оповiдi НАЦiОНАЛЬНОЇ 6 2015 АКАДЕМiЇ НАУК …Рис. 1....

оповiдiНАЦIОНАЛЬНОЇ

АКАДЕМIЇ НАУК

УКРАЇНИ

6 • 2015

БIОХIМIЯ

УДК 577.152.087:581.2

Л.М. Бабенко, М. М. Щербатюк, I. В. Косакiвська

Структурно-функцiональнi особливостi кореневища

Equisetum arvense L. в онтогенезi

(Представлено членом-кореспондентом НАН України Я.П. Дiдухом)

Дослiджено характер змiн активностi лiпоксигенази та ультраструктуру тканин ко-реневища хвоща польового (Equisetum arvense L.) у перiод фiзiологiчного спокою i пiд часвиходу з нього. Встановлено, що вихiд зi стану спокою вiдбувається на фонi зростанняактивностi лiпоксигенази. Виявленi специфiчнi змiни, що вiдбувалися в ультраструк-турi тканин кореневища хвоща пiд час виходу iз стану спокою, серед яких зменшеннячисла крохмальних зерен в амiлопластах та збiльшення кiлькостi лiпiдних крапель, якiформують розташований поруч iз плазмолемою лiпiдний шар.

Ключовi слова: Equisetum arvense L., лiпоксигеназа, ультраструктура, кореневище.

Лiпоксигенази (лiнолеат:кисень:оксидоредуктази КФ 1.13.11.12; ЛОГ) — клас негемовихзалiзовмiсних дiоксигеназ, якi каталiзують окиснення полiненасичених жирних кислот(ПНЖК), що мiстять 1,4-цис-, цис-пентадiєнову систему, з утворенням гiдроперокси-дiв транс- та цис-кон’югованих дiєнiв [1]. Така реакцiя є ключовою в циклi окисненняПНЖК [2]. Подальшi перетворення ферментами лiпоксигеназної системи призводять доутворення окиснених похiдних ПНЖК, у тому числi фiзiологiчно активних сполук — окси-лiпiнiв, якi забезпечують вiдповiдь органiзму на дiю абiотичних та бiотичних стресорiв,а також участь у процесах росту, розвитку, старiння клiтин та клiтинної смертi, захистiвiд патогенного ураження [1–4]. До головних фiзiологiчних функцiй ЛОГ належать участьу процесах пероксидного окиснення лiпiдiв, синтезi сигнальних сполук, мобiлiзацiя лiпi-дiв [5]. ЛОГ знайденi в тканинах тварин, вищих рослин, папоротей, хвощiв, водоростей,мохiв, дрiжджiв, грибiв i цiанобактерiй [6–10]. Бiльша частина лiпоксигеназ є розчиннимицитоплазматичними ензимами, проте окремi з них виявленi в хлоропластах, мiтохондрiяхта вакуолях. Завдяки високому вмiсту i вiдноснiй стабiльностi ЛОГ вищих рослин видi-ленi i очищенi до гомогенного стану, охарактеризованi їхнi структура i бiологiчнi власти-востi [7, 8, 9]. Однак вiдомостi про фiзiологiчну функцiю ЛОГ спорових рослин обмеженii потребують подальшого вивчення.

© Л.М. Бабенко, М. М. Щербатюк, I. В. Косакiвська, 2015

ISSN 1025-6415 Допов. НАН України, 2015, №6 147

Хвощi належать до одних iз найдавнiших рослин, якi з’явилися бiльше 300 млн рокiвтому в девонi палеозойської ери i досягли розквiту в кам’яновугiльний перiод. У наш часвiддiл хвощеподiбних (Equisetophyta) представлений одним родом Хвощ (Equisetum), якийнараховує 25 видiв [11]. У попереднiх дослiдженнях виявлено двi iзоформи лiпоксигенази —13-ЛОГ та 9-ЛОГ та встановлено характер залежностi їхнього розподiлу в рiзних органахнадземної та пiдземної частин репродуктивного i вегетативного пагонiв E. arvense вiд фазионтогенетичного розвитку [11]. Також було дослiджено ультраструктуру клiтин вегетатив-них пагонiв E. arvense [12] i досить детально вивчено структуру та характер вiдкладенькремнезему в пагонах цього виду [13].

Ми ставили за мету дослiдити лiпоксигеназну активнiсть та вивчити ультраструктуруклiтин кореневища E. arvense на рiзних етапах онтогенезу для з’ясування можливої участiензиму в мобiлiзацiї лiпiдiв при переходi до активного розвитку та виявленнi специфiчнихструктурних перебудов, що вiдбуваються на фонi активiзацiї метаболiчних процесiв.

Матерiали i методи. Об’єктом дослiдження були кореневища хвоща польового, якийзростав на науково-виробничiй базi Iнституту ботанiки iм. М. Г. Холодного НАН України“Феофанiя” (м. Київ) в умовах Пiвнiчного Лiсостепу України. Хвощ польовий — багаторiчнатрав’яниста рослина, що має пагони двох типiв: репродуктивнi (спороноснi) i вегетативнi(асимiляцiйнi). Спороноснi пагони з’являються навеснi (друга половина квiтня — початоктравня). Пiсля дозрiвання спор репродуктивнi пагони вiдмирають, а замiсть них розвива-ються вегетативнi, якi вiдмирають у другiй половинi вересня, з настанням холодiв. Корене-вище хвоща польового залягає в грунтi горизонтальними та вертикальними тяжами. Вонобурувато-чорного кольору, без серединної порожнини, повзуче, сильно розгалужене з довги-ми мiжвузлями, якi почленованi вузлами, що мають листковi пiхви, утворенi редукованимилистками. Як i на надземних стеблах, на кореневищах пiд захистом редукованих листкiвзакладаються бруньки майбутнiх пагонiв та коренiв, але, на вiдмiну вiд надземних пагонiв,бiльшiсть стеблових бруньок на кореневищах зазвичай залишаються сплячими, а зачаткикоренiв часто проростають, пробиваючи листковi пiхви, тому вузли кореневища частiше ма-ють не вiдгалуження пагонiв, а додатковi вiдгалуження коренiв. Деякi бiчнi бруньки як нагоризонтальних, так i на вертикальних кореневищах, проростаючи, утворюють бульбочки,якi являють собою сильно потовщене, видозмiнене i вкорочене мiжвузля [12, 13].

Для видiлення ЛОГ наважки тканин гомогенiзували в охолодженому до +4 ◦С 0,1 Мфосфатному буферi, pH 6,3, з додаванням 2 мМ фенiлметилсульфонiлфториду. Пiсля 30 хвекстракцiї при перемiшуваннi гомогенат центрифугували на центрифузi “WPW-310” (ПНР)при 10000 об/хв протягом 20 хв. Отриману надосадову рiдину використовували для визна-чення ензиматичної активностi. Загальний вмiст бiлка визначали за методом Бредфорд [14].Дослiдження активностi ферменту проводили за методом [11].

Для дослiдження ультраструктури тканин кореневища проводили вiдбiр фрагментiврозмiром 1 × 2 мм, якi фiксували розчином 3% глутарового альдегiду “Fluka AG” (ФРН)i 1%-го чотириокису осмiю на фосфатному буферi з рН 7,2, потiм зневоднювали в серiїрозчинiв етилового спирту зростаючої концентрацiї i пiсля обробки ацетоном переносилиу сумiш епоксидних смол епону i аралдиту “Fluka AG” (ФРН) згiдно з загальноприйнятимиметодиками [15]. Ультратонкi зрiзи готували на ультрамiкротомi LKB-3 (Швецiя) та ана-лiзували в мiкроскопi JEM-1230 (JEOL, Японiя). Дослiди проводили у двох бiологiчних татрьох аналiтичних повторах.

Результати i обговорення. У кореневищах E. arvense, що перебували в станi фiзiо-логiчного спокою, виявлено iзоформу 9-ЛОГ, pH 4,2 (рис. 1). Наявнiсть у кореневищi ЛОГ

148 ISSN 1025-6415 Dopov. NAN Ukraine, 2015, №6

Рис. 1. Активнiсть лiпоксигенази 9-ЛОГ в рiзних органах на рiзних етапах онтогенезу E. arvense

оптимуму pH iз низьким значенням розглядається як одна iз складових механiзму адапта-цiї E. arvense до iснування в кислому грунтi (pH 4,8) [11]. На зразках кореневищ, зiбра-них у листопадi–груднi, були знайденi крохмалевмiснi бульбочки, дiаметр яких становив2,5–5,0 мм. На кореневищах, вiдiбраних навеснi, бульбочок не було, що пояснюється мобi-лiзацiєю з них запасних речовин при вiдновленнi ростових процесiв. Встановлено, що навузлах кореневища у всiх вiдiбраних зразкiв пiд захистом листових пiхв формувалися за-чатки пагонiв (бруньки) i зачатки коренiв. Бруньки являли собою вкороченi спороноснiпагони, що мiстили 6–7 мiжвузлiв та зачатковий стробiл. Зазвичай, у зимовий перiод бiль-шiсть бруньок знаходяться в сплячому станi i довжина їх дорiвнює 0,5–2,5 мм. Виявленуварiабельнiсть у морфометричних показниках можна пояснити аномально високими тем-пературами повiтря в першiй половинi зими дослiджуваного перiоду.

Впродовж осiнньо-зимового перiоду вiдбувалося незначне збiльшення активностi ЛОГу кореневищах на 20% та бруньках на 12% i її зниження в бульбочках на 25% (див. рис. 1).Ближче до середини весни (03.04) при встановленнi позитивної середньодобової температу-ри зачатки пагонiв (бруньки) виходили iз стану спокою, вiдновлюючи ростову активнiсть.Вiдповiдно, активнiсть лiпоксигенази в кореневищах зростала майже вдвiчi, а в бруньках —на 25%. Слiдовi значення активностi 13-ЛОГ (0,23 ± 0,002 мкМ гiдропероксиду лiнолевоїкислоти/(хв · мкг бiлка)) зафiксованi в бруньках кореневища. У попереднiх дослiдженнях13-ЛОГ активнiсть була визначена в надземнiй (стробiл, мiжвузля, листки) i пiдземнiй(кореневище) частинах хвоща, тодi як 9-ЛОГ — у стробiлi i кореневищi. Було, зокрема,встановлено, що 9-ЛОГ активнiсть значно зростала в кореневищi при висипаннi спор — напочатку процесу вiдмирання генеративного пагона. При дослiдженнi вегетативного пагона9-ЛОГ активнiсть була iдентифiкована тiльки в кореневищi [11]. Подiбний тип розподi-лу ЛОГ активностi характерний для вищих рослин, зокрема для картоплi, у якої 13-ЛОГприсутня лише в листках i стеблах, а 9-ЛОГ — у бульбах [2]. Вiдомо, що основними про-дуктами лiпоксигеназних реакцiй є моногiдропероксиди, якi виконують рiзнi фiзiологiчнiфункцiї, при цьому 9-ЛОГ каталiзує реакцiю утворення 9-гiдропероксидiв, а 13-ЛОГ —13-гiдропероксидiв ПНЖК. 13-гiдропероксиди є попередниками бiологiчно активних речо-вин, таких як травматин, жасмонова кислота (ЖК) та її похiднi [1, 2]. 9-гiдропероксидиПНЖК у вищих рослин є попередниками сполук, якi стимулюють синтез кетолiв, що iнду-кують цвiтiння, забезпечуючи забарвлення квiтiв, захист та апоптоз при мiкробiологiчному


Рис. 2. Локалiзацiя крохмалю в клiтинах кореневища E. arvense: а — фото, отримане на сканувальномуелектронному мiкроскопi (×750); б — фото фрагмента клiтини паренхiми кореневища, отримане на транс-мiсiйному електронному мiкроскопi (×15000). Позначення: КЗ — крохмальнi зерна; в — компартменiзованавакуоля

ураженнi патогенами листкiв, регулюють бульбоутворення Solanum tuberosum L. В умовахin vivo цi продукти лiпоксигеназної реакцiї iндукували бульбоутворення, викликаючи пе-реорiєнтацiю мiкротрубочок, що супроводжувалося збiльшенням радiального розтягуванняклiтин i сприяло розвитку бульби [2]. Роль 9-гiдропероксиду ПНЖК у хвощiв поки що невiдома.

E. arvense належить до багаторiчних рослин, i на зиму в грунтi залишається лише розга-лужене кореневище. Для хвоща характернi горизонтальний i вертикальний типи кореневищ.Горизонтальнi зазвичай бiльш товстi, з довгими мiжвузлями; вертикальнi — тоншi, з корот-шими мiжвузлями. Поверхня кореневищних мiжвузлiв порiвняно з поверхнею надземнихмiжвузлiв вегетативних пагонiв бiльш рiвна, її гребенi слабко вираженi. У кореневищi вiд-сутнi продихи, а також фотосинтезуюча паренхiма (хлоренхiма), а тяжi механiчної тканинитакого типу, як у надземних вегетативних пагонах [12]. Пiд епiдермою (ризодермою) мiж-вузлiв кореневища залягає кiлька шарiв вiдносно товстостiнних паренхiмних клiтин, що недерев’янiють, i в стiнках яких може вiдкладатись кремнезем [13]. Пiд ними розташованiбiльш тонкостiннi клiтини основної паренхiми. Клiтини паренхiми мiстять численнi амi-лопласти, заповненi крохмальними зернами, i є достатньо вакуолiзованими (див. рис. 2),що вказує на активну запасаючу функцiю. На мiкрофотографiях тканин зимового корене-вища, отриманих за допомогою сканувального електронного мiкроскопа, видно сферичнiкрохмальнi зерна, якi залишаються в сухому матерiалi. З аналiзу зображень, отриманих натрансмiсiйному електронному мiкроскопi, зрозумiло, що крохмальнi зерна мiстяться в амi-лопластах, по одному, рiдше по два в однiй органелi. Саме такий характер вiдкладаннякрохмальних зерен мають амiлопласти асимiляцiйних пагонiв. Клiтини кореневища в зи-мовий перiод мiстять значну кiлькiсть амiлопластiв, наповнених крохмалем (див. рис. 2).У мiру виходу iз стану спокою i з початком формування генеративних пагонiв в амiло-пластах зменшується кiлькiсть крохмальних зерен, збiльшується число лiпiдних крапель,


Рис. 3. Ультраструктура тканин кореневища E. arvense на рiзних етапах онтогенезу: а — 21.11; б — 21.12;в — 3.04. Позначення: ЛК — лiпiднi краплi; КЗ — крохмальнi зерна; в — компартменiзована вакуоля (×3000)

Рис. 4. Загальний вигляд клiтини основної паренхiми кореневища E. arvense навеснi (а, ×2000) та фрагментклiтини епiдерми (ризодерми) кореневища в зимовий перiод (б, ×8000). Позначення: ЛК — лiпiднi краплi,КЗ — крохмальнi зерна, В — компартменiзована вакуоля, Я — ядро, ЯД — ядерце, ГП — осмiєфiльнi гранулипiгменту

якi формують ланцюжки, розташованi поруч iз плазмолемою (рис. 3). Наявнiсть таких по-в’язаних з метаболiзмом змiн свiдчить про вiдновлення ростових процесiв у кореневищi.Також у клiтинах основної паренхiми в зразках кореневищ, вiдiбраних навеснi, добре вiзу-алiзуються ядра з ядерцями (рис. 4, а). Згiдно з результатами мiкроскопiчних дослiджень,в клiтинах епiдерми (ризодерми) та поверхневих шарах клiтин паренхiми, що вкриваютькореневище, мiстяться численнi осмiєфiльнi пiгментнi гранули значної електронної густини,якi зумовлюють темний колiр кореневища хвоща (див. рис. 4, б ).


Отже, в результатi проведеного дослiдження встановлено, що змiни в активностi ЛОГкорелюють iз сезонними змiнами фiзiологiчних i метаболiчних процесiв у кореневищi E.аrvense. Взимку активнiсть перебуває на низькому стабiльному рiвнi. З весняним потеплiн-ням вiдбувається активацiя лiпiдного обмiну, що супроводжується зростанням активностiЛОГ. Пiдтвердженням цьому також є збiльшення числа лiпiдних крапель, що формуютьланцюжки в цитоплазмi клiтин, розташованi поруч iз плазмолемою. Виявлено значну кiль-кiсть крохмалю в клiтинах паренхiми кореневища, вiдкладення якого спостерiгалося про-тягом зимового перiоду. З вiдновленням ростової активностi вiдбувається гiдролiз цьогозапасного полiсахариду. Хвощ польовий характеризується накопиченням запасних речовину пагонах, кореневищi i бульбах пiд час короткого перiоду активного росту. Завдяки унi-кальнiй архiтектурi кореневища, що глибоко залягає в грунтi i маса якого перевищує масунадземної частини рослини в кiлька разiв, хвощ успiшно протидiє впливу несприятливихчинникiв довкiлля i конкурує з iншими рослинами.

Цитована лiтература

1. Feussner I., Wasternack C. The lipoxygenase pathway // Annu. Rev. Plant Biol. – 2002. – 53. – P. 275–297.2. Бабенко Л.М., Косакiвська I. В., Скатерна Т.Д., Харченко О.В. Лiпоксигеназа рослин в адаптацiї

до дiї абiотичних стресових чинникiв // Вiсн. Харкiв. нац. аграр. ун-ту. Сер. Бiол. – 2013. – Вип. 2. –С. 6–19.

3. Косакiвська I. В., Бабенко Л.М., Устiнова А.Ю., Скатерна Т.Д., Демiревська К. Вплив темпера-турного режиму на активнiсть лiпоксигенази проросткiв рiпаку Brassica napus var. Oleifera // Доп.НАН України. – 2012. – № 6. – С. 134–137.

4. Babenko L.M., Kosakivska I.V., Akimov Yu.A., Klymchuk D.O., Skaternya T.D. Еffect of temperaturestresses on pigment content, lipoxygenase activity and cell ultrastructure of winter wheat seedlings // Gen.and plant physiol. – 2014. – 4, No 1–2. – P. 117–125.

5. Joo Y.-C., Oh D.-K. Lipoxygenases: Potential starting biocatalysts for the synthesis of signaling compo-unds // Biotechnol. Advances. – 2012. – 30. – P. 1524–1532.

6. Zimmennan D., Vick B. Lipoxygenase in Chlorella pyrenoidosa // Lipids. – 1973. – 8, Is. 5. – P. 264–266.7. Hamberg M. Isolation and structure of lipoxygenase from Saprolegnia parasitica // Biochem. Biophys.

Acta. – 1986. – 876. – P. 688–692.8. Beneytout J., Andrianarison R., Tixiu I. Properties of a lipoxygenase in green algae (Oscilllatoria sp.) //

Plant Physiol. – 1989. – 9, No 1. – P. 367–372.9. Liavonchanka A. Lipoxygenases: Occurrence, functions and catalysis // J. Plant Physiol. – 2004. – 99,

No 1. – P. 37–42.10. Бабенко Л.М., Войтенко Л.В., Скатерна Т.Д., Мусатенко Л. I. Лiпоксигеназна активнiсть в онто-

генезi Equisetum arvense L. // Физиология растений и генетика. – 2014. – 46, № 1. – С. 37–44.11. Войтенко Л.В., Щербатюк М.М. Стахiв М.П., Мусатенко Л. I. Ультраструктурнi особливостi

клiтин мiжвузля хвоща польового (Equisetum arvense L.) // Доп. НАН України. – 2012. – № 2. –С. 170–173.

12. Holzhuter G., Narayanan K., Gerber T. Structure of silica in Equisetum arvense // Anal. Bioanal. Chem. –2003. – 372. – P. 512–517.

13. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizingthe principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. – 1976. – 72, No 2. – P. 248–254.

14. Лотова Л.И. Морфология и анатомия высших растений. – Москва: Эдитореал УРСС, 2001. – 528 с.

References

1. Feussner I., Wasternack C. Annu. Rev. Plant Biol., 2002, 53: 275–297.2. Babenko L.M., Kosakivska I.V., Skaterna T.D., Kharchenko O.V. The bulletin of Kharkiv National

Agrarian Univ. (Ser. biology), 2013, Is. 2(29): 6–19 (in Ukrainian).


3. Kosakivska I.V., Babenko L.M., Ustinova A.Yu., Skaterna T.D., Demirevska K. Dopov. NAN Ukrainе,2012, No 6: 134–137 (in Ukrainian).

4. Babenko L.M., Kosakivska I. V., Akimov Yu.A., Klymchuk D.O., Skaternya T.D. Gen. and plant physiol.,2014, 4, No 1–2: 117–125.

5. Joo Y.-C., Oh D.-K. Biotechnol. Advances, 2012, 30: 1524–1532.6. Zimmennan D., Vick B. Lipids, 1973, 8, Is. 5: 264–266.7. Hamberg M. Biochem. Biophys. Acta, 1986, 876: 688–692.8. Beneytout J., Andrianarison R., Tixiu I. Plant Physiol., 1989, 9, No 1: 367–372.9. Liavonchanka A. J. Plant Physiol., 2004, 99, No 1: 37–42.

10. Babenko L.M., Voytenko L.V., Skaterna T.D., Musatenko L. I. Phisiologia rasteniy i genetika, 2014, 46,No 1: 37–44 (in Ukrainian).

11. Voytenko L.V., Shcherbatiuk М.М., Stachiv М.P., Musatenko L. I. Dopov. NAN Ukraine, 2012, No 2:170–173 (in Ukrainian).

12. Holzhuter G., Narayanan K., Gerber T. Anal. Bioanal. Chem., 2003, 372: 512–517.13. Bradford M. Anal. Biochem., 1976, 72, No 2: 248–254.14. Lotova L. I. Morphology and anatomy of higher plants, Moscov: Editoreal URSS, 2001 (in Russian).

Надiйшло до редакцiї 29.01.2015Iнститут ботанiки iм. М. Г. ХолодногоНАН України, Київ

Л.М. Бабенко, Н.Н. Щербатюк, И.В. Косаковская

Структурно-функциональные особенности корневища Equisetum

arvense L. в онтогенезе

Институт ботаники им. М.Г. Холодного НАН Украины, Киев

Исследован характер изменений активности липоксигеназы и ультраструктуры тканейкорневища хвоща полевого (Equisetum arvense L.) в период физиологического покоя и во времявыхода из него. Установлено, что выход из состояния покоя происходит на фоне ростаактивности липоксигеназы. Обнаружены специфические изменения, которые происходилив ультраструктуре тканей корневища хвоща при выходе из состояния покоя, среди которыхуменьшение числа крахмальных зерен в амилопластах и увеличение количествa липидныхкапель, которые формируют расположенный рядом с плазмолеммой липидный слой.

Ключевые слова: Equisetum arvense L., липоксигеназа, ультраструктура, корневище.

L.M. Babenko, M.M. Shcherbatiuk, I. V. Kosakivskа

Structural-functional peculiarities of Equisetum arvense L. rhizomes inontogenesis

M.G. Kholodny Institute of Botany of the NAS of Ukraine, Kiev

The nature of changes in the lipoxygenase activity and the tissue ultrastructure of rootstock horsetail(Equisetum arvense L.) during the physiological rest and during the way out of it are investigated.It is found that going out the dormancy occurs against a background of the increased activityof lipoxygenase. Specific changes that took place in the cell ultrastructure horsetail rhizome, whileleaving the rest, are identified. They include reducing the number of starch grains in amyloplast andincreasing the number of lipid droplets that form the lipid layer located next to the plasmolemma.

Keywords: Equisetum arvense L., lipoxygenase, ultrastructure, rootstock.


оповiдi НАЦiОНАЛЬНОЇ 6 2015 АКАДЕМiЇ НАУК …Рис. 1....

Documents