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Impacto de la degradación de Heparán Sulfato en la regulación de las vías de
diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con Síndrome de Apert
Angela Johanna Muñoz Bolaños
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Morfología
Bogotá, Colombia
2016
Impacto de la degradación de Heparán Sulfato en la regulación de las vías de
diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con Síndrome de Apert
Angela Johanna Muñoz Bolaños
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Genética Humana
Director:
MD, M.Sc Harvy Mauricio Velasco Parra
Línea de Investigación:
Genética Clínica
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Morfología
Bogotá, Colombia
2016
A mi esposo Oscar e hija Salomé.
La ciencia es el alma de la prosperidad de las
naciones y la fuente de vida de todo
progreso. Louis Pasteur.
Agradecimientos Inicialmente a Dios por orientarme y guiarme por los caminos de la ciencia. A mi esposo
y a mi hija, quienes han sido mi mayor inspiración y apoyo en todos los momentos de
este recorrido académico y de la vida. A mis padres y hermano por no dejarme rendir y
animarme constantemente.
A mi compañera Diana Ramírez por ser mi andamio en el laboratorio y en los duros
momentos del desarrollo de la tesis. A mi profesor Harvy Mauricio Velasco Parra por su
confianza y por todas las enseñanzas que quedaron reflejadas en forma de experiencia
laboral y académica. A Diana Mayorga, Angela Johanna Espejo y Dra. Lilian Torres por
su seria y comprometida colaboración con el proyecto.
A la Universidad Nacional por acogerme y darme la oportunidad de formarme académica
y personalmente. A mis compañeros y profesores de la Maestría en Genética Humana,
quienes fueron mi sostén y apoyo durante todo este tiempo.
Finalmente, a los pacientes y familiares que participaron en el proyecto; a todo el equipo
de la Fundación Publica de Medicina Xenomica en Galicia en especial al Dr. Angel
Carracedo por su recibimiento y apoyo; a Diana Mayorga, Ángela Johanna Espejo y
Gualberto Hernández por su colaboración a lo largo de estos años.
Resumen y Abstract IX
Resumen La activación de FGFR2 requiere una configuración tridimensional entre ligando, receptor
y Heparán Sulfato (HS). Las mutaciones en la región extracelular de este receptor
(dominios tipo Inmunoglobulina) afectan el balance entre proliferación y diferenciación de
células osteoprogenitoras, llevando a craniosinostosis como la del Síndrome de Apert
(SA). Postulamos que la degradación de HS en tejido perióstico en pacientes con SA
puede modificar el perfil de expresión génica y modular el comportamiento celular. Se
obtuvieron fibroblastos de tres pacientes y un control sano, se cultivaron hasta el 3-5
pase y estimularon con FGF2 por 24 horas y con Idursulfase® (0.025mg/ml) por 48 horas
por triplicado. El ARN total (>50ng/uL) fue obtenido para evaluar la expresión génica
usando el Genechip® Human Gene 2.0 ST Array (Affymetrix). La mayoría de los genes
que evidenciaron cambio después del tratamiento están involucrados en la regulación de
componentes de la Matriz Extracelular. Los procesos moleculares afectados con mayor
impacto fueron diferenciación ósea, proliferación celular y respuesta inflamatoria. Sin
embargo este estudio se centra en los genes asociados a diferenciación ósea. Los
resultados demuestran: A) El tratamiento con Idursulfase® modifica la expresión de
elementos asociados a MEC y al proceso de diferenciación osteoblástica. B) Los datos
contrastan con reportes de modelos previos de SA. Se propone una probable
recuperación parcial del microambiente extracelular después del tratamiento.
Palabras clave: FGFR2, Idursulfase, Craneosinostosis, Heparán Sulfato
X Impacto de la degradación de Heparán Sulfato en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal
Abstract FGFR2 activation requires a tridimensional configuration between ligand, receptor and
heparan sulfate (HS) molecules. Mutations in the extracellular region of this receptor
(immunoglobulin type domains) affect the balance between proliferation and
differentiation of osteoprogenitor cells, leading to craniosynostosis as Apert Syndrome
(SA). We postulate that the degradation of HS in periosteal tissue in patients with SA can
modify the gene expression profile and modulate cell behavior. Fibroblasts cells from
three patients and a healthy control were obtained, grown to 3-5 pass and stimulated with
FGF2 for 24 hours and Idursulfase® (0.025mg / ml) for 48 hours in triplicate. Total RNA
(> 50 ng / uL) was obtained to evaluate gene expression using GeneChip Human Gene
2.0 ST Array (Affymetrix). Most genes showed significant change after treatment are
involved in the regulation of extracellular matrix components. The most impacted
molecular processes were bone differentiation, proliferation, and celullar inflammatory
response. However, this study focuses on genes associated with bone differentiation. The
results show: A) Treatment with Idursulfase® modifies the expression of elements
associated with MEC and the process of osteoblast differentiation. B) The data contrast
with reports of previous SA models. A probable extracellular microenvironment partial
recovery after treatment is proposed.
Keywords: FGFR2, Idursulfase, Craniosynostosis, Heparan Sulfate
Contenido XI
Contenido
Pág.
Resumen ........................................................................................................................... IX
Lista de figuras ............................................................................................................... XIII
Lista de tablas ................................................................................................................. XV
Introducción ....................................................................................................................... 1
1. Objetivos ...................................................................................................................... 31.1 Objetivo General .................................................................................................. 31.2 Objetivos Específicos ........................................................................................... 3
1.2.1 Objetivo específico 1 ................................................................................. 31.2.2 Objetivo específico 2 ................................................................................. 31.2.3 Objertivo específico 3 ................................................................................ 3
2. Problema de Investigación y Justificación .............................................................. 4
3. Marco Teórico ............................................................................................................. 6
4. Metodología ............................................................................................................... 184.1 Fase Pre-analítica .............................................................................................. 18
4.1.1 Toma de muestras ................................................................................... 184.1.2 Recolección de Información .................................................................... 194.1.3 Recolección de Datos .............................................................................. 19
4.2 Fase Analítica .................................................................................................... 204.2.1 Consentimiento Informado ....................................................................... 204.2.2 Análisis de mutación en FGFR2 y expresión de isoforma mesenquimal (FGFR2IIIc) .......................................................................................................... 204.2.3 Cultivos celulares ..................................................................................... 204.2.4 Densidad celular y ensayo de linealidad celular ...................................... 214.2.5 Determinación de la citotoxicidad del fármaco Idursulfase® y Ensayo de exposición a cultivos primarios ............................................................................ 214.2.6 Determinación de Inmunofenotipo por Epi-Inmunofluorescencia ............ 224.2.7 Extracción de RNA total ........................................................................... 224.2.8 Ensayos de Microarray ............................................................................ 234.2.9 Análisis de la expresión génica diferencial mediante qRT-PCR .............. 234.2.10 Análisis bioquímico: cuantificación de Heparán Sulfato y actividad enzimática de IDS e IDUA en orina, sangre y tejido. ........................................... 25
4.3 Tratamiento Estadístico ..................................................................................... 25
XII Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
Título de la tesis o trabajo de investigación
5. Resultados ................................................................................................................ 26
5.1 Identificación del Fenotipo Celular ..................................................................... 265.2 Identificación del Fenotipo Celular ..................................................................... 295.3 Análisis bioquímico: cuantificación de Heparán Sulfato y actividad enzimática de IDUS e IDUA en orina, sangre y tejido subperióstico craneal. .............................. 315.4 Evaluación del efecto citotóxico del fármaco Idursulfase® ............................... 335.5 Análisis de expresión diferencial por Microarray ............................................... 345.6 Análisis de expresión diferencial por qRT-PCR ................................................. 45
6. Discusión ................................................................................................................... 476.1 Identificación del Fenotipo Celular ..................................................................... 476.2 Cuantificación de GAGs y Actividad enzimática ................................................ 486.3 Efecto del fármaco Idursulfase® sobre la expresión génica de fibroblastos SA 49
Conclusiones ................................................................................................................... 56
Limitaciones ..................................................................................................................... 57
Perspectivas ..................................................................................................................... 58
A. Anexo: Consentimiento Informado para Participar en el Proyecto de Investigación ............................................................................................................. 59
Bibliografía ....................................................................................................................... 64
Lista de figuras XIII
Lista de figuras Pág. Figura 1 Observación microscópica aleatoria de expansión celular en primer pase de cultivo celular primario de fibroblastos de perioistiio de pacientes con SA. Agosto de 2014. Visualización 10X. ................................................................................................... 28
Figura 2 Epi-inmunofluorescencia cultivo 008: se observa tinción positiva color verde (lado izquierdo) para Ac dirigido a APF de superficie celular, al compararse con tinción para núcleo celular DAPI color azul (lado derecho) .......................................................... 28
Figura 3 Electroforesis de amplificación de fragmento de 286pb de la isoforma mesenquimal FGFR2IIIc. Carriles 1, 3, 5, 7 corresponden a muestras de control positivo y pacientes con tratamiento con Idursulfase®. Carriles 2, 4, 6 y 8 corresponden a muestras sin tratamiento. Carril C- corresponde a control negativo ................................. 29
Figura 4 4A: Perfil mutacional de tres cultivos celulares fibroblásticos con la enzima Bgll. Amplificación del fragmento ubicado en el exón 7 de FGFR2 (376pb) en tres muestras de ADN proveniente de los cultivos celulares evaluados (Gel a la izquierda). Perfil de restricción de la enzima BgII para la detección de la mutación P253R en geles de poliacrilamida al 9%, la muestra del paciente 1 es positivas para la mutación P253R y por lo tanto presenta una banda de bajo peso molecular (±300bp) (Gel a la derecha). MP: Marcador de peso; C+: Muestra control positiva para la mutación; 002-004: muestras cultivo celular, 004 corresponde al cultivo del paciente 1 (AP1); C-: DNA negativo de la mutación. 4B: Perfil mutacional en una muestra de sangre con la enzima MboI. Amplificación del fragmento ubicado en el exón 7 de FGFR2 (376pb) en ADN proveniente de muestra de sangre de Paciente 2 (AP2) rotulada como cultivo 008 y controles positivos propios (Gel a la izquierda). Perfil de restricción de la enzima MboI para la detección de la mutación S252W en geles de poliacrilamida al 9% Se observa una banda en 476pb que indica la presencia de la mutación (Gel a la derecha). MP: Marcador de peso; C+: Muestra control positiva para la mutación; 25-12: muestra de DNA de paciente 2; C-: DNA negativo de la mutación. 4C: Perfil mutacional en una muestra de sangre con la enzima MboI. Amplificación del fragmento ubicado en el exón 7 de FGFR2 (376pb) en una muestra de ADN proveniente de paciente 3 (AP3) rotulado como cultivo celular 012 y
XIV Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
Título de la tesis o trabajo de investigación
controles positivos propios (Gel a la izquierda). Perfil de restricción de la enzima MboI para la detección de la mutación S252W en geles de poliacrilamida al 9%, Se observa una banda en 476pb que indica la presencia de la mutación (Gel a la derecha). MP: Marcador de peso; C+: Muestra control positiva para la mutación; AP12: muestra cultivo celular 012, paciente 3; C-: DNA negativo de la mutación. .............................................. 30
Figura 5 Intensidad de la fluorescencia media (URF) al evaluar seis densidades celulares en los cultivos FIBRO CONTROL y FIBRO APERT durante un periodo de 48 horas. n=6 .......................................................................................................................................... 33
Figura 6 Curvas de supervivencia de los cultivos celulares FIBRO AP y FIBRO CONTROL. Las células se sembraron a una densidad de 30000 (cels/pozo) en cajas de cultivo de 48 pozos. 24 horas después, las líneas celulares FIBRO AP (Izquierda), y FIBRO CONTROL (Derecha) se sometieron a exposición del fármaco Idursulfase® en diferentes concentraciones (0.2, 0.02, 0.002, 0.0002 y 0.00002 mg/ml). Se realizó lectura 48 post-tratamiento por el método de viabilidad con Rezasurina. Este experimento se realizó por duplicado. Como controles se empleó células sin tratamiento; pozos vacíos sin células, y como control positivo (muerte), células sometidas a Taxól (4 x10-1 µM). .. 34
Figura 7 GO TERM (Gene Ontology) - Procesos biológicos (BP) ................................... 45
Figura 8 Resultados de qRT-PCR: Niveles de expresión de genes según qRT-PCR vs los resultados del Array para cada paciente al comparar las condiciones de tratamiento con Idursulfase® versus sin tratamiento. Se enuncia en la parte superior los valores del Fold change resultado del Array para cada paciente al comparar la condición basal y posterior al tratamiento con Idursulfase. ST: Sin tratamiento con Idursulfase®; CT: Con tratamiento. ....................................................................................................................... 46
Lista de tablas XV
Lista de tablas Pág. Tabla 1 Secuencia de primers usados en experimentos de qRT-PCR ............................ 24
Tabla 2 Cultivos usados en el estudio .............................................................................. 27
Tabla 3 Actividad enzimática de IDS e IDUA en tejido de paciente 004 .......................... 31
Tabla 4 Resultado de cuantificación enzimática en leucocitos, cuantificación de Heparán sulfato y actividad enzimática de IDS e IDUA en orina, sangre y tejido ........................... 32
Tabla 5 Resultado de cuantificación enzimática en leucocitos cuantificación de heparán sulfato y actividad enzimática de IDS e IDUA en orina, sangre y tejido ........................... 32
Tabla 6 Cuantificación RNA muestras cultivos 004 y 006 ................................................ 34
Tabla 7 Cuantificación RNA muestras cultivos 008 .......................................................... 35
Tabla 8 Cuantificación RNA muestras cultivos 012 .......................................................... 35
Tabla 9 Lista de genes diferencialmente expresados con su respectivo fold change. AP1, -2, -3: Valor de fold change; rojo: regulación a la alta; verde: regulación a la baja .......... 36
Tabla 10 Genes diferencialmente expresados asociados a diferenciación osteoblástica y matriz extracelular ............................................................................................................. 44
1 Introducción
Introducción
El síndrome de Apert (SA) es un desorden autosómico dominante que se caracteriza por
craneosinostosis, anomalías craneofaciales y sindactilia simétrica severa de manos y
pies. Es uno de los síndromes más severos dentro de los que cursan con
craneosinostosis; abarca aproximadamente el 4,5% de estos (1) y tiene una prevalencia
de 1 en 12.4-15.5/millones de nacidos vivos (2) y una incidencia en 1:60.000 recién
nacidos vivos (3). La mayoría de los pacientes con SA tienen una o dos mutaciones
missense que conllevan a la sustitución de aminoácidos contiguos, Ser252Trp (S252W) y
Pro253Arg (P253R) en el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos tipo 2
(FGFR2), las cuales afectan una región altamente conservada entre los dominios tipo
inmunoglobulina II y III, llevando a un aumento de la afinidad del receptor por sus
ligandos, los factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs, por sus siglas en inglés)
(4,5).
Los FGFs son moléculas de señalización mitogénicas que participan en el control de la
proliferación, diferenciación y supervivencia celular en muchos tejidos y su actividad
depende de la afinidad que tengan con sus receptores (6). Cuando interactúan con
FGFR2IIIc (isoforma mesenquimal) se activan diversas vías de transducción de señales:
Fosfolipasa Cγ (PLCγ), Proteína Kinasa Activada por Mitógenos (MAPK) y Proteína
Kinasa C (PKC) las cuales son muy importantes en los procesos de diferenciación celular
y desarrollo óseo (7,8). Son de interés particular para este estudio los genes de las vías
de señalización asociadas a la diferenciación de estas células, las cuales, según
hallazgos previos, están estrechamente involucradas con la osificación temprana
característica de los pacientes con SA (6,9,10).
Lista de tablas 2
Adicionalmente, se ha descrito un incremento en la concentración de Heparán Sulfato
(HS), concomitante con una disminución de la actividad de las enzimas degradadoras de
glicosaminoglicanos (11), los cuales son requeridos para una óptima señalización de
FGF/FGFR a nivel fisiológico y celular (4,12).
De acuerdo con estos hallazgos moleculares, se plantea realizar un estudio de
intervención in vitro, con y sin tratamiento con Idursulfase® (INN-Idursulfasa, enzima
degradadora de Heparán Sulfato) en cultivo de fibroblastos sub-periósticos de pacientes
con SA con las mutaciones P253R y S252W. Así, se hipotetiza que someter estas
células a tratamiento con este fármaco, reduciría la concentración del glicosaminoglicano
HS en el espacio extracelular y por ende, regularía la señalización corriente abajo de
FGF/FGFR2 asociada a una disminución de los procesos de diferenciación celular
osteoblástica, favoreciendo la resolución de la patología.
El manejo actual de estos pacientes consiste principalmente en intervenciones
quirúrgicas para corregir las anormalidades craneofaciales y de manos y pies. De esta
forma, es urgente encontrar una terapia alternativa que no sea invasiva, que ayude a
resolver molecularmente la enfermedad y que aporte nuevos conocimientos al
entendimiento de los procesos genéticos y de señalización de la patología, generando
avances importantes en la comprensión de las características clínicas y de nuevas
opciones de tratamiento posteriores.
3 Objetivos
1. Objetivos
1.1 Objetivo General Evaluar el impacto de la degradación del glicosaminoglicano Heparán Sulfato en la
señalización corriente abajo de FGF/FGFR2 y la diferenciación osteoblástica, en cultivo
de fibroblastos subperiósticos provenientes de pacientes con Síndrome de Apert,
después de someterlos a tratamiento con y sin Idursulfase®.
1.2 Objetivos Específicos
1.2.1 Objetivo específico 1
Identificar las mutaciones en el gen FGFR2 en plasma de pacientes con Síndrome de Apert.
1.2.2 Objetivo específico 2
Cuantificar los niveles de Heparán Sulfato en orina de pacientes con Síndrome de Apert.
1.2.3 Objertivo específico 3
Identificar los genes directamente regulados a la alta o a la baja en cultivo de fibroblastos periósticos de pacientes con Síndrome de Apert con y sin tratamiento con Idursulfase®, asociados a vías de señalización celular involucradas en diferenciación celular
Problema de Investigación y Justificación 4
2. Problema de Investigación y Justificación
El síndrome de Apert hace parte de las craneostosis sindrómicas catalogadas como
enfermedades raras. Las personas afectadas presentan importantes deficiencias
funcionales y estructurales, algunas de las cuales pueden amenazar la vida de los
pacientes (9). Así, los pacientes pueden presentar diferentes afectaciones
multisistémicas que involucran aspectos físicos, sensoriales y cognoscitivos que,
eventualmente, terminan afectando todos los ámbitos de la vida, especialmente su
inclusión laboral y educativa.
Considerando lo anterior, las personas afectadas requieren del cuidado constante de un
equipo interdisciplinario desde la infancia hasta la vida adulta. Diferentes servicios de
atención médica se involucran en el manejo de la patología (genética, cirugía plástica,
ortopedia, neurocirugía y neuropediatría), dentro de los que el manejo quirúrgico es el
más frecuentemente empleado para la gran mayoría de comorbilidades, sin que esta
resuelva completamente el espectro fenotípico del síndrome (10).
Conociendo y entendiendo más a fondo las vías moleculares de la patología es posible
proponer tratamientos alternativos además del manejo quirúrgico y de soporte, y que
planteen abordajes bioquímicos más finos en su lugar. Toda la información fisiológica y
genética que pueda obtenerse de la patología servirá de soporte para el establecimiento
de nuevas estrategias terapéuticas encaminadas a disminuir o eliminar el impacto de la
mutación presente.
Un ejemplo claro consiste en la modificación farmacológica de los perfiles de heparán
sulfato en los pacientes. Debido a que se ha establecido como característica molecular
del síndrome un aumento en la concentración de glicosaminoglicanos y una disminución
5 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
concomitante de las enzimas que degradan en tejido óseo (13)(14) y, considerando la
importancia de estas macromoléculas en la interacción entre FGFR2 y sus ligandos,
podría pensarse que esta modificación ayudaría a modular o disminuir la ganancia de
función del receptor mutado.
Más específicamente, se conoce que las cadenas de heparán sulfato controlan el
movimiento y recepción de factores de crecimiento hacia receptores en células blanco
durante el proceso de morfogénesis (14). Este glicosaminoglicano se asocia
directamente con el FGFR2 y sus diferentes ligandos, formando un complejo ternario en
la superficie de la célula (15), el cual desencadena diferentes vías de señalización
dependiendo del estímulo. Cuando se produce una alteración en el receptor, se
incrementa su afinidad por otros ligandos, activando múltiples vías de señalización y
promoviendo una aberrante y prematura osificación (16).
De acuerdo con estos antecedentes, se realizó un estudio en el cual se postuló que la
reducción de las concentraciones de HS por acción de sus enzimas de degradación,
específicamente con Idursulfase®, podría modificar el pool de expresión corriente abajo
de FGFR2. El tipo de ensayo que se plantea, permitirá demostrar la presencia de una
variación en los perfiles de expresión corriente abajo de FGFR2 en tejido de pacientes
con Apert cuando éste es sometido a tratamiento con Idursulfase® y podrá ser el primer
acercamiento hacia una nueva alternativa terapéutica en el manejo de esta patología,
además de brindar novedosas explicaciones hacia el entendimiento de la pleiotropía y la
severidad de la enfermedad.
Marco Teórico 6
3. Marco Teórico
3.1 Estado del Arte
El síndrome de Apert es una de las anomalías craneofaciales que forma parte de los
denominados síndromes de disostosis craneofacial. Aunque las descripciones clínicas de
craneosinostosis datan del tiempo de Hipócrates, en general se acepta que la primera
craneosinostosis referenciada históricamente fue realizada por Mestrius Plutarchus (46-
127AD), quien describió a estos niños como “cabezas de Ôsquill” (esquila), debido al
nombre común de una planta de la familia de las liliáceas con forma de bombilla
alargada. Aproximadamente 1500 años más tarde en “De Humani Corporis”, Andreas
Vesalius caracterizó formas de cráneos específicas asociadas con la ausencia de suturas
craneales (17). La identificación reciente de dos cráneos precolombinos con sinostosis
sagital (fechado en 6000 y 250 antes de Cristo) confirman que la craneosinostosis es un
antiguo trastorno de los seres humanos (18).
El síndrome de Apert fue descrito por primera vez a principios de 1900 por el pediatra
francés Eugène. Este síndrome se caracteriza por una serie de rasgos distintivos que
afectan al cráneo, cara y extremidades. Consecuentemente, también se ha clasificado
como acrocefalosindactilia tipo 1. Si la alteración genética está presente en una persona
afectada, entonces la probabilidad de que la transmita a cada uno de sus hijos es del
50%. Sin embargo, en el caso concreto del síndrome de Apert, la gran mayoría de
personas afectadas con padres sanos son el resultado de una mutación de novo.
Wheaton, en 1894, pudo haber proveído la primera descripción del Síndrome de Apert en
su artículo “Two specimens of congenital cranial deformity in infants associated with
fusion of the fingers and toes” (19); infortunadamente, atribuyó el fenotipo craneal y los
síntomas respiratorios a la sífilis congénita y la sindactilia a la inflamación fetal in utero.
7 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
Sin embargo, no fue sino hasta 1906 que este síndrome fue descrito como
Acrocefalosindactilia por el médico pediatra francés Eugene Charles Apert , el cual
describió nueve casos de sindactilia asociados con acrocefalia (20).
La mutación Serina 252 Triptófano (S252W) en ratones se demostró de forma
independiente en dos laboratorios diferentes (21,22). En el ratón, la sutura coronal
normalmente queda patente a lo largo de la vida. El primer modelo de ratón Apert,
implementado por Chen et al., 2003 (21) demostró la fusión de la sutura coronal,
caracterizada por un aumento prematuro de la superposición de los huesos frontal y
parietal seguido por su fusión progresiva aproximadamente al día 4 de vida posnatal. No
se observaron diferencias en la proliferación celular o la diferenciación de los
osteoblastos de la sutura coronal entre los ratones silvestres y los ratones mutantes, por
lo cual se propuso un aumento en el nivel de apoptosis en la sutura mutante como la
causa para la fusión de la sutura (21). En el segundo modelo murino de Apert (Wang et
al., 2005), las suturas de la línea media fueron afectadas diferencialmente y se observó la
fusión de la sutura coronal y lambdoidea aunque no fue caracterizada (22).
En los últimos años se han realizado varios estudios para proporcionar una mejor
comprensión de la etiología y la patogénesis de esta enfermedad. El síndrome de Apert
tiene un modo de transmisión autosómico dominante, y una mutación en el gen que
codifica para el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGFR2) es la
principal causa en la mayoría de los pacientes. Sin embargo, el hecho de que la misma
mutación puede producir una amplia gama de expresión fenotípica, hace que el
mecanismo de desarrollo anómalo sea mucho más complejo. Carinci, F. et al., fue uno de
los primeros autores en proponer una nueva explicación a esta amplio espectro
fenotípico (23): la matriz extracelular se compone de proteínas, glicosaminoglicanos, y
citocinas que son secretadas en una forma autocrina y paracrina las cuales son capaces
de modificarla. Lo que se conoce en la actualidad es que los factores de crecimiento de
fibroblastos forman un complejo con el heparán sulfato, un componente de la matriz
extracelular, antes de la unión al FGFR2. Existen datos sobre expresión diferencial de
citoquinas y macromoléculas de dicha matriz en fibroblastos y osteoblastos derivados de
craneosinostosis. Cambios en la composición de la matriz extracelular podrían explicar el
Marco Teórico 8
proceso osteogénico alterado y dar cuenta de las variaciones patológicas en el desarrollo
craneal, además de las mutaciones en FGFR2.
3.2 Craneosinostosis
Durante la etapa prenatal y la infancia, la calvaria debe expandirse para acomodar el
cerebro en crecimiento (24). Este proceso ocurre en estructuras denominadas suturas
craneales, las cuales son definidas como sinartrosis que permiten que los huesos
craneales se unan fuertemente por medio de tejido fibroso, y cuyo crecimiento se
produce a través de la osificación intramembranosa. Su morfogénesis corresponde a un
”complejo de sutura craneal” conformado por la duramadre, los frentes osteogénicos de
los huesos planos de la calvaria, el mesénquima de la sutura y el pericráneo (25). Este
complejo permite la deformación temporal del cráneo durante el parto o la compresión del
mismo durante un trauma, evitando la separación de los huesos craneales, protegiendo
los tejidos blandos subyacentes y sirviendo como sitio de crecimiento de los huesos
craneales a lo largo de los extremos de dos huesos opuestos (26). Cuando una sutura se
cierra tempranamente, el cráneo no puede crecer perpendicularmente a la sutura, en su
lugar, crece de forma paralela a él; este proceso se conoce como ley de Virchow y
predice la forma de la deformidad craneal (27).
La craneosinostosis, por lo tanto, es una condición que se caracteriza por la fusión
prematura de una o más suturas craneales (24,28–30), donde la distorsión secundaria de
la forma del cráneo ocurre debido a la falta de crecimiento perpendicular a la sutura
fusionada y un sobre-crecimiento compensatorio de las suturas no fusionadas (24). Esta
fusión prematura puede afectar significativamente el desarrollo craneal y cerebral,
aumentando el riesgo de presión intracraneal elevada (30). Esta patología también puede
estar asociada a deformidades faciales, anormalidades de la base endocraneal y del
prosencéfalo, patologías oculares y alteraciones cognitivas y de comportamiento (25).
La craneosinostosis es una malformación común que ocurre en aproximadamente 1 de
cada 2.000-2.500 nacidos vivos; puede ser espontánea o sindrómica y puede involucrar
una o múltiples suturas craneales (27). Adicionalmente, las craneosinostosis pueden ser
el resultado de un desarrollo anormal primario o secundario a causas externas como
teratógenos, falta de crecimiento cerebral, compresión intrauterina o desordenes
9 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
hematológicos, metabólicos o displasias de huesos (31). La mayoría de las
anormalidades en las suturas son condiciones aisladas (no sindrómicas), pero alrededor
del 15% de éstas, se encuentran asociadas a síndromes y otras anormalidades del
desarrollo (sindrómicas) (31).
Las suturas involucradas en las cranesinostosis son en orden de frecuencia:
• Sagital 40-58%, de etiología desconocida;
• Coronal 20-29%, se estima que un tercio causadas por mutaciones puntuales;
• Metópica 4-10% de etiología desconocida y
• Lamboidea 2-4% igualmente sin etiología conocida.
Cerca del 85% de las craneosinostosis son no sindrómicas, sin embargo, se han
identificado cerca de 200 síndromes genéticos que se manifiestan con craneosinostosis
(OMIM) (25,29). Las mutaciones en FGFR1, FGFR2, FGFR3 y TWIST son las más
comúnmente asociadas (29,32,33).
3.3 Síndrome de Apert
En humanos, el síndrome de Apert o Acrocefalosindactilia tipo I (MIM #101200) es
causado por mutaciones que producen la ganancia de función del Receptor 2 del Factor
de Crecimiento de Fibroblastos (FGFR2). El SA es una condición congénita caracterizada
por craneosinostosis coronal, hipoplasia del tercio medio facial, sindactilia simétrica de
manos y pies y malformaciones craneofaciales (34–36). Este síndrome es considerado
como una de las formas más severas de craneosinostosis y es causado principalmente
por dos mutaciones en el (FGFR2) (36,37).
3.3.1 Epidemiología Representa el 4,5% de todas las craneosinostosis sindrómicas. Su incidencia se estima
en 1:60.000 recién nacidos vivos, siendo más común en ciertas regiones geográficas
como Asia, con incidencias de 2:10.000 (3). En Colombia no existen estadísticas
formales acerca de la incidencia de este síndrome en la población, sin embargo, en un
reciente estudio realizado por nuestro grupo, en fase de publicación, con 7 pacientes
afectados, se encontró una relación en las mutaciones similar al reportado en la
Marco Teórico 10
población general con un 70% de prevalencia para S252W y el 30% restante para P253R
(38).
Se estima que las enfermedades genéticas en conjunto representan en la actualidad más
de dos tercios de las admisiones pediátricas y el 80% de la carga económica de los
servicios de urgencias pediátricas. En particular las de origen monogénico, como el
síndrome de Apert representan en conjunto el 5,5% de las admisiones de urgencias
pediátricas anuales. Con un promedio de días de hospitalización de 7.1 (6.0–8.2) y un
promedio de costos anuales de $17,218US ($13,234–$21,440US) (39).
3.3.2 Clínica Las características típicas del esqueleto de los pacientes con SA , además de evidenciar
el compromiso de las suturas craneales coronal y metópica en algunas ocasiones,
consiste en sindactilia óseas, sinoniquia y talla baja por defectos de la
osteogénesis/condrogenesis/displasia epifisiaria (34,35,40). También se han reportado
alteraciones a nivel de la base del cráneo observándose alteraciones faciales como
hipertelorismo ocular, proptosis, hipoplasia del tercio medio facial, maloclusión severa
(41,42).
Otros defectos asociados incluyen el compromiso del SNC manifestado por estenosis del
foramen yugular, ventriculomegalia, ausencia parcial o completa del septum pellucidum y
defectos del cuerpo calloso junto con Retardo Mental, presenta hasta en el 52% de los
pacientes (43). Adicional a esto se ha reportado la perdida de la audición secundaria a la
fusión de la cadena de huesecillos del oído interno (44,45).
Las anomalías viscerales están presentes en cerca de la mitad de los pacientes
afectados, de estas las alteraciones cardíacas como la estenosis de arteria pulmonar,
defectos del septo ventricular, ductus arterioso persistente y fibroelastosis endocardial se
encuentran en el 10% de los pacientes y las genitourinarias como riñones poliquísticos,
hidronefrosis, útero bicorne, atresia vaginal y criptorquidia en 9.6% de los pacientes
(43,46,47)
11 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
El diagnóstico se realiza clínicamente dados los hallazgos fenotípicos exclusivos al
síndrome. Las imágenes como la Tomografía axial computarizada (TAC) con
reconstrucción 3D y Resonancia magnética nuclear (RMN) cobran relevancia para la
planificación de las cirugías correctivas a realizar (48). El diagnóstico diferencial del
síndrome de Apert se hace con otros síndromes de craneosinostosis y alteración de las
extremidades en grado variable, como el síndrome de Pfeiffer relacionados también con
mutaciones en FGFR2 y los síndromes de Saethre Chotzen y Carpenter. El seguimiento
de estos pacientes es multidisciplinario, requiriéndose manejo por cirujanos plásticos,
neurocirujanos, pediatra, ortodoncista, oftalmólogo, audiólogo, genetista y psicólogo para
el paciente y su familia (28).
El enfoque neuroquirúrgico incluye craneotomía, la cual se recomienda antes de cumplir
el primer año, para descomprimir el cerebro y evitar de esta forma el aumento de la
presión intracraneal (PIC) a medida que el cerebro se expande, lo cual puede conducir a
la muerte del paciente (31). En la infancia tardía se realizan cirugías para el avance del
tercio medio facial que mejora el flujo nasal y disminuye las infecciones respiratorias
secundarias que son frecuentes en estos pacientes, y la cirugía ortognática en la
adolescencia que mejora la oclusión dental y la estética del paciente (49).
Debido al compromiso de las extremidades, se presentan limitaciones funcionales las
cuales pueden ser corregidas mediantes distintas técnicas quirúrgicas, en muchas
ocasiones mediante múltiples intervenciones, lo cual favorece el desempeño personal de
aquellos pacientes que no presentan otras limitaciones de tipo cognitivo (50).
3.3.3 Genética del Síndrome de Apert El SA presenta un patrón de herencia autosómico dominante y se considera que la
mayoría de los casos de esta enfermedad surgen de forma esporádica (51). El defecto
molecular se encuentra en el gen del FGFR2, cuyo locus es 10q26, con un tamaño de
120kb y un total de 18 exones, de los cuales 17 son codificantes (52).
En 1995 Wilkie et al, en un estudio con 40 pacientes con SA se encontró la presencia de
las dos mutaciones relacionadas: S252W y P253R. Ambas mutaciones involucran
cambios en aminoácidos adyacentes a la región de unión del receptor, aunque la
Marco Teórico 12
mutación S252W es más frecuente (70% de los casos) y se relaciona con paladar
hendido (53).
3.3.4 Vía molecular FGF/FGFR La importancia de la vía de los factores de crecimiento de fibroblastos y su receptor
FGF/FGFR en el desarrollo del esqueleto se ha puesto en evidencia con los numerosos
trastornos que resultan de mutaciones en FGFR y que pueden ser clasificados en dos
grandes grupos: condrodisplasias y craneosinostosis (24,29,54).
Los primeros comprometen principalmente los huesos que sufren osificación endocondral
y son resultado de mutaciones en FGFR3, mientras que las craneosinostosis sindrómicas
son atribuibles a mutaciones en FGFR1, FGFR2 y FGFR3 (32,55). Las mutaciones
observadas en estos síndromes sugieren que existen diversos mecanismos patológicos
relacionados con mutaciones puntuales y que los efectos de la vía FGF/FGFR son
pleiotrópicos (55,56).
La familia de los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) está compuesta por 23
miembros cuyos efectos de señalización están mediados por la unión a receptores de
alta y baja afinidad (57–59). Los de alta afinidad o aquellos para quien FGF se comporta
como ligando natural, son la familia génica de los FGFR compuesta por cuatro
integrantes FGFR1 a FGFR4. El gen del FGFR1 se ubica en el cromosoma 8, el del
FGFR2 en el 10, FGFR3 en el 4 y FGFR4 en el cromosoma 5 (60–62). Los diferentes
FGFRs tienen una estructura proteica similar que consiste en tres porciones: la primera
de unión a ligando extracelular con tres dominios tipo Inmunoglobulina (IgI, IgII y Ig III) de
los cuales los dominios 2 y 3 constituyen el sitio de unión; un dominio transmembrana
único y una porción citoplasmática con actividad tirosin kinasa (56).
Tres de los cuatro isotipos de FGFR, el 1, 2 y 3, mediante un proceso de splicing
alternativo, usan dos exones (8 y 9) para codificar alternativamente la región C-terminal
del tercer dominio Ig (IIIb y IIIc). Este proceso crea ARNm tejido-específicos de las
isoformas b y c, las cuales se unen a distintos subconjuntos de FGF (60,63). La región
restante del tercer dominio (IIIa) es codificado por el exón 7 para ambas isoformas,
región en la cual ocurren generalmente las mutaciones relacionadas con síndrome de
13 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
Apert (64). Mutaciones en estos sitios conducen a cambios en la orientación relativa de
los dominios afectando la vinculación del ligando.
Al ser receptores tirosin kinasa, estos sufren un proceso de dimerización como paso
crítico en su activación y el inicio de la cascada de señalización descendente (65). Sus
mecanismos de regulación constan de retroalimentación negativa que involucran la
internalización del receptor y la degradación del factor de crecimiento, lo cual atenúan la
señalización posterior a su activación (66). En este proceso participan proteínas como la
CBL ubiquitina ligasa y la proteína de acoplamiento FGFR sustrato 2 (FRS2a) las cuales
al encontrarse mutadas pueden alterar el proceso normal de degradación y contribuir a la
diferenciación prematura de osteoblastos evidenciada en la craneosinostosis humana
(55). La cascada intracelular de los FGFR se ha relacionado con diversos procesos como
mitogénesis, diferenciación, apoptosis y migración, sin embargo, esta cascada requiere
de la participación de elementos adicionales al ligando (67).
Los efectos biológicos de los FGFs están mediados por la asociación con proteoglicanos
tipo HS. La activación del receptor está mediada por el HS asociada con el ligando (FGF)
y el ligando con el receptor, pero también se ha observado que el HS probablemente se
asocie a otros receptores de baja afinidad (14,68).
La señalización FGF/FGFR controla la formación del hueso. En las suturas craneales y
las extremidades durante el desarrollo es crucial para la progresión de los fibroblastos
hacia el periostio y la proliferación y diferenciación de las células progenitoras en el
proceso de crecimiento y cierre de las suturas (69,70). En modelos de ratón Knockout
para FGF2 y FGFR2 se encuentra una menor densidad ósea, reducción de la
proliferación de las células progenitores y funciones anormales de los osteoblastos
maduros (3,51), además los ratones mutados para FGFR2 presentan craneosinostosis
por aumento de la diferenciación celular (71). La regulación principal de este proceso
ocurre sobre la ostoeblastogenesis, donde se controla específicamente la proliferación de
células indiferenciadas y la diferenciación de las células mesenquimales estromales de
la medula ósea por lo cual se ha atribuido un efecto anabólico óseo fuerte in vivo (72–
74). Recientemente se ha demostrado que este efecto estimulador de la proliferación
ocurre a edades embrionarias tan tempranas como E13 (Embriones de 13 días) en los
modelos murinos (75).
Marco Teórico 14
En osteoblastos, FGF2 activa una gran cantidad de vías de señalización incluyendo
Proteínas activadas por mitógenos (MAP) las cuales después de ser activadas por la
señal regulatoria extracelular continúan activando cascadas intracelulares tipo quinasas
como ERK, p38, MAP quinasa y Proteína C quinasa (PKC), todas relacionadas con la
proliferación osteoblástica y supervivencia celular por lo cual se ha considerado FGF2
como el ligando más importante en la vía FGF/FGFR relacionada con hueso (76).
3.3.5 FGFR2 en Síndrome de Apert La mutación en el receptor FGFR2 de los pacientes con Apert se localizan en el dominio
extracelular, más precisamente en dos aminoácidos adyacentes Serina 252 y Prolina 253
en la región entre el 2 y 3 dominio Ig codificada por el exón 7 (77). En condiciones
normales, la isoforma FGFR2b es reconocida por los ligandos FGF2, FGF6 y FGF9. La
mutación S252W favorece el splicing alternativo para la isoforma FGFR2c que permite
ser activada por ligandos adicionales como FGF7 y FGF10 (78) mientras que la mutación
P253R confiere una mayor afinidad por FGF10 (7,79). Ambas mutaciones pueden
generar cambios en la conformación de los dominios de unión con lo cual se podría
favorecer la unión de ligandos ectópicos (37). Andersen et al, en 1998 con experimentos
in vitro demostró que las dos mutaciones reportadas generan unión mejorada a FGF2 y
otros muchos FGFs en las suturas craneales, proponiendo que esta mutaciones se
comportan como una ganancia de función del receptor (80). Ibrahimi et al, en 2001
pudieron verificar la presencia de enlaces adicionales del receptor a la porción N-terminal
de FGF2 por la introducción del residuo hidrofóbico del Triptófano en la posición 252, los
cuales pueden resultar en una mayor unión del ligando. Por otra parte la mutación P253R
parece afectar la estabilidad de la unión al receptor en su afinidad y especificidad lo que
podría permitir la activación paracrina o autocrina de FGFR2 (81).
3.3.6 Vía de señalización corriente debajo de FGFR2 – Diferenciación Osteoblástica
La vía intracelular de quinasas es activada por la unión de FGF al receptor, el cual sufre
un proceso de dimerización y fosforilación. En esta vía están involucradas MAP quinasa,
ERK, PI3K, PKC y P38. ERK 1/2 se ha relacionado con la diferenciación celular en las
células precursoras de osteoblastos y controla la diferenciación mediada por FGFR2
15 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
(82,83). MAP quinasa, a través de la activación mediada por FGFR2 mutado aumenta la
activación de Runx2, el cual se comporta como un factor transcripción esencial que
interviene en osteoblastogénesis. Del mismo modo la activación de PKC también se ha
encontrado relacionado con la activación de Runx2 en células mesenquimales y
osteoblastos (84).
La vía del fosfatidil inositol 3 fostato quinasa (PI3K) participa en el control de la
osteoblastogenesis mediada por FGF, promoviendo la proliferación de células
progenitoras y su diferenciación de forma similar a ERK 1 y 2 (7,13). Estos resultados
ponen de relieve las múltiples vías de señalización que pueden mediar los efectos
positivos de FGF/FGFR (85).
Otras proteínas relacionadas con la vía de señalización FGF/FGFR es BMP-2 (bone
morphogenic protein 2) la cual se relaciona principalmente con crecimiento endocondral,
encontrándose también regulado a la alta in vivo después de aplicación de FGF2 en
huesos craneales a través de la expresión Runx2 (86).
FGF2 también participa como un determinante crítico de la masa ósea mediante la
modulación de la señalización vía Wnt-B-Catenina en ratones (5,87). Esta vía se ha
relacionado con el cierre de las suturas craneales, ya que la activación de la señalización
causa un cierre prematuro (72,88). Varios estudios han mostrado que en los procesos de
craneosinostosis desencadenados por la activación de FGFR2 mutados se promueve la
diferenciación de los osteoblastos a través del aumento de Runx2 evidenciándose en la
expresión de genes marcadores de osteogénesis (79,84,89). Así, Runx2 puede cooperar
en esta vía controlando la proliferación de osteoblastos y su diferenciación mediante la
regulación de los componentes de la matriz extracelular como los GAG y los
proteoglicanos (13).
Finamente se ha asociado TWIST1 como un factor de transcripción para la diferenciación
celular que interfiere con la señalización FGF durante la formación ósea (90). Se
reconoce su papel en el control de FGFR2 por una interacción directa no claramente
dilucidada contribuyendo así al cierre prematuro de las suturas coronales (90,91).
Marco Teórico 16
3.3.7 Matriz Extracelular
La osificación intramembranosa propia de las suturas craneales depende de la
diferenciación a osteablastos por un proceso de maduración de las células
mesenquimales (92). Este proceso se relaciona con un programa de expresión que
regula la proliferación diferencial y la mineralización de la matriz ósea, donde participan
señales paracrinas, autocrinas y hormonales así como interacciones de receptores y
ligandos con elementos de la matriz extracelular (93).
Los animales defectuosos en la biosíntesis de los GAGs tienen una perdida completa de
la señalización FGF/FGFR (94,95). En el caso particular de FGFR2, se ha demostrado
que las moléculas de MEC tipo HS, son indispensables su interacción con el respectivo
ligando (95,96).
Se ha demostrado in vitro que fibroblastos obtenidos de periostio de pacientes Apert,
presentan un aumento de GAG de tipo Acido hialurónico (HA), Heparan sulfato (HS),
Condroitin sulfato (CS) y Dermatan Sulfato (DS) secundario a estímulos dependientes de
un desequilibrio entre IL 1 y 6 y TGFB-1 (97), observando que los factores locales que
regulan la producción de la MEC son el Factor de crecimiento transformante B (TGF-B),
las interleuquinas (IL) y los FGF.
En otro estudio, Carinci et al, en el mismo tipo de tejidos describió alteraciones en la
producción de moléculas de la MEC con una sobreexpresión de GAGs, especialmente
HS, además de fibronectina y colágeno, junto con una disminución paralela en la
actividad de enzimas como proteasas, glicosidasas y metaloproteasas implicadas en la
degradación de la MEC y en el proceso de remodelamiento craneal (23).
Con estas múltiples se postula que las características clínicas pleiotrópicas en pacientes
con SA, deben explicarse en el contexto de las mutaciones puntuales y de su compleja
interacción con proteínas de MEC, tipo HS (12,14,15,23,58).
3.3.8 Degradación de Heparán Sulfato Los proteoglicanos son proteínas altamente glicosiladas que se encuentran expresadas
predominantemente en osteoblastos e interactúan funcionalmente con ligandos
17 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
osteogénicos, como por ejemplo FGF2/bFGF, BMPs, WNTs) (98–100). Los GAGs
unidos a estas proteínas potencian la señalización intracelular por medio de su habilidad
de unir diferentes ligandos y de soportar complejos ternarios extracelulares entre
proteoglicanos, ligandos y receptores (13). Modificaciones químicas en los motivos de
azúcares pueden controlar la especificidad de las interacciones y regular la eficiencia de
la señalización (101,102).
El HS es uno de los principales GAGs de la MEC e interviene en la formación de huesos,
cartílagos, tendones, cornea, piel y tejido conectivo además del líquido sinovial. Es una
molécula negativamente cargada, con una formación extendida que brinda alta
viscosidad a las soluciones y está formado por la unión de α-glucosamina (sulfatada o
acetilada), ácidos idurónico y glucorónico (97,103). La degradación del Heparán Sulfato
(HS) se realiza mediante la acción de enzimas tipo glicosidasas, sulfatasas y una N-
acetiltransferasa. Las tres enzimas que participan en la degradación del heparán sulfato
son: α-L-iduronidasa (EC 3.2.1.76), L-iduronato-2-sulfatasa (EC 3.1.6.13) y Heparán N-
Sulfatasa (EC 3.10.1.1), en una vía común que permite la degradación de otros tipos de
GAGs (104–106). Debido a que la mayoría de los GAGs en el cuerpo están unidos a
proteínas centrales y forman los denominados proteoglicanos o Mucopolisacaridos (107),
alteraciones de estas enzimas producen enfermedades de depósito lisosomal como las
Mucopolisacaridosis (MPS). Para el caso de las MPS tipo I, II y IIIA, se ha observado un
incremento en las concentraciones de varios GAGS, pero especialmente HS, DS y CS.
En el momento existen en el mercado formas sintéticas de α-L-iduronidasa
(ALDURAZIME®), L-iduronato-2-sulfatasa (ELAPRESE®) y la Heparan sulfatasa
(Medicamento en fase II, bajo el Brand de SHIRE Inc.) las cuales vamos a emplear en
este estudio, para incrementar la degradación de HS.
Metodología 18
4. Metodología
4.1 Fase Pre-analítica Este es un estudio de intervención, de tipo experimental, diseñado para proporcionar
evidencia contundente que juzgue la existencia de una relación de causalidad entre una
exposición y un efecto. Este estudio en particular, utilizó muestras de tejido fibroblástico
subperióstico de 3 pacientes con Síndrome de Apert con las mutaciones P253R y
S252W, las cuales fueron expuestas a Idursulfase® con el fin de degradar Heparán
Sulfato (HS) y comprobar si existía alguna repercusión positiva sobre la evolución
fenotípica de la enfermedad, específicamente en lo relacionado a la osificación prematura
de la sutura craneal coronal. Se decidió usar un tamaño de muestra a conveniencia.
4.1.1 Toma de muestras Previa aprobación por comité de ética institucional y firma del consentimiento
informado por los tutores de los pacientes se procedió a la toma de muestra de sangre
y del material óseo. La toma de la muestra de calota se realizó al momento de la
cirugía de corrección de craneosinostosis o en un tiempo quirúrgico secundario. Se
abordó por incisión coronal hasta el plano subgaleal, se detectó la zona de sinostosis
y se marcó un rectángulo que involucro suficiente tejido y se tuvo el cuidado de tomar
periostio adherido a hueso justo en la sutura sinostosada con un craneótomo. La
muestra fue recolectada en un tubo falcón estéril que contenía 5 ml de MEM, con
suero fetal bovino y antibiótico y se envió al laboratorio, mientras se continuó con la
cirugía planeada en forma rutinaria, esta información es tomada del cirujano
colaborador en el proyecto, el Dr. Rolando Prada en el Hospital infantil universitario
San Jose.
19 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
4.1.2 Recolección de Información La información recolectada para el diseño y ejecución del proyecto, fue extraída de
diferentes recursos bibliográficos provenientes de variadas bases de datos, tales
como PubMed, Science Direct, Free Medical Journals y Medline. Una vez generada la
búsqueda con diferentes palabras claves, como por ejemplo Apert Syndrome,
Heparan Sulfate, Glycosaminoglycans, FGFR2, FGF y osteoblastic differentiation,
entre otras, se procedió a filtrar la información de acuerdo a la pertinencia del
“abstract” para el proyecto. Finalmente, después de la lectura de los artículos
escogidos, se determinó cuáles eran relevantes y cuáles se incluirían en el marco
teórico y en la metodología del proyecto.
4.1.3 Recolección de Datos Los datos generados a partir de los cultivos celulares fueron obtenidos de fuentes
primarias de información, usando métodos experimentales tales como PCR y RFLP
para identificación de las mutaciones en el gen FGFR2, espectrofotometría para
cuantificación de glicosaminoglicanes, ensayos de linealidad celular y para
determinación de citotoxicidad y exposición a Idursulfase® de los cultivos celulares,
extracción de RNA total, inmunofluorescencia para identificación de la línea celular
(fibroblastos), microarrays de expresión para determinar la existencia de genes a la
alta o baja, ubicados corriente abajo de la vía de señalización de FGF/FGFR2 y genes
de matriz extracelular. Finalmente se utilizó la técnica de qRT-PCR para verificación
de datos del microarray. Así, diferentes variables de interés se manipularon bajo
condiciones controladas, realizando tres réplicas biológicas por cada experimento,
esperando encontrar diferencias significativas entre el tejido tratado y el no tratado.
Adicionalmente, otros datos, tales como la información personal de los participantes
del estudio fueron recolectados por medio de entrevistas con sus padres o tutores.
Metodología 20
4.2 Fase Analítica
4.2.1 Consentimiento Informado Previa aprobación del consentimiento informado por el Comité de Ética Institucional de
la Universidad Nacional y de la Fundación universitaria de ciencias de la salud FUCS,
se procedió a la firma del mismo por el paciente, los padres o tutores del paciente
menor de edad y el asentimiento del menor según fue el caso y se procedió a la toma
de muestra de sangre, orina y de tejido subperióstico en algún tiempo quirúrgico que
involucraba la corrección de la craneosinostosis. El formato del documento se
encuentra adjunto en el Anexo A.
4.2.2 Análisis de mutación en FGFR2 y expresión de isoforma mesenquimal (FGFR2IIIc)
Se realizó extracción de ADN a partir sangre periférica usando el kit Ultraclean
Isolation Kit® Mobio. Posteriormente se realizó PCR al cDNA de los pacientes, usando
los primers descritos por Fanganiello et al., para la amplificación de un fragmento de
386 pb del gen FGFR2 y que determina la presencia de la isoforma FGFR2IIIc (Primer
forward: 5′-agtgtggtcccatctgacaag-3′ y Primer Reverse: 5′-atagaattacccgccaagcac-3′)
(108). Las condiciones de amplificación incluyeron 35 ciclos de amplificación y una
temperatura de anillaje de 58ºC. Los productos fueron revelados en un gel de agarosa
al 2,0% usando un marcador de peso molecular de 100pb (Thermo Scientific® Life
Technologies). La presencia de las mutaciones S252W y P253R en el gen FGFR2
fueron evaluadas mediante RFLP usando las enzimas Bgl II y MboI, respectivamente.
Los productos de la reacción fueron observados en un gel de poliacrilamida al 9%
utilizando un marcador de peso molecular de 25 pb (Thermo Scientific® Life
Technologies).
4.2.3 Cultivos celulares Se continuó con la realización del cultivo celular de los fibroblastos subperiósticos de 3
individuos con SA. El explante obtenido de cada paciente fue disgregado en
segmentos de aproximadamente 2 a 3mm, colocado en medio de cultivo DMEM®
suplementado con suero fetal bovino al 10% más antibiótico Peniclina/Estreptomicina
al 1% a 37ºC y 5% de CO2, el crecimiento de los fibroblastos fue monitoreado
21 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
mediante observación del cultivo celular en microscopio invertido. Una vez se obtuvo
confluencia de 70-80% se realizó subcultivos (máximo 5) con el fin de obtener la
concentración de células necesaria para los experimentos. Toda la población celular
obtenida fue usada para los ensayos diseñados en el experimento.
4.2.4 Densidad celular y ensayo de linealidad celular Con el fin de conocer cuál era la densidad óptima para realizar los experimentos se
realizó un ensayo de densidad y linealidad celular. Para esto las células fueron
sembradas en cajas de micro titulación de 96 pozos en densidades desde 500 a
30,000 células por pozo, en volumen de 100 µL, durante 24 h y 48h. Las células
fueron sometidas a tinción con Resarzurina (4.4 µm) y la producción de color fue
evidenciada por lectura a una longitud de onda de 530nmex y 590nmex en un lector
de placas TECAN GENios para poder establecer el rango, en relación lineal, entre la
densidad celular y la absorbancia, cercano a 530nm que, en adelante, se empleó
como la densidad celular de trabajo.
4.2.5 Determinación de la citotoxicidad del fármaco Idursulfase® y Ensayo de exposición a cultivos primarios
En placas de cultivo de 48 pozos se sembraron 30.000 cels/pozo en un volumen de
200µL/pozo de DMEM suplementado, con un tiempo de incubación de 24h. Luego se
prepararon cinco diluciones con Idursulfase® del rango de 2*10-1 mg/ml hasta 2*10-4
mg/ml de las cuales se agregaron 200µL en pozos individuales. Como control de
crecimiento se usaron células sin tratamiento, como blanco se usó un pozo con medio
de cultivo sin células y como control positivo Taxol (1µM). La viabilidad celular fue
evaluada a las 24 y 48 pos-tratamiento mediante el ensayo Resarzurina (4.4 µm). A
partir de esto se determinaron las curvas de concentración y los porcentaje de
supervivencia, se construyó la curva dosis-respuesta y se calcularon las
concentraciones inhibitorias 50 (IC-50) del tratamiento para cada cultivo celular,
empleando una regresión no lineal en el programa estadístico GraphPad-Prism 6*
(GraphPad Software, USA). Cada tratamiento se realizó por triplicado y al menos dos
experimentos independientes con resultados consistentes, en semanas diferentes.
Metodología 22
Con el fin de imitar el estado de activación del receptor de activación del FGFR2
mutado, se sembraron en cajas de 6 pozos 80.000 células por pozo en 1.600 µL de
medio DMEM suplementado con FGF2 (0,069ng/uL) durante 24 horas, posterior a
esto se retiró el medio de cultivo de los pozos que serían destinados a tratamiento con
Idursulfase® y se les agregó DMEM suplementado más Idursulfase® a una
concentración de 0.025mg/ml según lo reportado en la literatura (109), dado que no
existieron diferencias con las diferentes concentraciones usadas en el ensayo anterior.
A los pozos usados para control sólo se les agregó DMEM suplementado. Las células
fueron incubadas durante 48 horas para proceder a la extracción de RNA total.
4.2.6 Determinación de Inmunofenotipo por Epi-Inmunofluorescencia
Se tomó una alícuota de 40.000 cels/pozo de cada cultivo celular, se sembró en
placas de 12 pozos que contenían láminas cubreobjetos y se incubó durante 24 horas
en medio DMEM suplementado con SFB 10%. Pasadas 24 horas, las células se
fijaron con Paraformaldehído 4% (vol/vol) y se permeabilizaron con Tritón X-100 al
0,5% (vol/vol). Se adicionó una solución de Cloruro de Amonio (NH4Cl) 50mM mas
Glicina 0,1 M por 30 minutos a temperatura ambiente y se agregó 4’,6-diamidino-2-
phenylindol (DAPI) 0.1µg/mL durante 30 minutos, protegido de la luz. Finalmente, se
incubaron con un anticuerpo primario monoclonal Anti-Fibroblast activation protein
alpha (5 µg/mL; AB28244: Abcam ®) durante 1 hora a 37°C protegido de la luz. Para
su visualización, las láminas cubreobjetos con las células teñidas fueron montadas en
un microscopio invertido de escaneo láser confocal Nikon C1, Software EZ-C1.
4.2.7 Extracción de RNA total El RNA total de cada uno de los cultivos pos tratamiento se extrajo usando el kit de
extracción, RNeasy® Mini Kit (74104: Quiagen ®) según condiciones del fabricante.
Posteriormente se cuantificó con el Quibit® RNA Assay Kit (Q32852: Invitrogen®) y se
almacenó a -80°C hasta iniciar el proceso de retrotranscripción. La pureza e integridad
del RNA usado fueron evaluadas usando el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent
Technologies, Palo Alto, USA).
23 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
4.2.8 Ensayos de Microarray Dado el alcance sobre transcriptoma (~46.000 transcritos) se eligió para este estudio
el Array GeneChip Human Gene ST 2.0 (Whole transcriptome, Affymetrix®). El
proceso metodológico se llevó a cabo de acuerdo a instrucciones del fabricante
(GeneChip Whole Transcript PLUS reagent Kit). El cDNA sense fue fragmentado y
marcado con biotina empleando TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) y usando
el kit GeneChip WT Terminal labeling. Aproximadamente 5.5 µg de DNA target
marcado fue hibridizado al GeneChip a 45°C por 16 horas. Los arrays hibridizados
fueron lavados y teñidos en la estación de fluídica para GeneChip 450 y escaneados
en el Escáner GCS3000 (Affymetrix). Los valores de señal fueron computados
usando el software GeneChip™ Comand Console®.
Los datos crudos fueron extraídos automáticamente usando el protocolo de extracción
de datos incluido en el software. Después de importar los archivos CEL, los datos
fueron resumidos y normalizados usando el método de RMA implementado en el
software Affymetrix® Expression Console™ Software (EC). Se exportaron los
resultados usando el análisis de RMA de nivel de gen y se realizó el protocolo para la
determinación de genes diferencialmente expresados (DEG). La significancia
estadística de los datos de expresión fue determinada usando “fold change”. Para
cada set DEG, el análisis jerárquico de clusters fue realizado usando “Complete
Linkage and Euclidean distance” como medidas de similitud. El análisis de
enriquecimiento de genes y de anotación funcional fue realizado usando DAVID
(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp). A cada término le fue asignado un score
(EASA), que consiste en el p-value modificado por el Test Exacto de Fisher. Si el
valor era menor a 0.05 fue clasificado como enriquecimiento.
4.2.9 Análisis de la expresión génica diferencial mediante qRT-PCR
A partir de una cantidad cercana a los 200 ng de ARN total se realizó el proceso de
retrotranscripción con el kit SuperScriptTM III Reverse Transcriptase (Invitrogen®) y el
cADN resultante se usó para el desarrollo de una PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-
PCR) para la determinación de los cambios en la expresión génica de 10 genes de
Metodología 24
interés identificados en el análisis de Microarray relacionados con los procesos biológicos
y moleculares de mayor importancia en lo reportado previamente en la fisiopatología de
la enfermedad. Los primers fueron diseñados usando el programa Primer 3 (versión
0.4.0) (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) (Tabla 1). GADPH fue usado como gen
referencia para normalizar los datos de los genes evaluados debido a que fue el gen de
referencia más estable entre los valorados para este estudio en particular. Los primers
también fueron diseñados como se explicó previamente. Las reacciones fueron
realizadas en el equipo Lighcycler 96 (Roche) utilizando SyberGreen Master Mix (Applied
Biosystems). Todos los ensayos fueron realizados por triplicado y con mínimo dos
réplicas por ensayo para estimar la variación. Los niveles de expresión se determinaron
mediante cuantificación relativa utilizando el método ΔCt (110). Los datos fueron
expresados como las veces de expresión de las células tratadas en relación a las células
sin tratamiento.
Tabla 1 Secuencia de primers usados en experimentos de qRT-PCR
GEN PRIMER FORWARD PRIMER REVERSE
SFRP2 ACGGCATCGAATACCAGAAC GCTGGATGGTCTCGTCTAGG
FGFBP3 AGGCACTGCAGTCTCCAACT TAATTGCACCACTGCTCCAG
MMP1 GGTCTCTGAGGGTCAAGCAG AGTTCATGAGCTGCAACACG
BMP4 TGGAATGACTGGATTGTG ATGGTTGGTTGAGTTGAG
CCL4 GTATGACCTGGAACTGAAC CTGAGTATGGAGGAGATGT
CDH3 AACCTCCACAGCCACCATAG GTCTCTCAGGATGCGGTAGC
HHIP TGATTTCACAGGCTCAGTGC TGGGATGTCTATCCACAGCA
PCDH10 GTTCCTGGCATGGACTCTGT TAAGGCGCTCGCGTATTAGT
PTPRB TGGGAACAAAACGTTCACAA TGCATCAAGCTGTTCCTCAC
COL1A1 TGACCTCAAGATGTGCCACT ACCAGACATGCCTCTTGTCC
GADPH CACCAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTA CCTTGACGGTGCCATGGAATTTGC
25 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
4.2.10 Análisis bioquímico: cuantificación de Heparán Sulfato y actividad enzimática de IDS e IDUA en orina, sangre y tejido.
Para la cuantificación de la actividad enzimática de Alfa L Iduronidasa (IDUA) e
Iduronato 2 Sulfatasa (IDS) se realizarán los protocolos establecidos para estudios de
MPS tipo I y II. Estas mediciones se harán en sangre periférica y en los cultivos sin
tratamiento. Se realiza la cuantificación de GAGs en orina de los pacientes mediante
la metodología de ensayo espectrofotométrico usando dye dimethylmethylene blue.
Además se realiza una electroforesis de MPS en dos dimensiones para diferenciar los
diferentes GAGS. Muestra: 3 muestras de orina fraccionadas en un periodo de ocho
horas. Lugar: Centro de investigaciones en Bioquímica (CIBI). Universidad de los
Andes. Bogotá – Colombia.
4.3 Tratamiento Estadístico Todos los análisis de datos y visualización de los genes expresados diferencialmente
fueron realizados usando R 3.1.2 (www.r-project.org). Los genes obtenidos en las
anotaciones funcionales fueron agrupados en clusters y se seleccionaron aquellos que
presentaron un fold change de ⏐2⏐ y un p valor significativo. Las correcciones del p valor
para la significancia estadística de los hallazgos fue realizada con los test de Bonferroni,
Benjamini y FDR.
Resultados 26
5. Resultados
5.1 Identificación del Fenotipo Celular Después de cultivar el explante de tejido perióstico de los pacientes con SA para obtener
el cultivo primario, se procedió a congelar una parte del mismo con el fin de preservar la
muestra en este estadio. Los cultivos realizados y su evolución se resumen en la tabla 2.
Al observarse al microscopio una confluencia del 70-80%, los células presentaban una
morfología fibroblastoide, con una distribución homogénea sobre la superficie del frasco
para cultivo celular T-25 (Figura 1) y no se encontró ningún tipo de aglutinamiento celular.
Para alcanzar este nivel de confluencia fueron necesarias aproximadamente 4-6
semanas. Después del quinto a décimo pase las células empezaban rápidamente su
proceso de senescencia y su viabilidad disminuía significativamente. Cuando los
cultivos primarios eran descongelados, la velocidad de crecimiento y el tiempo de
viabilidad celular disminuían ampliamente comparados con los cultivos que no habían
sido congelados. Por otra parte, la tinción con el anticuerpo AFP evidenció una tinción
homogénea en la superficie celular, producida por la presencia de la proteína de
activación anti-fibroblasto en el cultivo, sin encontrarse otro grupo celular presente
(Figura 2).
27 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
Tabla 2 Cultivos usados en el estudio
NUMERO CULTIVO CELULAR ASIGNADO
FECHA ESTABLECIMIENTO CULTIVO
FECHA DE PRIMER PASE
OBSERVACIONES
1 08/08/14 16/08/14 Se descarta. Muestra invalida posterior a tripsinización.
2 18/08/14 02/09/14
3 09/08/14 16/10/14
4 30/08/14 02/09/14
Usado en experimentos, corresponde a paciente 1. Proceso de congelamiento y descongelamiento invalido. No se cuenta con muestra
5 17/08/14 20/10/14 No fue posible obtener densidad celular deseada.
6 19/12/14 24/12/14
Usado como control basal de los experimentos. Proceso de congelamiento y descongelamiento invalido. No se cuenta con muestra
7 No establecido --------------- Muestra no prolifera a 4 semanas de observación
8 07/04/15 19/04/15 Usado en experimentos, corresponde a paciente 2
9 No establecido --------------- Corresponde a controles sanos que se requiere para calibración de metodología de mediciones bioquímicas sobre tejido. Muestras no proliferan a 4 semanas de observación
10 No establecido ---------------
11 No establecido ---------------
12 24/11/15 01/12/15 Corresponde a paciente 3
13 13/12/15 06/01/16
Corresponde a control sano, muestra de cráneo de adulto, que se requiere para calibración de metodología de mediciones bioquímicas sobre tejido.
14 10/01/16 28/01/16
Corresponde a control sano, muestra de cráneo de niño, que se requiere para calibración de metodología de mediciones bioquímicas sobre tejido.
Resultados 28
Figura 1 Observación microscópica aleatoria de expansión celular en primer pase de cultivo celular primario de fibroblastos de perioistiio de pacientes con SA. Agosto de 2014. Visualización 10X.
Figura 2 Epi-inmunofluorescencia cultivo 008: se observa tinción positiva color verde (lado izquierdo) para Ac dirigido a APF de superficie celular, al compararse con tinción para núcleo celular DAPI color azul (lado derecho)
29 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
Finalmente, se determinó la existencia de la isoforma FGFRIIIc del receptor en las
células subperiósticas cultivadas, al realizar una PCR convencional con primers
específicos para la misma (Figura 3).
Figura 3 Electroforesis de amplificación de fragmento de 286pb de la isoforma mesenquimal FGFR2IIIc. Carriles 1, 3, 5, 7 corresponden a muestras de control positivo y pacientes con tratamiento con Idursulfase®. Carriles 2, 4, 6 y 8 corresponden a muestras sin tratamiento. Carril C- corresponde a control negativo
5.2 Identificación del Fenotipo Celular Los perfiles de restricción obtenido por la técnica RFPL comprobó la presencia de las dos
mutaciones más reportadas para SA. En este caso, de los 3 pacientes que participaron
en el estudio, 2 (66%) presentaron la mutación S252W y 1 (33%) la mutación P253R
(figura 4).
Resultados 30
Figura 4 4A: Perfil mutacional de tres cultivos celulares fibroblásticos con la enzima Bgll. Amplificación del fragmento ubicado en el exón 7 de FGFR2 (376pb) en tres muestras de ADN proveniente de los cultivos celulares evaluados (Gel a la izquierda). Perfil de restricción de la enzima BgII para la detección de la mutación P253R en geles de poliacrilamida al 9%, la muestra del paciente 1 es positivas para la mutación P253R y por lo tanto presenta una banda de bajo peso molecular (±300bp) (Gel a la derecha). MP: Marcador de peso; C+: Muestra control positiva para la mutación; 002-004: muestras cultivo celular, 004 corresponde al cultivo del paciente 1 (AP1); C-: DNA negativo de la mutación. 4B: Perfil mutacional en una muestra de sangre con la enzima MboI. Amplificación del fragmento ubicado en el exón 7 de FGFR2 (376pb) en ADN proveniente de muestra de sangre de Paciente 2 (AP2) rotulada como cultivo 008 y controles positivos propios (Gel a la izquierda). Perfil de restricción de la enzima MboI para la detección de la mutación S252W en geles de poliacrilamida al 9% Se observa una banda en 476pb que indica la presencia de la mutación (Gel a la derecha). MP: Marcador de peso; C+: Muestra control positiva para la mutación; 25-12: muestra de DNA de paciente 2; C-: DNA negativo de la mutación. 4C: Perfil mutacional en una muestra de sangre con la enzima MboI. Amplificación del fragmento ubicado en el exón 7 de FGFR2 (376pb) en una muestra de ADN proveniente de paciente 3 (AP3) rotulado como cultivo celular 012 y controles positivos propios (Gel a la izquierda). Perfil de restricción de la enzima MboI
MP CP+ AP12 CN-
Patrón electroforético compatible con mutación S252W, banda de 476pb.
4A
4B
4C
31 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
para la detección de la mutación S252W en geles de poliacrilamida al 9%, Se observa una banda en 476pb que indica la presencia de la mutación (Gel a la derecha). MP: Marcador de peso; C+: Muestra control positiva para la mutación; AP12: muestra cultivo celular 012, paciente 3; C-: DNA negativo de la mutación.
5.3 Análisis bioquímico: cuantificación de Heparán Sulfato y actividad enzimática de IDUS e IDUA en orina, sangre y tejido subperióstico craneal.
Se realizó la cuantificación de HS y de las enzimas degradadoras de glicosaminoglicanes
para todos los pacientes. La muestra del primer paciente, de sexo masculino (004) de
una año de edad consistió en tejido celular ya que no se contaba con muestras de sangre
y orina porque el paciente falleció inmediatamente después de la intervención quirúrgica.
Se calibran resultados con fibroblastos gingivales (FG) de línea celular como control sano
(Tabla 3).
Tabla 3 Actividad enzimática de IDS e IDUA en tejido de paciente 004
Enzima Resultado Control FG Alfa-L-Iduronidasa 15.5 12.04 Iduronato Sulfatasa 6.92 13.05
La muestra paciente 008 de 3 años de edad y sexo femenino consistió en sangre y orina
para determinar la cuantificación enzimática en leucocitos y la cuantificación de
mucopolisacáridos en orina (Tabla 4), las cuales presentan una ligera elevación Alfa-L-
Iduronidasa en sangre y normalidad en la cuantificación de mucopolisacáridos. No se
logró obtener suficiente cantidad celular para el ensayo de la actividad enzimática en
fibroblastos.
Resultados 32
Tabla 4 Resultado de cuantificación enzimática en leucocitos, cuantificación de Heparán sulfato y actividad enzimática de IDS e IDUA en orina, sangre y tejido
Enzima Resultado Valor de referencia
Alfa-L-Iduronidasa 19.4 4-16nmol/mg-Proteína/hora
Iduronato Sulfatasa 18.28 9.5-35.2 nmol/mg-Proteína/hora
Muestra Creatinuria mg/dL Unidades CPR/gramo de creatinina
ALCIAN BLUE mg de GAG/mol de creatinina
1 56.8 209.37 15.96 2 23.55 78.63 14.69 3 15.45 52.15 17.17
Valor referencia Hasta 228 Hasta 19.8
Finalmente, los resultados en sangre total y orina para estos mismos análisis en el
paciente 3 (012), de 8 años de edad y sexo masculino, resultaron normales (Tabla 5). No
se logró obtener suficiente cantidad celular para el ensayo de la actividad enzimática en
fibroblastos.
Tabla 5 Resultado de cuantificación enzimática en leucocitos cuantificación de heparán sulfato y actividad enzimática de IDS e IDUA en orina, sangre y tejido
Enzima Resultado Valor de referencia
Alfa-L-Iduronidasa 13.8 4-16nmol/mg-Proteína/hora
Iduronato Sulfatasa 32.02 9.5-35.2 nmol/mg-Proteína/hora
Muestra Creatinuria mg/dL Unidades CPR/gramo de creatinina
ALCIAN BLUE mg de GAG/mol de creatinina
1 130.42 91.81 8.58 2 102.1 58.37 6.01 3 17.66 7.52 7.87
Valor referencia Hasta 161 Hasta 9.1
33 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
5.4 Evaluación del efecto citotóxico del fármaco Idursulfase®
Con el fin de estandarizar la concentración celular necesaria para trabajar en los
experimentos de exposición al fármaco Idursulfase®, se realizó un ensayo de linealidad
celular, por medio del cual se determinó un incremento directamente proporcional en la
reducción de Resazurina al aumentar la densidad celular sembrada por pozo. La figura 5,
indica un fuerte grado de correlación existente (R2 >0.98), indicando un ajuste alto al
modelo de regresión lineal, entre las variables de número de células sembradas y la
respuesta en unidades relativas de fluorescencia (URF). Esta regresión no es
dependiente de la carga mutacional del cultivo. De otra parte, con microscopio invertido
se estableció que la densidad de 30.000 células/pozo presenta un estado de confluencia
cercano al 80%, 72 horas después de la inoculación (24 horas de incubación previa a la
adición del fármaco más 48 horas de exposición), razón por la cual esta es la densidad
escogida para realizar experimentos subsecuentes, debido a que es necesario mitigar la
variación de los resultados por desprendimiento de la monocapa celular (figura 5).
Figura 5 Intensidad de la fluorescencia media (URF) al evaluar seis densidades celulares en los cultivos FIBRO CONTROL y FIBRO APERT durante un periodo de 48 horas. n=6
Después de las 48 horas de tratamiento con Idursulfase®, la viabilidad y el crecimiento
del cultivo celular no se vieron afectados; al contrario, después de este tiempo, el cultivo
fibroblástico aumentó su tasa de crecimiento y la viabilidad se mantuvo. En contraste, el
efecto del Taxol produjo una tasa de mortalidad celular del 90% (figura 6).
Resultados 34
Figura 6 Curvas de supervivencia de los cultivos celulares FIBRO AP y FIBRO CONTROL. Las células se sembraron a una densidad de 30000 (cels/pozo) en cajas de cultivo de 48 pozos. 24 horas después, las líneas celulares FIBRO AP (Izquierda), y FIBRO CONTROL (Derecha) se sometieron a exposición del fármaco Idursulfase® en diferentes concentraciones (0.2, 0.02, 0.002, 0.0002 y 0.00002 mg/ml). Se realizó lectura 48 post-tratamiento por el método de viabilidad con Rezasurina. Este experimento se realizó por duplicado. Como controles se empleó células sin tratamiento; pozos vacíos sin células, y como control positivo (muerte), células sometidas a Taxól (4 x10-1 µM).
5.5 Análisis de expresión diferencial por Microarray Se obtuvo con éxito RNA total a partir de las células fibroblásticas de pacientes con SA,
en condiciones basales y al ser expuestas al fármaco. Las mediciones se encuentran por
encima de 50ng/µL, dentro del rango necesario aceptado para comenzar el ensayo de
hibridación para el microarray. Se evaluaron 3 réplicas biológicas por paciente sin
tratamiento y con el tratamiento (Idursulfase®) (Tablas 6, 7 y 8)
Tabla 6 Cuantificación RNA muestras cultivos 004 y 006
Muestra Concent. Acidos Nucleicos Unidad A260 A280 260/280 260/230
004 rb1 st 264,8 ng/µl 6,621 3,175 2,09 1,04 004 rb1 e 338,7 ng/µl 8,469 4,076 2,08 1,27 004 rb2 st 327,2 ng/µl 8,181 3,949 2,07 2,01 004 rb2 e 342,7 ng/µl 8,568 4,144 2,07 1,7 004 rb3 st 195,5 ng/µl 4,887 2,349 2,08 0,57 004 rb3 e 196,4 ng/µl 4,909 2,388 2,06 1,83 006 rb1 st 135,9 ng/µl 3,399 1,59 2,14 0,2 006 rb1 e 113,8 ng/µl 2,845 1,372 2,07 0,58 006 rb2 st 161,9 ng/µl 4,047 1,926 2,1 0,3 006 rb2 e 128 ng/µl 3,201 1,533 2,09 0,41 006 rb3 st 184,6 ng/µl 4,616 2,24 2,06 1,4 006 rb3 e 185,2 ng/µl 4,631 2,22 2,09 0,49
050100
FIBROAP
050100
FIBROCONTROL
35 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
Tabla 7 Cuantificación RNA muestras cultivos 008
Muestra Concent. Acido Nucleico Unidad A260 A280 260/280 260/230
008 rb1 st 230,7 ng/µl 3,275 2,278 2,12 0,15 008 rb1 e 181,3 ng/µl 4,514 2,308 2,12 0,54 008 rb2 st 104,1 ng/µl 3,546 1,63 2,07 0,89 008 rb2 e 156,5 ng/µl 4,809 1,674 2,14 0,07 008 rb3 st 144,3 ng/µl 2,879 1,896 2,07 1,61 008 rb3e 124,9 ng/µl 2,965 4,042 2,22 0,05
Tabla 8 Cuantificación RNA muestras cultivos 012
Muestra Concent. Acido Nucleico Unidad A260 A280 260/280 260/230
012 rb1 st 63,35 ng/µl 8,475 1,028 5,68 0,47 012 rb1 e 229,23 ng/µl 6,423 2,54 2,07 1,07 012 rb2 st 136,23 ng/µl 4,123 1341 2,08 0,5 012 rb2 e 75,28 ng/µl 3,762 3,76 2,06 1,19 012 rb3 st 63,49 ng/µl 8,412 2,789 2,09 1,09 012 rb3 e 138,77 ng/µl 7,31 3,341 2,16 0,26
Una vez se obtuvieron los datos iniciales del micrroarray, al comparar la expresión génica
pos-tratamiento con Idursulfase® contra la expresión génica de las células sin
tratamiento, se encontraron 220 genes diferencialmente expresados en total: 101 a la alta
y 119 a la baja.
Posteriormente fue realizado el proceso de anotación por medio de la herramienta
bioinformática DAVID (versión 7.0), a partir de la cual los genes fueron agrupados en
clústeres de acuerdo a su función biológica. Con este nuevo filtro se encontraron 218
genes (a partir de los 220) con una función biológica conocida (Tabla 9), agrupados en
los siguientes categorías funcionales:
• Biogénesis o componentes de matriz extracelular (52 genes),
• Señalización intracelular (49 genes),
• Respuesta inflamatoria (21 genes),
• Regulación de la proliferación celular y apoptosis (21 genes),
Resultados 36
• Diferenciación celular (14 genes) y
• Moléculas de unión a glicosaminoglicanos (4 genes).
Resulta importante resaltar que algunos de los genes comparten clústeres y que, debido
al enfoque de este trabajo, se hará énfasis en el análisis de los genes asociados a
diferenciación celular y los que impacten directamente a esta categoría. En la Tabla 10
se relacionan los genes implicados en el proceso de diferenciación osteoblástica y que
cumplen funciones cruciales para el desarrollo de la craneosinostosis.
Tabla 9 Lista de genes diferencialmente expresados con su respectivo fold change. AP1, -2, -3: Valor de fold change; rojo: regulación a la alta; verde: regulación a la baja
Numero acceso Símbolo Nombre del gen AP1 AP2 AP3 p value
NM_001005484
OR4F5 Olfactory receptor, family 4, subfamily F, member 5
2,76 2,07 2,43 2,98E-04
NM_014357 LCE2B Late cornified envelope 2B 2,18 2,12 2,96 1,41E-04
NM_002966 S100A10 S100 calcium binding protein A10
2,58 2,07 2,40 2,46E-03
NM_001164586
IGFN1 Immunoglobulin-like and fibronectin type III domain containing 1
3,54 2,49 2,20 2,49E-03
NM_001178096
F3 Coagulation factor III (thromboplastin, tissue factor)
18,20 7,96 5,43 3,70E-03
NM_001001827
OR2T35 Olfactory receptor, family 2, subfamily T, member 11
2,87 2,26 2,74 7,81E-03
NM_024114 TRIM48 Tripartite motif containing 48 2,19 2,43 2,67 3,04E-02
NM_001004458
OR1S1 Olfactory receptor, family 1, subfamily S, member 1
2,10 2,35 2,21 1,02E-02
NM_002422 MMP3 Matrix metallopeptidase 3 (stromelysin 1, progelatinase)
2,38 2,43 2,43 2,71E-03
ENST00000553087
KRT6C Keratin 6C 2,24 2,04 2,36 1,02E-02
NM_002935 RNASE3 Ribonuclease, rnase A family, 3 2,57 2,47 2,60 1,99E-02
NM_003013 SFRP2 Homo sapiens secreted frizzled-related protein 2 (SFRP2
17,33 16,81 7,12 2,71E-13
NM_001145938
MMP1 Matrix metallopeptidase 1 (interstitial collagenase)
5,84 3,97 2,14 1,57E-20
NM_003554 OR1E2 Olfactory receptor, family 1, subfamily E, member 2
2,66 2,02 2,59 2,46E-04
NM_133475 ANKRD24 Ankyrin repeat domain 24 2,34 2,78 2,08 3,50E-04
NM_145276 ZNF563 Zinc finger protein 563 2,74 2,57 2,68 7,05E-03
NM_003014 SFRP4 Secreted frizzled-related protein 4
2,78 2,54 2,75 5,60E-04
NM_138330 ZNF675 Zinc finger protein 675 2,03 2,38 3,06 8,09E-03
NM_005924 MEOX2 Mesenchyme homeobox 3,94 2,94 2,16 1,85E-08
NM_001079 CFC1B Cripto, FRL-1, cryptic family 1B 2,36 2,09 2,27 1,57E-07
37 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
530
NM_001142351
ST6GAL2 ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 2
2,31 2,04 2,21 2,46E-04
ENST00000429538
PAX8 Paired box 8 2,07 2,06 2,91 3,50E-06
ENST00000437310
OR5H14 Olfactory receptor, family 5, subfamily H, member 14
2,96 2,76 2,87 2,46E-03
NM_003716 CADPS Ca++-dependent secretion activator
2,41 2,73 3,32 2,49E-03
NM_001302770
CSN2 Casein beta 2,58 2,94 2,91 9,63E-09
NM_019105 TNXB Tenascin XB 2,06 3,77 3,03 0,0082787
ENST00000466254
TRBC2 T cell receptor beta constant 2 2,12 2,12 2,46 0,00381862
ENST00000408906
OR2A5 Olfactory receptor, family 2, subfamily A, member 14
2,46 2,97 3,36 0,00620194
ENST00000390348
TRGV1 T cell receptor gamma variable 1
2,81 2,19 2,26 0,02531844
NM_000598 IGFBP3 Insulin-like growth factor binding protein 3
3,25 2,71 3,12 0,00643311
NM_006682 FGL2 Fibrinogen-like 2 2,92 3,38 2,31 0,00693147
NM_022573 TSPY2 Testis specific protein, Y-linked 2
2,01 2,70 2,56 0,00745442
AF111708 MSTO1 Misato 1, mitochondrial distribution and morphology regulator
2,19 2,28 2,49 0,00888039
ENST00000369175
FAM72C Family with sequence similarity 72, member C
2,71 2,16 2,33 0,02727223
NM_001100 ACTA1 Actin, alpha 1, skeletal muscle 2,19 2,17 2,64 0,00174779
NM_001135241
AKR1C2 Aldo-keto reductase family 1, member C2
2,21 4,03 2,68 0,00800633
NM_024114 TRIM48 Tripartite motif containing 48 2,11 3,56 2,42 1,59E-04
NM_001004739
OR5L2 Olfactory receptor, family 5, subfamily L, member 2
3,16 3,25 2,71 0,00165787
XR_432738 PRSS23 Protease, serine, 23 2,62 2,92 2,98 0,0034415
NM_001004740
OR5M1 Olfactory receptor, family 5, subfamily M, member 1
2,31 2,64 2,10 0,04752524
NM_176890 TAS2R50 Taste receptor, type 2, member 50
2,01 2,70 2,09 3,30E-04
ENST00000390585
IGHD2-8 Immunoglobulin heavy diversity 2-8
2,14 2,56 2,26 8,68E-04
ENST00000390598
IGHV3-7 Immunoglobulin heavy variable 3-7
2,53 2,24 2,31 0,03039373
ENST00000469461
CATSPER2// LOC101930343
Cation channel, sperm associated 2//uncharacterized LOC101930343
2,27 2,49 2,10 0,04445651
NM_002986 CCL11 Chemokine (C-C motif) ligand 11
2,11 2,32 2,16 9,63E-04
NM_001165252
KRTAP2-3 Keratin associated protein 2-3 2,78 3,06 2,33 0,02978834
NM_033059 KRTAP4-11 Keratin associated protein 4-11 2,91 3,12 2,13 0,00129305
NM_021013 KRT34 Keratin 34 2,58 2,22 2,35 0,00348018
Resultados 38
NM_002522 NPTX1 Neuronal pentraxin I 2,44 2,05 2,88 0,0108257
NM_001143818
SERPINB2 Serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 2
2,39 3,01 3,32 0,01240639
NM_001190441
LGALS16 Lectin, galactoside-binding, soluble, 16
2,08 2,86 2,04 0,0129595
NM_001289158
EMR3 Egf-like module containing, mucin-like, hormone receptor-like 3
2,38 2,72 2,20 0,02707838
NM_181621 KRTAP13-2 Keratin associated protein 13-2 2,36 2,18 2,30 0,0496378
NM_001080440
OTOL1 Otolin 1 2,47 3,06 3,35 1,49E-05
ENST00000296575
HHIP Hedgehog interacting protein 2,48 2,56 3,22 0,00217683
NM_144644 SPATA4 Spermatogenesis associated 4 2,65 2,66 2,53 0,00298018
NM_003536 HIST1H3H Histone cluster 1, h3h 2,51 3,02 2,64 0,01008408
ENST00000377050
UBD Ubiquitin D 3,15 3,04 3,37 0,01157834
NM_006900 IFNA13 Interferon, alpha 13 2,35 2,43 2,04 0,00981119
NM_176891 IFNE Interferon, epsilon 2,59 2,38 2,44 0,00633825
ENST00000529915
LPXN Leupaxin 2,64 2,09 2,90 0,00755223
NM_001882 CRHBP Corticotropin releasing hormone binding protein
3,75 2,39 2,92 0,01082954
NM_001099850
LOC391003 PRAME family member-like 3,05 3,02 2,26 0,01981219
ENST00000369851
GNAI3 Guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha inhibiting activity polypeptide 3
3,09 3,01 2,78 0,03396304
NM_178354 LCE1F Late cornified envelope 1F 2,15 2,69 2,17 1,86E-03
NM_020950 KIAA1614 Kiaa1614 3,03 2,33 2,12 7,01E-03
NM_001146344
PRAMEF11 PRAME family member 11 2,88 2,40 2,76 1,37E-07
NM_001289158
ADGRE3 Adhesion G Protein-Coupled Receptor E3
2,62 3,03 2,33 1,86E-03
NM_001001827
OR2T35 Olfactory receptor, family 2, subfamily T, member 35
2,48 3,00 2,48 1,04E-04
ENST00000523376
CALCB Calcitonin-related polypeptide beta
2,88 2,16 2,73 1,68E-04
NM_024081 PRRG4 Proline rich Gla (G-carboxyglutamic acid) 4 (transmembrane)
2,88 2,16 2,73 2,40E-09
NM_033180 OR51B2 Olfactory receptor, family 51, subfamily B, member 2
3,04 3,10 2,82 3,77E-05
ENST00000454832
SIK3-IT1 SIK3 intronic transcript 1 (non-protein coding)
2,30 3,03 2,32 4,28E-05
NM_002935 RNASE3 Ribonuclease, rnase A family, 3 3,19 2,59 2,15 1,22E-04
NM_182515 ZNF714 Zinc finger protein 714 3,02 2,55 2,70 1,31E-03
NM_006959 ZNF17 Zinc finger protein 17 2,80 2,80 2,55 5,08E-02
NM_001017920
DAPL1 Death associated protein-like 1 2,58 2,24 2,38 6,61E-05
NM_001163561
C2orf61 Chromosome 2 open reading frame 61
2,36 2,38 2,57 5,67E-06
39 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
ENST00000371328
FAM209A//FAM209B
Family with sequence similarity 209, member B
2,26 3,19 2,88 6,14E-04
ENST00000390302
IGLV2-33 Immunoglobulin lambda variable 2-33 (non-functional)
2,91 2,50 2,72 0,00191333
XM_005261590
GSTT2 Glutathione S-transferase theta 2
2,47 2,21 2,68 0,00207512
NM_001040448
DEFB131 Defensin, beta 131 2,46 3,02 2,31 7,94E-04
NM_054023 SCGB3A2 Secretoglobin, family 3A, member 2
2,59 2,11 3,02 5,04E-08
NM_001143957
GPR63 G protein-coupled receptor 63 2,55 2,77 2,74 5,45E-07
NM_001024678
LRRC24 Leucine rich repeat containing 24
3,20 2,13 3,05 2,74E-03
NM_005949 MT1F Metallothionein 1F 2,48 2,03 2,99 2,74E-04
NM_022661 SPANXC SPANX family, member C 2,89 2,53 2,97 4,96E-06
NR_024560 MAPT-IT1 MAPT intronic transcript 1 (non-protein coding)
2,32 2,35 2,29 7,49E-08
AK092813 IFIT1 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1
2,67 2,32 2,81 3,08E-06
NM_001005285
OR2AT4 Olfactory receptor, family 2, subfamily AT, member 4
2,91 2,54 2,63 8,43E-05
ENST00000390442
TRAV12-3 T cell receptor alpha variable 12-3
2,22 3,02 2,37 1,52E-10
ENST00000390598
IGHV3-7 Immunoglobulin heavy variable 3-7
2,45 3,07 2,77 2,96E-10
ENST00000390304
IGLV3-27 Immunoglobulin lambda variable 3-27
2,96 2,80 2,80 4,51E-06
NM_001270483
TST Thiosulfate sulfurtransferase (rhodanese)
2,30 2,24 3,04 5,67E-06
ENST00000507053
DDX46 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 46
2,66 2,80 3,14 9,12E-10
AK294939 DDX39B DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 39B//small nucleolar RNA, C/D box 84
2,48 2,65 2,36 6,06E-09
NM_001013736
FAM47C Family with sequence similarity 47, member C
2,61 2,71 2,32 4,35E-08
NM_000618 IGF1 Insulin-like growth factor 1 (somatomedin C)
10,09 6,80 5,40 5,19E-06
NM_002006 FGF2 Fibroblast growth factor 2 2,54 2,55 2,57 0,00104216
NM_001258038
SPRY1 Sprouty homolog 1, antagonist of FGF signaling
4,43 3,67 4,38 0,01456281
NM_004464 FGF5 Fibroblast growth factor 5 5,26 3,74 5,25 0,01154194
NM_002016 FLG Filaggrin -14,52
-6,99 -2,70 0,00105033
NM_001109754
PTPRB Protein tyrosine phosphatase, receptor type, B
-5,06 -3,62 -3,10 3,77E-15
NM_178134 CYP4Z1 Cytochrome P450, family 4, subfamily Z, polypeptide 1
-3,91 -3,08 3,90 2,74E-12
ENST00000371438
RUNX2 Runt-related transcription factor 2
-2,09 -2,63 -3,26 0,0110733
NM_001267585
FBXW10 F-box and WD repeat domain containing 10
-2,09 -2,06 -2,33 0,01154194
NM_001202 BMP4 Bone morphogenetic protein 4 - -3,36 -2,10 5,69E-11
Resultados 40
12,63
NM_152429 FGFBP3 Fibroblast growth factor binding protein 3
-3,20 -2,72 -2,07 2,74E-12
NM_001009611
PRAMEF4 PRAME family member 4 -2,01 -3,67 -3,59 0,00115843
NM_002900 RBP3 Retinol binding protein 3, interstitial
-2,47 -2,93 -2,22 0,00115843
NM_001271983
C11orf44 Chromosome 11 open reading frame 44
-2,51 -3,00 -2,89 1,34E-04
NM_001005288
OR51I1 Olfactory receptor, family 51, subfamily I, member 1
-3,26 -2,01 -2,28 1,36E-04
NM_001206631
TRIM64C Tripartite motif containing 64C -3,48 -2,09 -3,40 1,41E-04
NM_001193471
FOLH1 Folate hydrolase (prostate-specific membrane antigen) 1
-2,35 -2,12 -2,14 1,41E-04
NM_025208 PDGFD Platelet derived growth factor D -3,65 -2,39 -3,15 1,47E-04
NM_001135 ACAN Aggrecan -2,29 -2,18 -2,12 1,49E-04
NM_012360 OR1F1 Olfactory receptor, family 1, subfamily F, member 1
-2,21 -2,15 -2,41 1,50E-04
NM_001286075
ATP2A1 Atpase, Ca++ transporting, cardiac muscle, fast twitch 1
-2,06 -2,64 -2,54 1,53E-04
NM_001793 CDH3 Cadherin 3, type 1, P-cadherin (placental)
-2,29 -3,64 -2,11 5,08E-12
NM_001267585
FBXW10 F-box and WD repeat domain containing 10
-2,01 -3,18 -2,51 1,61E-04
NM_005623 CCL8 Chemokine (C-C motif) ligand 8 -2,21 -2,14 -2,21 0,00115843
NM_002984 CCL4 Chemokine (C-C motif) ligand 4 -2,10 -2,14 -2,16 3,34E-09
NM_138286 ZNF681 Zinc finger protein 681 -2,70 -2,76 -2,39 1,05E-08
uc002qeu.1 LILRA5 Leukocyte immunoglobulin-like receptor, subfamily A (with TM domain), member 5
-2,88 -2,96 -2,54 3,49E-09
NM_198694 KRTAP10-5 Keratin associated protein 10-5 -2,03 -2,62 -2,05 3,49E-09
NM_001084393
DDTL D-dopachrome tautomerase-like -2,52 -2,42 -2,03 1,52E-08
NM_177478 FTMT Ferritin mitochondrial -3,36 -2,32 -2,40 2,45E-08
NM_001190470
MTRNR2L2 MT-RNR2-like 2 -2,96 -2,81 -2,76 8,74E-09
NM_032532 FNDC1 Fibronectin type III domain containing 1
-2,36 -2,32 -2,40 8,95E-08
NM_001170692
CAGE1 Cancer antigen 1 -3,17 -2,26 -2,34 6,31E-08
ENST00000415525
MICA MHC class I polypeptide-related sequence A
-3,03 -2,68 -2,78 4,07E-08
NM_001039361
PRAMEF10 PRAME family member 10 -2,56 -2,42 2,57 4,95E-07
BC021276 IGHD Immunoglobulin heavy constant delta
-2,25 -2,71 -3,12 8,32E-08
NR_002931 CLEC4GP1 C-type lectin domain family 4, member G pseudogene 1
-2,92 -2,98 -2,38 9,17E-07
NM_145276 ZNF563 Zinc finger protein 563 -2,64 -2,10 -2,68 2,02E-07
NM_014219 KIR2DL2 Killer cell immunoglobulin-like receptor, two domains, long cytoplasmic tail, 2
-2,70 -3,09 -2,95 1,63E-07
41 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
ENST00000511306
POTEC POTE ankyrin domain family, member C
-2,56 -2,26 -2,71 3,20E-06
NR_036685 KRT19P2 Keratin 19 pseudogene 2 -2,24 -2,31 -2,32 2,88E-06
NM_000104 CYP1B1 Cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1
-2,49 -2,10 -2,55 3,83E-06
ENST00000387419
MT-TD Mitochondrially encoded trna aspartic acid
-2,32 -2,16 -2,27 3,02E-06
NM_001001963
OR2L8 Olfactory receptor, family 2, subfamily L, member 8
-3,06 -2,33 -2,26 2,55E-05
XR_246241 CYP4A1 Cytochrome P450, family 4, subfamily A, polypeptide 1
-2,12 -2,13 -2,84 1,16E-05
NM_052941 GBP4 Guanylate binding protein 4 -2,22 -2,35 -2,25 4,52E-05
ENST00000369175
FAM72C Family with sequence similarity 72, member C
-3,05 -2,88 -2,15 8,06E-06
NM_001201536
TAF1A TATA box binding protein (TBP)-associated factor, RNA polymerase I, A, 48kda
-3,01 -2,32 -3,02 3,04E-05
ENST00000316529
OR56B4 Olfactory receptor, family 56, subfamily B, member 4
-2,86 -3,04 -2,75 6,58E-05
NM_207645 C11orf87 Chromosome 11 open reading frame 87
-2,72 -2,20 -2,23 3,46E-05
NM_006982 ALX1 ALX homeobox 1 -2,81 -2,11 -2,82 8,58E-05
NM_004093 EFNB2 Ephrin-B2 -2,36 -2,18 -2,30 1,15E-04
NM_006456 ST6GALNAC2
ST6 (alpha-N-acetyl-neuraminyl-2,3-beta-galactosyl-1,3)-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 2
-2,34 -2,22 -2,55 6,46E-06
NM_005951 MT1H Metallothionein 1H -2,26 -2,08 -2,09 7,96E-05
NM_001220488
CDH13 Cadherin 13 -2,50 -2,61 -2,14 1,83E-04
NM_031957 KRTAP1-5 Keratin associated protein 1-5 -2,40 -2,57 -2,09 1,19E-04
NM_030967 KRTAP1-1 Keratin associated protein 1-1 -3,03 -3,03 -2,44 4,39E-05
NM_001165252
KRTAP2-3 Keratin associated protein 2-3 -2,32 -2,25 -2,56 2,62E-04
NM_001242907
TCEB3CL2 Transcription elongation factor B polypeptide 3C-like 2
-2,42 -2,24 -2,46 3,15E-04
AK303593 BST2 Bone marrow stromal cell antigen 2
-2,47 -2,22 -2,15 9,52E-05
NM_003430 ZNF91 Zinc finger protein 91 -2,41 -2,85 -2,60 3,58E-04
NM_001163561
C2orf61 Chromosome 2 open reading frame 73
-2,14 -2,86 -2,10 3,72E-04
ENST00000392701
GALNT3 Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 3
-2,88 -2,73 -2,22 2,05E-04
ENST00000446716
ATG9A Autophagy related 9A -2,21 -2,22 -2,23 6,25E-04
NM_198687 KRTAP10-4 Keratin associated protein 10-4 -2,52 -2,44 -2,89 7,41E-04
NM_003392 WNT5A Wingless-type MMTV integration site family, member 5A
-2,18 -2,38 -2,28 2,75E-04
NM_032961 PCDH10 Protocadherin 10 -2,52 -2,97 -3,03 1,69E-08
NM_001253727
RXFP1 Relaxin/insulin-like family peptide receptor 1
-2,47 -2,27 -3,11 0,00195225
Resultados 42
NM_000908 NPR3 Natriuretic peptide receptor 3 -3,12 -2,96 -2,16 0,00200613
ENST00000507053
DDX46 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 46
-3,06 -2,36 -3,06 0,00104385
ENST00000394409
PPP2R2B Protein phosphatase 2, regulatory subunit B, beta
-2,42 -2,14 -2,11 0,00227964
ENST00000314332
HIST1H2BG//HIST1H2BF //HIST1H2BE//HIST1H2BI// HIST1H2BC
Histone cluster 1, h2bg -2,14 -2,55 -2,54 0,00229002
NM_001293626
LOC93432 Maltase-glucoamylase (alpha-glucosidase)
-2,26 -2,40 -2,62 7,75E-04
NM_004840 ARHGEF6 Rac/Cdc42 guanine nucleotide exchange factor (GEF) 6
-3,00 -2,76 -3,01 0,0030292
NM_015869 PPARG Peroxisome proliferator-activated receptor gamma
-2,34 -2,45 -2,29 0,00149306
NM_000037 ANK1 Ankyrin 1, erythrocytic -2,25 -2,70 -2,80 0,00326132
NM_001190476
MTRNR2L4 MT-RNR2-like 4 -2,09 -2,39 -2,20 0,00372433
NM_144690 ZNF582 Zinc finger protein 582 -3,49 -3,89 -3,34 0,00392593
NM_018476 BEX1 Brain expressed, X-linked 1 -2,85 -2,39 -3,02 7,76E-04
BC064619 CD24 CD24 molecule -2,66 -2,26 -2,74 1,29E-04
NM_015849 CELA2B Chymotrypsin-like elastase family, member 2B
-2,54 -2,38 -2,29 1,08E-04
NM_001282588
SLAMF7 SLAM family member 7 -2,22 -2,19 -2,82 2,13E-04
NM_021186 ZP4 Zona pellucida glycoprotein 4 -2,45 -2,25 -2,33 1,13E-04
NM_001005186
OR6Q1 Olfactory receptor, family 6, subfamily Q, member 1
-2,10 -2,20 -2,29 3,97E-05
ENST00000451616
PGA5 Pepsinogen 5, group I (pepsinogen A)
-3,12 -2,86 -2,43 1,20E-04
NM_001005324
OR10V1 Olfactory receptor, family 10, subfamily V, member 1
-2,28 -2,55 -2,41 1,23E-04
ENST00000390438
TRAV8-4 T cell receptor alpha variable 8-4
-2,31 -2,43 -2,73 1,44E-04
NM_001204416
RGS6 Regulator of G-protein signaling 6
-2,59 -3,07 -2,98 6,93E-04
ENST00000556551
PTGR2 Prostaglandin reductase 2 -2,31 -4,04 -2,03 5,17E-05
AK097435 TP53TG3//TP53TG3C// TP53TG3B
TP53 target 3//TP53 target 3C//TP53 target 3B
-3,01 -2,19 -2,80 3,05E-04
NM_020995 HPR Haptoglobin-related protein -3,08 -2,60 -3,02 1,54E-04
ENST00000564671
TERF2IP Telomeric repeat binding factor 2, interacting protein
-3,24 -2,64 -3,10 1,54E-04
NM_001100112
MYH2 Myosin, heavy chain 2, skeletal muscle, adult
-2,62 -2,86 -2,34 4,54E-04
ENST00000329882
CSH1//CSHL1//GH1
Chorionic somatomammotropin hormone 1 (placental lactogen)//chorionic somatomammotropin hormone-like 1//growth hormone 1
-2,24 -2,63 -2,13 2,33E-04
43 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
ENST00000382349
ONECUT3 One cut homeobox 3 -3,01 -2,63 -3,28 1,57E-04
NM_000554 CRX Cone-rod homeobox -2,58 -2,85 -2,15 1,94E-04
NR_002931 CLEC4GP1 C-type lectin domain family 4, member G
-3,15 -2,19 -2,83 3,83E-04
NM_000762 CYP2A6 Cytochrome P450, family 2, subfamily A, polypeptide 6
-2,20 -2,67 -2,34 2,04E-04
AL833447 ZNF285 Zinc finger protein 285 -2,20 -3,21 -2,97 2,00E-04
NM_014219 KIR2DL2 Killer cell immunoglobulin-like receptor, two domains, long cytoplasmic tail, 2
-2,18 -2,22 -2,43 1,95E-04
NM_024795 TM4SF20 Transmembrane 4 L six family member 20
-2,45 -2,37 -3,07 2,02E-04
ENST00000371328
FAM209A//FAM209B
Family with sequence similarity 209, member A//family with sequence similarity 209, member B
-2,95 -2,71 -3,19 8,60E-05
ENST00000390306
IGLV2-23 Immunoglobulin lambda variable 2-23
-2,04 -2,81 -2,66 2,20E-04
NM_001136213
POTEH POTE ankyrin domain family, member H
-3,01 -2,82 -2,38 2,14E-04
NM_001199978
PLSCR2 Phospholipid scramblase 2 -2,67 -2,69 -3,16 2,07E-04
NM_139248 LIPH Lipase, member H -2,64 -2,82 -2,25 9,14E-05
NM_005546 ITK IL2-inducible T-cell kinase -2,16 -2,45 -2,64 2,21E-04
NM_025218 ULBP1 UL16 binding protein 1 -2,17 -2,33 -2,16 2,44E-04
NM_001080538
AKR1B15 Aldo-keto reductase family 1, member B15
-2,01 -2,35 -2,20 1,80E-04
NM_001190487
MTRNR2L6 MT-RNR2-like 6 -3,05 -2,91 -2,36 2,81E-04
NM_000238 KCNH2 Potassium voltage-gated channel, subfamily H (eag-related), member 2
-2,38 -2,10 -2,21 2,84E-04
ENST00000378120
BLACE B-cell acute lymphoblastic leukemia expressed
-2,06 -2,92 -2,09 0,00179338
NM_001001874
TPD52L3 Tumor protein D52-like 3 -2,21 -2,11 -2,44 3,02E-04
NM_001293798
DUX4 Double homeobox 4 -2,72 -2,21 -2,15 3,18E-04
NM_001168647
CNKSR2 Connector enhancer of kinase suppressor of Ras 2
-3,00 -2,29 -3,08 3,12E-04
NM_001077188
HS6ST2 Heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 2
-2,66 -2,75 -2,57 0,00192307
NM_001009609
SPANXN3 SPANX family, member N3 -3,20 -3,17 -3,13 3,29E-04
NM_004825 CDY2A Chromodomain protein, Y-linked, 2A
-2,50 -3,01 -2,51 5,65E-04
ENST00000451062
FAM197Y9 Family with sequence similarity 197, Y-linked, member 9
-2,88 -2,72 -2,68 5,63E-04
XR_427902 LOC166994 Integral membrane glycoprotein-like
-2,31 -2,92 -2,48 1,52E-08
NM_004465 FGF10 Fibroblast growth factor 10 -2,20 -3,01 -2,19 8,74E-09
NM_003862 FGF18 Fibroblast growth factor 18 -2,95 -2,43 -2,36 6,74E-07
Resultados 44
NM_001200 BMP2 Bone morphogenetic protein 2 -3,16 -2,83 -3,48 5,67E-06
NM_002607 PDGFRA Platelet-derived growth factor receptor alpha
-2,06 -2,81 -2,60 9,01E-06
NM_005559 LAMA1 Laminina alpha 1 -2,58 -2,94 -2,93 1,25E-06
ENST00000267843
FGF7 Fibroblast growth factor 7 -2,40 -2,49 -2,20 0,0110733
NM_000095 COMP Cartilage oligomeric matrix protein
-2,26 -2,74 -2,25 0,01154194
NM_002609 PDGFRB Platelet-derived growth factor receptor beta
-3,12 -2,96 -3,07 1,63E-04
XM_005245820
ALPL Alkaline phosphatase, liver/bone/kidney
-2,81 -3,39 -2,65 5,67E-06
NM_001040194
AGTRAP Angiotensin II receptor-associated protein
-2,06 -2,09 -2,09 1,52E-03
NM_001078 VCAM1 Vascular cell adhesion molecule 1
-4,20 -4,85 -4,27 0,00392593
Tabla 10 Genes diferencialmente expresados asociados a diferenciación osteoblástica y matriz extracelular
Categoría funcional GO Genes asociados p value
Proceso biológico:
2,61E-06
DIFERENCIACION CELULAR (15 genes):
BMP4, BMP2, IGF1, PTHLH, RUNX2, IGFBP3, SPRY1, FGF10, FGF2, FGF7, FGF18, WNT5A, ALPL,
HHIP, SFRP2
Componente celular:
MATRIZ EXTRACELULAR
1,97E-44
(52 genes): ASPN, PXDN, COL21A1, MMP9, MMP3, MMP1, OGN, DSPP, HMCN1, CTGF, COL12A1, COL11A1, SPON1,
EGFL6, ZP4, COL22A1, ANXA2P3, MMP12, , BGN, VCAM1, ADAMTS3, MFAP4, ADAMTS2, OTOL1, MFAP5, WNT5A, COL28A1, SPOCK1, DCN, VIT,
TIMP3, CPZ, LAMB3, SMOC1, COMP, RPTN, ACAN, PCHD10, BMP4, HAPLN1, COL4A1, TNXB,
C2ORF61, HSPG2, ECM1, LAMA1, FBLN1, CDH3, CDH13
Finalmente, después de la anotación funcional arrojada por DAVID se obtuvo una tabla
asociada a Gene Ontology sobre los términos con p value más representativos
encontrados (Figura 7).
45 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
Figura 7 GO TERM (Gene Ontology) - Procesos biológicos (BP)
5.6 Análisis de expresión diferencial por qRT-PCR Se evaluaron algunos de los genes expresados diferencialmente en el array, con mayor
score de enriquecimiento y fold change, usando la técnica de qRT-PCR: COL1A1,
SFRP2, BMP4, PTPRB y HHIP. Los resultados corroboraron lo encontrado en el
Microarray para 4 de los 5 genes escogidos: regulados a la baja BMP4, COL1A1, PTPRB
y a la alta HHIP (solo pacientes 2 y 3). Adicionalmente se midió la expresión de RUNX2,
la cual coincidió con los resultados del array para los pacientes 1 y 2, mostrando infra-
regulación (figura 8).
Resultados 46
Figura 8 Resultados de qRT-PCR: Niveles de expresión de genes según qRT-PCR vs
los resultados del Array para cada paciente al comparar las condiciones de tratamiento
con Idursulfase® versus sin tratamiento. Se enuncia en la parte superior los valores del
Fold change resultado del Array para cada paciente al comparar la condición basal y
posterior al tratamiento con Idursulfase. ST: Sin tratamiento con Idursulfase®; CT: Con
tratamiento.
-2,09-2,66-3,26
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
AP1 AP2 AP3
BMP4
ST
CT
-12,63 -3,36 -2,10
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
AP1 AP2 AP3
HHIP
ST
CT
2,48 2,56 3,22
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
AP1 AP2 AP3
SFRP2
ST
CT
17,33 16,81 7,12
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
AP1 AP2 AP3
COL1A1
ST
CT
0.88
0.44
1.19
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
AP1 AP2 AP3
RUNX2
ST
CT
Discusión 47
6. Discusión
6.1 Identificación del Fenotipo Celular En este estudio se pretende determinar si la acción del fármaco Idursulfase® genera un
cambio en el perfil de expresión génica de fibroblastos periósticos de sutura coronal
extraídos de pacientes con Síndrome de Apert.
De esta forma, lo primero que se corroboró para obtener resultados concluyentes, fue el
tipo celular que se había obtenido en los cultivos, por lo cual se realizó una
caracterización del fenotipo, con el fin de comprobar si las células correspondían a
fibrobastos o a células mesenquimales, debido a que al microscopio, ambas poseen
morfología fibroblastoide. Se utilizó medio DMEM alto en D-Glucosa (4500 mg/mL), lo
cual garantizaba un mejor desempeño y mayor densidad poblacional de fibrobastos
(111).
Lo siguiente que se corroboró fue que durante el tiempo de cultivo existiera la formación
de algún tipo de aglutinamiento celular, lo cual no sucedió en los cultivos de este estudio,
debido a que este tipo de agrupamiento celular es presentado principalmente por las
células mesenquimales (112). Otra característica exhibida por las células cultivadas,
particular de los fibroblastos, fue su lento crecimiento y su rápido proceso de senescencia
(111,113).
Posteriormente se utilizó la técnica de epi-inmunofluorescencia, usando el anticuerpo
Anti-Fibroblast activation protein alpha, específico de fibroblastos y células
mesenquimales, por medio de la cual se pudo evidenciar el origen fibroblastoide de las
células.
Discusión 48
Finalmente, utilizando la técnica de PCR se pudo determinar la presencia de la isoforma
mesenquimal del receptor (FGFR2IIIc) en cDNA obtenido de los fibroblastos; esta
isoforma se transcribe en el mesodermo paraxial y lateral, en el primordio de la
extremidad y el mesénquima de arco branquial y, más tarde, en el músculo y otros tejidos
mesenquimales, incluyendo la periferia de los modelos de cartílago formadoras de hueso
(114). Tiene una afinidad por FGFs diferente a la isoforma epitelial (FGF2IIIb),
reconociendo, bajo condiciones fisiológicas, a FGF1, FGF2, FGF4, FGF8, FGF21 y
FGF23 (57).
De acuerdo con los argumentos expuestos previamente, se puede tener la certeza de
estar trabajando con fibroblastos de periostio de sutura coronal, los cuales serán
utilizados para realizar diferentes experimentos que determinen su expresión diferencial
después de la exposición al fármaco.
6.2 Cuantificación de GAGs y Actividad enzimática Se realizó la cuantificación de GAGs en orina de pacientes, los cuales no se encontraban
bajo tratamiento con Idursulfase®, para tener una idea general del estado catabólico de
estas moléculas en los pacientes con SA. De acuerdo con Carinci et al., el tejido óseo de
pacientes con SA, presenta un incremento en la cantidad de HS, asociado a una
reducción de la actividad de enzimas que degradan GAGs (11). Los resultados de estos
análisis contradicen estos hallazgos previos, debido a que mostraron una cuantificación
normal de GAGs en los dos pacientes a los que se les pudo realizar el estudio, dado que
el primer paciente (004) falleció después de la intervención quirúrgica. Por otra parte, los
ensayos de actividad enzimática de los pacientes 004 y 008 mostraron un aumento leve
en la actividad de la alfa-L-Iduronidasa. Sin embargo, se debe resaltar que la actividad de
esta enzima, en el paciente 004, se realizó sobre el cultivo celular debido a que no se
contaba con muestra de sangre, calibrándose con los resultados de fibroblastos sin la
mutación, lo cual no permite la comparación entre ensayos. No se logró obtener
suficiente cantidad celular para el ensayo de la actividad enzimática en fibroblastos para
las otras dos muestras.
49 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
6.3 Efecto del fármaco Idursulfase® sobre la expresión génica de fibroblastos SA
Los resultados de la evaluación del efecto citotóxico del fármaco Idursulfase® permitieron
mostrar que el modelo in vitro es válido para la evaluación de la acción del fármaco sobre
los perfiles de expresión génica, dado que este no presentó ningún tipo de toxicidad que
pudiera detener o ralentizar el crecimiento o viabilidad celular de los fibroblastos. Con
esto definido, se analizaron los datos arrojados por el Microarray, encontrando 15 genes
diferencialmente expresados asociados a diferenciación osteoblástica, proceso
fundamental en el desarrollo de la osificación temprana y aberrante de la sutura coronal
en el SA.
Utilizando la técnica de qRT-PCR se determinó que cuatro de los cinco genes evaluados,
coincidían con la expresión génica obtenida por medio del microarray, aunque no en el
mismo nivel. Se encontró que BMP4, COL1A1, HHIP y SFRP2 mostraban el mismo
comportamiento por medio de las dos técnicas, lo cual proporciona evidencia clara con
respecto a la expresión diferencial de estos genes en los fibroblastos mutados después
del tratamiento con Idursulfase®. A los 11 genes restantes solo se les midió el cambio en
sus niveles de expresión por medio del microarray.
Runx2 (runt related gene 2) es uno de los factores de transcripción más importantes y
necesarios para el proceso de osteogénesis, y es el responsable de la activación de
genes marcadores de diferenciación osteoblástica (115). Por ejemplo, Runx2
desencadena la expresión de osteocalcina por el mecanismo de unión al elemento en cis
(elemento específico de osteoblastos 2; OSE2 o sitio de unión a Runx) de la región
promotora del gen osteocalcina (116,117). Existen otros genes marcadores de
osteogenesis, como por ejempo ALP, COL-I, sialoproteínas de hueso (BSP),
osteopontina y (OPN), que tienen elementos tipo OSE2 y que están reguladas de una
manera similar por Runx2. Este mecanismo hace hincapié en la posición vital de Runx2
en el estudio de desarrollo de los huesos (116), específicamente de la diferenciación
celular de osteoblastos (118).
En algunos estudios, la deficiencia de Runx2 en ratones evidenció la falta completa de
formación de hueso, debido a la ausencia total de los osteoblastos (119,120). Los
Discusión 50
resultados de este estudio mostraron una disminución en la expresión de Runx2 en las
células fibroblásticas de pacientes con SA después del tratamiento con Idursulfase®, lo
que podría indicar una concomitante disminución de los genes activados por este factor
de transcripción, como es el caso del gen Col1A1, el cual se encontró disminuido en su
expresión después de analizar los resultados de la qRT-PCR.
Debido a que el fármaco degrada moléculas de HS y que éstas están asociadas a
procesos de regulación de vías de señalización que promueven la proliferación y
diferenciación celular, se piensa que este es el mecanismo molecular por el cual el
fármaco disminuye la expresión de RUNX2. En un estudio de Teplyuk et al. donde se
usaron células nulas para RUNX2 con expresión adenoviral del mismo factor de
transcripción, se demostró que este gen regula selectivamente la expresión de
proteoglicanos, aumentando los niveles de expresión de FGFR2, FGFR3, sindecanes, -1,
-2 y -3, versican -1 y exostosin -1 (13). De esta forma, RUNX2 modula el repertorio de
FGFRs, así como a los proteoglicanos que modulan la unión de FGFs a sus receptores.
Los datos encontrados en este estudio indicarían que la disminución en la expresión de
RUNX2 podría afectar la modulación de estos componentes, disminuyendo su
concentración en el espacio extracelular y, por lo tanto, funcionando como un feedback
negativo en el proceso de diferenciación celular. Nuevamente, en el estudio de Teplyuk
et al., encontraron que RUNX2 también controla las enzimas modificadoras de GAGs
(13), indicando que la disminución de su expresión tendría consecuencias sobre la
concentración y distribución de patrones de sulfatación sobre la cadena que compone los
GAGs, modulando su habilidad de unirse selectivamente a diferentes ligandos, como por
ejemplo FGF2, BMPs o WNTs .
BMP4 y BMP2 (Bone Morphogenetic Proteins) son citoquinas de señalización
extracelular con múltiples funciones, que juegan un rol primordial en la diferenciación
específica hacia el linaje osteoblástico y la formación posterior de hueso endocondral e
intramembranoso al inducirla por medio de BMP7 y BMP9 (121). Ambas citoquinas
pueden activar p38 y ERK-MAPK, pero no JNK, moléculas de señalización intracelular
estrechamente asociadas a procesos de diferenciación celular (122). Un estudio llevado
a cabo en modelos murinos, realizado por Holmes et al., sugirió que el aumento de
señales extracelulares provenientes del mesénquima de la sutura mutada (donde
51 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
predominan BMP4 y FGF2) aumentaría la osteogénesis en esta zona, disminuyendo la
proliferación celular y aumentando la diferenciación osteoblástica (51).
Recientes estudios en conejos han mostrado que niveles elevados de BMP2 causan
fusión prematura de las suturas craneales (123) y debido a que la señalización de BMP
ocurre corriente abajo de la de FGF durante el crecimiento del cráneo, la manipulación de
la vía BMP podría ser una terapia efectiva para el tratamiento de las craneosinostosis
(124). BMP2 promueve la diferenciación osteoblástica al inducir la expresión de AKT, la
cual mejora la función y la actividad transcripcional de RUNX2 (125). Por otra parte, la
actividad de las moléculas de BMP se encuentra regulada extracelularmente por un
complejo compuesto por moléculas secretadas y de superficie celular, entre ellas Noggin
y moléculas de HS (124,126–128). Con respecto a esto, Coussens et al. demostraron
que Glipican 1 y Glipican 2 (proteoglicanos de HS situados en membrana celular) se
encuentran expresados en las suturas craneales en condiciones fisiológicas, y que su
concentración disminuye durante la fusión prematura de las suturas en niños con
craneosinostosis (129).
En el SA se ha observado evidencia de una disminución de los niveles de moléculas
antagonistas de la vía BMP, lo que estaría asociado a un aumento de la actividad de
BPM4 en osteoblastos y a una sobre-diferenciación celular (130,131). Nuestros datos
reportan una regulación a la baja de estos genes luego del tratamiento con Idursulfase®,
proponiendo así una disminución de la expresión de BMP4, molécula con un importante
rol en los procesos de osificación.
La señalización canónica WNT, así como RUNX2, también actúa regulando la
diferenciación osteogénica. Sin embargo, RUNX2 es el primer factor de transcripción
requerido para la determinación del linaje osteoblástico, mientras que WNT compromete
definitivamente a las células progenitoras hacia osteoblastos en estadios posteriores,
bloqueando así su diferenciación en condrocitos (118).
La señalización WNT juega roles críticos en el desarrollo, crecimiento y homeostasis del
sistema esquelético; la unión de WNT a complejos receptores activa vías de señalización
canónicas dependientes de β-Catenina o vías no canónicas independientes de β-
Discusión 52
Catenina (132,133). Los resultados hallados en este estudio indican una disminución en
la expresión de WNT5 después del tratamiento con Idursulfase® a fibroblastos de
pacientes con SA. WNT5 (subfamilia WNT) hace parte de las moléculas WNT
independientes de β-Catenina (vía no canónica) y activa otras vías de señalización, tales
como WNT/Ca2+ y WNT/PCP (planar cell polarity) (134). De acuerdo a estos
antecedentes, en un estudio realizado por Nemoto et al. se demostró que la
diferenciación osteoblástica mediada por BMP-2 está asociada a una mayor expresión de
Wnt5a y ROR2 in vivo e in vitro, y que el silenciamiento de la expresión génica de Wnt5a
y ROR2 resulta en la supresión de fosfatasa alcalina (ALP) y de osteocalcina (OCN), lo
que sugiere que la señalización mediada por Wnt5a y ROR2 es un determinante
fundamental para la diferenciación osteoblástica mediada por BMP-2 (135).
Estudios de Okamoto et al. también mostraron que la falta de WNT5 en células de linaje
osteoblástico deteriora la vía de señalización WNT/β-Catenina, debido a que reduce la
expresión de Lrp5 y Lrp6 (low density lipoprotein receptor-related protein -5 y -6),
receptores que se unen individualmente al receptor Frizzled para formar un único
complejo receptor de WNT y que generan la acumulación de β-Catenina y su posterior
translocación al núcleo para iniciar la transcripción de los genes blanco (136). De
acuerdo con los estudios citados, el fármaco Idursulfase® estaría contribuyendo a la
resolución del fenotipo de la craneosinostosis mediante dos vías: la primera, por medio
de la disminución de la expresión de WNT5 y, por lo tanto, la concomitante disminución
de la mineralización de matriz extracelular, y la segunda, al deteriorar la vía de
señalización canónica de WNT, aumentando la acumulación de β-Catenina y su actividad
transcripcional.
Igf1 es importante para una gran variedad de procesos de crecimiento y diferenciación en
distintos tejidos. Específicamente, Igf1 es capaz de modular el crecimiento óseo a través
de mecanismos endocrinos/paracrinos y autocrinos, activando corriente abajo del
receptor las vías de señalización PI3K y ERK/MAPK, las cuales son necesarias para
controlar la diferenciación celular (137). Algunos síndromes por deficiencia de insulina,
como por ejemplo la diabetes mellitus tipo 1 y el Síndrome de Laron, causadas por
deficiencias de Igf1, exhiben en los pacientes densidad mineral ósea reducida y aumento
del riesgo de fracturas.(138).
53 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
Por el contrario, la expresión aumentada de Igf1 estimula el crecimiento del hueso
trabecular y cortical y la mineralización de la matriz celular (139). La maduración de los
osteoblastos se puede dividir en proliferación, maduración y mineralización de matriz
(140). Un estudio de Zhang et al. en osteoblastos de calvaria demostró que el
tratamiento con Igf1 mejoraba la fase temprana de la proliferación celular, mientras que
inhibía la expresión génica de osteocalcina, un marcador de diferenciación celular en
osteoblastos (141). Los datos de expresión diferencial de este estudio mostraron un
aumento en la expresión de Igf1 en los fibroblastos de sutura craneal después del
tratamiento con Idursulfase®, lo cual indicaría un aumento de la proliferación celular
temprana y una disminución del proceso de diferenciación celular, determinado por la
supra-regulación de osteocalcina y, por lo tanto, reduciendo la mineralización extracelular
y previniendo la osificación temprana de la sutura.
IGFBP3 hace parte de la familia de proteínas de unión a factores de crecimiento tipo
insulina, la cual cumple un rol integral en la modificación de los efectos de los IGFs en
una gran variedad de tipos celulares (142). Sin embargo, IGFBP3 también puede realizar
otras funciones, independientes de las típicas atribuidas a esta familia, dependiendo del
contexto celular, como por ejemplo la inhibición del crecimiento celular y la estimulación
de la apoptosis y la diferenciación celular (143).
En un estudio de Li et al. se demostró la interacción y co-localización de IGFBP3 y VDR
(Vitamin D Receptor) en el núcleo; además mostraron que IGFBP3 inhibe la regulación
transcripcional de VDR mediada por 1,25(OH)2D3, la expresión de osteocalcina y la
actividad de ALP en células osteoblásticas (144). En condiciones fisiológicas, VDR se
une a 1,25(OH)2D3 para regular la expresión de genes blanco, entre los que se
encuentran genes asociados a diferenciación osteoblástica, por medio del detenimiento
del ciclo celular, la consecuente maduración de la matriz extracelular y, por último, la
mineralización del hueso (145).
De acuerdo con la evidencia presentada previamente, el aumento de la expresión de
IGFBP3 en las células fibroblásticas de pacientes con SA después del tratamiento con
Idursulfase® promovería indirectamente una disminución de la mineralización de la
matriz extracelular mediada por la desregulación de VDR, proceso moderado por la
Discusión 54
reducción de la actividad de ALP, de la expresión de osteocalcina y de otros genes
asociados a diferenciación celular, lo cual ayudaría a disminuir la osificación temprana
presentada en estos pacientes. Así mismo, se pudo comprobar una disminución en la
expresión de ALP (importante marcador de osteogénesis) después del tratamiento con
Idursulfase®, aportando evidencia contundente acerca de la desaceleración del proceso
de diferenciación osteoblástica.
Corriente abajo de FGFR2, la cascada de señalización intracelular se encuentra
controlada fuertemente por proteínas reguladoras especializadas, como por ejemplo las
proteínas SPRY (Sprouty), encargadas de operar como reguladoras negativas
intracelulares de FGFRs, entre otros receptores, interactuando estrechamente con GRB2
para inhibir la vía RAS/MAPK y para regular la vía PI3K/AKT (146). Estas proteínas se
encuentran ubicadas de forma ubicua tanto en el embrión en desarrollo, como en adultos
(147,148). Después del tratamiento con Idursulfase®, las células SA sobre-expresaron el
gen SPRY1, lo que podría implicar la regulación negativa de vías de señalización
intracelular asociadas a diferenciación celular.
FGFR2IIIc se encuentra predominantemente en tejido mesenquimal y neural y es
activado por ligandos derivados de epitelio tales como FGFs -2, -4, -8, -9, -18 y -20. Por
el contrario, FGFR2IIIb se encuentra expresado normalmente por células epiteliales y es
activado por FGFs derivados de tejido mesenquimal: -3, -7, -10 y -22 (149–151). Cuando
alguna de las mutaciones causantes del Síndrome de Apert está presente en estos
receptores, la consecuencia radica en la modificación de su afinidad por los ligandos,
generando mayor afinidad por unos o pérdida de la especificidad (80,81,152,153).
En el caso particular de FGF10, un estudio de Hajihosseini et al. comprobó en ratones
FGF10-/-, FGF10+/- y FGFR2IIIc+/S252W el rescate de los defectos asociados al
esternón, craneofaciales, y vicerales observados en los controles FGFR2IIIc+/S252W,
demostrando la importancia del rol de FGF10 en la fisiopatología de la craneosinostosis y
otras patologías asociadas al SA (71). En los resultados de expresión diferencial
obtenidos después del tratamiento con Idursulfase®, se encontró una disminución en la
expresión de FGF10, lo que podría significar un elemento más a favor de la
desaceleración de la diferenciación celular de fibroblastos de sutura en pacientes con SA,
dado que esta disminución restauraría los niveles normales de señalización corriente
55 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
abajo de FGFR2, aumentando los niveles de fosforilación de la p38 y disminuyendo los
de p44/p42.
Los altos niveles de FGF están asociados con la diferenciación osteogénica. En otras
palabras, en las suturas normales hay expresión diferencial de FGF con altos niveles
encontrados en la región diferenciada y bajos niveles en resto de la sutura. En el
momento de la fusión de la sutura, se pueden observan niveles incrementados de FGF2
(154). Los datos arrojados por el Microarray en este estudio mostraron un aumento en la
expresión de FGF2, pero es atribuible al hecho de que se usó este factor de crecimiento
para estimular el cultivo celular antes de la extracción de RNA. Sin embargo, otros FGFs
mostraron una disminución en la expresión después del tratamiento con Idursulfase®,
como es el caso de FGF7 y FGF18.
Conclusiones 56
Conclusiones En este estudio se presenta un perfil de expresión génica diferencial estadísticamente
significativo en un modelo celular que expresa la isoforma mesenquimal del receptor
FGFR2 (FGFR2IIIc) en un grupo de pacientes con SA después de tratamiento con
Idursulfase®. Los hallazgos indican que el efecto del tratamiento se asocia con una
expresión diferencial génica relacionada particularmente con matriz extracelular y con
procesos de señalización celular, lo que podría tener un impacto determinante en el
desarrollo del tejido subperióstico craneal, dado que son estos procesos los que guían
factores como la diferenciación celular, entre otros, llevándolo a un aumento de la
mineralización y a la generación de una respuesta inflamatoria elevada. Estos resultados
están asociados a la presencia de redes génicas y procesos celulares implicados en la
modificación o recuperación parcial de los algunos procesos patológicos del SA.
57 Limitaciones
Limitaciones Durante el desarrollo del proyecto, la mayor dificultad se presentó durante la consecución
de pacientes para la obtención de las muestras necesarias. El primer paciente
lamentablemente falleció y no fue posible obtener muestra de sangre ni orina, siendo
necesario cuantificar los GAGs y medir la actividad enzimática a partir de cultivo celular
del paciente. De igual forma, muchos pacientes que habían aceptado participar en el
estudio no pudieron hacerlo debido a la cancelación repentina de sus cirugías
correctivas, lo cual representaba el aplazamiento indefinido del procedimiento.
Por otro lado, el manejo de los cultivos celulares fibroblásticos también implicó un reto
importante. Los fibroblastos tienden a crecer a una tasa baja y llegan a la etapa de
senescencia con rapidez, por lo cual se dificultó el mantenimiento, congelamiento y
descongelamiento de los mismos. Muy pocos cultivos primarios conservados a -80ºC
fueron descongelados con éxito, debido a las características de estas células, por lo que
las oportunidades para realizar los experimentos se vieron reducidas drásticamente,
pudiendo realizar sólo los experimentos más representativos para el estudio.
58 Perpectivas
Perspectivas
• En el conocimiento del campo de estudio:
Este estudio permitirá aportar más evidencia sobre la importancia de los GAGs en los
procesos de interacción entre el FGFR2 y su ligando en el SA.
Por otro lado nos acercará a la creación de nuevas hipótesis sobre la fisiopatología de
este síndrome.
Este estudio, pionero a nivel mundial, intentará proponer al HS, como un blanco
terapéutico en el manejo del SA, iniciando en un modelo de tipo in vitro, que deberá ser
replicado y validado en modelo animal.
• Productividad, competitividad e impacto regional:
Este trabajo nos permitirá ingresar en la dinámica de investigaciones in vitro en este
tema, convirtiéndonos en pioneros regionales y acercando nuestra investigación a
espacios traslacionales, donde en un futuro cercano podamos aplicar estos resultados al
ámbito clínico.
• En la calidad de vida de la población:
Con el conocimiento sobre las vías moleculares relacionadas a la fisiopatología de del
síndrome de Apert, en un futuro se podrán establecer nuevos abordajes diagnósticos, de
seguimiento y terapéuticos precisos, empleando elementos moleculares para la toma de
estas decisiones.
59 Anexo A: Consentimiento Informado para Participar en el Proyecto de Investigación
A. Anexo: Consentimiento Informado para Participar en el Proyecto de Investigación
EXPLICACIÓN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN AL PACIENTE Y SU FAMILIA
OBJETIVO- ¿QUÉ BUSCA ESTE ESTUDIO?
El síndrome de Apert es una enfermedad genética causado por mutaciones en el gen FGFR2, sin embargo existe aún una gran cantidad de interrogantes sobre cómo se presenta el daño en las células afectadas de la región cráneal. Adicional a esto, no existe en la actualidad una terapia farmacológica que permita disminuir o eliminar la sintomatología de la enfermedad. Este estudio busca explorar algunas vías moleculares que intervienen en el desarrollo de esta patología y por otro lado, proponer un abordaje farmacológico para mejorar el ambiente celular de ese tejido afectado
PROCEDIMIENTO-¿QUÉ LE PEDIMOS?
Su hijo, o menor a cargo, tiene características que hace pensar que puede cursar con el Síndrome de Apert, el cual estamos estudiando.
Si permite su participación en este estudio, se procederá a tomar una muestra de sangre (7cc en el brazo) y unas muestras de orina, cuando el pacientes este hospitalizado y usando las vías venosas por donde ingresa el suero. Además se tomará un fragmento de tejido óseo craneal, que sea descartado en el momento en que se esté corrigiendo quirúrgicamente el defecto en su hijo. Por lo tanto, todas estas muestras se tomaran al mismo tiempo en que se está siendo manejando hospitalariamente al paciente.
Las muestras serán enviadas posteriormente al Instituto de Genética de la Universidad Nacional para la realización de los estudios. Luego de ello, con las muestras de sangre, orina y tejido de hueso, continuaremos hacia la búsqueda de la mutación P253R en el gen FGRF2 y posterior a ello el análisis
60 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
de varios procesos moleculares en dicha muestras.
El riesgo de la toma de esta muestra de sangre y orina es mínimo y no se han descrito situaciones adversas que afecten la salud su hijo como consecuencia de este procedimiento.
RIESGOS E INCOMODIDADES: La participación en este estudio representa riesgo mínimo para la salud eintegridadde suhijo yaque seemplearanmuestrade tejidosque se tomanenprocedimientosprogramadopara el manejo de la condición clínica presente en el paciente y las molestias y efectos adversos estaránrepresentados exclusivamente por la toma de muestras, y como se explicó arriba los riesgos son pocos ypuedenincluirdolorleve,infecciones,sangradoy/ohematomas(morados).
BENEFICIOS ADICIONALES: Este estudio tiene para usted el (los) siguiente(s) beneficio(s) adicional(es): 1.Detección de la mutación P253R del gen FGFR2 en su hijo o menor a cargo, en el caso que la tuviese. 2.Proporcionar más información a la comunidad científica, sobre los mecanismos de desarrollo de estaenfermedad 3. Colaborar en el proceso de propuesta de desarrollo de terapias en este tipo decraneosinostosis(Defectocraneal)
MANEJODERESULTADOS:Losresultadosdelaspruebasseránfacilitadosaustedsiasílodesea.
OTRA INFORMACIÓN PERTINENTE: En el curso del estudio se le suministrará a usted cualquier tipo deinformación nueva, derivada de éste, que pueda modificar su participación en el mismo. Las muestras einformaciónqueustedaportóseránempleadasparaeldesarrollodeESTAinvestigación.
Soloenalgunoscasos,lainformaciónymuestrassuministradasporustedsepuedenemplearenotrosestudiosclínicosodecienciasbásicas.SIEMPRESELEPEDIRÁunaautorizaciónporescritoencasodequeustedautoricequesuinformaciónolainformaciónymuestrasDELMENORASUCARGO,seanempleadasenotrosestudios.Por ello le solicitamos que revise el formato de AUTORIZACIÓN donde usted puede aprobar o rechazar elempleodelainformaciónymuestrasenlascircunstanciasallímencionadas.
Ustedpodrá,enelmomentoquelodesee,retirarlasmuestrasdelalmacenamiento.
Siustedcreequehasufridounalesiónrelacionadaconlainvestigaciónodeseacualquierinformaciónadicional,porfavorllamealosteléfonosmencionadosmásadelante.INVITACIONAPARTICIPACIONENELPROYECTO.
Ustedysuhijoomenoracargo,estásiendoinvitadoaparticiparenunestudiodeinvestigaciónpropuestoporelInstitutodeGenéticaHumanadeUNIVERSIDADNACIONALDECOLOMBIAFUNDACIONUNIVERSITARIADECIENCIASDELASALUDyelHOSPITALINFANTILUNIVERSITARIODESANJOSE.Esmuyimportantequeustedleayentiendaciertospuntosimportantesenlarealizacióndeesteestudio:
(a) a)Suparticipaciónenesteestudioestotalmentevoluntaria.(b) (c) (b) Esteestudiopuedegenerarbeneficiosdirectos sobreusted y su familia, yaqueenalgunospacientes se
detectaránmutacionesenelgenFGFR2.ConlosdatosobtenidosenesteestudiopodremosconocermássobreeldesarrollodelSíndromedeAPERTysepodríaafuturoofrecerdeterminadasalternativasterapéuticas.
(d) (e) (c)Ustedennombredelmenorasucargopuederetirarsedelestudiocuandolodesee.Larevocatoriadeeste
consentimiento no tendrá perjuicio alguno sobre la relación médico-paciente ni consecuencia alguna en la
Anexo A. Consentimiento Informado para Participar en el Proyecto de Investigación
61
calidaddeatenciónmédicaqueselesuministre.
(f) (g) (d) Ninguna persona involucrada en este estudio recibirá beneficios económicos como pago por su
participación.(h) (i) (e)Esteestudionotieneningúninteréseconómicoporpartenuestraodelasinstitucionescolaboradoras.(j) (k) (f)Participarenesteestudionotieneningúncostoparausted.(l) (m) (g) CONFIDENCIALIDAD: Los registros con la información de cada individuo permanecerán archivados en el
Instituto de Genética de la Universidad Nacional. Las historias médicas, los resultados de exámenes y lainformaciónqueustednos ha dado sonde carácter absolutamente confidencial, demanera que, solamenteustedyelequipodeinvestigacióntendráaccesoaestosdatos.Porningúnmotivosedivulgaráestainformaciónsinsuconsentimiento.Cuandolosresultadosdeesteestudioseanreportadosenrevistasmédicascientíficasoencongresoscientíficos,losnombresdetodosaquellosquetomaronparteenelestudioseránomitidos.
(n) (o) (h) La naturaleza de este estudio, sus riesgos, sus inconvenientes, incomodidades y cualquier información
importanteestáresumidayexplicadaporelgrupoinvestigador.Sitienealgúninterrogantesobreelestudioporfavor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores, quien con mucho gusto, contestará suspreguntas.
Para mayor información, llame en Colombia al 3165000 EXT 11631, para comunicarse con el investigador Dr. Harvy Velasco Parra, en el Instituto de Genética Humana de la Universidad Nacional, Carrera 44 #26-85 y al correo por Internet: [email protected],
Adicionalmente,siustednoestásatisfechoconlaformacomoseestáconduciendoesteestudiootieneotraspreguntasconcernientesasusderechoscomoparticipantedelestudio,porfavorcontactealmismoteléfonoocorreoelectrónicomencionadosantes.
AUTORIZACION
El ingreso a este estudio es voluntario. Usted tiene derecho a retirarse del estudio en cualquier momento. Los investigadores guardarán las muestras de sangre y tejido para realizar estudios sobre el IMPACTO DE LA DEGRADACION DE HEPARAN SULFATO EN LOS PERFILES DE EXPRESION DOWNSTREAM DE FIBROBLASTOS DE PACIENTES CON MUTACIONES P2353R EN FGFR2
Una vez terminado este trabajo, requerimos de su autorización para:
• Ser almacenadas para emplearlas en estudios de investigación nacionales e internacionales de patologías relacionadas con la entidad objeto de esta investigación (Sindrome de Apert), siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificación y los del menor a mi cargo. En el caso que su respuesta sea afirmativa, el
�Si �No
62 Impacto de la degradación de HS en la regulación de las vías de diferenciación osteoblástica en fibroblastos de sutura craneal de pacientes con SA
grupo de investigación se compromete a contactarse con usted y solicitar una nueva autorización, previa autorización del comité de Ética de la Universidad Nacional y de Ética e Investigación en Seres Humanos del Hospital Infantil Universitario de San José para proteger la integridad del sujeto de estudio
• Ser desechadas una vez terminado este trabajo, mediante incineración y se tendrá un registro de desecho de muestras
�Si �No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL
ESTUDIO: “IMPACTO DE LA DEGRADACION DE HEPARAN SULFATO EN LOS
PERFILES DE EXPRESION DOWNSTREAM DE FIBROBLASTOS DE PACIENTES CON
MUTACIONES P2353R EN FGFR2” Yo, _________________________________________identificado con documento numero
________________ de _____________, acepto voluntariamente que se me tome a mi o a mi
hijo (a) o menor a mi cargo, cuyo nombre es
_______________________________________________________________ muestras
de__________________________________________, con el fin de almacenarlas para el
estudio molecular en el Síndrome de Apert. Así mismo, declaro que se me ha explicado Y HE
ENTENDIDO la presencia de los riesgos y el manejo que se le dará al material de muestra.
_____________________________
Firma del padre
Nombre:______________________
Identif: _______________________
Teléfono: _____________________
_____________________________
Firma de la madre Nombre: _______________________ Identif: _________________________ Teléfono:_______________________
_____________________________ __________________________________
Responsable del menor Sujeto de investigación (mayor de 7 años)
Nombre:______________________
Identif: _______________________
Teléfono: _____________________
_____________________________ _____________________________
Anexo A. Consentimiento Informado para Participar en el Proyecto de Investigación
63
Testigo 1 Testigo 2
Nombre:______________________ Nombre:______________________
Identif: _______________________ Identif: _______________________
Teléfono: _____________________ Teléfono: _____________________
_____________________________ Fecha: _______________________
Investigador
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