ii. proliferation/stammzellen ws 2008/2009. identität embryonaler neuraler vorläuferzellen
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II. Proliferation/StammzellenWS 2008/2009
Identität embryonaler neuraler Vorläuferzellen
Proliferation neuroepithelialer Zellen
Aus neuroepithelialen Zellen entstehen Radiale Gliazellen
Radiale Gliazellen sind neuronale Vorläuferzellen
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P/Psymmetrisch
P/Nasymmetrisch
Zellteilungsmuster der radialen Gliazellen
Neuronen enstehen in der VZ und wandern entlang von radialen Gliazellen zur Cortex
Wie können Neuronen entlang radialer Gliazellen wandern wenn radiale Gliazellen sich teilen?
Wie teilen sich radiale Gliazellen?
TuJ1/GFP
Asymmetrische Zellteilung radialer Gliazellen und Wanderungder neuronalen Tochterzelle
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Innere Kortex (4-6)durch VZ-Proliferation
Äussere Kortex (1-3)durch SVZ-Proliferation
P/Psymmetrisch
P/Nasymmetrisch
N/Nsymmetrisch
Zellteilungsmuster ändern sich während der Entwicklung
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Zellzykluslänge vergrößert sich während der Entwicklung
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Hypothese: Die Veränderung des Zellteilungsmusters (P/P vs P/N vs N/N) wird durch Zellzykluslänge (G1-Phase) gesteuert
Fakt: In neurogenen P werdenFaktoren exprimiert,die den Zellzyklus verlangsamen(Tis21, BM88)
Modell: Neuronale Zell-Fate-Determinanten werdenasymmetrisch auf dieTochterzellen vererbt.Wirksamkeit von G1-Länge abhängig!
Wo und wie lange findet Zellproliferation während der Entstehung des Nervensystems
statt?
Proliferation im Nervensystem: Analyse durch 3H-Thymidinmarkierung oder BrdU-Markierung (birthdating)
Methode:
Pulsmarkierung durch 3H-Thy oder BrdU
während der Neurogenese
- wird in DNA eingebaut.
Histologische Analyse unmittelbar nach
Pulsmarkierung - identifiziert Zellen in S-Phase
Histologische Analyse im adulten Gewebe- identifiziert Zellen, die sich zum Zeitpunkt
der Pulsmarkierung zum letzten Mal ge-
teilt haben. - sich weiter teilenden Zellen werden nicht markiert
wg. Ausverdünnung von BrdU/3H-Thy
Proliferation im Nervensystem: Analyse durch 3H-Thymidinmarkierung oder BrdU-Markierung (birthdating)
Ergebnisse:
• Neurale Zellen entstehen in Proliferationszonen (VZ, SVZ)• Es entstehen zunächst Nervenzellen (VZ), dann Gliazellen
(SVZ).• Die verschiedenen Nervenzellen werden in bestimmter
Reihenfolge in den Proliferationszonen gebildet• Nervenzellen entstehen ausschließlich während der
Embyronalentwicklung, aber...
Externe Körnerschicht
Ventrikulärzone
Ventrikulärzone
Ventrikulärzone
Subventrikulärzone
Proliferationszonen
Inside-out Muster der Neurogenese im Cortex
P. Rakic
Proliferation im adulten ZNS
• Riechepithel
• Proliferation und Apoptose von Nervenzellen im Singzentrum beim Vogel
• Subventrikulärzone (SVZ), Vorläufer von Neuronen im olfaktorischen Bulbus
• Hippokampus (Gyrus dentatus), Subgranulärzone produziert Körnerzellen im Gyrus dentatus
Proliferation im adulten CNS: SVZ
30 000 Zellen/Tag
Proliferation im adulten CNS: SVZ
Proliferation im adulten ZNS: Hippokampus von Säugern incl. Primaten
150 Zellen/Tag
Proliferation im adulten ZNS: Hippokampus beim Menschen
SVZ (Maus)
-30 000 Zellen/Tag
- Ersatz von absterbenden Zellenim olfaktorischen Bulbus
- 60% der Zellen werden ersetztinnerhalb von 18 Monaten
DG (Maus)
-150 Zellen/Tag
- Zusätzliche Zellenim Gyrus Dendatus
- 10% der Zellen zusätzlichinnerhalb von 18 Monaten
Eigenschaften der proliferierenden neuronalen Vorläufer im adulten CNS - handelt es sich um Stammzellen?
Stammzelleigenschaften (Hämapoietisches System)
1. proliferieren während der gesamten Lebensdauer der Organismus
2. produzieren identische Nachkommen (selbstreplizierend).
3. produzieren eine grosse Anzahl von unterschiedlichen Nachkommen (multipotent) durch Progenitor/Vorläufer-Zellen (transient amplifying cells), die nur eine bestimmte Zahl von Zellteilungen durchlaufen und ein eingeschränktes Entwicklungspotential besitzen.
4. Multipotenz bleibt erhalten während der Lebensdauer des Organismus.
5. Eine einzelne Stammzelle kann das gesamte Gewebe regenerieren.
Eine selbstreplizierende Zelle die mindestens zwei unterschiedliche Nachkommen produziert (Temple).
Eigenschaften der proliferierenden neuronalen Vorläufer im adulten CNS - handelt es sich um Stammzellen?
- kontinuierliche Produktion von Neuronen- Selbstreplikation in klonalen Kulturen (Neurosphären)
Stammzellkulturen aus dem ZNS
FGF/EGF
FGF/EGF
Entfernung vonProliferationsfaktorenZugabe von Differenzierungs-Faktoren (CNTF-Astrozyten)
Klonale Kulturen
Differenzierung in vitro Differenzierung in vivo
Nach Implantierung in embryonales oder adultes Nervengewebe
Abnahme ‚früher‘und
Zunahme ‚später‘
Stammzellen in
Neurosphärenkulturen
≠ adulte Stammzellen
in Stammzell-Nische
Identifizierung/Charakterisierung adulter neuraler Stammzellen
SVZ Stammzellen und Vorläuferzellen
GFAP promotor-abhängige- virale Infektion oder - GFP-expression oder
GFAP+ GFAP- GFAP-
Dbx+ Dbx+
PSA-NCAM
Vergleichbare Eigenschaften der Stammzellen in der Subgranulärzone im Hippokampus und in der
neurogenen Zone beim Zebrafinken
Hippocampus Neurogene region im Vogelgehirn
GFAP-promotor dependentinfection
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are needed to see this picture.SVZ
Hippocampus
Seminar
Vergleichbare Umgebung der Stammzellen in der Subgranulärzone im Hippokampus und in der SVZ:
‚Stammzell-Nische‘
SVZ Stammzell-Nische
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B-Zelle (ca 6000/LV)
Blutgefäß
A-Zelle
Neu produzierte Neuronen im adulten CNS sind funktionell - Zebrafink HVC
Neuron im HVC antwortet auf akkustische Stimuliund ist 3H-Thymidin-markiert
Neu produzierte Neuronen im adulten CNS sind funktionell - Hippokampus
Zusammenfassung
• Aus der SVZ (B-Zellen) können Neurosphären gewonnen werden, die über lange Zeiträume passagiert werden können und somit selbst-replizierend sind
• Klonale Neurosphären enthalten pluripotente Zellen
• Diese Zellen bleiben im adulten Tier erhalten
• Somit sind also GFAP+ SVZ ( B-Zellen) neurale Stammzellen
Was ist die Funktion der Neurogenese im adulten
Gehirn?
Die Produktion neuer Neuronen im HVC ist für das Erlernen neuer Lieder beim Zebrafink/Canary
erforderlich
Neuronen werden ersetzt
Adulte Neurogenese im Hippocampus ist wichtig für Lernen und Gedächtnis
(Hippocampus-abhängiges räumliches L.)
• Anregende Umgebung (‚enriched environment‘) und Laufen erhöht Neurogenese, Lernvermögen und LTP
• Maus-Stämme mit erhöhter hippokampaler Neurogenese (C7Bl6) zeigen besseres räumliches Lernverhalten als Maus-Stämme mit niedriger Neurogenese (DBA/2)
Adulte Neurogenese im Hippocampus ist wichtig für Lernen und Gedächtnis
BrdU-labeled cellsControl 1,409 ± 132Runners 3,746 ± 800*
Neue olfactorische Neuronen aus der SVZ (I) - sind für Geruchsdiskrimination
wichtig
Gheusi et al., 1999
Neue olfactorische Neuronen aus der SVZ (II)‚neue‘ Neuronen reagieren besser auf unbekannte olfaktorische Stimuli, (Macklis, unpublished; single cell analysis)
Neue olfaktorische Neuronen aus der SVZ (III)Zahl der Neuronen nimmt zu in Umgebung mit olfaktorischen Stimuli - bessere Geruchsdifferenzierung(Rochefort et al., 2002)
Kontrolle adulter Neurogenese -
• Genetische Unterschiede-Maus-Stämme
• Enriched environment• Running• Hormone (Stress)• Wachstumsfaktoren (FGF, EGF)
• Läsion (e.g. Hirnschlag) - spielt Neurogenese eine Rolle bei
Regeneration??
Neurale Stammzellen und Stammzell-Therapie
A: Aktivierung endogener Stammzellen (Macklis)
B: Injektion exogener Stammzellen oder aus Stammzellen gewonnener Zellen.
Implantierung von Neurospären-Zellen in das adulte CNS- im Hippokampus und SVZ: Neuronen- in andere Gehirnregionen: Glia
Stammzell-Nische
Implantierung von Stammzellen inadultes CNS
- in Regionen mit Läsion, apoptotischem Zelltod (II/III): Neuronen
- in Regionen ohne Läsion:Gliazellen
Implantierte immature Neuronen differenzieren zu glutamatergen Neuronen und innervieren die korrekte
Zielregion
Läsion in Cortex-Schicht VI
Endogene Stammzellen differenzieren zu Neuronen nach Läsion in Schicht VI
Endogene Stammzellen differenzieren zu Neuronen nach Läsion in Schicht VI
Neurale Stammzellen und Zell-Therapie
A: Aktivierung endogener Stammzellen (Macklis)
B: Injektion exogener Stammzellen oder aus Stammzellen gewonnener Zellen.
Modelle neuronaler Degeneration
Parkinsonsche Krankheit
• Degeneration dopaminerger Neuronen der Substantia nigra, (projizieren zum Striatum)
• Verbesserung des klinischen Befunds durch Implantierung von Zellen aus der fötalen Substantia nigra. Korrelation mit Überleben der implantierten Zellen und Innervation des Striatums.
• In vitro Vermehrung von Zellen aus der S. nigra - Test im Tiermodell
Parkinsonsche Krankheit
Parkinsonsche Krankheit:Tiermodell
Implantierung von Vorläuferzellen aus der S. Nigra in Striatum-Läsion
Funktioniert im Prinzip, aber Problem der Zellgewinnung ungelöst!
Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) - die optimale neurale
Stammzelle?
Embryonale Stammzelle (ES-Zelle)
Most protocols involve ‚embryoid body‘ aggregate cultureas initial step and then sequence of different factors
Strategien um spezifische Neuronen aus Stammzellen
zu differenzieren (e.g dopaminerge N.)
Versuch und Irrtum Embryologischer Ansatz Verbesserter Embryolog.Ansatz
Stem cell
Patterning signalsMorphogens,Fate specifying transcription factors
Select committed progenitors usingreporter gene (GFP)
Implantation of ES cell-derived differentiated dopaminergic cells into animal model of Parkinson‘s
disease
Also better in more specific motor tasks
Modified from Marín et al. Dev. Dynamics 234:709-717, 2005
Pax6DlxIsl1
En1/2LmxNurr1Pitx3
Pax6Nurr1GABA Nkx2.1
MsxGABA
Probleme und Potential von ES Zell-Therapien
Undifferenzierte ES Zellen werden zu Teratoma (Tumoren) - 100% der implantierten Zellen müssen differenzierte Neuronen sein.
Alternative: Reprogrammierung oder adulte endogene Stammzellen
Dopaminerge Neuronen und Motoneuronen aus iPS Zellen, aber auch dort Teratoma-Problem
•Wenn differenzierte ES Zellen xenotransplantiert werden (Maus in Ratte)• wird eine sehr geringe Tumorrate beobachtet.•Sehr hohe Tumorrate bei homologen Transplantationen, •selbst wenn die Zellen vor-differenziert wurden (Erdö et al., 2003).
Demyelinisierungs-Erkrankungen (Multiple Sklerose)
Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosisNature 422, 688 - 694 (2003);
Radiale Gliazellen produzieren Neuronen in vivo (Cortex)
lacZGlut/NeuN