6. November 2014, Ruhr-Universität Bochum

Karin Peters, karin.peters@rub.de

Immunologische Methoden

Charakterisierung von Antikörpern

Affinität: Bindungsstärke eines Antikörpers an eine

einzige Antigenbindungsstelle

Avidität: Gesamte Bindungsstärke mit mehr als einer

Bindungsstelle

Idiotyp: Antikörper mit der gleichen Spezifität

Isotyp: IgG, IgM, IgE, IgA und IgD definiert durch die

konstante Region des Antikörpers

Spezifität: Erkennt der Antikörper nur ein spezifisches Epitop?

Herstellung von Antikörpern: Eigenschaften des Antigens

Das Inflammasom wird auch von Alum aktiviert

Pro IL-18

IL-18

Die Bedeutung des Inflammasoms für die Immunantwort

IL-18

Aktivierung

Von T-Zellen

Haptene

- Niedermolekulare Substanzen, die

ohne Trägerprotein keine

Immunantwort auslösen.

- Z. B. Nickel oder Penicillin können

durch haptenartige Wirkung

Immunreaktionen auslösen

Affinitätschromatografie

Tag 1 14 24 35 45 56 70

Immunisierung mit 0,5mg Peptid konjugiert an KLH subcutan

mit Freudschem Adjuvanz

Blutentnahme

Herstellung polyklonaler Antikörper

Herstellung monoklonaler Antikörper

HGPRT=Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase

HAT-Medium=Hypoxanthin, Aminpterin, Thymidin

HAT-Medium

Aminopterin: blockiert den de novo Syntheseweg für Purine und Thymidin

Hypoxantin: Abbauprodukt aus dem Purinstoffwechsel, kann über den

salvage-pathway zur Purinsynthese eingesetzt werden mittels

HPGRT

Thymidin: muss zugeführt werden, da die Synthese durch Aminopterin

blockiert ist

Hämagglutination und Blutgruppenbestimmung

Coombs-Test

ELISA = Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

1) Beschichtung

mit dem

Antigen

2) Bindung eines

spezifischen

Antikörpers

3) Bindung eines

enzymgekoppelten

Zweitantikörpers

4) Substrat Farbiges

Produkt

5) Messung der

Absorbtion

Indirekter ELISA

Blockierung

freier Bindungs-

stellen

Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat)

+

NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid)

Alkalische

Phosphatase

Antigen

(Spezifisches Allergen)

+ Serum-IgE + Detektionsantikörper

(IgG-Anti-IgE)+ Substrat

Beispiel 1: Detektion von Allergen spezifischem IgE

Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat)

+

NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid)

Alkalische

Phosphatase

Fänger-Antikörper

(IgG-Anti-IgE)

+ Serum-IgE + Detektionsantikörper

(IgG-Anti-IgE)+ Substrat

Beispiel 2: Messung von IgE mittels Sandwich ELISA

Kompetitions-ELISA

Western Blot (Immunoblot)

HIV-Nachweis durch Western Blot

H.R. Gelderblom

Robert-Koch-Institut, Berlin

Nachweis von Antikörperreaktionen durch Luminiszenz

Western-Blot

HRP: horseradish peroxidase

λλλλ=488 nm

Laser

λλλλ=530 nm

Emission

Fluorochrome

Antibody Photodetector

Fluoreszenz

FluorochromesExcitation

(nm)

Emission

(nm)

Immunfluoreszenz

Nachweis von Antigenen auf Zellen oder Gewebe mittels

Antikörpern, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind

Macrophagen (grün) in der roten

Pulp der Milz

Wofür wird die Immunfluoreszenz verwendet?

In der Medizin:

Nachweis von Autoantikörpern

In der Biologie:

Nachweis bestimmter Zelltypen im Gewebe

Lokalisation von Proteinen in der Zelle