İmmünolojik Açıdan

Transplantasyon Öncesi

Olmazsa Olmazlar

Dr. Fatma Savran Oğuz

İ.Ü İstanbul Tıp Fakültesi

Doku Tipleme Laboratuvarı

Sunum Planı

• İmmün yanıt

• HLA alelleri

• Anti HLA antikorları

– CXM (CDC-CXM, Flow CXM)

– PRA

– Luminex

– Virtual XM

• Non HLA antikorları

21. yüzyılda transplantasyonun önündeki en büyük engel transplante organın sağ

kalımını sınırlayan « immun yanıt»tır.

Donor spesifik antikorların varlığı (DSA) antikor ilişkili rejeksiyonu başlatan ve

allograft sağ kalımı etkileyen ana faktördür .

21. yy da Bireysel Tedavi

İmmün Tanıma

HLA moleküllerince sunulan yabancı peptidin T hücrelerince

tanınmasıdır.

–TCR

–Yabancı peptid

–MHC molekülü

hücresel hem de hümoral immün cevabı

ortaya çıkarırlar.

• T lenfositlerin tam olarak aktive olabilmesi için, antijen sunan hücre yüzeyinde bulunan,

• MHC/antijen kompleksinin, T cellreseptör (TCR)/CD3 tarafından tanınması ve ko-stimulatör yolakların aktive olmaları gereklidir .

Ch. 17

İmmün Tanıma II

T hücreleri ve ASH arasındaki etkileşim;

B7

CD40

CD28

CD11a/CD18

ICAM-1

Hücre yüzey

molekülleri

İntersellüler

adezyon

molekülleri

Ligand-reseptör çifti ko-stimulatör

olarak görev görür.

B7/CD28/CTLA-4 ko-stimulatör yoludur.

CD28, B7 ligandına bağlanarak T hücrelerini aktive eder

• Bu aktivasyon T hücre çoğalması, sitotoksik lenfositlerin oluşumu ve

lenfokin/sitokinlerin üretimi ile sonuçlanarak immun reaksiyonları

potansiyalize eder

İmmun Yanıtın İnhibisyon ve

Regülasyonu;

• -TCR sinyalizasyonu inhibe ederek,

• - IL-2 üretimini bloke ederek,

• -T hücre siklusunu baskılayarak,

• -CD4+ CD25+ regülatör T lenfosit (Treg)

oluşumunu sağlayarak ,

• -T hücre anerjisine ve T hücre

apoptozisine yol açarak sağlanır.

HLA Molekülleri

HLA antijenlerinin temel rolü : - öz tanıma- sağkalım

Serolojik tanımlama:

Antijen grupları, antikorlarla verdikleri reaksiyon

değerlendirilerek belirlenir.

Moleküler tanımlama:

Aleller dizilimlerindeki (sekans) benzerliklere göre

gruplanır. Bu dizilim serolojik reaksiyonlar ile de ilişkilidir.

HLA Tiplendirme Yöntemleri

• Düşük rezolüsyonlu

– Allel grubunu belirler

– ör: HLA-A*01

• Orta rezolüsyonlu

– Sonuçta birkaç allel seçeneği birlikte verilir

– ör: HLA-A*01:01/01:02/01:03

• Yüksek rezolüsyonlu

– Allelik düzeyde tiplendirme

– ör: HLA-A*01:01

Ön ek ile gen ayrım çizgisi Null”(eksprese edilmeyen ) bir allel

ayırıcı Alan ayırıcısı

HLA ön eki

GEN

Allel grubu

Spesifik HLA proteini

Kodlanmayan bölgelerdeki Farklılıklar

Sinonim mutasyonu olan allel

• HLA gen bölgesi yüksek oranda polimorfik bir bölge olup, Sınıf I HLA alleleri (n=8.124)

ve sınıf II HLA alleleri (n= 2409) olmak üzere toplam 10.533 farklı alel içermektedir

(www.hla.alleles.org, 2013).

• HLA allellerinin sıklıkları ve dağılımları popülasyonlar arasında, etnik kökene göre

farklılık gösterir.

HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DR HLA-DQ HLA-DP

2313 3011 1985 1850 5995 480

Farklı HLA proteinleri

• Pekçok hasta HLA uyumsuz veriden nakil olmaktadır

• Her uyumsuz HLA antijeni antikor oluşumuna yol açmaz

• graft rejeksiyonuna neden olmaz

1. non-immunogenik HLA uyumsuzluğunu ön görebilmek mümkün müdür?

2. Özellikle sensitize hastalar için kabul edileblir veya edilemez uyumsuzlukları

antikor testleri yapmadan tespit etmek mümkün müdür?

Türkiye’deki sağlıklı bireylerle yapılan

çalışmalarda, en sık rastlanan doku

grupları

HLA-A; A2, A24 ve A3

HLA-B; B35, B51, B44

HLA-DRB1; DR11, DR4 ,DR13

• Bazı doku grupları toplumlarda yaygın, bazıları

nadir rastlanan bir kalıtım şekli gösterir

0

5

10

15

20

25

30

35

40

19,4

17,93

10,3

9,95

20,65

13,53

13,21

11,18

9,55

30,17

9,72

HLA-DQB1*02:01

HLA-DQB1*03:01

HLA-DRB1*07:01

HLA-DRB1*11:01

HLA-DRB1*11:04

HLA-C*07:01

HLA-C*04:01

HLA-B*35:01

HLA-B*51:01

HLA-A*24:02

HLA-A*02:01

HLA Alel Sıklıkları

HLA-A1 HLA-A2 HLA-A3

anti-HLA-A1

Her bir HLA antijeni, polimorfik amino asid

residüleri tarafından tanımlanan epitopları

sunar ve bunlara karşı da antikor oluşur.

Anti-HLA antikoru

Antijen havuzu, fenotip paneli=Panel reaktif antikor (PRA)

Spesifik bir donöre ait hücreler = Cross-match

Anti-HLA: HLA antijenine karşı oluşmuş antikor.

DSA: Donör spesifik antikor

Cross-match

PRA testi

Bir hastanın antikor durumundaki değişikliği

tespit etmenin en iyi yolu

hastadan her ay kan alıp,

antikor testi yapmaktır.

Hastalar, tercihen diyalizlerinin ertesi günü olacak şekilde,

6 aylık aralıklarla

anti-HLA antikor tayini için

kan vermek üzere yönlendirilmelidir.

Anti-HLA antikor testi için önerilen aralıklar,

3 ayda bir ya da 6 ayda bir

Antikor testleri

Hastaya kan takılması

halinde HLA laboratuarı

mutlaka bilgilendirilmelidir.

Örnek verme esnasında,

Enfeksiyon olması testi etkiler.

Kan takıldıktan 1 ay sonra antikor testi için

kan verilmelidir.

Nakil sonrası dönemde,

anti-HLA antikor tayini

pek çok laboratuarda rutin bir uygulama

olmamakla birlikte,

merkezler özellikle nakil sonrası

1., 7.,14.,21.,28. gün, 3.ay , 6. ay ve 12. aydaki

serum örneklerini toplamak konusunda

hassas olmalılardır.

• Hücresel yöntemler

– CDC

– Flow sitometri

• Solid faz immünoassay (soluble HLA molekülleri solid

yapıda matrikse bağlıdır)

– ELISA

– Luminex (C4 d assay, C1 q assay)

• Luminex teknolojisi düşük düzeydeki HLA spesifik antikor tayininde hem CDC hem de flow sitometriden daha sensitiftir

Anti HLA antikor tayini ve CXM

yöntemleri

Serolojik Yöntem ( Mikrolenfositotoksisite )

Flow-Sitometri

ELISA

XM

CDC-XM

Yöntem olarak Serolojik HLA tiplendirilmesindeki ile aynıdır

Alıcının serumu bu kez vericinin lenfositleri ile inkübe edilir

DTT’li ve DTT’siz olarak iki ayrı plak hazırlanır

DTT IgM antikorlarını uzaklaştırır

Hasta Serumu

+Donör Lenfositleri

+

Kompleman

+

Boya , Formaldehid

DEĞERLENDİRME

Serolojik Yöntem

SEROLOJİK YÖNTEM

OTO XM

MAJOR

DTT’li XM

NC ; IgG ; IgM

Komplemansız

CDC-XM, nakil sonrası

saatler/günler

içerisinde meydana gelen ve

allogreft rejeksiyonu

ile greft kaybı açısından

artmış risk ile ilişkili olan

düşük seviyedeki DSA’ları

tespit etmek için

yeterli hassasiyete sahip değildir.

Gebel HM et al. Am J Transplant, 2003

Daha hassas olan flow sitometri cross-match (FC-XM),

bir çok nakil merkezinde DSA tespitinde kullanılan hücre tabanlı mevcut en iyi test olarak

kabul edilmektedir.

Flow Sitometri Cross-Match

Neden FCXM?

• Düşük düzeydeki HLA Sınıf I antikorlarını

• Sınıf II antikorlarını

• Antikorun hedef hücresini T- XM ve B XM

• Tüm IgG alt gruplarını saptar.

• Ig-G Antikorlar alt grupları vardır:

• IgG1 ve 3 kompleman aktivasyonunu güçlü

• IgG2 ve 4 zayıf aktive ederler.

• 1. ve 3. grup IgG reaktif özellikli

• 2. ve 4. grup IgG tolerans regüle ediciantikorlar denilir.

Flow XM

• Alıcının serumu ile inkübe edilen verici

lenfositlerine önce B ya da T hücresine

spesifik floresan işaretli marker eklenir

daha sonra 2. bir floresan boyaya sahip

anti Ig G ilave edilirT FCXM (+) olan testte

IgG-FITC histogramının

negatif ve pozitif

kontrolün IgG-FITC

histogramları ile

karşılaştırması

---- Negatif kontrol, -

--- Pozitif kontrol, ----

CM

T hücre ve B hücre pozitif –kontrendikasyon

anti sınıf I HLA antikorlarını gösterir; anti sınıf II HLA

antikoru da var olabilir?

T hücre pozitif- kontrendikasyon

Yalnızca B hücre pozitifliği-tartışmalı

- Sınıf II HLA-DSA

- Düşük seviyede Sınıf I HLA-DSA

- Enfeksiyon varlığı (1 ay sonra test tekrarlanır)

- HLA dışı antikorlar

- Spesifik olmayan bağlanmalar (yanlış

pozitiflik)

-Otoantikorlar (grefte zarar vermezler)

T hücre B hücre Yorumlama

Negatif Negatif HLA antikoru YOK veya çok düşük titre

Negatif pozitif Öncellikle Sınıf II antikoru

Negatif Zayıf pozitif Zayıf Sınıf I veya II antikoru

pozitif pozitif Kuvvetli Sınıf I antikoru veya Sınıf I ve

Sınıf II birlikte

pozitif Negatif non-HLA reaksiyonu ?

Flow Sitometrik XM reaksiyon paternleri

Transplantation Immunology methods and protocols 2013

Solid Faz Immunoassay-Luminex

Test serumu önce sınıf I ve sınıf II HLA antijeni kaplı mikroboncuklarlainkübe edilir

Test serumundaki mevcut HLA antikorları boncukların üzerindeki antijenlere bağlanır

Non HLA antikorlar ve immün kompleksler

Luminex sisteminde tespit edilmez.

DSA saptanması

• Tek antijen boncuk (SA bead) dayalı Solid faz yöntemleri

• Virtual Cross Match uygulaması

• SA bead’ ler ile saptanan tüm DSA’ lar klinik etkisi ??

• DSA’ ların patojenitesi arasında farklılık varsa

Zararlı / Zararsız ayırımı nasıl yapılacak?

• Fonksiyone graft

• Rejeksiyon Öngörü ?

• Graft kaybı

• DSA karakterizasyonu yapılabilir mi?

• Kompleman bağlayıcı DSA

• IgG alt sınıflaması

• Çalışma tasarımları ve sonuçlardaki heterojenitenedeni ile bu tekniklerin klinik uygulamalarda

nasıl kullanılacağına dair bir konsensus yok

Amico P. American Journal of Transplantation 2015

Luminex Modifikasyonları

• C4d assay– Kompleman fikse eden ve etmeyen antikorların

ayrımında kullanılır.

– Kompleman aktivasyonu gerekir ve komplemanregüle edici faktörlerden etkilenir

– CRP ligandlarına bağlandıktan sonra, kompleman 1 q'yu aktive eder, böylece klasik yoldan kompleman aktivasyonu gerçekleşebilir . CRP aynı zamanda kompleman aktivasyonunu regüleeden inhibitör protein olan faktör H'yi de aktive edebilmektedir .

– C4d+ antikorların varlığının böbrek ve kalp graft ömrü ile ilişkili olduğunu gösteren yayınlar mevcut

– C4d antikorlarının böbrek graflerinde AMR ile ilişkisi ??

– De nova DSA kötü graft survi ilişkisinin MFI ve C4d den bağımsız olduğu gösterilmiş

Luminex Modifikasyonları

• C1q assay

– Komplemana bağlanan ve klasik yolağı aktive

etme yeteneğine sahip antikorlar saptanır.

Kompleman aktivasyonu gerekmez

– Kompleman regüle edici faktörlerden

etkilenmez.

Standart miktarda hC1q hasta serumuna eklenir; sonra SAB’ler

eklenir; en son PE konjuge anti hC1q antikorları eklenir

Luminex Modifikasyonları

• C1q assay

– Daha çok IgG antikoru saptar (CDC’ den )

– Kompleman fikse eden IgM’ leri de saptar.

Kardiyak ve renal transplant rejeksiyon ve C1q antikor

ilişkisini gösteren yayınlar var.

HLA uyumu graft rejeksiyonu sonrası yüksek

sensitizasyonu önler

Transplantasyon sonrası De novo DSA ile kötü

graft sağkalım ilişkisi

Uygun olmayan Antijenler

• Anti-HLA antikorlarının tespitin de tek HLA

molekülleri ile kaplı solid faz immün (SFI)

test lerin kullanıma girmesi antikor tespitinde

öz güllüğü ve hassasiyeti artırmıştır.

Solid Faz İncelemeler ile anti HLA antikorları

(tek antijen) saptanır

Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı

Bir hastanın (özellikle yüksek

oranda sensitize hastaların)

hiç HLA antikoru oluşturmadığı

HLA antijenlerinin belirlenmesidir.

Eurotransplant’ta

HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ lokusları için

kabul edilebilir uyumsuzluklar

belirlenmektedir.

(Acceptable mismatch-EUROTRANSPLANT)

Acceptable mismatchKabul edilebilir uyumsuzluklar

pozitif

negatif

PRA %92

HLA: A1, A24, B7, B8 acceptable mismatch A24

HLA: A1, A2, B7, B18 acceptable mismatch B18

Hasta HLA: A1, A2, B7, B8

Kabul edilebilir uyumsuz antijenler

A2, A11, B7, B39, CW4

Kabul edilebilir uyumsuz antijenler hastanın serumunun

reaksiyon vermediği, yani antikor oluşturmadığı antijenlerdir.

%PRA

• Yüksek oranda sensitize hastalar, %85 ve üzeri oranda panel reaktif antikora sahiphastalar olarak tanımlanır.

• Eurotransplant Kalite Kontrol Programı aynı serumun %PRA değerinin farklı laboratuvarlar arasında %5-80 değişiklik gösterdiğini,

• HLA antikor spesifisitesinin ise oldukça uyumlu olduğunu ortaya koymuştur.

Yüksek oranda sensitize hasta

Paneldeki hücrelerin

%85’i ile pozitif veren

Virtual PRA

Donör popülasyonundaki antijen frekansına göre

Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı

Yüksek oranda sensitize hastalar: PRA %80-85XVPRA- cPRA –sanal PRA

Doxiadis IIN, Claas FHJ.Current Opinion Org Transplant, 2009

Sensitizasyon derecesini tanımlamanın en iyi şekli, bir

hastanın HLA antikorlarının bir donör popülasyonun da ki

hedef antijenlerin frekansına göre değerlendirilmesidir ki,

buna “sanal (virtual) PRA” denmektedir

(%PRA= % popülasyon reaktif antikorlar).

‘Gerçek PRA hesaplama Programına’http://eurotransplant.nl/cms/index.php

adresinden erişilebilmektedir.

Bir hastanın anti-HLA antikoru

geliştirdiği allellerin gen frekanslarının

bilinmesi ile geleneksel PRA değerinden

daha doğru bir şekilde anti-HLA

reaktivitesini yansıtan ‘(virtual) PRA

yüzdesi’ hesaplanabilmektedir.

Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı

http://eurotransplant.nl/cms/index.php

Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı

Flow sitometri cross-match (FC-XM),

bir çok nakil merkezinde DSA tespitinde

kullanılan hücre tabanlı

mevcut en iyi test olarak

kabul edilmektedir.

Anlamlı olmayan antikorların,

hücre yüzeyine

özgül olmayan bağlanmaları

nedeniyle yanlış pozitif sonuçlar

ortaya çıkabilir

!!! !!!Wen R et al. Kidney Int, 2006

Yeni teknikler; Cross-match sonuçlarının

doğru bir şekilde öngörülmesini sağlama potansiyeline sahiptir.

VIRTUAL CROSS-MATCH BİR ÖNGÖRÜDÜR

Alıcının önceden karakterize edilmiş

antikor spesifitelerine dayanarak,

nihai cross-match sonuçlarının tahmin edilmesidir.

Tek antijen boncuklar kullanılarak

yapılan HLA- antikor testlerinden elde edilen

ayrıntılı HLA spesifitelerinin,

potansiyel bir donörün HLA doku tipi

ile karşılaştırılarak, ayrıntılı HLA spesifisiteleri

ve buna bağlı olarak kabul edilebilir/kabul

edilemez antijenlerin tanımlanarak, potansiyel bir

donörün HLA fenotipine görebu donörle yapılacak

nihai cross-match sonucunun öngörülmesine

VIRTUAL CROSS-MATCH denir.

Virtual Cross-Match

Hasta doku tiplemesiHLA-A, -B, -C, -DR, -DR, -DQ, -DP

Antikor tarama

PRA 0 Sensitize değil

negatif

Luminex/Flow tek antijen boncuklarHLA-A, -B, -C, -DR, -DR, -DQ, -DP

pozitif

Kabul edilemeyen antijenlerin belirlenmesi

Donör HLA tiplemesiHLA-A, -B, -C, -DR, -DRw, -DQ, -DP

VIRTUAL CROSS MATCH

AKTÜEL CDC-XM --------------vXM

KORELASYON OLDUKÇA KÖTÜDÜR

Bunun sebebi, CDC-XM’in hassasiyet ve özgüllüğünün,

vXM için kullanılan antikor testlerininkindendüşük olmasıdır.

Vaidya S et al. Transplantation, 2006Nikaein A et al. Transplantation 2009

Virtual Cross-Match

AKTÜEL FC-XM --------------vXM

KORELASYON >%85

Virtual Cross-Match

Bunun sebebi, FC-XM’in hassasiyet ve özgüllüğünün,vXM için kullanılan antikor testlerininkine

benzer olmasıdır.

Vaidya S et al. Transplantation, 2006Nikaein A et al. Transplantation 2009

Nakilden 10 önce CDC XM ve Flow XM analizi yapılmalı

CDC (pozitif) hiperakut rejeksiyon

Flow XM (pozitif) graftı 1 yıl içine kaybetme riski var

ÖNERİLER

• Transplantasyon öncesi en az bir kez solid faz immunoassay ile anti HLA sınıf I ve II antikorları araştırılmalıdır.’

• ‘HLA-immünize hastalarda en az bir kez SAB (singleantigen bead) immunoassay uygulanmalıdır (özellikle Cw,DQA,DPA ve DPB’ye karşı gelişen ve diğer yöntemlerle gösterilemeyen antikorlar için) ‘

• ‘SPI yöntemle hücre bazlı yöntemlerle desteklenmeli ve SPI ile ölçülen antikor düzeyinin pozitif crossmatch’e yol açıp açmayacağı değerlendirimelidir’

• ‘Luminex teknolojisini kullanırken antijen yoğunluğu ya da boncuklar üzerindeki antijenlerin denatürasyonu gibi teknik faktörlerin sonuçları etkileyebileceği göz önünde bulundurulmalıdır

PRETRANSPLANTASYON GRUBU ÖNERİLERİ

– Antikor ve CXM sonuçlarına göre hastanın risk kategorisi belirlenmelidir

– Doğru CXM sonuçları doğru HLA tiplendirmesi ile ilişkili olduğundan donörün HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLADRB4, HLA-DRB5, HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DPA, ve HLA-DPB tiplendirmesi yapılmalıdır

– CDC ile saptanmış DSA ve pozitif CXM (en yakın tarihli serumda) varlığında AMR ve graft kaybı riski yüksek olacağından transplantasyondan kaçınılmalıdır

– DSA pozitif ancak CDC CXM negatif hastalar yüksek riskli kabul edilmelidirler ancak transplantasyona kontrendikasyon sayılmamalıdır

– Eğer SAB ile tüm sınıf I ve II antikorlar negatifse prospektif CXM yapılmadan transplantasyon yapılabilir

– Kalp ve akciğer nakillerinde DSA pozitifliğinden kaçınılmalıdır (erken akut rejeksiyon riski); karaciğer, ince barsak ve adacık hücre nakillerinde DSA varlığı risk olarak algılanmalıdır

– HLA antikorlarının varlığı farklı zamanlarda alınan 2 serum örneğinde teyit edilmelidir

POST TRANSPLANTASYON GRUBU ÖNERİLERİ

– De novo DSA gelişimini takip edebilmek için tüm donörlerin DNA’sı ve alıcının pretransplantasyon serumu saklanmalıdır

– Düşük riskli hastalarda (nonsensitize, ilk transplantasyon)• Transplantasyon sonrası 3-12. aylar arası en az 1 kez DSA

bakılmalı

• Tedavi değişikliği planlanması, tedaviye uyumsuzluk şüphesi, graft disfonksiyonu gibi durumlarda DSA bakılmalı

• DSA pozitif ise BİYOPSİ yapılmalı

– Orta risk grubu ( Önceden DSA + ancak şu an -)• İlk 1 ay içinde DSA---------biyopsi

– Yüksek risk grubu (DSA+/XM -)• Transplantasyondan sonraki 3 ay içinde biyopsi ve DSA takibi

– Çok yüksek risk (Desensitize edilmiş)• Yakın DSA takibi ve 3 ay içinde biyopsi

Non HLA antikorları

• MICA antikorları??

• Angiotensin II tip I reseptör aktive edici IgG

• Self antijenlere karşı gelişen antikorlar

(Tubulin, Kollajen, Myosin, Vimentin )

• Anti-peroksizomal trans 2 enoly coA redüktaz

Endotel prekürsör hücreler ile FLOW XM

Cylex ImmunoKnow Cell

Function Assay

• CD4+ Hücre aktivitesini ölçmek

• Hücrenin bazal ATP ve uyarı sonrası ATP’ sini ölçüyor

Berlung D. Transp Immunol 2011

Gelecek

• Hücre içi sitokinler

• Tolerojenik Dendritik Hücreler

• T supresör hücre uyarımı

• Transkriptomik çalışmaları, ekspresyon

analizleri, RNA dizileme

• HLA tetramer boyama ile HLA spesifik

B hücre saptanması

TEŞEKKÜRLER

HLA