～ミックスモードカラム～...pka:4.75 移動相:ph2.75 移動相:ph6.75...

©2012 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.

TCI Chromatography DepartmentTCI Chromatography Department

～～ミックスモードカラムミックスモードカラム～～

ODSODSとの違いとの違い

移動相の考え方移動相の考え方


逆相とミックスモード：充填剤の違い逆相とミックスモード：充填剤の違い

ODSカラムに用いる充填剤

オクタデシル基をシリカゲルに化学結合

ミックスモードカラムに用いる充填剤

オクタデシル基とイオン交換基両方を有する試薬をシリ

カゲルに化学結合

※弊社製品はODSとイオン交換の充填剤を混ぜることはしており

ません

疎水性部分：イオン交換基：


分離モード逆相ミックスモード

カラム ODS ODS+イオン交換

疎水性化合物分析有効有効

酸性化合物分析

弱酸性化合物：移動相pHを下げ解離抑制させ

て分析。

強酸性化合物：酸性物質用イオン対試薬を移動相に添加

ODS+アニオン交換系カラムを選択（Kaseisorb LC ODS-SAX Superなど）

緩衝液（弱酸性～中性条件）で酸性化合物を解離状態にして分析。イオン対試薬の添加は不要。

塩基性化合物分析

塩基性物質用イオン対試薬を移動相に添加

ODS+カチオン交換系カラムを選択（TCI Dual ODS-CX15など）

緩衝液（酸性～弱酸性条件）で塩基性化合物を解離状態にして分析。イオン対試薬の添加は不要。

逆相とミックスモード：条件の違い1逆相とミックスモード：条件の違い1


分離モード逆相ミックスモード

有機溶媒の種類アセトニトリル、メタノール、THF等

ODSと同じ

有機溶媒比率疎水性試料の保持は水との混合比率で調整する

ODSと同じ

緩衝液イオン性試料分析時に必要必要

緩衝液の種類リン酸系、酢酸系、ギ酸系等 ODSと同じ

イオン対試薬イオン性試料の保持が弱い場合に使用

不要

イオン対試薬濃度 2～10mM程度不要

緩衝液濃度 5mM～50mM程度 ODSと同じ

グラジエント溶出有効有効

逆相とミックスモード：条件の違い2逆相とミックスモード：条件の違い2


カラム選択：カチオン交換タイプカラム選択：カチオン交換タイプ

TCI Dual ODS-CX15（ODS+中カチオン交換）

TCI Dual ODS-CX10（ODS+強カチオン交換）

TCI Dual ODS-CX20（ODS+弱カチオン交換）

保持が弱い場合保持が強い場合

塩基性化合物

保持の強さはカラムのイオン交換基の強さと同じ順序になる場合が多いODS-CX10(強カチオン交換)＞ODS-CX15(中カチオン交換)＞ODS-CX20(弱カチオン交換)


Column Size : 4.6 mmI.D. × 150 mmMobile Phase: CH3CN / 50mmol/L HCOONH4 (pH3.5)=70/30Flow Rate : 1.0 ml/minDetection : UV 254 nmTemperature : 25 ℃Sample :

1. VMA 2. DOPA 3. HVA4. Noradrenaline5. Adrenaline 6. Creatinine 7. Dopamine 8. Serotonin9. Tyramine

10. Isoproterenol

3110

97

6

54

カチオン交換系分離比較①カチオン交換系分離比較①

保持の強さ: TCI Dual ODS-CX20 < TCI Dual ODS-CX15 < TCI Dual ODS-CX10

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

-100000

-50000

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000uV

8

321

1098654 7

2,4,5,7,8,9,106

1,3

2

本条件下 (pH 3.5)ではイオン交換基が

解離抑制されるため保持が弱くなっています(中性条件では保持が強まります）

TCI Dual ODS-CX20

TCI Dual ODS-CX15

TCI Dual ODS-CX10


0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min

-100000

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

uV

Column Size : 4.6 mmI.D. × 50 mmMobile Phase : CH3CN / 20mmol/L KH2PO4 (pH3.0) = 40/60Flow Rate : 1.0 ml/minDetection : UV 230 nmTemperature : 25 ℃Sample : Melamine

保持の強さ: TCI Dual ODS-CX20 < TCI Dual ODS-CX15 < TCI Dual ODS-CX10

TCI Dual ODS-CX20

TCI Dual ODS-CX15

TCI Dual ODS-CX10

カチオン交換系分離比較②カチオン交換系分離比較②


カラム選択：アニオン交換タイプカラム選択：アニオン交換タイプ

Kaseisorb LC ODS-SAX Super

TCI Dual ODS-AX10

TCI Dual ODS-AX20

保持が弱すぎる場合

まだ保持が弱い場合

酸性化合物

保持の強さは以下の様になる場合が多い。ODS-AX20(弱アニオン交換)＞ODS-AX10(強アニオン交換)＞ODS-SAX(強アニオン交換)


アニオン交換系の分離比較アニオン交換系の分離比較

Mobile Phase : pH7.0 ⇒ CH3CN/ 50mmol/L K2HPO4 （pH7.0, H3PO4)=50/50pH5.0 ⇒ CH3CN/ 50mmol/L CH3COONH4 (pH5.0, CH3COOH)=50/50pH3.5 ⇒ CH3CN/ 50mmol/L HCOONH4(pH3.5, HCOOH)=50/50

Detection : UV254nm Flow Rate : 1.0mL/min Temperature : 30 ℃ Column Size : 4.6mmI.D.×150mmSample : 1.Benzene 2.Toluene 3.Ethylbenzene 4.Benzenesulfonic Acid

5.p-Toluenesulfonic Acid 6.4-Ethylbenzenesulfonic Acid

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

uV

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

uV

0 10 20 30 40 50 60 70 80 min

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

uV

Kaseisorb LC ODS-SAX TCI Dual ODS-AX10 TCI Dual ODS-AX20

pH3.5 pH3.5 pH3.5

pH5.0 pH5.0 pH5.0

pH7.0 pH7.0 pH7.0

45 61 2

3

321

465

1 23

45 6

1

1

1

2

2

2

3

3

3

4

4

4

5

5

5

6

6

6

2

2

2

1

1

1

3

3

3

4

4

4 5

5

5 6

6

6

保持の強さ:Kaseisorb LC ODS-SAX Super<TCI Dual ODS-AX10<TCI Dual ODS-AX20


移動相設計移動相設計

有機溶媒の比率を変更する有機溶媒の組成を上げる

疎水性化合物⇒早く溶出する

酸性および塩基性化合物⇒早く溶出する傾向がある

（疎水性化合物と比べて保持時間の変動が少ない場合が多い）

緩衝液の濃度を変更する緩衝液の濃度を上げる

疎水性化合物⇒影響なし（保持時間がほとんど変わらない)酸性および塩基性化合物⇒早く溶出する

pHを変更するpHを低くする

疎水性化合物⇒影響なし（保持時間がほとんど変わらない)酸性化合物⇒遅く溶出する傾向がある

塩基性化合物⇒早く溶出する傾向がある


有機溶媒と水の組成比を変更する有機溶媒と水の組成比を変更する

Column:TCI Dual ODS-AX204.6mmI.D.×150mm

Temperature:25℃Flow Rate:1.0 mL/min5’-Adenylic Acid

(酸性化合物) 2. Methyl Benzoate

(疎水性化合物)

1

0 10 20 30 40 Time(min)

21

2

10mmol/L Phosphatebuffer 70%

Methanol30%


Methanol60%

Mobile Phase


12

0 10 20 30 40 Time(min)

Column:TCI Dual ODS-AX204.6mmI.D.×150mm

Temperature:25℃Flow Rate:1.0 mL/min5’-Adenylic Acid

(酸性化合物) 2. Methyl Benzoate

(疎水性化合物)1

2


Methanol30%

Mobile Phase


Methanol30%

バッファー濃度を変更するバッファー濃度を変更する


pHを変更するpHを変更する

0 10 20 30 40 50 60 70 80 min

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

uV

pH3.5

pH5.0

pH7.02

2

2

1

1

1

3

3

3

4

4

45

5

5 6

6

6

Column : TCI Dual ODS-AX204.6mmI.D.×150mm

Temperature : 30℃

Flow rate : 1.0 mL/minMobile phase : CH3CN/50mM buffer＝50 / 50

pH7.0 : K2HPO4 （pH7.0)pH5.0 : CH3COONH4 (pH5.0)pH3.5 : HCOONH4 (pH3.5)

Sample : 1. Benzene2. Toluene3. Ethylbenzene4. Benzenesulfonic acid5. p-Toluenesulfonic acid6. 4-Ethylbenzenesulfonic acid


酢酸 CH3COOH CH3COO- + H+

pKa:4.75移動相:pH2.75 移動相:pH6.75

疎水性増大→逆相イオン性増大→イオン交換

pKaを考えるpKaを考える

試料のpKaより2以上離したpHに移動相を調整することで、試料が完全に解離しイオン交換が有効に働く(ODSでイオン対試薬を使用するときと同じ考え方)

グルクロン酸

pKa:3.2親水性の糖関連化合物は逆相条件での保持が難しい

→イオン性を増大させイオン交換を適用

OCOOH

HOHO

HOOH


Column : TCI Dual ODS-CX15 (4.6 mm I.D. ×150 mm)

Mobile phase : A) CH3CN / 50mmol/L HCOONH4 (pH3.5) = 10 / 90

B) CH3CN / 50mmol/L HCOONH4 (pH3.5) = 70 / 30

0-50% B (0-30min.)

Flow rate : 1.0 mL/min

Detection : UV 254 nm

Temperature : 25 ℃

Sample :

1. 5-Hydroxy-L-tryptophan

2. 5-Hydroxy-3-acetic acid（5-HIAA)

3. Acetylserotonin

4. L-Tryptophan

5. Serotonin(5-HT)

6. Melatonin

12

34

5 6

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

グラジエント溶出：溶媒比率グラジエント溶出：溶媒比率

4.

1. 2.

NH

HO

HNO3.

5.

NH

CH3O

HNO6.

NH

HO

COOH

NH2

NH

HOCOOH

NH

HO

NH2

NH

COOH

NH2


グラジエント溶出：塩濃度グラジエント溶出：塩濃度

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200mAU 1

2

3

4

Column : TCI Dual ODS-AX10 (4.6 mmI.D. X 150 mm)

Mobile phase : A) CH3OH / 10mmol/L K2HPO4 (pH7.0) = 20 / 80

B) CH3OH / 50mmol/L K2HPO4 (pH7.0) = 20 / 80

0-100% B (10-30min)



Temperature : 40 °C

Sample :

1. AMP 2. cAMP

3. ADP 4. ATP


OH

O

H2N

HO OH

O O

NH2

Column size : 4.6 mmI.D. X 150 mmMobile phase : CH3CN / H2O / H3PO4 = 5 / 95 / 0.1Flow rate : 1.0 mL/minDetection : UV 210nmTemperature : 25 ℃Sample :

1. L-Glutamic Acid

2. γ-Aminobutyric Acid(GABA)

0 10 20 30 40 50 min

TCI Dual ODS-CX101 2

1

1

1

2

2

2

TCI Dual ODS-CX15

TCI Dual ODS-CX20※酸性条件ではイオン交換基が働かないため保持が弱い

Kaseisorb LC ODS 2000

γ-Aminobutyric acid(GABA)γ-Aminobutyric acid(GABA)


0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

250000

275000

300000

325000

350000

uV

Sialic AcidsSialic Acids

1Kaseisorb LC ODS-SAX Super

TCI Dual ODS-AX10

TCI Dual ODS-AX20


1

1

1

2

2

2

2

O

OH

COOH

HO

HN

HO OH

HO

HOH2C

O

O

OH

COOH

HO

HN

HO OH

HO

O

2. N-Acetylneuramic acid(Neu5Ac)

1. N-Glycolylneuramic acid(Neu5Gc)

Column size : 4.6 mmI.D. × 50 mmMobile phase : CH3CN / 10mmol/L AcONH4 (AcOH, pH5.0) = 5/95Flow rate : 1.0 ml/minDetection : UV 210 nmTemperature : 30 ℃Sample :


Column : 4.6 mmI.D. × 150 mmMobile Phase : CH3OH / 10mmol/L K2HPO4

(pH7.0, H3PO4) = 10/90Flow Rate : 1.0 mL/minDetection : UV 210 nmTemperature : 40 ℃Sample :1. Galacturonic Acid

2. L-Ascorbic Acid

Galacturonic Acid, L-Ascorbic AcidGalacturonic Acid, L-Ascorbic Acid

0.0 2.5 5.0 7.5 min

1

Kaseisorb LC ODS-SAX Super

TCI Dual ODS-AX10

TCI Dual ODS-AX20


1

1

1, 2

2

2

2

O

OHHO

O

HO

HO


Basic Drugs ①Basic Drugs ①

Column : TCI Dual ODS-CX20 4.6 mmI.D. × 150 mmMobile phase : CH3CN / 50mmol/L CH3COONH4 (pH5.0,CH3COOH) = 80 / 20Flow Rate : 1.0 mL/minDetection : UV 210 nmTemperature : 40 ℃Sample : 1. Nicardipine 2. Verapamil 3. Alprenolol

4. Clomipramine 5. Chlorpromazine

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min

-50

0

50

100

150

200

250

300

mAU

12

3

45

HN CH3H3C

O

OH3C

O

O

CH3

N

NO2

H

1 2

CH3

N

H3C CH3

CN

OO

CH3

CH3

O

O

H3CH3C

OHN

OH3

N

Cl

4

S

N

N

Cl

5


Basic Drugs ②Basic Drugs ②

Column : TCI Dual ODS-CX10 4.6 mmI.D. × 150 mm Mobile phase : CH3CN/50mmol/L CH3COONH4(pH5.0,CH3COOH)=80/20Flow Rate : 1.0 mL/minDetection : UV 210 nm Temperature : 40 ℃Sample :

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 min

-100

0

100

200

300

400

500

600

700mAU1

2

3

HN CH3H3C

O

OH3C

O

O

CH3

N

NO2

H

1.Nicardipine

CH3

N

H3C CH3

CN

OO

CH3

CH3

O

O

H3CH3C

2.Verapamil

OHN

OH

3.Alprenolol


NH

HONH2N

H

HOCOOH

NH

COOH

NH2NH

HOCOOH

NH2

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

0

25

50

75

100

125

mAU

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100mAU

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

0

25

50

75

100

mAU

TCI Dual ODS-CX10

Column size : 4.6 mmI.D. X 150 mmMobile phase : A) CH3CN / 50mM HCOONH4 (pH3.5) = 10/90

B) CH3CN / 50mM HCOONH4 (pH3.5) = 70/300-50%B (0-30min)




Sample :

1 34

26

5

TCI Dual ODS-CX15


321

45

13

4

2

65

Serotonin MetabolitesSerotonin Metabolites

NH

CH3OHN

ONH

HOHN

O

1. 5-Hydroxy-L-tryptophan 4. L-Tryptophan

6. Melatonin

2. 5-Hydroxyindole-3-acetic acid(HIAA)

3. N-Acetylserotonin

5. Serotonin(5-HT)


Amino AcidsAmino Acids

Column : TCI Dual ODS-CX15(4.6 mmI.D. × 150 mm)Mobile Phase : A) CH3CN / 5 mmol/L KH2PO4 (pH3.0, H3PO4) = 5/95

B) CH3CN / 50 mmol/L KH2PO4(pH3.0, H3PO4) = 40/600-100%B(5-20min.)

Flow Rate : 1.0 mL/minDetection : UV 210 nmTemperature : 40 ℃

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min-10000

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000

120000

130000

uV

Aspartic Acid

Alanine

Methionine

Phenylalanine

Arginine

Aspartic Acid Alanine

NH2

OH

OS

Methionine Phenylalanine

Arginine


0 10 20 30 40 50 min

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

600000

650000

uV

TCI Dual ODS-CX10

Column size : 4.6 mmI.D. X 150 mm

Mobile phase : CH3CN / 50mmol/L KH2PO4 (pH3.0) = 50/50


Detection : UV 230nm


Sample : TCI Dual ODS-CX15

TCI Dual ODS-CX20※酸性条件ではイオン交換基が働かないため保持が弱い


N

Anti-diabetic agentAnti-diabetic agent

NH

NH2

NH NH

Metformin


Column Size : 4.6 mmI.D. ×150 mm Mobile Phase : CH3OH / 20mmol/L K2HPO4 (pH6.0,H3PO4) = 10/90 Flow Rate : 1.0 mL/minDetection : UV 210 nmTemperature : 30 ℃Sample :

1

2

0 4 8 12 time(min)

1

2

0 4 8 12 time(min)

NH

NH

O

O

NH

H2N

O

NH

OH

O

OH

H3C CH3HO

1. Allantoin 2. D-Panthenol

TCI Dual ODS-CX10 TCI Dual ODS-CX20

Allantoin, D-Panthenol


Levulinic Acid, Methyl LevulinateLevulinic Acid, Methyl Levulinate

Column : TCI Dual ODS-AX20 4.6mmI.D.×150mmMobile Phase : CH3CN / 20 mmol/L K2HPO4(pH7.0,H3PO4) = 20 / 80Flow Rate : 1.0 mL/minDetection : UV 210 nmTemperature : 25 ℃Sample :

H3COH

O

O

0.0 2.5 5.0 7.5 min

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

mV

2.742

3.729

12

H3COCH3

O

O

2. Methyl Levulinate

1. Levulinic Acid


Column : TCI Dual ODS-AX10 (4.6 mmI.D. X 150 mm)

Mobile phase : A) CH3OH / 10mmol/L K2HPO4 (pH7.0) = 20 / 80

B) CH3OH / 50mmol/L K2HPO4 (pH7.0) = 20 / 80

0-100% B (10-30min)




Sample :

1. AMP 2. cAMP

3. ADP 4. ATP

Adenosine PhosphatesAdenosine Phosphates

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200mAU 1

2

3

4


Column Size : 4.6 mmI.D. × 150 mm Mobile Phase : CH3OH / 10mmol/L K2HPO4 (pH 7.0,H3PO4) = 20 / 80Flow Rate : 1.0 mL/minDetection : UV 254 nmTemperature : 40 ℃Sample : 1. CMP 2. UMP 3. IMP 4. GMP 5. AMP

NucleotidesNucleotides

0 5 10 15 time(min)

1 2

3

4

5

0 5 10 15 time(min)

1

2

3,4

5

TCI Dual ODS-AX10TCI Dual ODS-AX20


Alkali HalidesAlkali Halides

Coulmn : TCI Dual ODS-CX154.6 mmI.D.×150 mm

Mobile Phase : CH3CN/ 50mmol/L CH3COONH4(pH5.00, CH3COOH) = 50/50

Detection : Corona CADTemperature : 40 ℃Flow Rate : 1.0 mL/minSample Size : 5uLSample : Lithium chloride

Sodium chloridePotassium chloride

min0 5 10 15

CI -

Li +

Na+

K+


Halide IonsHalide Ions

Coulmn : Kaseisorb LC ODS-SAX Super 4.6mmI.D.×150 mm

Mobile Phase : CH3CN/ 50mmol/L CH3COONH4(pH5.00, CH3COOH) = 50/50

Detection : UV 210 nm, Corona CADFlow Rate : 1.0 mL/minTemperature : 40 ℃Sample Size : 5 uLSample : Potassium cloride

Potassium bromidePotassium Iodide

min0 5 10 15

Corona CAD

K+

Cl -

Br -

I -

min0 5 10 15

UV 210 nm

I -

Br -


Ionic LiquidIonic Liquid

min0 2 4 6 8

Cl- N+

N

(CH2)3CH3

CH3

Column : TCI Dual ODS-CX20 (4.6 mm I.D. X 150 mm)Mobile phase : CH3CN / 50mmol/L AcONH4 (AcOH,pH5.0) = 10 / 90 Flow rate : 1.0 mL/minDetection : Corona CADTemperature : 40 ℃

Sample : 1-Butyl-3-methylimidazolium Chloride (bmimCl)


タイプODS+カチオン交換タイプ

塩基性化合物の分離に

ODS+アニオン交換タイプ

酸性化合物の分離に

カラム

保持力強中弱強中弱

2.0×100mm 60,000円 S3707 S3767 S3717 S3737 S3727 S1832

4.6×100mm 54,000円 S3709 S3769 S3719 S3739 S3729 S1834

10.0×150mm 180,000円 S3706 S3766 S3716 S3736 S3726 S1835

カートリッジタイプガードカラム [ 専用ホルダーが必要です：S1450 19,000円 ]

2.0×50mm 55,000円 S3705 S3765 S3715 S3735 S3725 S1821

2.0×150mm 65,000円 S3702 S3762 S3712 S3732 S3722 S1298

2.0×250mm 75,000円 S3703 S3763 S3713 S3733 S3723 S1299

4.6×50mm 47,000円 S3704 S3764 S3714 S3734 S3724 S1833

4.6×150mm 59,000円 S3700 S3760 S3710 S3730 S3720 S1292

4.6×250mm 72,000円 S3701 S3761 S3711 S3731 S3721 S1293

10.0×250mm 200,000円 S3708 S3768 S3718 S3738 S3728 S1836

3.0×15mm 12,000円

TCI DualODS-CX10

TCI DualODS-CX15

TCI DualODS-CX20

TCI DualODS-AX20

TCI DualODS-AX10

Kaeisorb LC ODS-SAX Super

S3770 S3771 S3772 S3775 S3774 S3773

ラインアップラインアップ

～ミックスモードカラム～...pka:4.75 移動相:ph2.75 移動相:ph6.75...

Documents