igenetics ch15 1 - imbb.forth.gr · igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις2009 4...

Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 1

Γενετική ΙΙ:Ύλη:1. iGenetics τόμος ΙΙ, κεφάλαια: 15-252. Ανασυνδυασμένο DNA. Watson J, κεφάλαια: 3-113. Γενετική: από τα γονίδια στα γονιδιώματα-Hartwell(κατά περίπτωση και όταν αναφέρεται στην αρχή κάθε παρουσίασης)

Επικοινωνία: Email: [email protected] website: www.garinislab.grΓραφείο: Α125

iGeneticsMια Μεντελική προσέγγιση

iGenetics 3Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

Κεφάλαιο 15 (+ κεφάλαιο 7 Hartwell)

Μεταλλαγές του DNA, επιδιόρθωση του DNA και μεταθετά στοιχεία

Η πρωτεΐνη UvrB, ένα ένζυμο επιδιόρθωσης με εκτομή νουκλεοτιδίου.


Μεταλλαγές και βλάβες του DNA

Μεταλλαγές: αλλαγή στη πληροφορία, κληρονομούνταιΒλάβες: αλλαγή στη διπλή έλικα, η πληροφορία παραμένει ανέπαφη, δεν κληρονομούνται

Σωματικές μεταλλαγές: επηρεάζει μόνο το άτομο στο οποίο εμφανίζονταιΜεταλλαγές γαμετικής σειράς: κληρονομούνται επηρεάζοντας και τις επόμενες γενιές

Ρυθμός μεταλλαγής: αριθμός μεταλλαγών ανά γονίδιο ανά γενιάΣυχνότηητα μεταλλαγής: αριθμός εμφάνισης μίας μεταλλαγής προς τον αριθμό κυττάρων


ΕΙΚΟΝΑ 15.1Συνέπειες των μεταλλαγών στην κωδική περιοχή ενός γονιδίου.

Σημειώστε ότι δεν οδηγούν όλες οι μεταλλαγές σε τροποποιημένες πρωτεΐνες (όπως παρουσιάζεται στο γενικευμένο παράδειγμα της εικόνας αυτής) και ότι

δε συμβαίνουν όλες οι μεταλλαγές σε κωδικές περιοχές.


ΕΙΚΟΝΑ 15.2Αναπαράσταση ενός διαιρούμενου πληθυσμού E. coli άγριου τύπου που είναι ευπαθής

στο φάγο Τ1.

Η θεωρία της προσαρμογής και των τυχαίων μεταλλαγών


ΕΙΚΟΝΑ 15.3Είδη μεταλλαγών αντικατάστασης ζεύγους βάσεων.


ΕΙΚΟΝΑ 15.4Μια ανερμηνεύσιμη μεταλλαγή και οι επιπτώσεις της στη μετάφραση.


Σημειακές μεταλλαγές:Πρόσθιες μεταλλαγές που μετατρέπουν το γονότυπο αγρίου τύπου σε μεταλλαγμένο

Αντίστροφες μεταλλαγές που επαναφέρουν το γονότυπο αγρίου τύπου μερικώς ή πλήρως.

-γνήσια αντιστροφή: επαναφέρει το αμινοξύ αγρίου τύπου-μερική αντιστροφή: αντικαθιστά το κωδικόνιο τερματισμού σε κωδικόνιο που αντιστοιχεί σε κάποιο άλλο αμινοξύ (αποκαθιστά πλήρως ή μερικώς τη λειτουργία της πολυπτειτιδικής αλυσίδας)

Κατασταλτική μεταλλαγή: γίνεται σε διαφορετική θέση από την αρχική και αποκρύπτει ή αναπληρώνει τις επιπτώσεις της αρχικής μεταλλαγής.

-ενδογονιδιακός καταστολέας: η κατασταλτική μεταλλαγή συμβαίνει στο ίδιο γονίδιο-διαγονιδιακός καταστολέας: η κατασταλτική μεταλλαγή συμβαίνει σε διαφορετικό γονίδιο (κατασταλτικό γονίδιο)


ΕΙΚΟΝΑ 15.5Μηχανισμός δράσης μιας κατασταλτικής μεταλλαγής η οποία μεταβάλλει την αλληλουχία ενός γονιδίου tRNA και λειτουργεί ως διαγονιδιακός καταστολέας, εξαλείφοντας τις συνέ-

πειες μιας ανερμηνεύσιμης μεταλλαγής.

Τα γονίδια tRNAβρίσκονται σε περισσόερα τουενός αντίγραφα =Άρα πάντα θα υπάρχουν φυσιολογικά tRNAμόρια.


Μεταλλαξιγένεση: η δημιουργία μεταλλαγών

Αυθόρμητες μεταλλαγές: προκύπτουν φυσιολογικά (10.000-1.000.000/γονίδιο /γενιά

Επαγόμενες μεταλλαγές: συμβαίνουν μετά από έκθεση σε μεταλλαξιγόνο (συχνές)

Αυθόρμητες και επαγόμενες μεταλλαγές

13

DNA ΒΛΑΒΕΣ

ΕΙΚΟΝΑ 15.6Φυσιολογικό ζευγάρωμα των βά- σεωνκατά Watson καιCrick και ζευγάρωμαβάσεων που βρίσκεται σε ασυμφωνία μετους κανόνες συμ- πληρωματικότηταςτων Watson και Crick. (α) Φυσιολογικόζευγάρωμα των βάσεων κατά Watson καιCrick ανάμεσα στις φυσιολογικές μορφέςτων Τ και Α, καθώς και των C και G. (β)Ζευγάρωμα βάσεων που παραβιά- ζει τουςκανόνες συμπληρωματικό- τητας κατάWatson και Crick ανάμεσα σεφυσιολογικές μορφές πυριμιδινών καισπάνιες ταυτομερικές καταστά- σειςπουρινών. (γ) Ζευγάρωμα βά- σεων πουπαραβιάζει τους κανόνεςσυμπληρωματικότητας κατά Watson-Crickανάμεσα σε σπάνιες ταυτομερι- κέςμορφές πυριμιδινών και φυσιολο- γικέςμορφές πουρινών.

Ταυτομερή: ίδιος χημικός τύπος αλλάδιαφορετική συνδεσιμότητα μεταξύ τωνμορίων της ένωσης. Οι διαφορετικέςμορφές βρίσκονατι σε ισορροπία.

Σφάλματα κατά την αντιγραφή


ΕΙΚΟΝΑ 15.7Πρόκληση μεταλλαγής λόγω αναντιστοιχίας που οφείλεται σε

ταυτομερική μετατροπή κάποιας βάσης στη σπάνια μορφή της.


ΕΙΚΟΝΑ 15.8Αυθόρμητη δημιουργία μεταλλαγών προσθήκης και ελλείμματος λόγω δημιουργίας

βρόχων στο DNA κατά την αντιγραφή.

ΕΙΚΟΝΑ 15.9(α) Απαμίνωση της κυτοσίνης προς ουρακίλη. (β) Απαμίνωση

της 5-μεθυλοκυτοσίνης (5mC) προς θυμίνη.

Επίσης: Αποπουρίνωση

(αφαίρεσης μια αδενίνης

ή θυμίνης από το DNA)

Σημείωση: Η κυτοσίνη μπορεί να απαμινωθεί αυθόρμητα και να δώσει ουρακίλη. Δηλαδή, C U μεταλλαγές.Μάλλον κατά την εξέλιξη προστέθηκε ένα CH3 στην ουρακίλη μετατρέποντάς την σε θυμίνη στο DNA. Ετσι τα κύταρρα μπορούν να ξεχωρίζουν τη φυσιολογική θυμίνη από την ουρακίλη που υπέστη βλάβη (στο RNA αυτό δεν είναι δυνατό).


ΕΙΚΟΝΑ 15.10Δημιουργία διμερών θυμίνης λόγω της επίδρασης υπεριώδους ακτινοβολίας.

Τα δύο μέρη του διμερούς είναι ομοιοπολικά ενωμένα μεταξύ τους, γεγονός που προκαλεί παραμόρφωση της διπλής έλικας του DNA στη θέση αυτή.


ΕΙΚΟΝΑ 15.11Μεταλλαξιγόνες επιδράσεις του αναλόγου βάσης 5-βρομοουρακίλη (5BU).

(α) Στη φυσιολογική της κατάσταση η 5BU ζευγαρώνει με την αδενίνη.


ΕΙΚΟΝΑ 15.11Μεταλλαξιγόνες επιδράσεις του αναλόγου βάσης 5-βρομοουρακίλη (5BU).

(γ) Οι δύο πιθανοί μηχανισμοί μεταλλαγής. Η 5BU επάγει μεταλλαγές μετάπτωσης όταν εισάγεται στο DNA σε μια κατάσταση και στη συνέχεια μετατρέπεται στην άλλη κατά

τον επόμενο κύκλο αντιγραφής του DNA.


ΕΙΚΟΝΑ 15.12Η δράση τριών παραγόντων τροποποίησης βάσεων.


ΕΙΚΟΝΑ 15.12Η δράση τριών παραγόντων τροποποίησης βάσεων.

(β) Η υδροξυλαμίνη (ΝΗ2ΟΗ) αντιδρά μόνο με την κυτοσίνη. (γ) O μεθανοσουλφονικός μεθυλεστέρας (MMS, Methylmethane Sulfonate), ένας αλκυλιωτικός παράγοντας, αλκυ-

λιώνει τη γουανίνη. (Σημείωση: dR = δεοξυριβόζη.)


ΕΙΚΟΝΑ 15.13Μεταλλαγές λόγω εισαγωγής παρεμβαλλόμενων παραγόντων.

(α) Μεταλλαγή μετατόπισης αναγνω-στικού πλαισίου λόγω προσθήκης που προκαλείται από την ένθεση του παρεμ-βαλλόμενου παράγοντα στην αλυσίδα-μήτρα.

(β) Μεταλλαγή μετατόπισης αναγνωστικού πλαισίου που προκαλείται από τη δημιουργία ελλείμματος λόγω της ένθεσης του παρεμβαλλόμενου παράγοντα στην αλυσίδα που συντίθεται.

Βρομιούχο αιθίδιο!


ΕΙΚΟΝΑ 15.14Δοκιμασία Ames για τον προσδιορισμό της πιθανής μεταλλαξιγόνου

δράσης χημικών ουσιών.

Μείγμα ηπατικών ενζύμων αρουραίου,

ποντικού ή χάμστερ

Μεταλλαγμένα στελέχη, αυξοτροφικά

ως προς την ιστιδίνη


ΕΙΚΟΝΑ 15.15Τεχνική επίστρωσης αντιγράφων για τον εντοπισμό μεταλλαγμένων στε-λεχών ενός μικροοργανισμού που

σχηματίζει αποικίες.

Εντοπισμός μεταλλαγών:

1.Ορατές μεταλλαγές: επηρεάζουν τη μορφολογία ή τη

φυσική εμφάνιση ενός οργανισμού

1.Διατροφικές/αυξοτροφικές μεταλλαγές

1.Υπό συνθήκη μεταλλαγές (θερμοευαίσθητες μεταλλαγές)

25

Επιδιορθωτικοί μηχανισμοί

Cyclobutane Pyrimidine Dimers (CPD) 6-4 PhotoProducts (6-4PP)

UV

T - T5’

5’3’

3’

Διμερή πυριμιδινών

Επιδόρθωση διμερών πυριμιδίνης: φωτολυάση

Φωτολυάσες:

n Ενζυματική φωτοαντίδρασηn Αποδιμερισμός σε 1 μόνο βήμαn Ειδικότητα στη βλάβηn Δεν υπάρχουν στα θηλαστικά με πλακούντα

Φωτολυάσες

Ορατό φωςεπιδόρθωση

Αποδέσμευση

Οχι στα θυλαστικά με πλακούντα:

CPD Photolyase

Tasmanian rat kangaroo

Διαγονιδιακά ποντίκια για τη CPD-φωτολυάση

CPDs

Non-CPD lesions

UV

Λιγότερο ερύθημα!

Λιγότερη υπερπλασία!

Λιγότεροι όγκοι

στα διαγονιδικά

ποντίκια με

CPD φωτολυάση!

Μηχανισμός Εκτομής Βάσεων (ΒER)

NN

AP: apurinic/

apyrimidinic site

DNA deoxyribophosphodiesterases

(dRPases)

ΕΙΚΟΝΑ 15.16Επιδιόρθωση με εκτομή

νουκλεοτιδίου (NER) στην περίπτωση διμερών πυρι-μιδινών και άλλων παρα-μορφώσεων του DNA που

οφείλονται σε βλάβες.

Η εικόνα αφορά στο μηχανισμό ΝER στα

βακτήρια

Μηχανισμός Εκτομής Νουκλεοτιδίων (NER)

Μηχανισμός Εκτομής Νουκλεοτιδίων (NER) Global Genome Transcription-coupled

Η εικόνα αφορά

στο μηχανισμό ΝERστά

θηλαστικά

Global genome nucleotide excision repair (GG-NER)

RPA

ERCC1XPF

XPA


DNA polymerase δ/ε, RFC

PCNA and DNA ligase


CSB

RNA polymerase IIRNA

Transcription-coupled nucleotide excision repair (TC-NER)

XPG ERCC1/

XPF

RPA

XPA


DNA polymerase δ/ε, RFC

PCNA and DNA ligase


Το σύστημα επιδιόρθωσης αταίριαστου ζεύγους αναγνωρίζει σε ποιον κλώνο βρίσκεται το λαν-θασμένο νουκλεοτίδιο με βάση τη μεθυλίωση σε μια γειτονική αλλη-λουχία GATC. Αν η αλληλουχία

αυτή δεν είναι μεθυλιωμένη, τότε απομακρύνεται τμήμα του κλώνου DNA που περιέχει τη λανθασμένη βάση και συμπληρώνεται με σύν-

θεση νέου DNA.

MutS, H, L: Γονίδια-μεταλλάκτες

Οι δύο κλώνοι διακρίνονται λόγω της μεθυλίωσης στην αδενίνη σε γειτονική αλληλουχία (GATC) στην αλυσίδα

μήτρα.

Ο νέος κλώνος μεθυλιώνεται λίγο αργότερα

Μηχανισμός επιδιόρθωσης αταίριαστου ζεύγους

Μηχανισμός Επιδιόρθωσης Διπλών Θραυσμάτων DNA

E. Coli: η απόκριση SOS(και η σχέση της με τη διαβλαβική σύνθεση)

DNA polymerase V (Pol V)!

Διαβλαβική σύνθεση DNA(translesion DNA synthesis)στα ευκαρυωτικά κύτταρα

Η ίδια η διαδικασία είναι μεταλλαξιγόνος!

DNA polymerase η is involved in the DNA repair by translesion synthesis

Polymerase δ is the main polymerase involved with nuclear DNA replication


ΕΙΚΟΝΑ 15.18Άτομο που πάσχει από μελαγχρωματική ξηροδερμία.


ΕΙΚΟΝΑ


Μεταθετά στοιχεία


ΕΙΚΟΝΑ 15.19Η αλληλουχία ένθεσης IS1.

Αυτό το μεταθετό στοιχείο IS έχει μήκος 768 bp και φέρει ανάστροφες επαναλήψεις (IR) στα άκρα του. Κάτω από το στοιχείο παρουσιάζονται οι

αλληλουχίες των ανάστροφων επαναλήψεων. Το μήκος καθεμιάς είναι 23 bp.

Μεταθετά στοιχεία στους προκαρυώτες


ΕΙΚΟΝΑ 15.20Διαδικασία ένθεσης ενός στοιχείου IS στο χρωμοσωμικό DNA.

ΜεταθετάσηTransposase:

It catalyzes the movement of

the transposon to another part of the genome by a

cut and paste mechanism or a replicative

transposition mechanism.


ΕΙΚΟΝΑ 15.21Η δομή των βακτηριακών τρανσποζονίων.

…πιο πολύπλοκα από τα στοιχεία IS

Σύνθετο τρανσποζόνιο Μη σύνθετο τρανσποζόνιο

Καταλύει την ένθεση του Tn3 Εμπλέκεται σε γεγονότα ανασυνδυασμούπου σχετίζονται με τη μετάθεση

Καταστρέφει αντιβιοτικά(πενικιλίνη, αμπικιλλίνη)


ΕΙΚΟΝΑ 15.22Μοντέλο συνενσωμάτωσης για τη

μετάθεση ενός μεταθετού στοιχείου μέσω αντιγραφής.

Το DNA-δότης, που περιέχει ένα μετα-θετό στοιχείο, συνενώνεται με το DNA -δέκτη. Κατά τη διαδικασία της συνέ-

νωσης, το μεταθετό στοιχείο διπλασιά-ζεται, με αποτέλεσμα να προκύπτει ένα συνενσωμάτωμα που φέρει ένα μεταθε-τό στοιχείο σε κάθε σημείο συνένωσης μεταξύ DNA-δότη και DNA-δέκτη. Το συνενσωμάτωμα διασπάται μεσω ανα-συνδυασμού σε δύο μόρια, καθένα από τα οποία φέρει ένα αντίγραφο του με-

ταθετού στοιχείου.


Tn10

2ος τύπος μηχανισμού μετάθεσης (συντηρητική μετάθεση) «μετακίνηση του μεταθετού στοιχείου από μία θέση σε μία άλλη στο ίδιο ή διαφορετικό μόριο DNA χωρίς να γίνει αντιγραφή του στοιχείου.

Στοιχεία IS υπάρχουν και στο παράγοντα F της E.coli.-δύο αντίγραφα IS3-ένα αντίγραφο IS2-ένα αντίγραφο γδ

ΕΙΚΟΝΑ 15.23Σπόροι καλαμποκιού, ορισμένοι από τους οποίους εμφανίζουν κηλίδες χρωστικής.

Οι κηλίδες αυτές αντιστοιχούν στα κύτταρα στα οποία έχει γίνει απομάκρυνση ενός μεταθετού γενετικού στοιχείου από ένα γονίδιο που ευθύνεται για την παραγωγή χρωσ-τικής, με αποτέλεσμα την αποκατάσταση της λειτουργίας του. Τα κύτταρα των λευκών περιοχών του σπόρου δε διαθέτουν χρωστική, επειδή το γονίδιο που ευθύνεται για την παραγωγή της εξακολουθεί να είναι απενεργοποιημένο λόγω της παρουσίας ενός μετα-

θετού στοιχείου μέσα σε αυτό.

Μεταθετά στοιχεία στους ευκαρυώτες

2 είδη τρανσποζονίων: 1.Αυτόνομα μεταθετά στοιχεία2.Μη αυτόνομα μεταθετά στοιχεία

Barbara McClintock

Λάθος: “theory of developmental control”Σωστό: “theory of transposition”

(June 16, 1902 – September 2, 1992), an American scientist and cytogeneticist who was awarded the 1983

Nobel Prize in Physiology


ΕΙΚΟΝΑ 15.24Το χρώμα του σπόρου στο καλαμπόκι και πώς επηρεάζεται από τα τρανσποζόνια.


ΕΙΚΟΝΑ 15.25Ο μηχανισμός μετάθεσης του Ac.


ΕΙΚΟΝΑ 15.26Το μεταθετό στοιχείο Ty του ζυμομύκητα.

Το Ty μοιάζει με τους ρετροιούς (DNA RNA DNA ένθεση. Είναι ένα ρετροτρασποζόνιο και η διαδικασία μετάθεσης του λέγεται ρετρομετάθεση.

Τρασποζόνια στο ζυμομύκητα


ΕΙΚΟΝΑ 15.27Δομή του αυτόνομου μεταθετού στοιχείου Ρ που συναντάται στην Drosophila melanogaster.

Τρασποζόνια στη μύγα


ΕΙΚΟΝΑ 15.28Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίαςεισαγωγής διαγονιδίων στο γονιδίωματης Drosophila με τη χρήση στοιχείων Ρ.


Τρασποζόνια στον άνθρωπο

LINE: long interspersed nucleotide elements (μακρά διάσπαρτα στοιχεία νουκλεοτιδίων)-επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες μήκους ±5kb-αυτόνομα ρετροτρανσποζόνια

SINE: short interspersed nucleotide elements (βραχέα διάσπαρτα στοιχεία νουκλεοτιδίων)-επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες μήκους ±500b-μη αυτόνομα ρετροτρανσποζόνια-Alu repeats (AluI περιοριστική θέση)

igenetics ch15 1 - imbb.forth.gr · igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις2009 4...

Documents