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Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie
Il metabolismo dell’RNA
Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie
I vari tipi di RNA
• Il filamento di DNA che dirige la sintesi dello mRNA è chiamato filamento stampo o filamento antisenso.
• L’altro filamento che ha sequenza identica a quella dello mRNA è chiamato filamento codificante o filamento senso.
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Il messaggero è tradotto in proteine
• Per esempio, la globina è sintetizzata da un gruppo di 5 ribosomi per molecola di mRNA.
• I ribosomi appaiono come oggetti sferici di 7 nm di diametro, connessi da un filamento di mRNA.
• I ribosomi sono posizionati in diversi punti del messaggero– quelli all’estremità 5’ hanno appena iniziato la
sintesi della globina– quelli all’estremità 3’ hanno quasi completato la
proteina.
Ogni mRNA è associato a diversi ribosomi: il complesso prende il nome di poliribosoma o polisoma. Ogni ribosoma nel polisoma sintetizza indipendentemente un polipeptide, che cresce di dimensioni man mano che il ribosoma si muove dall’estremità 5’ all’estremità 3’.
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• I 19.000-20.000 ribosomi di un batterio rappresentano circa un quarto della sua massa.
• Il numero di tRNA eccede quello dei ribosomi di circa 10 volte.
• Si stima che ci siano circa 1.500 molecole di mRNA in un batterio (difficile da calcolare, il messaggero dei batteri è molto instabile).
Il messaggero è tradotto in proteine
I ribosomi liberi formano un pool, da cui vengono reclutati quelli ingaggiati nella sintesi proteica. Il numero di ribosomi su un messaggero dipende dalla efficienza del mRNA nel reclutarli.
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• Nei batteri, il messaggero è trascritto e tradotto nello stesso compartimento cellulare, ed i due processi sono collegati così strettamente che avvengono contemporaneamente.
• La trascrizione del messaggero avviene a circa 40 nucleotidi/sec a 37 °C– ci vogliono circa 2 min a trascrivere un mRNA di
5000 nucleotidi.• La sintesi delle proteine avviene a circa 15 aa/sec
– 45 nucleotidi/sec di mRNA tradotto.• La trascrizione e la traduzione viaggiano alla stessa
velocità.
Il messaggero dei procarioti• L’RNA messaggero ha la stessa funzione in
procarioti ed eucarioti, ma ci sono differenze importanti nella sintesi e nella struttura del mRNA nei due sistemi.
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Il messaggero dei procarioti
• Nella fotografia, molti mRNA sono trascritti simultaneamente, e ogni mRNA è tradotto da molti ribosomi.
• Un RNA la cui sintesi non è stata ancora completata si chiama RNA nascente.
Trascrizione e traduzione nei batteri possono essere visualizzate tramite la microscopia elettronica.
• Gli mRNA batterici sono policistronici. – regione codificante– leader (5’UTR)– trailer (3’ UTR)– regioni intercistroniche (0-30 nt)
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Il messaggero degli eucarioti
• L’estremità 5’ è modificata dall’aggiunta di un cappuccio, che avviene immediatamente.
• L’estremità 3’ è generata tramite taglio del trascritto primario anzichè terminazione della trascrizione.
• Immediatamente dopo il taglio, l’estremità 3’ è modificata dalla aggiunta di una serie di nucleotidi di acido adenilico: acido poliadenilico o poli(A).
• Solo dopo questa serie di modificazioni il messaggero è pronto per essere trasportato nel citoplasma dove è relativamente stabile, con una emivita di 4-24 ore.
Entrambe le estremità del messaggero degli eucarioti sono modificate dalla aggiunta di nucleotidi successivamente alla trascrizione.
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Il Cappuccio
• In seguito, l’enzima guanililtransferasi catalizza l’aggiunta di una G con un legame 5’-5’ (orientazione inversa rispetto agli altri nucleotidi).
• La guanina-7-metiltransferasi aggiunge un metile in posizione 7– cappuccio tipo 0, presente negli
eucarioti unicellulari.• La 2’-O-metiltransferasi
aggiunge un alro metile– cappuccio tipo 1, presente nella
maggior parte degli eucarioti
La trascrizione comincia con un nucleoside trifosfato (tipicamente A o G), di modo che il trascritto primario ha al 5’ struttura pppApNpNpNp….
Quando un posizione 2 (ex 1) c’è una Adenina, può essere aggiunto un metile in posizione 6 dopo l’aggiunta del metile in posizione 2’-O.Infine, se sono state efettuate tutte le modificazioni precedenti, può essere aggiunto un metile in 2’-O della terza base: cappuccio tipo 2, 10-15% degli eucarioti superiori.
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L’estremità 3’ del messaggero
• La polimerasi trascrive oltre l’estremità 3’ del messaggero maturo.
• Un complesso enzimatico esegue il taglio e la successiva poliadenilazione del trascritto.
• La poliadenilazione stabilizza il trascritto all’estremità 3’.
• L’estremità 5’ del trascritto è già stabilizzata dalla presenza del cappuccio.
• La polimerasi prosegue oltre il sito di taglio e poliadenilazione, ma l’estremità 5’ generata dal taglio non è protetta.
• Di conseguenza, il resto del trascritto primario è degradato molto rapidamente– è difficile determinare cosa succede oltre il
sito di taglio e poliadenilazione.
Non è chiaro se esista un sito di terminazione per la RNA polimerasi II. Sono state evidenziate terminazioni non specifiche più di 1000 paia di basi a valle della estremità 3’ del messaggero maturo.
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La poliadenilazione• Nei messaggeri degli eucarioti superiori (non nel lievito)
è presente la sequenza AAUAAA 11-30 nt a monte della coda di poli(A)
– saudi α-talassemia.• Un fattore multisubunità, chiamto CstF, lega una
sequenza ricca in G e U a valle del sito di taglio.• Un fattore (composto da 4 subunità) chiamato CPSF
(Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor) riconosce la sequenza AAUAAA quando CstF ha legato la regione ricca in G e U.
• Una endonucleasi, composta dalle subunità CFI e CFII taglia il trascritto.
• La poliadenilato polimerasi sintetizza la coda di poli(A)• Inizialmente vengono aggiunti circa 10 nucleotidi.• In seguito, la PABP (poly(A)-Binding Protein) lega la
coda di poli(A) nascente.• Questo stimola la poli(A) polimerasi ad aggiungere acido
adenilico fino ad una lunghezza di circa 200 nucleotidi.
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Il messaggerodegli eucarioti
Trascritto primario
La vera funzione delle proteine che legano il trascritto primario resta sconosciuta.
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Taglio e saldatura dell’RNA: splicing
Donor splice site Acceptor splice site
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La rimozione dell’introne• Struttura a cappio.• Punto di ramificazione
– si trova 18-40 nucleotidi a monte del 3’ splice site.
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Adenine
A
G
La trans-esterificazione
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Posizione 3’Posizione 4’
Posizione 5’
La struttura degli intermedi di splicing
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Gli snRNA, le snRNP e lo splicing
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Lo splicing• Assemblaggio dello spliceosoma• U1 si stacca; U5 si sposta.• U6 si stacca da U4 (sarà rilasciato)
e lega U2 formando in centro catalitico).
• U2 e U6 catalizzano la trans-esterificazione