imagejチュートリアル

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ImageJ によるバイオ画像解析チュートリアル

2014/6/20(ver.1.0)

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目次

1. イントロダクション

2. デジタル画像の基本

3. カラー画像の基礎と画像合成

4. 形の解析: 二値化，粒子解析，繊維解析

5. 動きの解析

補遺: ImageJ の主なメニュー項目の紹介

1


1. イントロダクション


ImageJの基本画面

← メニューバー← ツールバー← ステータスバー

← 画像ウインドウ

http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/tools.html

ツールバー

赤い三角形の付くアイコンは右クリックで機能切り替え可．

赤い線: 頻用するもの．青い線: selection (ROI)．

← 画像タイトル画像情報(サイズ等)

タバコBY-2 液胞膜


メニュー操作に関して:

File - Open… File から Open… を選択する．

ショートカット操作に関して:

t Windows : tキー．Mac : コマンド + tキー．

Shift + c Windows : Shift を押しながら cキー．Mac : コマンドと Shift を押しながら cキー．

※コマンド一覧は Plugins - Shortcuts - Control Panel… でツリー形式，Plugins - Shortcuts - Create Shortcut の Command 欄でプルダウン形式で確認できる．

※メニューの一部は ij.jar 内の IJ_Props.txt を編集することでカスタマイズ可能．JARはZIP形式として展開できる．メニューを完全に変更したい場合は ImageJ.java をいじる．

※ ショートカットの一覧表示や追加は Plugins - Shortcuts メニューから可能．一部のショートカットはソース中に埋め込まれている ( t とか < とか) ．

ImageJの基本画面


2.デジタル画像の基本


←画像情報: 159x153 pixels; 8-bit; 24K

画素と画素数

(3200%) ：拡大・縮小率

画像ウインドウ左上に青い枠が表示されている場合，ウインドウに画像全域が収まっていない．現在表示されている部位が，画像全域のどこに相当するかを示している．

159

153

画素, pixel (picture element)

+ キーで拡大- キーで縮小


座標系と画素と輝度

←画像情報: 159x153 pixels; 8-bit; 24K

y

x

(x,y) = (0, 0)

輝度 35

(3, 0)

輝度30

(3, 2)

輝度 21

ImageJ では左上を原点(0, 0)とし，右に X 軸，下にY軸が伸びる．各画素には輝度 (強度，intensity．明度 brightness とも言う)

が割り当てられている．※ 「0から数えること」「左上が原点であること」に注意．


座標系と画素と輝度

y

(x,y) = (0, 0)

輝度 35

(3, 0)

輝度30

(3, 2)

輝度 21

x

Excel で開いた例表示を縮小

159列

159

153

153行

File - Save As - Text Image…


PowerPoint 等での強拡大に注意

PowerPointや Photoshop 等で補間をともなう"強拡大"をするとデジタル的な解像度や分解能と関係なく擬似的にズームしたようになるが，解像度や分解能が上がる訳ではない．データ解釈を誤らないよう注意．

PowerPoint

で拡大

補間なし

補間あり


Brightness & Contrast による表示状態の変更 ( Shift + cキー)

スライドバーを動かすことによる調整は，表示上の"明るさ"を変えているに過ぎない．→ 輝度は変化しない．8-bit 画像の場合は Apply ボタンを押すことによって，その時の表示範囲が0～255にスケールされる．→ 輝度が変化する．

真っ白

真っ黒


輝度ヒストグラム ( hキー )

h

位置情報を無視した上で，全画素について輝度の分布を可視化したもの．輝度の基本的な統計量(最小，最大，平均，標準偏差等)も表示されている．


輝度のタイプ

(0, 0)

輝度 35

(3, 0)

輝度30

(3, 2)

輝度 21

8-bit: 0～255 の整数(integer)


32-bit:浮動小数点数(float)

実数の近似値．±3.4*1038 の範囲で7桁位の精度．

グレイスケール画像, 濃淡画像

輝度のデータ型．ビット深度(bit depth), bits per pixel,

量子化ビット数等とも呼称．

カラー画像

≠白黒画像

8-bit Color: 使わない．RGB Color: 赤緑青の3チャネルを重ねることによるカラー表現．各チャネルのデータ型は8-bit，16-bit, 32-bit のいずれかで，チャネル間では統一されている．


輝度のビット深度



32-bit:浮動小数点数(float)

実数の近似値．±3.4*1038 の範囲で7桁位の精度．

グレイスケール画像, 濃淡画像≠白黒画像

原画像のビット深度はカメラによって異なり，8～16 bits/pixelが主．12 bits/pixel (212 , 0～4095) や 14 bits/pixel (214 , 0～16383)のカメラで得た画像は 16 bits/pixel の画像フォーマットとして扱う(大は小を兼ねる)．輝度には必ずノイズが混じるので，深度が大きい方が一概に高性能というわけではない．画像処理的には内部で 32-bit (float) を用いることも多い(小数やマイナスの値が扱えるので) ．

輝度

位置(pixel)8 bits/pixel

28 ＝256 段階

0

255


画像情報の修正 (ビット深度, スケール情報)

ビット深度: Image - Type - …

スケール情報: Analyze - Set Scale…


3.カラー画像の基礎と画像合成


輝度 (5, 70, 134)

輝度 (179, 39, 4)

カラー画像 (RGB画像の場合)はRed, Green, Blueの輝度のバランスにより色が表現される．

輝度 (111, 111, 13)

Red Green Blue

Image – Color – Split channels

カラー画像の基礎


画像合成

Image – Color – Merge channels…


画像合成の注意点

伝わるデザインhttp://tsutawarudesign.web.fc2.com/index.html

細胞工学色覚の多様性と色覚バリアフリーなプレゼンテーションhttp://www.nig.ac.jp/color/barrierfree/barrierfree3-4.html


画像合成の注意点

画像合成はMagentaとGreenの使用が推奨されることが多い．

MagentaとGreen

はグレースケールで示しても良い


4.形の解析: 二値化，粒子解析，繊維解析


手作業でのROI設定を介した形状解析：長さ

線分や曲線をマウスで引き tキーで ROI Manager に登録, を繰返す．ROI Manager の「Show All」をチェックしておくと見やすい．Measure ボタンで登録済の ROI 全部をまとめて測定．角度や長さ(画素単位)が得られる． Excel等でμmに変換し，統計処理．

Excel 等にペースト or

テキストファイルに保存してR スクリプトで統計処理等.

t

ROI: region of interest，関心領域，注目領域


手作業でのROI設定を介した形状解析：面積

or

測定項目は Analyze - Set Measurements...で決定．「測定対象領域をマウスで指定し，

tキーで ROI Manager に登録」を繰返す．Measure ボタンで測定．

t


二値化による領域抽出 ( Shift + t キー)

or

蛍光像の場合，「高い輝度の領域」が「測定対象領域」の場合が多い．閾値となる輝度を決め，二値画像(白黒画像)

に変換することで，領域抽出(領域分割， segment)ができる．ではどのように閾値を決めればいいのか?

グレイスケール画像(濃淡画像)

二値画像(白黒画像)


人間の目視による閾値決定

作業者の感覚が頼り．同じ人が作業しても，閾値が同じになるとは限らない(部屋やモニタの明るさの影響など)．


Thresholdウインドウでは，人間による閾値決定だけでなく自動閾値決定もできる．右図のように，複数のアルゴリズムから選択する．いずれも輝度ヒストグラムをもとに「ある明るさ」を閾値として背景と背景(解析対象)を分ける．画像自体と解析対象に関する輝度分布の性質によって，適切なアルゴリズムは異なる．

自動閾値決定


二値化を介した粒子解析の例

二値画像

グレイスケール画像Analyze -

Analyze Particles…


二値化を介した繊維構造の解析例

共焦点画像バンドパスフィルタによる繊維等の強調

二値化像細線化像

短径 / 長径

短径

長径

気孔開閉の指標

気孔に対するアクチン繊維の角度

アクチン繊維の配向の指標

気孔

q

気孔

q

気孔この場合，

短径 / 長径＝0.47この場合，

アクチン繊維の角度＝54.3°灰色: 気孔領域黒色: アクチン繊維

シロイヌナズナ気孔アクチン繊維


バンドパスフィルタ

Process - FFT - Bandpass Filter...

注目している物を，おおよその大きさを指定することで強調する処理．ノイズや細胞形状の影響を抑制する．

細胞表層微小管のプラス端

輝度プロファイル(左図の黄色い線)


5.動きの解析


スタック画像

時系列画像(動画像，動画，XYT)

や，焦点面を変えて撮影した連続画像(立体画像，XYZ)はともにスタック画像として操作できるが，ZとTの区別が無いことに注意．スタック画像を構成する2次元画像をスライスとかフレームと呼ぶ．

ステータスバーの z=2は「Z座標の値が2」を示す(0から数えている． 0-origin) ．

画像情報欄の 3/10 は「全10枚中3枚目」を示す(1から数えている．1-origin)．

表示中のスライスを変更

再生 (速度設定: Image - Stacks - Tools - Animation Options...)

タバコ培養細胞微小管プラス端


動き解析のための粒子追跡

輝度投影(疑似色)

1スライス目 10スライス目

平均速度:(pixel/slice)

T: スライス数

T－1


補遺: ImageJの主なメニュー項目の紹介


File メニュー: ファイルの読み込み・書き込み等

New: 新規作成．System Clipboard で他アプリから画像の読み込みができる．

Open...: 画像ファイル等を開く．Import: 各種フォーマットの

画像ファイル等を開く．

Close: 画像ウインドウを閉じる．

Save: 画像ウインドウの内容をファイルに保存する．

※ Save しない限り，ファイルは書き変わらない．

Quit: ImageJ を終了する．


Edit メニュー: 画像の切り貼り，描画

Undo: 直前の作業の取消し．1ステップ限定かつ一部のみ対応．

Cut, Copy, Paste:

画像の切り貼り．対象は画像全域かROI ．

Copy to System:

他アプリへのコピー．

Clear, Fill, Draw:単色描画．実際の色はColor Pickerで色は設定．

Selection: ROI の制御．(Selection = ROI)

Add To Manager:

複数のROI を管理．


Image メニュー: 種別，色，スタック，変形，複製等，色々

Type: 輝度タイプの変換．8-bit, 16-bit, 32-bit, RGB color...

Adjust: 表示上の明るさの調整や二値化等．

Color: グレイスケール画像とカラー画像の変換等．

Stacks: 時系列画像(動画像)，立体画像の処理．輝度投影，スライス一覧(montage)

の作成等．

Crop: ROI 部分の切り出し．Duplicate: 画像ウインドウの複製．Rename: 画像ウインドウのタイトル変更．Scale: 画像解像度の変更．つまり画像サイズの拡大・縮小．※表示の拡大・縮小と混同しないよう注意．


Process メニュー: 基礎的な画像処理(フィルタ等)

Find Edges: 輪郭強調．

Binary: 2値画像(白黒画像)処理．Math: 加減乗除等による

各画素の輝度変更．

Filters: ノイズ抑制等のフィルタ．

Image Calculator:

画像と画像の間の演算．加減乗除等．


Analyze メニュー: 測定やグラフ関係

Measure: ROI 部分の諸パラメタの測定．Analyze Particles...: 粒子解析．Set Measurements...: 'Measure' で測定するパラメタの選択．

Set Scale...: 1画素が何 mm かを設定する．Histogram: 輝度ヒストグラムの表示．Plot Profile: 輝度プロファイルの表示．

他のメニュー

Plugins: プラグイン，マクロ，ショートカットキー設定等．

Window: 画像ウインドウ，ログウインドウ等の一覧や並び換え．

Help:ブラウザにウェブ上のマニュアルを表示する等．

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