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IｇＥ非依存性アレルギー疾患検査方法

群馬大学大学院医学系研究科 小児科学分野

准教授 滝沢 琢己

大学院生 八木 久子

教授 荒川 浩一

2

4.5%

2.6%2007

2013

文部科学省統計

30万人

58万人

学童の食物アレルギー6年間で28万人の増加

背景 アレルギー疾患は爆発的に増加している

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抗原

肥満細胞

IgE抗体による抗原の認識

B細胞

ヒスタミンを放出

ヘルパーＴ細胞(Th2)

抗原提示細胞

感作

蕁麻疹全身症状

IgE依存性アレルギー

背景

4

IgE非依存性アレルギー

背景

IgE抗体が存在せずとも起こるアレルギー反応乳児消化管アレルギー薬物アレルギー

病態の詳細は不明 リンパ球の直接応答による組織障害か？

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背景アレルギー 補助検査

IgE依存性アレルギー →特異的IgE抗体価測定

IgE非依存性アレルギー →リンパ球刺激試験

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従来のリンパ球刺激試験

患者末梢血

PBMC分離

抗原の添加培養開始

5－6日間培養

放射性同位体などによる標識

1日間培養

細胞増殖の評価シンチレーションELISAフローサイトメトリー

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問題点

✓ PBMCの分離✓ PBMC分離のために新鮮な血液が必要

→採血のタイミングが限られる✓ 末梢血量が多量に必要。1抗原につき0.5-1mL、合計５ｍL✓ 長い（6～7日）培養期間✓ 放射性アイソトープを取り扱える施設

手間と時間がかかり、採血量が多い

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新しいリンパ球刺激試験

患者末梢血

PBMC分離

抗原の添加培養開始

5－6日間培養

放射性同位体などによる標識

1日間培養

マーカー遺伝子のPCRによる検出

24時間

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新技術の特徴

✓PBMC単離をする必要がない。

✓培養時間を大幅に短縮

✓放射性同位体を用いる必要がない。

✓採血量は1/5程度に減少

✓RNAを測定するので、刺激後検査まで凍結保存できる。

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想定される使用法

PCRによるマーカー検出

予め採血管に抗原を入れておき、血液を入れた後そのまま一晩培養し、凍結後に検査会社に送付できる

採血時間を任意の時間に設定できる検体の取扱いによる細胞障害の影響をうけにくい

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検討結果

αラクトアルブミン

βラクトグロブリン

αカゼイン κカゼイン

AUC 0.914 AUC 0.914

AUC 0.809

AUC 0.938

ミルクによる消化管アレルギー 従来法判別に対するROC曲線解析

PBMCによる結果

単一マーカーでも感度、特異度ともに高い

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ROCの多重ロジステック回帰分析AUC

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

αLac βLac α casein κ casein protein mix milk

IL2RA+LRRC32 IL2RA＋TNFRSF4 LRRC32+TNFRSF4 IL2RA＋IL1B IL2RA＋TGFβ1 TNFRSF4＋IL1β LRRC32＋IL1β TNFRSF4＋TGFB1

LRRC32+TGFB1 IL1β＋TGFB1 IL2RA+IL19 TNFRSF4+IL19 LRRC32+IL19 IL1β＋IL19 TGFB1+IL19

複数のマーカーを組み合わせることで、AUCは更に改善

PBMCによる結果

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aLac-IL2RA

aLac

-IL2R

A-n

eg

aLac

-IL2R

A-p

os

0

20

40

60

80

ROC of aLac-TNFRSF4:ROC curve

100% - Specificity%

0 20 40 60 80 100

0

20

40

60

80

100aLac-TNFRSF4

TNFR

SF4

(CD13

4)-n

eg

TNFR

SF4

(CD13

4)-p

os

0

5

10

15

20

aLac-LRRC32

LRRC32

-neg

LRRC32

-pos

0

5

10

15

ROC of aLac-LRRC32:ROC curve

100% - Specificity%

0 20 40 60 80 100

0

20

40

60

80

100

aLac-CD69

CD69

-neg

CD69

-pos

0

1

2

3

4

ROC of aLac-CD69:ROC curve

100% - Specificity%

0 20 40 60 80 100

0

20

40

60

80

100

検討結果

ミルクによる消化管アレルギー 従来法判別に対するROC曲線解析

全血法による結果 αラクトグロブリン

陰性 陽性ALST

ROC of aLac-IL2RA:ROC curve

100% - Specificity%

0 20 40 60 80 100

0

20

40

60

80

100IL2RA

陰性 陽性ALST

TNFRSF4

陰性 陽性ALST

LRRC32 CD69

陰性 陽性ALST

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IL2RA (CD25)

TNFRSF4

(CD134)LRRC32 CD69 IL1B TGFBI IL1F9 IER3 INHBA

αラクトアルブミン

ROC-AUC 0.800 1.000 0.792 1.000 0.750 1.000 0.833 0.800 0.800

ROC-P 0.128 0.011 0.153 0.053 0.317 0.046 0.183 0.245 0.125

t検定-p 0.161 0.007* 0.194 0.095 0.429 0.071 0.286 0.381 0.381

βラクトグロブリン

AUC 0.568 0.800 0.667 1.000 0.500 0.583 0.667 0.700 0.600

P 0.735 0.128 0.414 0.053 1.000 0.739 0.505 0.439 0.699

t検定-p 0.811 0.160 0.497 Er 1.00 0.857 0.643 0.571 0.857

αカゼイン

AUC 0.825 0.950 0.786 0.800 0.533 1.000 0.667 0.900 0.900

P 0.057 0.008 0.131 0.245 0.882 0.025 0.456 0.121 0.130

t検定-p 0.065 0.006* 0.163 0.381 1.000 0.036 0.571 0.191 0.191

κカゼイン

AUC 0.524 0.667 0.567 0.583 0.750 1.000 0.667 0.667 0.889

P 0.886 0.317 0.715 0.724 0.289 0.034 0.480 0.513 0.127

t検定-p 0.945 0.366 0.792 0857 0.400 0.057 0.629 0.700 0.200

上記混合

AUC 0.760 0.780 0.580 0.750 0.500 0.750 0.700 0.700 0.800

P 0.111 0.087 0.624 0.439 1.000 0.221 0327 0.439 0.245

t検定-p 0.129 0.099 0.679 0.560 1.00 0.286 0.413 0.571 0.381

検討結果全血法による結果 ROC解析のまとめ

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実用化に向けた課題

• 現在、PBMCを用いたものに関しては、複数マーカーの組み合わせでROC解析により診断可能性の高いものを見出している。しかし、陰性コントロールのデータが少ない。

• 全血を用いた解析は、解析症例数が少ない。今後症例数の増加、陰性コントロールのデータ蓄積を行っていく。

• 複数マーカの組み合わせは現在検討中。

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実用化に向けた課題

• これまでの解析症例が、小児の消化管アレルギーのみであり、IgE非依存性薬物アレルギーに関しては、症例の蓄積がない。

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今後の展開

• 転写産物のみでなく、培養液中に増加する液性因子をマーカーとすることで、イムノクロマトを用いたオンサイト診断技術を開発

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企業への期待

• 共同研究することで、多くの消化管アレルギーや薬物アレルギー症例の検体を集積し、それらの解析により、より精巧な技術となることが期待される。

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本技術に関する知的財産権

• 発明の名称：ＩｇＥ非依存性アレルギー疾患検査方法

• 出願番号 ：特願2015-181355

• 出願人 ：群馬大学

• 発明者 ：荒川浩一、滝沢琢己

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お問い合わせ先

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