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IL MODELLO DELL’OPERON
La regolazione genica nei procarioti
� I microrganismi presentano sorprendenti capacità di adattamento a diverse condizioni ambientali
� Questa capacità di adattarsi, e quindi di crescere, risiede nella capacità di esprimere velocemente i geni necessari a far fronte a specifici stimoli ambientali � VANTAGGIO: risparmio energetico, quindi una
crescita più veloce e migliore utilizzo delle risorse disponibili
GENI
COSTITUTIVI sono sempre espressi nella cellula, geni essenziali per la cellula (ad esempio rRNA, tRNA, proteine ribosomali, RNA polimerasi, ecc)
REGOLATI la loro attività è controllata in risposta alla necessità
Per regolare l’espressione genica
1. Devono riconoscere le condizioni ambientali nelle quali attivare o reprimere l’espressione di specifici geni
2. Devono essere in grado di attivare o reprimere l’espressione cordinata di specifici geni o gruppi di geni
DNA mRNA proteina
trascrizione traduzione
A che livello può agire la regolazione nei procarioti?
controllo della trascrizione
controllo della stabilità dei
trascritti
controllo della traduzione
controllo della stabilità della
proteina
controllo dell’attività
proteica
Controllo delle proteine per l’utilizzo di zuccheri
� I batteri possono utilizzare diversi zuccheri come fonte di carbonio e di energia
� (glucosio, lattosio, arabinosio, xylosio, ecc.)
� Le proteine necessarie per il metabolismo dello zucchero comprendono � quelle che favoriscono l’ingresso dello zucchero
nella cellula
� quelle che catalizzano i passaggi di degradazione dello zucchero
Regolazione del catabolismo del lattosio in E. coli
� Il metabolismo del lattosio è stato studiato in dettaglio negli anni 1950 da François Jacob e Jacques Monod
� La loro descrizione del sistema di controllo della trascrizione è stata una scoperta di enorme valore scientifico che è valso loro il premio Nobel nel 1965
� E. coli può crescere in un terreno minimo contenente glucosio � I geni del metabolismo del glucosio sono costitutivi,
la glicolisi è un processo fondamentale
� Se al terreno minimo viene aggiunto lattosio, al posto del glucosio, E. coli sintetizza gli enzimi utili per metabolizzare questo zucchero
Enzimi indotti dal lattosio
� β-galattosidasi (gene lacZ) � che scinde il lattosio in galattosio e glucosio
� catalizza l’isomerizzazione del lattosio in allolattosio
� Lattosio permeasi (gene lacY) � per promuovere il passaggio del lattosio all’interno
della cellula
� la β-galattoside transacetilasi (gene lacA) � trasferisce un gruppo acetilico ai β-galattosidi, ma la
sua funzione è ancora poco chiara
QUESTI GENI SONO DETTI GENI STRUTTURALI
Jocob e Monod studiarono le mutazioni che alterano il metabolismo del lattosio
� Mutazioni nei 3 geni strutturali (lacZ, lacY e lacA) � le mutazioni nei geni lacZ−, lacY−, lacA− furono
mappate con tecniche classiche � I tre geni sono strettamente concatenati e l’ordine
lacZ−lacY−lacA � I tre geni sono trascritti in un unico mRNA detto
policistronico o poligenico
� Mutazioni che influenzavano la regolazione di tutti e 3 i geni strutturali � Mutanti costitutivi
� i geni strutturali sono sempre espressi, sia in presenza che in assenza di lattosio
� Mutanti che bloccano l’espressione dei geni strutturali anche quando è presente il lattosio
Mappatura dei mutanti costitutivi
Sono state identificate due classi:
1a classe: mappava in una regione piccola a monte del gene lacZ che chiamarono operatore (lacO)
2a classe: mappava a monte dell’operatore in
un gene che chiamarono lacI, che codifica per il repressore
Struttura della regione genomica
Essi coniarono il termine di OPERONE per indicare un cluster di geni che svolgono funzioni correlate e che sono regolati in
modo coordinato
Come potrebbe essere regolata la trascrizione di geni inducibili?
REGOLAZIONE Vie CATBOLICHE o di degradazione (lac)
INDUCIBILI
Vie ANABOLICHE o di biosintesi (trp)
REPRIMIBILI
GENE REGOLATORE
ATTIVATORI REPRESSORI
legano una regione regolativa in base alla presenza di MOLECOLE EFFETTRICI
INDUTTORI CO-REPRESSORI
Influenzano la struttura tridimensionale dei regolatori
SISTEMI INDUCIBILI: REGOLAZIONE POSITIVA
INDUTTORE ASSENTE INDUTTORE PRESENTE
INDUTTORE
SISTEMI INDUCIBILI: REGOLAZIONE POSITIVA
SISTEMI INDUCIBILI: REGOLAZIONE NEGATIVA
operatore
INDUTTORE
SISTEMI INDUCIBILI: REGOLAZIONE NEGATIVA
Per meglio definire il ruolo di ciascun componente dell’operone
Jacob e Monod si servirono di ceppi parzialmente diploidi
Utilizzarono ceppi F’ che portavano alcuni geni dell’operone sul fattore di fertilità F
� Poterono definire quali mutazioni sono dominanti e quali recessive
� Formulare ipotesi circa il ruolo svolto da ciascuna regione dell’operone
Diploide parziale per mutazioni lacOc
lacI+ P O+ Z− Y+
CELLULA BATTERICA
CROMOSOMA BATTERICO PLASMIDE F’
lacI+ P O+ Z- Y+
F’ lacI+ P Oc Z+ Y− GENOTIPO:
SENZA INDUTTORE CON INDUTTORE
β-galattosidasi + +
permeasi −
(sintesi della forma mutata)
+
� Il gene Lac Z è espresso in modo costitutivo
� Il gene Lac Y è soggetto a controllo inducibile
SI PUO’ DEDURRE CHE UNA MUTAZIONE lacOc ALTERA SOLO I GENI A VALLE SULLA STESSA MOLECOLA DI DNA
QUESTO TIPO DI MUTAZIONI SONO DETTE CIS-DOMINANTI
L’operatore NON CODIFICA PER UN PRODOTTO DIFFUSIBILE altrimenti uno dei due alleli controllerebbe tutti i geni per
l’utilizzo del lattosio
lacI+ P O+ Z− Y+ F’ lacI+ P Oc Z+ Y−
Diploide parziale per mutazioni lacI−
lacI+ P O+ Z− Y+
CELLULA BATTERICA
CROMOSOMA BATTERICO PLASMIDE F’
lacI+ P O+ Z− Y+
F’ lacI− P O+ Z+ Y− GENOTIPO:
lacI+ P O+ Z− Y+
F’ lacI− P O+ Z+ Y− SENZA INDUTTORE
β-galattosidasi −
permeasi −
� L’espressione di entrambi i geni è inducibile
� lacI+ nella cellula è dominante su lacI−
DATO CHE I GENI lacI SI TROVANO SU MOLECOLE DIVERSE DI DNA (configurazione in trans)
LA MUTAZIONE lacI+ E’ DETTA TRANS-DOMINANTE SU lacI−
Jacob e Monod ipotizzarono quindi che il gene lacI codificasse
per un REPRESSORE DIFFUSIBILE nella cellula
IL MODELLO DI REGOLAZIONE NEGATIVO PROPOSTO DA JACOB E MONOD
IN ASSENZA DI LATTOSIO
IN PRESENZA DI LATTOSIO
Il modello spiega i mutanti trovati? I MUTANTI lacOc IN ASSENZA DI LATTOSIO
I MUTANTI COSTITUTIVI lacI-
Il modello proposto per i diploidi parziali lacI+ P O+ Z- Y+ A+
F’ lacI+ P Oc Z+ Y- A+
IN ASSENZA DI LATTOSIO
GENOTIPO
SENZA INDUTTORE
β-galattosidasi +
permeasi − (sintesi della
forma mutata)
lacI+ P O+ Z- Y+ A+
F’ lacI+ P Oc Z+ Y- A+ GENOTIPO IN PRESENZA DI LATTOSIO
CON INDUTTORE
β-galattosidasi +
permeasi +
lacI+ P O+ Z− Y+ A+
F’ lacI− P O+ Z+ Y− A+ IN ASSENZA DI LATTOSIO GENOTIPO
Il secondo diploide parziale analizzato
SENZA INDUTTORE
β-galattosidasi −
permeasi −
lacI+ P O+ Z− Y+ A+
F’ lacI− P O+ Z+ Y− A+
IN PRESENZA DI LATTOSIO
GENOTIPO
CON INDUTTORE
β-galattosidasi +
permeasi +
I mutanti di regolazione identificati GENE MUTAZIONE FENOTIPO
lacI lacI- sintesi costitutiva dei 3 enzimi
lacO lacOc sintesi costitutiva dei 3 enzimi
lacI lacIs nessuna sintesi anche in presenza di lattosio
lacP lacP- nessuna sintesi anche in presenza di lattosio
La mutazione lacIs (superrepressore)
Nei diploidi parziali (lacI+/lacIs) lacIs è TRANS-DOMINANTE bloccando la sintesi dei geni strutturali su entrambe le copie dell’operone
L’operone lattosio ha anche un sistema di regolazione positiva
� Questo sistema di regolazione assicura che i geni dell’operone lattosio siano espressi ad alti livelli solo se i lattosio è l’unica fonte di carbonio e se non è presente anche il glucosio
� Il glucosio è preferito perché può essere direttamente utilizzabile nella glicolisi per produrre energia
� Gli altri zuccheri devono essere convertiti in glucosio prima di poter essere utilizzati � queste conversioni richiedono energia
Il modello di regolazione positiva dell’operone lattosio di E.coli
CAP (Catabolite Activator Protein)
cAMP (AMPciclico)
La proteina regolatrice CAP “sente” la presenza di glucosio nella cellula legandosi al cAMP la cui concentrazione è inversamente correlata alla quantità di glucosio nella cellula
RNA polimerasi
Il legame del complesso CAP-cAMP al DNA favorisce il legame della RNA polimerasi al promotore
Il legame del cAMP alla proteina CAP aumenta l’affinità di questo complesso con un sito adiacente a lacP
CAP e cAMP mantengono gli operoni dell’arabinosio e del galattosio
Gli operoni sono molto comuni nei procarioti
Permettono di:
� regolare contemporaneamente più geni coinvolti nello stesso metabolismo
� mantenere i rapporti dei trascritti bilanciati
� rispondere velocemente alle variazioni ambientali
Altri esempi di operoni:
� triptofano
� arabinosio
Operone reprimibile negativo
O P trpR trpD trpE trpC trpB trpB
L’operone triptofano
L’operone è sotto il controllo negativo del repressore codificato dal gene trpR
Il triptofano agisce come corepressore, attivando il repressore e bloccando la trascrizione
repressore inattivo triptofano
repressore attivo
P262
Acido Corismico->Triptofano
L’attenuazione della trascrizione
O P trpR trpD trpE trpC trpB trpB
L’operone triptofano
peptide leader (14AA) attenuatore
1 2 3 4
codoni trp
leader
162 nt
mRNA
Se deleta la sequenza leader determina incremento di espressione dell’operone trp Senza effetti sulla reprimibilita’ dell’operone.
L’attenuazione della trascrizione
O P trpR trpD trpE trpC trpB trpB
L’operone triptofano
peptide leader (14AA) Attenuatore Seq. palindroma ricca in G:C seguita da coppie A:T
1 2 3 4
codoni trp
leader
162 nt
mRNA
Secondo livello di regolazione -> attenuazione In presenza di tRNA trp carico di triptofano causa la terminazione prematura della trascrizione dell’operone-> trascritto tronco (140nt)
1 2 3 4
1 2 3 4
UUUUUUU
1
2 3
4
Attenuatore (terminatore della
trascrizione)
mRNA
MA…..Se al segmento 1 viene impedito di appaiarsi con il segmento 2, quest’ultimo si appaia con il segmento 3. Il 4 rimane singolo e non si forma il terminatore TRASCRIZIONE ATTIVA
Trascrizione di questa sequenza e dei segnali di terminazione della seq attenuatore
RNA nascente che puo’ formare una struttura a forcina seguita da alcuni uracili
Avviene un cambiamento conformazionale nell’RNApolimerasi associata causando la terminazione della trascrizione
E la presenza del trp come influenza l’attenuazione?
Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide leader regola l’attività della RNA polimerasi NB:Nei procarioti trascrizione e traduzione avvengono contemporaneamente
1 2 3 4 mRNA
peptide leader
AUG UGA
Se è presente sufficiente triptofano il ribosoma sintetizzerà il peptide leader arrivando fino al codone di stop. Il ribosoma sporge sul segmento 2 impedendogli l’appaiamento con il segmento 3
3 4
1 2 AUG UGA
PRESENZA TRIPTOFANO -> Forcina di Terminazione ->OPERONE TRP NON TRASCRITTO
Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide leader regola l’attività della RNA polimerasi
1 2 3 4 mRNA
peptide leader
AUG UGA
Se manca il triptofano, il ribosoma si fermerà in corrispondenza dei 2 codoni trp adiacenti impedendo al segmento 1 di appaiarsi con 2. Il segmento 2 si associa con il segmento 3
2 3
4 1 AUG UGA
2 3
La polimerasi continua
2
3 4
La polimerasi termina la trascrizione
2
3 4
PRESENZA TRIPTOFANO -> ATTENUAZIONE ->OPERONE trp ATTENUATO
FORCINA DI TERMINAZIONE
ASSENZA TRIPTOFANO -> LOOP ->OPERONE trp NON ATTENUATO
Agendo insieme, repressione e attenuazione possono coordinare la velocità di sintesi degli enzimi biosintetici per gli amminoacidi con la disponibilità degli amminoacidi e la velocità globale della sintesi proteica.
Quando il triptofano è presente ad alte concentrazioni, qualsiasi RNA polimerasi non bloccata dal repressore probabilmente non oltrepasserà la sequenza dell’attenuatore.
La repressione riduce la trascrizione di circa 70 volte e l’attenuazione la riduce ulteriormente di 8-10 volte: quando entrambi i meccanismi operano insieme, la trascrizione può essere ridotta di circa 600 volte.
Sembra che l’attenuazione abbia un ruolo importante nella regolazione della biosintesi di molti amminoacidi