بسم اهللا الرحمن الرحيم بسم اهللا الرحمن الرحيم قالوا سبحانك ال علم لنا إال ما علمتنا قالوا سبحانك ال علم لنا إال ما علمتنا “ “

 “ “ إنك أنت العليم الحكيم إنك أنت العليم الحكيم

صدق اهللا العظيم صدق اهللا العظيم

Use of the laboratory (General principle) Use of the laboratory (General principle) Sampling in Clinical Microbiology Sampling in Clinical Microbiology 

Laboratory Procedures for Laboratory Laboratory Procedures for Laboratory Diagnosis Diagnosis 

By By Dr.Maysaa Dr.Maysaa El El Sayed Sayed Zaki Zaki 

Assitant Assitant Professor of Clinical Pathology Professor of Clinical Pathology

Proper  Sampling in Clinical Proper  Sampling in Clinical Microbiology Laboratory Microbiology Laboratory 

§ §  Collection of good quality specimens: Collection of good quality specimens: § §  Depends on Depends on § §  The optimal time of specimen collection . The optimal time of specimen collection . § §  The correct type of specimen The correct type of specimen § §  Well collected specimens with minimum Well collected specimens with minimum contamination from normal flora of the patient or contamination from normal flora of the patient or the person collecting the specimen. the person collecting the specimen. § §  Adequate amounts of each specimens and Adequate amounts of each specimens and appropriate no. of specimens appropriate no. of specimens § §  Clearly labeled safe specimens Clearly labeled safe specimens

Optimal time of collection of Optimal time of collection of collection of specimens: collection of specimens: 

§ §  Specimens for the culture of bacteria collected before the Specimens for the culture of bacteria collected before the start of antibiotic therapy start of antibiotic therapy 

§ §  Blood cultures and blood films for malarial parasites are Blood cultures and blood films for malarial parasites are best collected just as the patient best collected just as the patient’ ’s temp. starts to starts to s temp. starts to starts to rise, however, when infective rise, however, when infective endocarditis endocarditis is suspected , is suspected , three blood culture sets collected with 24 hour irrespective three blood culture sets collected with 24 hour irrespective of patient temp. of patient temp. 

§ §  Specimens for virus isolation are most likely to give Specimens for virus isolation are most likely to give positive results when collected during the most acute positive results when collected during the most acute stages of the disease stages of the disease 

§ §  Serology is satisfactory when four fold or greater rising Serology is satisfactory when four fold or greater rising antibody antibody titre titre is demonstrated in pained sera. is demonstrated in pained sera. 

§ §  The 1st serum sample as early as possible in the disease The 1st serum sample as early as possible in the disease course. Second in the convalescent stage course. Second in the convalescent stage

2 2­ ­Correct types of specimens Correct types of specimens 

§ §  Examples: Examples: § §  Bacterial meningitis Bacterial meningitis­­­­­­­­­­­­­­­ ­­­­­­­­­­­­­­­blood blood cultures, CSF collected cultures, CSF collected § §  Suspected gonorrhea Suspected gonorrhea­­­­­­ ­­­­­­cervical, urethral cervical, urethral and rectal swab should be collected rather and rectal swab should be collected rather than high regional subs than high regional subs. .

3 3­ ­Well collected specimens with Well collected specimens with minimum contamination from the minimum contamination from the 

normal flora: normal flora: § §  Poor quality specimens include saliva instead of sputum or Poor quality specimens include saliva instead of sputum or a salivary a salivary – – mucoid mucoid sputum sample instead of a sputum sample instead of a muco muco purulent  sputum. purulent  sputum. 

§ §  ­ ­Mid stream urine reed careful collection to a void excess Mid stream urine reed careful collection to a void excess contamination by genital flora. contamination by genital flora. 

§ §  ­ ­A throat swab should not touch the A throat swab should not touch the buccal buccal mucosa and mucosa and the tongue depressed by a spatula. the tongue depressed by a spatula. 

§ §  ­ ­Vaginal speculum should not be wet with antiseptic Vaginal speculum should not be wet with antiseptic solution  during collection of high vaginal swabs with care solution  during collection of high vaginal swabs with care not to touch the lower region or perineum not to touch the lower region or perineum 

§ §  ­ ­Strict septic and antiseptic techniques are used for blood Strict septic and antiseptic techniques are used for blood and CSF cultures to avoid contamination from Skin flora or and CSF cultures to avoid contamination from Skin flora or from the doctor. from the doctor.

Adequate amounts and Adequate amounts and appropriate appropriate number of specimens number of specimens 

§ §  The volume of blood for culture from adult The volume of blood for culture from adult § §  5 5­ ­10 ml per bottle and in children and neonates 1 10 ml per bottle and in children and neonates 1­ ­ 5ml per bottle. 5ml per bottle. § §  Collection of early morning sputum specimens, Collection of early morning sputum specimens, and collection of adequate amount of early and collection of adequate amount of early morning urine specimen for 3 successive days is morning urine specimen for 3 successive days is required for the isolation of M.T.B. required for the isolation of M.T.B. § §  Patients with diarrhea Patients with diarrhea  at least 2 specimens of at least 2 specimens of faces is collected for culture of Salmonellae or faces is collected for culture of Salmonellae or Shigella Shigella. . § §  Serological investigations usually require paired Serological investigations usually require paired sera. sera.

٥ ٥ ­ ­ Clearly labeled and safe Clearly labeled and safe specimens specimens 

§ §  Specimens for microbiological investigations Specimens for microbiological investigations should be placed in leak should be placed in leak – – proof containers, and proof containers, and each container should be enclosed in plastic bag. each container should be enclosed in plastic bag. § §  The hazards to staff handling leaking container s The hazards to staff handling leaking container s include acquiring enteric infection from feces, T.B. include acquiring enteric infection from feces, T.B. from sputum of an open case of pulmonary. T.B. from sputum of an open case of pulmonary. T.B. and viruses s such as HCV , HBV, HIV, from and viruses s such as HCV , HBV, HIV, from leaking blood. leaking blood.

Transport of specimens to the Transport of specimens to the laboratory laboratory 

§ §  Many pathogenic organisms don Many pathogenic organisms don’ ’t survive for long t survive for long in clinical specimens kept at room temp. Examples in clinical specimens kept at room temp. Examples include gonococci, include gonococci, Haemophilus Haemophilus, , Bacteroides Bacteroides, or , or aerobic aerobic cocci cocci and most viruses. and most viruses. § §  On the other hand, some organisms contaminating On the other hand, some organisms contaminating specimens from the normal flora such as specimens from the normal flora such as coliform coliform and and coagulase coagulase – –ve ve staphylo staphylo cocci cocci, may rapidly , may rapidly grow in specimen Kept at room temp. grow in specimen Kept at room temp. § §  ­ ­Urine or sputum specimens should reach the Urine or sputum specimens should reach the laboratory within 2h.of collection when even laboratory within 2h.of collection when even possible. If delay are expected immediately possible. If delay are expected immediately inoculated  into transport media . inoculated  into transport media .

Transport media used. Transport media used. § § 

Stuart Stuart’ ’s transport media                 for pus or swabs for s transport media                 for pus or swabs for bacterial culture when delays in transport.>1/2h or when bacterial culture when delays in transport.>1/2h or when Neisseria Neisseria infections ore suspected. However the inoculated infections ore suspected. However the inoculated transport media should be sent to the laboratory within 4h. transport media should be sent to the laboratory within 4h. 

§ §  The investigation of eye, genital tract is best carried at the The investigation of eye, genital tract is best carried at the bed side when suitable culture media are directly bed side when suitable culture media are directly inoculated. inoculated. 

§ §  ­ ­CSF not refrigerated since otherwise meningococcal may CSF not refrigerated since otherwise meningococcal may rapidly die. rapidly die. 

§ §  ­ ­Viral transport media is necessary for virus isolation, and Viral transport media is necessary for virus isolation, and also for Chlamydia isolation . also for Chlamydia isolation . 

§ §  Specimens for virus isolation are kept at Specimens for virus isolation are kept at – –70 70º ºC till time of C till time of transferring the appropriate cell line which support growth transferring the appropriate cell line which support growth of the possible virus or Chlamydia. of the possible virus or Chlamydia.

Laboratory procedures for Laboratory procedures for microbiological diagnosis microbiological diagnosis 

§ §  Laboratory procedures for microbiological diagnosis Laboratory procedures for microbiological diagnosis Include the following steps: Include the following steps: 

§ §  ­ ­Naked eye examination of Specimens Naked eye examination of Specimens § §  ­ ­Microscopy. Microscopy. § §  ­ ­Detection of microbial antigens. Detection of microbial antigens. § §  ­ ­Isolation of microbes Isolation of microbes § §  ­ ­ Antibiotic sensitivity Antibiotic sensitivity § §  ­ ­Serology. Serology. § §  ­ ­Molecular biology techniques. Molecular biology techniques. § §  ­ ­Gas Gas – – liquid chromatographic techniques. liquid chromatographic techniques. § §  ­ ­Skin  tests. Skin  tests.

I . Naked eye examination of I . Naked eye examination of specimens: specimens:­ ­ 

§ §  This helps to determine whether a specimen is suitable or This helps to determine whether a specimen is suitable or no. no. 

§ §  ­ ­ A saliva sample instead of an expectorated sputum A saliva sample instead of an expectorated sputum sample should be discarded. sample should be discarded. 

§ §  ­ ­Turbid CSF, is an immediate evidence of infection Turbid CSF, is an immediate evidence of infection § §  ­ ­A foul A foul – – smelling pus specimen may suggest presence of smelling pus specimen may suggest presence of anaerobes. anaerobes. 

§ §  ­ ­A rice water stool sample may indicate A rice water stool sample may indicate vibrio vibrio cholera cholera infection infection 

§ §  ­ ­Anchory Anchory sauce sputum sample would suggest invasive sauce sputum sample would suggest invasive amoebiasis amoebiasis in lungs. in lungs. 

§ §  ­ ­Sulpur Sulpur  granules in pus would indicate granules in pus would indicate actinomycosis actinomycosis

II. Microscopy: II. Microscopy: 

§ §  1 1­ ­Wet preparation for light microscopy in Wet preparation for light microscopy in examination of CSF, urine , body fluid for examination of CSF, urine , body fluid for evidence of pus cells, and organisms. evidence of pus cells, and organisms. § §  ­ ­Vaginal secretion Vaginal secretion  trichomonas trichomonas and and Candida . Candida . § §  ­ ­Skin, nail , hair (in Skin, nail , hair (in KaoH KaoH) ) ­ ­evidence of evidence of fungus fungus § §  ­ ­Dark ground illumination to look for Dark ground illumination to look for spirochates spirochates, , treponema treponema pallidum pallidum in in suspected 1ry or 2ry . suspected 1ry or 2ry .

۲ ۲ ­ ­ Gram stained smear: It may help Gram stained smear: It may help of saving of saving lif lif 

§ §  ­ ­Important in rapid diagnosis of bacterial meningitis on Important in rapid diagnosis of bacterial meningitis on exam of CSF deposit. exam of CSF deposit. 

§ §  ­ ­Diagnosis of Diagnosis of strepto strepto pneumonia in pneumonia in  sputum smear sputum smear § §  ­ ­Performed in serious septicemia when a blood culture Performed in serious septicemia when a blood culture bottle is bottle is flaged flaged + +ve ve. . 

§ §  ­ ­ Identification of colonies appearing on culture media Identification of colonies appearing on culture media § §  Gram Gram – – stained smear may give + stained smear may give + ve ve results al though the results al though the subsequent cultures are subsequent cultures are – – ve ve as a result of given antibiotics as a result of given antibiotics 

§ §  In In vincent vincent angina: stained smear the only means of angina: stained smear the only means of diagnosis diagnosis 

§ §  Acid fast stain of sputum allow rapid diagnosis of open Acid fast stain of sputum allow rapid diagnosis of open plm plm. . T.B demonstrating acid fast bacilli T.B demonstrating acid fast bacilli  . .In other, clinical In other, clinical specimens such as urine , peritoneal fluid, CSF specimens such as urine , peritoneal fluid, CSF

Immunoflourescent Immunoflourescent microscopy is microscopy is important for rapid diagnosis of viral important for rapid diagnosis of viral 

infection e.g. infection e.g. § §  ­ ­RSV in infants and children RSV in infants and children § §  ­ ­Herpes simplex Herpes simplex § §  ­ ­CMV in urine throat swab. CMV in urine throat swab. § §  ­ ­Rabies in brain biopsy specimen Rabies in brain biopsy specimen § §  Clamydia Clamydia trachomatis trachomatis in conjunctiva scraping in conjunctiva scraping § §  Also in serological antibody test e.g. Also in serological antibody test e.g. § §  ­ ­Fluorescent Fluorescent treponema treponema antibody antibody § §  ­ ­fluorescent  amoebic antibody. fluorescent  amoebic antibody.

٥ ٥ ­ ­ Eectron Eectron microscopy microscopy 

§ § Mainly used for rapid diagnosis of Rota virus Mainly used for rapid diagnosis of Rota virus or herpes infection, CMV in neonatal urine or herpes infection, CMV in neonatal urine specimens. As the virus voids in urine in specimens. As the virus voids in urine in large amount. large amount.

III III­ ­ Detection of microbial Detection of microbial antigens: antigens: 

§ §  Becomes increasingly  important in recent years. Becomes increasingly  important in recent years. § §  ­ ­ Immunoelectrophoresis Immunoelectrophoresis . . e.g e.g Pneumococcal Pneumococcal polysaccharide Ag. may polysaccharide Ag. may 

be detected in sputum, serum , urine of patients by be detected in sputum, serum , urine of patients by immunoelecto immunoelecto phoresis phoresis, when patients have already given antibiotics where as , when patients have already given antibiotics where as conventional sputum blood cultures are negative conventional sputum blood cultures are negative 

§ §  ­ ­HbsAg HbsAg. Detected using ELISA or latex test . Detected using ELISA or latex test § §  ­ ­Cryptococcal Cryptococcal antigen in CSF in patients with antigen in CSF in patients with cryptoccal cryptoccal meningitis. meningitis. § §  ­ ­Rota virus Ag. Using Elisa in feces of diarrheic children infect Rota virus Ag. Using Elisa in feces of diarrheic children infected with ed with 

Rota v. Rota v. § §  ­ ­Chlamydia Chlamydia trachomatis trachomatis Ag using Elisa in conjunctiva scrapping in Ag using Elisa in conjunctiva scrapping in 

patients with active trachoma. patients with active trachoma. § §  ­ ­Detection of meningococcal, Detection of meningococcal, hemophiluss hemophiluss, , preumococcal preumococcal Ag. In CSF Ag. In CSF 

specimens by latex specimens by latex § §  ­ ­Commercially available monoclonal specific antibodies for detect Commercially available monoclonal specific antibodies for detection of ion of 

Ag. In clinical specimens or cultures including various streptoc Ag. In clinical specimens or cultures including various streptococcal, occal, staphylococcal species, staphylococcal species, Neisseria Neisseria, Candida , Candida spp spp. Chlamydia . Chlamydia trachomatis trachomatis, and Rotaviruses, CMV, herpes, , and Rotaviruses, CMV, herpes, Adeno Adeno viruses, RSV, viruses, RSV, influenza viruses. influenza viruses.

IV IV­ ­ Isolation of microbes Isolation of microbes § §  Is the most reliable way in which a diagnosis can be Is the most reliable way in which a diagnosis can be confirmed and for obtaining antimicrobial susceptibility confirmed and for obtaining antimicrobial susceptibility results. results. 

§ §  ­ ­Isolation of bacteria or fungus from specimens such as Isolation of bacteria or fungus from specimens such as Blood, CSF (which are normally sterile) are easy to Blood, CSF (which are normally sterile) are easy to interpret. interpret. 

§ §  ­ ­Bacterial or fungal isolation from specimens collected from Bacterial or fungal isolation from specimens collected from sites with normal flora are often difficult to interpret. sites with normal flora are often difficult to interpret. 

§ §  ­ ­Choice of media is important according to type of Choice of media is important according to type of specimen and suspected organism. specimen and suspected organism. 

§ §  ­ ­Virological Virological or Chlamydia isolation methods. Need or Chlamydia isolation methods. Need preparation of the cell line required for support growth of preparation of the cell line required for support growth of suspected infecting virus. suspected infecting virus. 

§ §  For Chlamydia For Chlamydia ­ ­  Vero, McCoy live Vero, McCoy live

§ §  ­ ­  For For Adeno Adeno Vero , HEP Vero , HEP § §  For CMV For CMV­ ­  human diploid fibroblast. human diploid fibroblast. § §  For Influenza For Influenza­­­­­­ ­­­­­­  chick embryo. chick embryo. § §  V V­ ­Serology Serology § §  10 days or longer has to pass before arising 10 days or longer has to pass before arising antibody antibody demonotrated demonotrated § §  in chronic infections. e.g. , Brucellosis. Serology is in chronic infections. e.g. , Brucellosis. Serology is often available often available § §  ­ ­IgM IgM abs abs may indicate recent infection. ( may indicate recent infection. (e.g e.g Rubella) Rubella) § §  ­ ­ELISA technique widely used nowadays for ELISA technique widely used nowadays for detection of abs detection of abs § §  Immune status of the patients immunization Immune status of the patients immunization should be taken  in considerations. should be taken  in considerations.

VI VI­ ­Molecular biology techniques: Molecular biology techniques: 

§ §  Increasingly important for rapid diagnosis of Increasingly important for rapid diagnosis of infections for epidemiological investigations infections for epidemiological investigations and for monitoring antimicrobial therapy and for monitoring antimicrobial therapy § §  Also,  important for research on the Also,  important for research on the pathogenesis of infection, the pathogenesis of infection, the developmental new raciness and immune developmental new raciness and immune therapeutic agents. therapeutic agents.

VII_Gas VII_Gas Liquid chromatographic Liquid chromatographic techniques: techniques: 

§ §  Become increasingly useful for the rapid detection Become increasingly useful for the rapid detection of anaerobic infections of anaerobic infections § §  Specimens of pus from abdominal, gynecological Specimens of pus from abdominal, gynecological or brain abscesses may be shown to have multiple or brain abscesses may be shown to have multiple volatile fatty acids present which indicate volatile fatty acids present which indicate anaerobic infection with a few hours of collection anaerobic infection with a few hours of collection of the specimen of pus and this may affect of the specimen of pus and this may affect decisions about the chemotherapy of infection decisions about the chemotherapy of infection

VIII VIII­ ­ Skin test: Skin test: 

§ § Of limited value for diagnosis of infection ex: Of limited value for diagnosis of infection ex: § §  ­ ­Mantaux Mantaux skin test skin test § §  ­ ­Histoplasmin Histoplasmin test test § §  ­ ­Casoni Casoni test test § §  ­ ­Schick test. Schick test. XI XI­ ­Antimicrobial susceptibility testing Antimicrobial susceptibility testing

Thank Thank You You