III. BAHAN DAN METODE ,

Untuk mencapai sasaran tujuan penelit ian, ' sesua i dengan s p a yang

te lah dikemukakan pada BabI d i muka, maka penel i t ian ini disusun

dalam bebe rapa tahap. Seca ra keseluruhan, penel i t ian ini meliputi: 1)

pene l i t i an laboratorium, berupa pene l i t i an serologik: p a d a tahap ini

dimulai dengan pengumpulan bahan i so l a s i be rupa bu r sa Fabr ic ius ayam-

ayam yang terinfeksi oleh virus IBD, berasa l da r i peternakan ayam d i

bebe rapa tempat d i Pulau-pulau Sumatera, Jawa, Ba l i dan Pulau

Sulawes i , diikuti dengan tahapan i so l a s i dan ident i f ikasi t ipe v i rus IBD

asa l lapang; dan 2) penelit ian ekeperimental . P a d a tahapan penel i t ian

eksper imental ini te lah dikerjakan 2 macam percobaan yaitu uji

imunisasi pa s i f s i lang dan uji netra l isas i s i l ang an ta ra i so l a t v i ru s IBD

asa l lapang dengan ant isera v i rus vaksin a sa l impor.

Mengenai bahan-bahan s e r t a metode-metode yang digunakan p a d a

s e t i ap langkah dar i penelit ian ini, dapa t diikuti p a d a uraian-uraian

sebaga i berikut:

3. 1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penel i t ian ini dimulai pada bulan M e i 1992 hingga September

1994 dan dilakukan di Laboratorium Imunologi, Jurusan Penyakit Hewan

dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakul tas Kedokteran Hewan,

Institut Pertanian Bogor .

3. 2. Penelltian di Laboratorlum

Penelitian ini meliputi:

1) isolasi virus IBD dari bursa Fabricius pada telur berembrio bebas . patogen tertentu (SPF = specific pathogen f r ~ e ) , umur 9-10 hari dan

pada biakan jaringan (chicken embryo Jlbroblast = CEF), melakukan

uji serologik dengan uji netralisasi serum terhadap isolat virus IBD

asal lapang, dilanjutkan identifikasi virus IBD asal lapang

2) pembugtan dan pemurnian antigen (cloning)

5) titrasi virus IBD pada biakan re1 fibroblas embrio ayam

4) pembuatan serum kebal kelinci terhadap isolat virus IBD anal lapang

5) uji netralisasi serum untuk menentukan keterkaitan antigen; untuk

memilih inolat virus IBD asal lapang yang dapat mewakili beberapa

tempat d i Indonesia.

3.2.1. Isolasi dam Identifikasi Tipa Isola t Virus IBD Asal Lapang:

Hswan Percobaan:

T I / K ~ berembrio yang bebas patogen tertentu ( S P F = specific

pathogen free) beranal dari P T Vaksindo Satwa Nusantara,

Citeureup.

Kelinci pr t ib (New Zealand white) dengan berat badan kisaran 1 kg

yang berasal dari Balai Penelitian Ternak, Ciawi

Ayam petelrr jantan berumur 1 (satu] hari, dari PT Manggis, Cibadak.

Sukabumi.

Baban Kimia. Bahan-bahan untuk media biakan jaringan (chicken

embryo fibroblast = CEF) adalah L-glutamin, tryptoee phosphat

broth, serum an& sapi (calf serum), tripsin 0.25%. photiphat pen-

28

yangga (buffer) atau larutan PBS yang mempunyai pH = 7.4 ini akan

digunakan untuk bahan pelarut d m pengencer suspensi dari organ

bursa. antibiotika, fungizon, NaH2C0, 7.3%.

Plralaian .Peralatan yang digunakan dalam penelitian a d a l d high speed

centrifuge, laminar flow dan C02 incubator.'

Metadc:

Biakan re / . Biakan se l fibroblas (chicken embryo fibroblast = CEF)

dibuat dari telur berembrio SPF berumur 9-10 hari. Tatacara

pembiakan CEF sama seperti dilaporkan oleh Lukert (1986). Biakan

sel diinkubasikan dalam inkubator suhu 37OC dengan kadar 5% COz.

Media yang digunakan mengikuti Jackwood e t a l . (1982b) dengan

jenis MEM (minimal essential medium) dari Dulbecco ( D M E M ) .

Trlur berembrio. Telah lama diketahui bahwa virus tidak dapat

berkembang biak dalam media sintetik yang terdiri dari bahan kimia.

Virus hanya dapat berkembang biak dalam sistem sel hidup, yakni

hewan percobaan (ayam, marmot dan kelinci) telur berembrio dan

biakan sel atau biakan jaringan. Telur berembrio digunakan

sebagai bahan untuk membuat biakan re1 fibroblas embrio (CEF).

Pembnatan biakan set.

Tujran: untuk mengisolas i , mengidentifikasi , memperbanyak virus,

t i t r a s i v i rus inolat lapang dan untuk uji netra l isas i s e r u m .

Cara ker ja : embrio ayam diambil dengan pineet s te r i l dan dimasukkan

d a l a m cawan pe t r i nteril. Kepala , kaki, eayap dan is i perut dibuang

s e l eb ihnya dimasukkan ke da lam labu erlenmeyer, kemudian

dipotong-potong dengan gunting sampai hhlus dan dicuci dengan

larutan PBS s te r i l , untuk menghilangkan darah. Setelah itu dituangkan

larutan t r ips in 0,25% yang telah dihangatkan pada suhu 37°C dalam

penangas a i r (waterbath).

Untuk melepaskan sel-sel d a r i potongan jaringan, maka larutan

te r sebut dikocok dengan a la t pengocok magnet (magnetic st irrer)

s e l a m a 10 menit. Kemudian larutan yang mengandung t r ips in

didiamkan b e b e r a p a menit, agar potongan jar ingan yang masih besar

mengendap. Supernatan yang mengandung t r ips in dan butir darah

merah dibuang dan kepada endapannya kembal i ditambahkan larutan

t r ipein, p ro se s t r ips inas i diulang 3 ka l i namun supernatan yang

terbentuk dituangkan ke dalam tabung sentrifus. Untuk memisahkan

s e l d a r i larutan t r ips in , maka s e l disentrifue p a d a kecepatan 1.500

rpm se l ama 10 menit. Selanjutnya s e l tersebut d icuc i dengan

larutan PBS s t e r i l untuk menghilangkan kandungan tripsinnya, guna

memisahkan s e l halus dar i eel potongan besar maka larutan s e l

t e r sebut d i sa r ing dengan saringan kasa (s ter i l ) , kemudian disentr i fus

kembal i . Endapan s e l tersebut dilarutkan dalam med ia penumbuh,

selanjutnya dihitung jumlahnya. Se l yang didapat 2 x lo5 s e l pe r

ml med ia penumbub (DMEM, NaH2C03 7,3%, tryptoee phosphat

broth, 5% CS, penis i l in 10.000 pl/ml, streptomisin 10.000 pg/ml

dan fungizon 100 pglml). Kemudian s e l tersebut dibiakkan dalam

microplate 96 sumur (lubang) dan inkubaeikan dalam inkubator

pada suhu 37°C dengan C 0 2 5% selama 24 jam. Sel siap dipakai

24-48 jam atau setelah membentuk sel selapis penuh, dan sel

langsung digunakan untuk uji netralisasi serum atau titrasi virus.

Virus (IBD). Virus IBD diisolasi dari beberapa tempat di pu lau Jawa.

Medan, Lampung . Bali dan Maros. Vi rw diisolasi dari bursa

Fabricius ayam penderita IBD. Dan bursa yang terinfekoi tersebut

dibuat suspenei 20% dengan larutan PBS steril yang mengandung

antibiotik (penisilin 200 IU, streptomisin 200 pg, kanamisin 200 pg

dan fungizon 100 pg masing-masing per ml), kemudian disentrifus

1.500-2.000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh

ditambah dengan serum ayam terhadap ND (serum kebal) yang

mengandung titer HI 2'' per rnl sebanyak 20% (vlv), dibiarkan pada

suhu kamar atau di dalam penangas a i r pada suhu 37OC selama 10-15

menit untuk mengadakan proses netralisasi antara virus N.D. dan

serum kebalnya, b i l a dalam supernatan bursa diduga terdapat virus

ND. Selanjutnya suspensi tersebut disaring dengan f i l ter ukuran 0.22

pm (Mill ipore) disuntikkan ke dalam kantung kuning telur embrio

ayam SPF umur 5-6 hari. ke dalam ruang alantoik embrio ayam SPF'

yang berumur 9 hari, membran khorio-alantoik ayam SPF umur 11

hari dan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37OC selama 5

hari. Virus dipanen dengan mengumpulkan selaput kantung kuning

telur, cairan alantoik dan membran khorio-alantoik. Selaput kantung

kuning telur dan membran khorio-alantoik digerus dan dibuat

suspensi 20% dalam larutan Hanks steril atau PBS steril. Kemudian

disentrifus 1.500 rpm selama 10-15 menit, supernatannya merupakan

suspensi yang mengandung virus IBD. Suspensi tersebut kemudian

digunakan untuk mengidentifikaai virus dengan uji presipitasi agar

gel. Di samping itu suepensi yang berasal dari bursa juga

diinfeksikan kepada ayam SPF umur 3 minggu melalui tetes mata d m

per ora l dengan doria f 1 ml. Ayam itu eetiap hari diamati untuk

melihat tanda klinik terutama 2-6 hari setelah infeksi. Selanjutnya

prosedur diatas diikuti identifikasi virus dengan cara pemeriksaan

patologianatomik, pemeriksaan hietopatologik serta uji nrtralisasi.

Sebagian suspensi bursa juga dinokufasikan pada lapisan

biakan se l fibroblas embrio ayam (CEP). Biakan tersebut

diinkubaeikan dalam inkubator yang mempunyai suhu 37°C dengan

5% C02. Pengamatan dilakukan setiap hari dengan harapan akan

timbul perubahan sel berupa degenerasi dari sel akibat perusakan

sel oleh virus. Kelainan sel tersebut dinamakan efek sitopatik

(cytopathic effect), sedang virus yang menimbulkannya dieebut

virus yang sitopatogenik. Efek sitopatik dapat dilihat di bawah

inverted microscope. Dalam usaha untuk mengisolasi virus efek

sitopatik terdapat indikasi bahwa bahan tersebut mengandung virus.

Akan tetapi lintasan atau pasasi pertama pada biakan se l fibroblas

belum terbentuk efek sitopatik yang diharapkan maka lintasan pada

biakan CEF dilakukan berulang-ulang berkisar 1-5 kali sampai

terlihat efek sitopatiknya.

Cars membuat lintasan biakan virus adalah sebagai berikut:

cairan dan sel biakan virus tersebut dipanen dan disentrifus pads

1.500-2.000 rpm selama 15 menit. Endapan yang terbentuk dilarutkan

ke dalam larutan media penumbuh dan diinfeksikan kembali pada

biakan jaringan CEF, diulangi perlakuan tersebut sampai

mendapatkan bentuk CPE. Mulai pada lintasan ketiga jelas terlihat

se l yang rusak akibat infeksi virus dengan membentuk bercak

(plaque), eebagian sel yang rusak terlepas dan meninggalkan suatu

bercak yang makin lama makin meluas karena makin banyak sel yang

dirusak. Biasanya pada hari ke 5 sampai hari ke 7 eel-re1

seluruhnya telah rusak.

Dengan cara tersebut telah berhasil dikumpulkan lebih dari 30

isolat virus IBD dan yang akao digunakan seterusnya pada

penelitian adalah 24 isolat virus IBD, di samping itu juga galur

Lukert yang telah dibakukan diikut sertakao dalam penelitian sebagai

standar. ,

3.2.2. Pembnatan dan pemnrnlan antlgen. Pembuatan dan pemurnian

antigen mengikuti metode yang dilaporkan oleh Jackwood et a l .

(1987). Secara singkat dapat dijelaskan bahwa isolat virus yang akan

dimurnikan ditumbuhkan dalam biakan CEF. Dengan metode plaque

puriflcatfon virus diisotasi dari bentuk plaque yang sama ukurannya

sehingga dapat dibatasi kontaminannya.

Cara kloning: surpensi yang ternyata sudah positif mengandung

virus Ciumboro (pada lintasan keempat atau kelima) dibuat

pengenceran 10-I sampai lo-*, diinfeksikan 25 p l per sumur (yang

menggunakan mikroplat 96 sumur) pada biakan se l selapis fibroblas

embrio ayam dan diinkubasikan dalam inkubator 37OC dengan C02

5% selama 3-5 hari. Pada biakan tersebut apabila terlihat efek

sitopatiknya, maka 0,l ml cairan dan sel yang mengandung CPE . dikumpulkan dan dilarutkan dalam 1 ml larutan PBS steril , setelah itu

disentrifus pada 2.000 rpm selama 20 menit. Kemudian endapan

yang terbentuk dilarutkan dalam PBS steril dan diinfeksikan pada

mikroplat 6 sumur (Nunc Ltd) yang berisi lapisan biakan sel

fibroblas embrio ayam (CEF) yang telah sempurna. Biakan CEF

tersebut diinkubasikan dalam inkubator bersuhu 37OC selama 30-60

menit untuk memberi kenempatan penyerapan virus ke dalam sel,

setelah itu diberi media agar 1% (agar Nobel 296, media penumbuh

DMEM 2x dan calf serum (CS) 5%) rebagai pelapis penutup. Sel

tersebut diinkubasikan dalam inkubator 37OC dengan 5% C02, dan

diamati tiap hari. Dua hari kemudian ditambah dengan agar 1%

yang mengandung indikator 0.02% neutral red.

Sel tersebut diinkubasikan pada inkubator ruhu 37OC dengan 5%

C 0 2 , dan diamati setiap hari sampai terbentuk CPE yang sama

ukurannya. CPE yang terbentuk dipanen satu per satu dap dilarutkan

dalam 1 ml media penumbuh steri l (DMEM + 5% calf serum =

CS), dan proses kloning tersebut di atae diulang untuk mendapatkan

klon yang sama ukurannya (murni). Klon yang dihasilkan tersebut

diperbanyak dengan cara ditumbuhkan pada biakan sel CEF. Virus

yang dihasilkan disimpan dalam suhu -20°C sebagai stok virus.

3.2.3. Tit ras i virus pada biakan sel fibroblas embrio ayam . Titrasi

v i r u ~ bertujuan untuk mengetahui konsentrasi virus yang ada dalam

suspensi guna menetapkan dosis virus yang dapat menginfeksi

sebanyak 50% media percobaan (dalam ha1 ini digunakan biakan sel

fibroblas embrio ayam .

Cara krrja:: mula-mula dibuat pengenceran desimal dari setiap

isolat virus lapang yang telah murni dan masing-masing

pengenceran virus tersebut (10" sampai 1 0 ~ ' ~ ) diinfeksikan pada

biakan sel selapis fibroblas embrio ayam yang sudah ditanam pada

microplate (96 sumur). Untuk setiap pengenceran isolat virus aoal

lapang murni diinfeksikan masing-masing 25 pl pada 5 sumur dalam

microplate. Kemudian biakan tersebut diinkubasikan pada inkubatar

suhu 37"C, 5% COz.

Diamati selama 3-5 hari eampai terbentuknya efek sitopatik. Hasil

t i traai virus atau titer dosis infektif 50 (IDso) juga diperhitungkan

per ml dan dihitung dengan metode Reed dan Muench (Cessi dan

Nardelli , 1976; Bayyari et al., 1991).

3.2.4. Pembnatan antlsernm te rhadap vlrus IBD (sera hlpcrlmnn).

Tufuan: untuk mendapatkan serum yang mengandung antibodi

terhadap virus IBD lapang yang telah murni.

Vlrns IBD yang dlgunakan: adalah virus lapang yang telab

dimurnikan dan eebagai virus kontrol (standar) adalah virus Lukert.

Virus diinokulasikan kepada kelinci putih (New ~ e ; l a n d white)

dengan berat badan f 1 kg. Cara pembuatannya mengikuti cara yang

digunakan Jackwood e l al. (1982b).

Setiap isolat virus titernya ditetapkan sehingga t iap ml

mengandung l o 4 sampai l o 6 TCIDso. Suspenei virus tereebut

dicampur dengan larutan Freund's adjuvant komplit dengan volume

sama banyak.

Kelinci yang telah dipersiapkan, diinfeksi eecara intramuskuler

dengan suspensi virus di atas pada otot paha dan diikuti dengan

penyuntikan di bawah kulit atau subkutan masing-masing

menggunakan dos is lo4 sampai l o 6 TCIDSO. Selanjutnya, kelinci

disuntik ulang 2x (booster) dengan suspensi virus d i atas selang 2

minggu. Sera dipanen 4 minggu setelah penyuntikan terakhir dan sera

dari kelinci diuj i terhadap galur Lukert, yang merupakan virus

standar.

3.2.5. Ujl netral lsasl seram (N.S.) sllang. Uji ini dilakukan

berdasarkan metode f l dengan menggunakan microplate (96 sumur)

yaitu dengan menggunakan pengenceran serum dengan konsentrasi

virus konstan. Pengenceran serum dilakukan dua (2) kali sedangkan

konsentrasi virus konstan atau tetap yaitu 100 TCIDSo per 25 ~ 1 .

rujuan uji nrtrallsasi sllang: untuk menentukan titer antibodi

terhadap virus IBD homolog maupun heterolog. Dan dalam

percobaan ini digunakan virus IBD Lukert sebagai standar

(standar).

Titer serum dihitung berdasarkan pengenceran terakhir serum yang

masih dapat menetralkan 100 TCID5,, virus IBD.

Cora: seluruh sumur pada mlcroplate (96 sumur) diisi dengan ,

25 p l larutan DMEM steril. Pada sumur pertama diberikan 25 p l

serum dan dikocok sehingga homogen kemudian pindahkan 25 p1

pada sumur kedua yang artinya larutan serum tersebut diencerkan

secara kelipatan 2x sampai sumur ke 10. Setelah itu sumur pertama

sampai kesepuluh diisi dengan 25 p l virus (100 TCIDSo), sedangkan

sumur ke 11 diisi dengan 25 p1 virus IBD Lukert (100 TCIDSO)

aebagai kontrol positif, dan sumur keduabelas hanya berisi larutan

serum sebagai kontrol negatif. Kemudian diinkubasikan ke dalam

inkubator pada suhu 37OC, 5% C 0 2 selama 30 menit. Selanjutnya

seluruh sumur diberi 100 p1 suspensi biakan CEF yang mengandung

2 x 10' sel per ml. Diinkubasikan kembali dalam inkubator dan

diamati setiap hari sampai terjadi perubahan dengan terbentuknya

CPE, dibandingkan dengan kontrol posit if yang terdiri dari biakan sel

dan virus Lukert eedang dan kontrol negatif terdiri dari serum

normal dan biakan sel (Jackwood et al., 1982a).

Pengerjaan ini dilakukm hanya terhadap 24 isolat virus pilihan

yang dinetralisasi silang dengan masing-masing serum kebal kelinci

yang mengandung antibodi terhadap 24 isolat virus. Setiap uji

diulang sebanyak 4 kali. Perhitungan indeks netralisasi serum

berdasarkan metode Reed and Muench (1950) (Cessi dan Nardelli,

1976; Bayyari et al.. 1991).

3.3. Penelitian Eksperimental

3.3.1. Pcrcobasn 1: Pcncntman kctcrkaltan sntlgen. Antiserum yang

mengandung 20 unit antibodi terhadap eatu serotipe IBD tidak

mampu menetralkan 100 TCIDSo dari serotipe lain (KBpikian et ol.,

1967), sedangkan apabila virus tereebut homolog dengan

antibodinya rnaka satu unit antibodi adalah titer antiserum terendah

yang mampu menetralkan 100 TCIDSo virus.

Cara yang dilakukan pada percobaan ini adalah uji netralisasi

antara ieolat setiap virus IBD anal lapang yang telah dipilih

sebanyak 24 dan 1 isolat virue galur Lukert sebagai standar, terhadap

masing-masiog antiseranya akan didapatkan nilai indeks netralisasi

dari masing-masing uji pada biakan jaringan (CEF). Kemudian

berdasarkan rumus Archetti dan Horefall didapatkan nilai R yang

akan digunakan dalam analieis penentuan keterkaitaa antigen.

Rnmns Arch e t t i dun Horsfall:

r, adalah haeil bagi titer heterolog dengan virus 2, oleh titer

homolog yang diperoleh dengan v i n e 1, eedangkan rz merupakan

hauil bagi titer heterolog dengan virus 1, oleh titer homolog yang

diperoleh dengan virus 2.

R mencerminkan antigenic relatedness di antara kedua virus

baik virus maupun antibodinya digunakan pada uji netralisasi

silang. Nilai R ditetapkan dengan menghitung titer rataan secara

geometri dari minimal 4 kali pengujian NS.

3.3.2. Percobaan 2. Ujl imnnfsasI paslf sllang.

Uji ini dimaksud untuk mengetahui reaksi silang antibodi yang

dihasilkan oleh uatu virus terhadap virus lain.

Melalui penelitian mengenai keterkaitan antigen antar virus dapat

diindentifikasi varian atau subtipe yang didapat dari ,ke 24 isolat

virus itu . Dari ke 24 isolat virus IBD asal .lapang dapat ditetapken

virus terpilih pada percobaan 1. Selanjutnya antiserum yang

mengandung antibodi terhadap virus varian dari percobaan 1

digunakan pada percobaan pengebalan ayam petelur jantan melalui

suatu ca ra imunisasi pasif yaitu dengan pemberian serum kebal.

Untuk pengujian ini diperlukan jumlah masing-masing antiserum.

yang cukup banyak oleh karena itu dilakukan pembuatan antiserum

tersebut pada kelinci melalui penyuntikan dengan masing-masing

isolat virus IBD asal lapang terpilih (dari percobaan 1). Serum

kelinci yang mengandung antibodi isolat virus IBD asal lapang

(percobaan I), kemudian ditetapkan titer antibodinya pada biakan

CEF. Titer Ab yang didapat adalah >5.120 (Jackwood e t al.,

1982b).

Pelaksanaan imunisari pasif silang. Sebelum melaksanakan,

imunisasi silang perlu diketahui tertebih dahulu titer antibodi asal

induk (AAI) pada ayam yang digunakan untuk percobaan ini. Oleh

karena itu dilakukan pengambilan serum pada 10 ekor ayam

percobaan umur 1 hari (DOC), ternyata dari haeil uji uetralisasi

serum pada biakan jaringan cukup tinggi yaitu > 512 maka

pengambilan serum diulang saat ayam berumur 14 dan 21 hari untuk

mengetahui titer antibodi asal induk terhadap Gumboro seperti yang

diinginkan yaitu < 500 . Ayam percobaan yang digunakan 100 ekor, dibagi menjadi 5

kelompok. Empat kelompok A, B, C, D dan kelompok E untuk

kontrol tidak mendapat perlakuan, yang masing-masing terdiri dari

20 ekor ayam percobaan. Kemudian setiap kelompok dibagi menjadi

4 subkelompok (A. B, C dan D) yang terdiri dari 5 ekor ayam.

Masing-masing antiserum disuntikkan kepada 4 subkelompok ayam

umur 3 minggu masing-masing 5 ekor ayam setiap subkelompok

dengan demikian ada 4 x 4 = 16 subkelompok ayam pbrcobaan. Di

samping 4 subkelompok ayam yang tidak dikebalkan, diperlakukan

aebagai kontrol.

Pemberian serum kebal tersebut dilakukan pada saat diketahui titer

antibodi asal induk < 500. Serum kebal tersebut mengandung titer

antibodi terhadap virus yang homolog minimal 5.120 per ml dan

diaplikasikan secara intraperitoneal (Wood et al., 1988 dan Fahey

et al . . 1991a).

Pada hari ke 5 setelah imunisasi, setiap kelompok (A. B. C, dan D)

ditantang dengan masing-masing isolat virus IBD asal lapang

terpilih (percobaan 1) termasuk kelompok E (kontrol). Dosis virus

tantang pdalah 0,s ml yang mengandung 1 0 ~ ' ~ TCIDSO setiap ekor,

diberikan melalui mulut. Ayam percobaan diamati mulai hari ke 2-5

pasca inokulasi terhadap gejala klinik, kesakitan/kematian dan

perubahan pasca mati yang terbentuk pada otot dada, otot paha

bagian dalam dan pada organ bursa Fabricius. Lima hari

pascainfeksi, darah ayam diambil dari ayam yang masih hidup baik

ayam aehat maupun sakit. Penghitungan titer serum dilakukan menurut

Reed and Muench. Sebagai kontrol digunakan virus Lukert. Seluruh

kelompok ayam mendapat vaksinasi terhadap ND sesuai dengan

program baku.

3.3.3. Percobaan 3. Uj1 netrallsasf sllang lsolat Iapang terplllh

t e rhadap ant isera vaksin akt i f Gumboro asal impor yang

dlgmnnkan d l peternakan d l Indonssla.

Dalam periode tahun 1990-1991 penyakit Gumboro mewabah

hampir di seluruh dunia, termasuk di Indonesia. Masalah yang

dihadapi di Indonesia adalah bahwa vaksin terhadap Pumboro ini

sudah diimpor baik dari Eropa maupun Ame~ika. Akan tetapi semua

vaksin yang ada ternyata belum mampu secara tuntas mencegah

timbulnya penyakit Gumboro. Dengan demikian masih banyak yang

harus diperhatikan berkaitan dengan ca ra pengendalian penyakit

Gumboro, antara lain diduga adanya perbedaan virus vaksin dengan

virus asal lapang.

Pada uji coba ini dilakukan uji netralisasi serum silang antara

serum kebal dari keempat virus vaksin komersial terhadap isolat

virus IBD asal lapang k-5. 11.13 dan 19. Serum kebal tersebut

dihasilkan dari kelinci yang disuntik dengan keempat virus vaksin

asal impor (komersial). Uji ini dilakukan dalam skala laboratorium

pada biakan CEF yang menggunakan microplate.

Tujuan : untuk mengetahui apakah ada kesamaan sifat serologik

antara galur virus vaksin asal impor dan galur virus isolat IBD asal

lapang. Atan dapat dikatakan untuk mengetahui kemampuan vaksin

impor dalam mencegah infeksi virus IBD asal lapang.

Pada percobaan ini digunakan 4 jenis vaksin asal impor yang

digunakan pada peternakan ayam baik peternakan ayam skala besar

maupun kecil di Indonesia.

Tltrasi virus vaksln. Keempat jenis vaksin aktif yang digunakan

pada percobaan dengan kode A, B, C dan Lukert (D) yang

sebelumnya telah diadaptasikan pada biakan CEF serta ditetapkan

titer virusnya.

Pembuatan serum tcba l . Pada pembuatan serum kebal telah

digunakan 4 ekor kelinci dan 1 ekor kelinci untuk eerum normal.

Kemudian 1 dosis vaksin masing-masing disuntikkan pada kelinci

dewasa secara intramustuler dan 2 minggu kemudian diruntikkan

secara intraperitoneal setelah terlebih dahulu dicampur dengan

larutan Freund's adjuvant komplit. Pengulangan vaks ina~ i (booster)

dilakukan lx dengan selang waktu 2 minsgu. Pada hari ke 15

setelah penyuntikan terakhir kelinci diambil darahnya. Untuk

mengetahui titer antibodi yang didapat dilakukan uji netralisasi

serum pada biakan jaringan fibroblas embrio ayam SPF. Kelinci

diambil serumnya sebanyak mungkin, disentrifus 1.500 rpm selama

10 menit dan supernatannya yang mengandung serum kebal

diinaktivasikan dalam penangas a i r (waterbath) pada suhu 5b°C

selama 30 menit (Jackwood et al., 1982b).

Ujf netraltsasi serum. Selanjutnya dilakukan uji netralisasi serum

silang pada biakan sel fibroblas embrio ayam SPF terhadap isolat

virus lapang yang terpilih (percobaan 1) . Uji netralisasi

dilaksanakan pada biakan CEF (microplate). Keempat serum kebal

yang dihasilkan hewan percobaan kelinci putih masing-masing

direaksikan secara silang dengan isolat virus IBD asal lapang

terpilih (isolat virus varian).

Uji netralisasi serum silang ini dilakukan berdasarkan metode 3 yaitu serum diencerkan dengan kelipatan 2x dan dinetralkan dengan

100 TCID50 masing-masing isolat virus varian, dengan ulangan 4x.

Cora: serum diencerkan dengan larutan DMEM secara seri,

kemudian ditambahkan 100 TCIDSO isolat virus varian sama

volumenya dan diinkubasikan dalam inkubator suhu 37°C. 5Yo C 0 2

selama 30 menit, kemudian ditambahkan 100 p1 suspenai biakan sel

fibroblas embrio ayam yang mengandung 2 x lo5 eel per ml.

Selanjutnya diinkubasikan kembali dalam inkubator lagi dan diamati

retiap hari untuk melihat terbentuknya CPE pada biakm tersebut.

Biasanya pada hari ke 2, titer serum sudah dapat dilihat yaitu nilai

kebalikm dari pengenceran tertinggi y m g secara sempurna

menghambat terjadinya CPE (Jackwood e t at., 1982a). ,