s e k i t ( U n i t e dS t a t e s B i o c h e m i c a l , V e r s i o n 2 . 0 ) . S e v e r a l i n d e p e n d e n tc l o n e s w e r e s e q u e n c e d i n b o t h d i r e c t i o n s t o g e t t h e c o m p l e t es e q u e n c e o f t h e V r e g i o n .

RESULTSI s o l a t i o n o f A n t i - I d l o t y p i c A n t i b o d i e s . B A L B / c m i c e w e r ei m m u n i z e d w i t h a c o n j u g a t e o f B SA a n d t a x o l a n d h y b r i d -

1 0 0

6 0 -04 0 -

O . 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0C o n c e n t r a t i o n s o ft a x o l a n a l o g u e s ( u M )

F I G . 1 . I n h i b i t i o n o f t h e b i n d i n g o f 8 2 H t o F a b f r g m e n t s o fa f f i n i t y - p u r i f i e d r a b b i t a n t i - t a x o l a n t i b o d i e s b y t a x o l a n d t a x o l a n a -l o g u e s , b y E L I S A . 9 , T a x o l ; o , t a x o t e r e ; m , b a c c a t i n I I I m . T h e r e s u l t sa r e m e a n s o f d u p l i c a t e p o i n t s a n d a r e e x p r e s s e d a s p e r c e n t a g ei n h i b i t i o n r e l a t i v e t o t h e a b s o r b a n c e a t 4 9 0 nm m e a s u r e d i n t h ea b s e n c e o f i n h i b i t o r i n t h e E L I S A .

c0. 0c2C _

. 0 1 . 1 1C o n c e n t r a t i o n s o fp r o t e i n s ( m g / m l )

F I G . 2 . I n h i b i t i o n o f t h e b i n d i n g o f [ 3 H i t a x o l t o m i c r o t u b u l e s b ya n t i b o d i e s . * , 8 2 H ; o , F a b f i r a n e n t s ; A , c o n t r o l a n t i b o d y ( a n t i -t h y m i n e g l y c o l ) o f s a m e i s o t y p e ( 2 1 ) . ( N o t e : T h i s a n t i b o d y w a se r r o n e o u s l y d e s c r i b e d a s a n I g G 2 a i n r e f . 2 1 . ) T h e r e s u l t s a r e m e a n so f d u p l i c a t e p o i n t s a n d a r e e x p r e s s e d a s p e r c e n t a g e i n h i b i t i o nr e l a t i v e t o s p e c i f i c [ 3 H ] t a x o l b i n d i n g m e a s u r e d i n t h e a b s e n c e o fi n h i b i t o r s i n R I A .

I m m u n o l o g y : L e u e t a l .


3/5

1 0 6 9 2 I m m u n o l o g y : L e u e t a l .0 . 2 0 - jEC 0 . 1 5 -c mc o_ a 0 . 1 0 -

6 0 . 0 5

ECC uC6 .6 o

0 1 0 2 0 3 0 40 5 0 60 70 80 9 0M i n u t e s

0 1 0 20 3 0 40 5 0 60Minutes

F I G . 3 . P o l y m e r i z a t i o n o f t u b u l i n t o m i c r o t u b u l e s b y 8 2 H , i t s F a b f i r m e n t , a n d t a x o l . ( A ) Two d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f 8 2 H : 0 , 6 P M8 2 H ; A , 3 pM 8 2 H . ( B ) e , 6 p u M 8 2 H ; o , 1 2 uM 8 2 H F a b ; u , 2 0 pM t a x o l ; A , 6 p u M 2 6 F ; o , PBS b u f f e r .

_

t .rVW4 . .I 5 S i-Y... i . 3 k- - . A X L - - I rl i ; . " A F. - : A.. . ,

% I " b 4ft

I. -wF I G . 4 . E l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f t h e s u s p e n s i o n p r o d u c e d b y 6 pM 8 2 H d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d t o F i g . 3 . ( A , X 1 5 , 0 0 0 ; B ,x 2 5 , 2 0 0 ; C , x 1 2 6 , 0 0 0 . )

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 1 ( 1 9 9 4 )

.I w

B .l A ..4- A r A i L ., .- r . ; i rM . M - . - ,. 6 ..I ' m " - - F , POl . l i . .317

}

- , ! : , I


4/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 1 ( 1 9 9 4 ) 1 0 6 9 3CAG ATC CAG TTG G TG CAG TC T G G A CC T G AG C TG A AG AAG CCT G G A G A G ACA G TC AAG ATC 6 0Q Q L V Q S G P E L K K P G E T V KT O C TG C AAG G CT TC T GGT TA T GCC TT C ACA GAC TA T TC A AT G CAC T GG G TG AAG CAG G C T 1 2 0S C K A S G Y A F T D Y S M H W V K Q ACCA G GA AAG GGT TT A A AG T GG ATG G G C TGG AT A AA C A C T GA G A C T G GT G A G CC A A C A TA T 1 8 0P G K G L K W M G W I NT ET G E P T YGCA GAT G AC TT C AG G G GA CG G H T GCC TT C T C T T T G GAA ACC T C T GCC AGC A C T GCC TA T 2 4 0A DDFR G R F A F S L E T S A Y T A YTT G CAG A TC A AC A AC C TC AAA AA T GAG G AC ACG GCT ACA TA T TT C TGT GCT AGA GAG TA T 3 0 0L 0 1 N N L K N E D T A T Y F C A R E YGOC OCA TAC TT C GAT GTC TGG G G C GCA G G G ACCA P Y F D V W G A G T

F I G . 5 . N u c l e o t i d e a n d d e d u c e d a m i n o a c i d s e q u e n c e o f t h e cDNA e n c o d i n g t h e V r e g i o n o f t h e h e a v y c h a i n o f 8 2 H . U n d e r l i n i n g i n d i c a t e st h e C D R s .omas were p r e p a r e d as d e s c r i b e d f o r t h e i s o l a t i o n o f m o n o -c l o n a l a n t i - t a x o l a n t i b o d i e s ( 8 ) . I n t h i s c a s e , h o w e v e r , screen-i n g b y ELISA was f o r a n t i b o d i e s c a p a b l e o f t a x o l - i n h i b i t a b l eb i n d i n g t o t h e F a b f r a g m e n t o f a f f i n i t y - p u r i f i e d r a b b i t a n t i -t a x o l a n t i b o d y . P o s i t i v e c l o n e s were s u b c l o n e d t w i c e b y t h et e c h n i q u e o f l i m i t i n g d i l u t i o n s a n d t e s t e d f o r t h e i r a b i l i t y t oi n h i b i t t h e b i n d i n g o f [ H ] t a x o l t o m i c r o t u b u l e s .P r o p e r t i e s o f A n t i - I d i o t y p i c A n t i b o d y 8 2 H . One a n t i b o d y ,8 2 H , an I g G 2 b , was s e l e c t e d f o r f u r t h e r s t u d y b e c a u s e i ts t r o n g l y i n h i b i t e d t h e b i n d i n g o f [ 3 H ] t a x o l t o m i c r o t u b u l ep r e p a r a t i o n s . I t h a d t h e f o l l o w i n g c h a r a c t e r i s t i c s :( i ) I t s b i n d i n g t o F a b o f r a b b i t a n t i - t a x o l w as i n h i b i t e d b yt a x o l a n d t a x o t e r e ( 2 0 ) , b o t h a c t i v e a n t i - t u m o r a g e n t s , b u t n o tb y b a c c a t i n I I I , a s t r u c t u r a l l y r e l a t e d c o m p o u n d d e v o i d o fa n t i - t u m o r a c t i v i t y ( F i g . 1 ) .( i i ) A n t i b o d y 82H a n d i t s Fab f r a g m e n t i n h i b i t e d t h eb i n d i n g o f [ 3 H ] t a x o l t o m i c r o t u b u l e s w i t h an I C 5 0 o f 1 P M a n d3 u M , r e s p e c t i v e l y ( F i g . 2 ) . A c o n t r o l m o n o c l o n a l I g G 2 ba n t i b o d y , 2 6 F , s p e c i f i c f o r t h y m i n e g l y c o l ( 2 1 ) , was i n a c t i v e .T h e r e l i a b i l i t y o f t h e assay w as t e s t e d b y a s s a y i n g f o ri n h i b i t i o n b y t a x o l , t a x o t e r e , a n d b a c c a t i n I I I . T a x o l a n dtaxotere inhibited binding: IC 5 0 3 pMfor b o t h ; noi n h i b i -t i o n was seen w i t h b a c c a t i n I I I ( d a t a n o t s h o w n ) . C o n t r o le x p e r i m e n t s were a l s o ru n t o show t h a t 8 2H d i d n o t b i n dt a x o l .( i i i ) When i n c u b a t e d w i t h t u b u l i n a t 3 7 C , a n d t h e assem-b l i n g o f m i c r o t u b u l e s was f o l l o w e d t u r b i d i m e t r i c a l l y ( 1 3 ) ,82H a n d i t s F a b f r a g m e n t i n d u c e d t h e f o r m a t i o n o f m i c r o t u -b u l e s , w h i c h , l i k e t h o s e p r o d u c e d b y t a x o l , were n o t d i s s o -c i a t e d b y C a 2 + ( 2 2 ) . As w i t h t a x o l , t h e curves were s i g m o i d a l ,a l t h o u g h t h e l a g p e r i o d s f o r t h e a n t i b o d y a n d i t s Fab werec o n s i d e r a b l y l o n g e r , t h a t o f t h e i n t a c t a n t i b o d y b e i n g t h el o n g e s t ( F i g . 3 ) . T h i s i s i n a c c o r d w i t h t h e r e l a t i v e l y h i g hm o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e i m m u n o g l o b u l i n m o l e c u l e s c o m -p a r e d t o t a x o l , w h i c h w o u l d r e s u l t i n a s l o w e r r a t e o f d i f f u s i o n( r e f . 2 3 , pp. 5 8 2 - 5 8 4 ) . A d d e d t o t h a t i s t h e l e s s e r p r o b a b i l i t yo f a p r o d u c t i v e c o l l i s i o n t h a n i n t h e case o f t a x o l - i . e . , o nei n w h i c h c o n t a c t i s made b y t h e c o m b i n i n g s i t e o f t h ea n t i b o d y , w h i c h o c c u p i e s a r e l a t i v e l y s m a l l s i t e i n t h e i m -m u n o g l o b u l i n s .E l e c t r o n M i c r o s c o p i c E x a m i n a t i o n o f t h e P u t a t i v e M i c r o t u -b u l e s . E l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f t h e p r o d u c t i n -d u c e d b y i n t a c t a n t i b o d y r e v e a l e d t y p i c a l m i c r o t u b u l e s t r u c -t u r e s ( 2 4 ) w i t h arrays o f a n t i b o d y - l i k e m o l e c u l e s a l o n g t h es u r f a c e ( F i g . 4 ) . T h e m i c r o t u b u l e s m e a s u r e d a b o u t 2 4 0 A i nd i a m e t e r ; so m e w er e as l o n g as 2 - 3 um. T h e a n t i b o d y - l i k em o l e c u l e s w er e a b o u t 1 2 5 A i n s i z e . B o t h measurements arei n a g r e e m e n t w i t h d a t a i n t h e l i t e r a t u r e ( 2 4 , 2 5 ) .

S e q u e n c i n g t h e V R e g i o n s o f 8 2 H . T h e a m i n o a c i d s e q u e n c eo f t h e l i g h t c h a i n V r e g i o n , e x c e p t f o r o n e a m i n o a c i d i nc o m p l e m e n t a r i t y - d e t e r m i n i n g r e g i o n 2 ( C D R 2 ) , w a s i d e n t i c a lt o t h e s e q u e n c e s o f s e v e r a l t y p e V K c h a i n s ( P 6 5 ) i n t h e K a b a te t a l . d a t a b a s e ( 2 6 ) .T h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f t h e h e a v y c h a i n o f 8 2 H ( F i g .5 ) , u p t o t h e CDR3 r e g i o n , w a s a l m o s t i d e n t i c a l t o t h a t o f a na n t i - i d i o t y p i c a n t i b o d y t o a n a n t i - i n s u l i n a n t i b o d y , e x c e p t f o rt h r e e a m i n o a c i d s i n f r a m e w o r k r e g i o n s a t p o s i t i o n s 1 0 , 2 8 ,a n d 3 9 ( 2 7 ) . I t s CDR3 s e q u e n c e , h o w e v e r , w a s m a r k e d l yd i f f e r e n t : VFYDGYYAWFPY v s . EYAPYFDV i n 8 2 H .

DISCUSSIONT h e c o n c e p t o f t h e " i n t e r n a l i m a g e " w a s p u t f o r t h b y J e r n e( 2 8 , 2 9 ) a n d e x p a n d e d u p o n b y o t h e r s ( 3 0 - 3 2 ) . T h i s c o n c e p ti m p l i e s t h a t t h e i m m u n e r e p e r t o i r e i s d i v e r s e e n o u g h t oc o n t a i n i m m u n o g l o b u l i n s w i t h s p e c i f i c i t i e s t h a t " r e f l e c t t h eo u t s i d e w o r l d " ( 2 9 ) . I t w o u l d f o l l o w , t h e n , t h a t w i t h a p p r o -p r i a t e r i g o r o u s s c r e e n i n g a n d d e t e c t i o n p r o c e d u r e s a n t i b o d -i e s c o u l d b e f o u n d t h a t m i m i c k e d " a n y " a n t i g e n i n t h eo u t s i d e w o r l d .T h i s i d e a i s b y n o m e a n s u n i v e r s a l l y a c c e p t e d . F o r e x a m -p l e , a r e c e n t a r t i c l e c l a i m e d t o h a v e " u n d e r m i n e d " t h ec o n c e p t o f m i m i c r y b e t w e e n a n t i b o d i e s , r e c e p t o r s , a n d t h e i rl i g a n d s ( 3 3 ) . T h e c r i t i c i s m w a s a p p l i e d p a r t i c u l a r l y t o m i m -i c r y b y a n t i b o d i e s t h a t b e a r n o s t r u c t u r a l s i m i l a r i t y t o t h ei m m u n i z i n g l i g a n d , w h i c h w a s d e s c r i b e d a s a " c h a n c e e v e n to f i n c a l c u l a b l e f r e q u e n c y " ( 3 4 ) .A n t i b o d y 8 2 H f i t s t h a t d e s c r i p t i o n - i . e . , i t b e a r s n o s t r u c t u r a ls i m i l a r i t y t o t a x o l . T h e f a c t t h a t 8 2 H i s a n t i - i d i o t y p i c a n d w a sg e n e r a t e d a n d s e l e c t e d d e l i b e r a t e l y f o r t a x o l m i m i c r y s h o u l d ,f i n a l l y , m u t e t h e c o n t r o v e r s y o v e r t h e c o n c e p t o f f u n c t i o n a lm i m i c r y b e t w e e n a n t i b o d i e s , r e c e p t o r s , a n d t h e i r l i g a n d s , r e -g a r d l e s s o f p e r c e p t i o n s o f s i m i l a r i t i e s o n t h e b a s i s o f c h e m i c a ls t r u c t u r e . An a n a l o g y c a n b e m a d e w i t h t h e f a c t t h a t p o l y c y c l i co p i o i d s a n d p o l y p e p t i d e e n d o r p h i n s a c t a t t h e s a m e r e c e p t o r .A n t i b o d y 8 2 H , r a t h e r t h a n j u s t m i m i c k i n g t h e b i n d i n g o ft a x o l t o m i c r o t u b u l e s , i s c a p a b l e o f a s s e m b l i n g t h e s u p r a m o -l e c u l a r s t r u c t u r e f r o m s o l u b l e c e l l u l a r c o m p o n e n t s - i . e . ,f r o m t u b u l i n . T h e r e i s n o p r e c e d e n t f o r t h i s k i n d o f a c t i v i t yo n t h e p a r t o f a n i m m u n o g l o b u l i n . I t o p e n s u p new p o s s i b i l -i t i e s f o r t h e a p p l i c a t i o n o f i n t e r n a l i m a g e a n t i b o d i e s t o t h es t u d y o f b i o l o g i c a l s y s t e m s .We h a v e s e q u e n c e d t h e V r e g i o n s o f 8 2 H . T h e p u r p o s e w a st o g a i n i n s i g h t i n t o t h e p e p t i d e s e q u e n c e ( s ) r e s p o n s i b l e f o r t h em i m i c r y , i n f o r m a t i o n t h a t c a n b e o f v a l u e f o r t h e d e s i g n o fne w a n t i - c a n c e r a g e n t s w i t h t a x o l - l i k e a c t i v i t y . B e c a u s e o ft h e a p p a r e n t i m p o r t a n c e o f t h e CDR3 s e q u e n c e f o r t h e

I m m u n o l o g y : L e u e t a l .


5/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 9 1 ( 1 9 9 4 )s p e c i f i c i t y o f 82H ( s e e a b o v e ) , a p p r o p r i a t e p e p t i d e s c a n b es y n t h e s i z e d t o t e s t t h i s p o s s i b i l i t y . X - r a y c r y s t a l l o g r a p h i ca n a l y s i s o f t h e s t r u c t u r e o f t h e F a b f r a g m e n t s h o ul d p r o v id ei n f o r m a t i o n c o n c e r n i n g t h e c o n f o r m a t i o n o f t h e p e p t i d e se n g a g e d i n t h e t a x o l m i m i c r y .T h e f i n d i n g t h a t a p o ly pe p t id e c a n m i m i c t a x o l r a i s e s t h ep o s s i b i l i t y t h a t t a x o l a c t s a s a p e p t i d o m i m e t i c c o m p o u n d t h a ti n t e r f e r e s w i t h t h e f u n c t i o n o f a n e n d o g e n o u s c e l l u l a r p o l y -p e p t i d e .We t h a n k M . L . S h e l a n s k i f o r a d v i c e a n d d i s c u s s i o n s , W. M e l l a d of o r h e l p i n p r e p a r i n g t u b u l i n , a nd K . B r o w n f o r h e l p w i t h t h e e l e c t r o nm i c r o s c o p y . T a x o t e r e w a s a g i f t o f D r . P . P o t i e r o f t h e I n s t i t u t d eC h i m i e d e s S u b s t a n c e s N a t u r e l l e s ( C N R S ) , G i f - S u r - Y v e t t e , F r a n c e a n dD r . J . - L . F a b r e o f R h o n e - P o u l e n c R o r e r ( A n t o n y , F r a n c e ) . We t h a n kD r s . S . L . M o r n s o n a n d E . A . K a b a t f o r t h e p r i m e r s . T h i s w o r k w a ss u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h , t h e A m e r -i c a n C a n c e r S o c i e t y , a n d t h e D e v e l o p m e n t F u n d o f C o l u m b i a -P r e s b y t e r i a n C a n c e r C e n t e r ( B . F . E . ) a n d b y a f e l l o w s h i p f r o m t h eD e p a r t m e n t o f E d u c a t i o n , T a i w a n , R e p u b l i c o f C h i n a ( J . - G . L . ) .

1 . W a n i , M . C . , T a y l o r , H . L . , W a l l , M . E . , C o g g o n , P . & McP h a i l , A . T . ( 1 9 7 1 ) J . Am. C h e m . S o c . 9 3 , 2 3 2 5 - 2 3 2 7 .2 . S c h i f f , P . B . , F a n t , J . & H o r w i t z , S . B . ( 1 9 7 9 ) N a t u r e ( L o n d o n )2 7 7 , 6 6 5 - 6 6 7 .3 . P a r n e s s , J . & H o r w i t z , S . B . ( 1 9 8 1 ) J . C e l l B i o l . 9 1 , 4 7 9 - 4 8 7 .4 . R a o , S . , H o r w i t z , S . B . & R i n g e l , I . ( 1 9 9 2 ) J . N a t l . C a n c e r I n s t .8 4 , 7 8 5 - 7 8 8 .5 . R a o , S . , K r a u s s , N . E . , H e e r d i n g , J . M . , S w i n d e l l , C . S . ,R i n g e l , I . , O r r , G . A . & H o r w i t z , S . B . ( 1 9 9 4 ) J . B i o l . C h e m .2 6 9 , 3 1 3 2 - 3 1 3 4 .6 . C l e v e l a n d , W. L . , W a s s e r m a n n , N . H . , S a r a n g a r a j a n , R . ,P e n n , A . S . & E r l a n g e r , B . F . ( 1 9 8 3 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 0 5 ,5 6 - 5 7 .7 . E r l a n g e r , B . F . ( 1 9 9 1 ) B i o c h e m . S o c . T r a n s . 1 9 , 1 3 8 - 1 4 3 .8 . L e u , J . - G . , C h e n , B . - X . , S c h i f f , P . B . & E r l a n g e r , B . F . ( 1 9 9 3 )C a n c e r R e s . 5 3 , 1 3 8 8 - 1 3 9 1 .9 . L o m b e s , M . , E d e l m a n , I . S . & E r l a n g e r , B . F . ( 1 9 8 9 ) J . B i o l .C h e m . 2 6 4 , 2 5 2 8 - 2 5 3 6 .1 0 . C o l i g a n , J . E . , K r u i s b e e k , A . M . , M a r g u l i e s , D . H . , S h e v a c h ,E . M . & S t r o b e r , W. ( 1 9 9 2 ) C u r r e n t P r o t o c o l s i n I m m u n o l o g y( W i l e y , New Y o r k ) .

1 1 . L o m b e s , M . , D e s f o s s e s , B . , C i t t a n o v a , N . & E r l a n g e r , B . F .( 1 9 8 9 ) J . I m m u n o l . 1 4 3 , 4 0 7 8 - 4 0 8 3 .

1 2 . S h e l a n s k i , M . L . , G a s k i n , F . & C a n t o r , C . R . ( 1 9 7 3 ) P r o c .N a t i . A c a d . S c i . USA 7 0 , 7 6 5 - 7 6 8 .1 3 . P a r n e s s , J . , K i n g s t o n , D . G . I . , P o w e l l , R . G . , H a r r a c k s i n g h ,C . & H o r w i t z , S . B . ( 1 9 8 2 ) B i o c h e m . B io p h y s. R e s. C o m m u n .1 0 5 , 1 0 8 2 - 1 0 8 9 .1 4 . B r a d f o r d , M . M . ( 1 9 7 0 ) A n a l . B i o c h e m . 7 2 , 2 4 8 - 2 5 4 .1 5 . Z o v i c h , D . C . , O r o l o g a , A . , O k u n o , M . , K o n g , L . W . , T a l -m a g e , D . A . , P i a n t e d o s i , R . , G o o d m a n , D . S . & B l a n e r , W . S .( 1 9 9 2 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 7 , 1 3 8 8 4 - 1 3 8 8 9 .1 6 . C o l o m a , M . J . , H a s t i n g s , A . , W i m s , L . A . & M o r r i s o n , S . L .( 1 9 9 2 ) J . I m m u n o l . M e t h o d s 1 5 2 , 8 9 - 1 0 4 .1 7 . C o l o m a , M . J . , L a r r i c k , J . W . , A y a l a , M . & G a v i l o n d o - C o w -l e y , J . V . ( 1 9 9 1 ) B i o T e c h n i q u e s 1 1 , 1 5 2 - 1 5 6 .1 8 . L e u n g , S . , D i o n , A . S . , P e l l e g r i n i , M . C . , G o l d e n b e r g , D . M .& H a n s e n , H . J . ( 1 9 9 3 ) B i o T e c h n i q u e s 1 5 , 2 8 6 - 2 9 2 .1 9 . B e r g h a m m e r , H . & A u e r , B . ( 1 9 9 3 ) B i o T e c h n i q u e s 1 4 , 5 2 7 - 5 2 8 .2 0 . G u e r i t t e - V o e g e l e i n , F . , G u e n a r d , D . , L a v e l l e , F . , L e G o f f ,M . - T . , M a n g a t a l , L . & P o t i e r , P . ( 1 9 9 1 ) J . M e d . C h e m . 3 4 ,9 9 2 - 9 9 8 .2 1 . C h e n , B . - X . , H u b b a r d , K . , I d e , H . , W a l l a c e , S . & E r l a n g e r ,B . F . ( 1 9 9 0 ) R a d i a t . R e s . 1 2 4 , 1 3 1 - 1 3 6 .2 2 . S c h i f f , P . B . & H o r w i t z , S . B . ( 1 9 8 1 ) B i o c h e m i s t r y 2 0 , 3 2 4 7 -3 2 5 2 .2 3 . C a n t o r , C . R . & S c h i m m e l , P . R . ( 1 9 8 0 ) B i o p h y s i c a l C h e m i s -t r y : P a r t 2 p p . 5 8 2 - 5 8 4 ( F r e e m a n , S a n F r a n c i s c o ) .2 4 . B e h n k e , 0 . ( 1 9 7 5 ) C y t o b i o l o g i e 1 1 , 3 6 6 - 3 8 1 .2 5 . V a l e n t i n e , R . C . & G r e e n , N . M . ( 1 9 6 7 ) J . M o l . B i o l . 2 7 ,6 1 5 - 6 1 7 .2 6 . K a b a t , E . A . , W u , T . T . , P e r r y , H . M . , G o t t e s m a n , K . S . &F o e l l e r , C . ( 1 9 9 1 ) S e q u e n c e s o f P r o t e i n s o f I m m u n o l o g i c a lI n t e r e s t ( U . S . D e p t . H e a l t h Hum. S e r v . ) , 5 t h e d .2 7 . T h o m a s , J . W. ( 1 9 9 2 ) E u r . J . I m m u n o l . 2 2 , 2 4 4 5 - 2 4 4 8 .2 8 . J e r n e , N . K . ( 1 9 7 4 ) A n n . I n s t . P a s t e u r / l I m m u n o l . 1 2 5 C , 3 7 3 -3 8 9 .2 9 . J e r n e , N . K . ( 1 9 8 4 ) I m m u n o l . R e v . 7 9 , 5 - 2 4 .3 0 . N i s o n o f f , A . & L a m o y i , E . ( 1 9 8 1 ) C l i n . I m m u n o l . I m m u n o p a -t h o l . 2 1 , 3 9 7 - 4 0 6 .3 1 . G a u l t o n , G . N . & G r e e n e , M . I . ( 1 9 8 6 ) A n n u . R e v . I m m u n o l . 4 ,2 5 3 - 2 8 0 .3 2 . E r l a n g e r , B . F . ( 1 9 8 9 ) I n t . R e v . I m m u n o l . 5 , 1 3 1 - 1 3 7 .3 3 . D a v i s , S . J . , S c h o c k m e l , G . A . , S o m o z a , C . , B u c k , D . W . ,H a l e y , D . G . , R i e b e r , E . P . , R e i t e r , C . & W i l l i a m s , A . F .( 1 9 9 2 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 5 8 , 7 6 - 7 9 .3 4 . D a v i s , S . J . ( 1 9 9 3 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 6 1 , 2 1 2 ( l e t t e r ) ; i n r e p l y t oE r l a n g e r , B . F . , 2 1 1 - 2 1 2 .

1 0 6 9 4 I m m u n o l o g y : L e u e t a l .

idiotypic mimicry supra molecular structure antibody taxol tubulin--microtubule

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