imunizaÇÃo oral contra a esquistossomose com salmonella typhimurium atenuada carreando plasmÍdeos...
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IMUNIZAÇÃO ORAL CONTRA A ESQUISTOSSOMOSE COM Salmonella typhimurium ATENUADA CARREANDO PLASMÍDEOS (VACINAS DE DNA) PORTADORES DO GENE Sm14.
Luis Gustavo Carvalho Pacheco
Orientador: Prof. Dr. Vasco AzevedoCo-Orientador: Prof. Dr. Alan Lane de
Melo
LABORATÓRIOS
Genética Celular e Molecular
(LGCM), Dep. de Biologia Geral.
Taxonomia e Biologia de
Invertebrados, Dep. de
Parasitologia.
Imunologia das Doenças
Infecciosas, Dep. de Bioquímica e
Imunologia.
PLANO DE APRESENTAÇÃO
INTRODUÇÃO
OBJETIVOS
MATERIAIS E MÉTODOS
RESULTADOS E DISCUSSÃO
CONCLUSÕES
AGRADECIMENTOS
VACINA DE DNA
Histórico e conceito
Mecanismos de indução de resposta imunológica.
Vias de administração.
BACTÉRIAS CARREADORAS
Vantagens.
Mecanismo de transferência de plasmídeos vacinais.
Trabalhos com gene repórter.
Outras doenças.
Ainda não há trabalhos na literatura relatando o uso de linhagens atenuadas de Salmonella como carreadoras de vacinas de DNA contra doenças parasitárias, incluindo esquistossomose.
ESQUISTOSSOMOSE
Vermes do gênero Schistosoma Problema sócio-econômico e de
saúde pública Pessoas em risco: quase 800 milhões Pessoas infectadas: cerca de 200
milhões No Brasil: ~6,4 milhões (NE e MG) Ciclo biológico
(BERGQUIST et al., 2002; KATZ & PEIXOTO, 2000)
CICLO DE VIDA DE SCHISTOSOMA spp.
www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/ Frames/S-Z/Schistos...
ESTRATÉGIAS DE CONTROLE
Saneamento básico
Quimioterapia: oxamniquina e
praziquantel
Re-infecção em áreas endêmicas
VACINA EFETIVA (proteção a longo prazo)
CONCEITO DE VACINA PROTETORA
Diferente do normalmente associado com vacinas.
Imunidade parcial: diminuição da carga parasitária. menos ovos acumulados = redução da
reação granulomatosa. menos ovos liberados para o ambiente.
(BERGQUIST et al., 2002)
CARACTERÍSTICAS IMUNOLÓGICAS
Natureza provável da resposta imunológica:
dicotômica: células Th1 e Th2
variação na produção de citocinas e imunoglobulinas pelo hospedeiro, de acordo com a fase de desenvolvimento do parasito.
(AL-SHERBINY et al., 2003; HOFFMANN & WYNN, 2000)
CANDIDATOS VACINAIS 6 antígenos de Schistosoma escolhidos
pela OMS como os mais promissores, utilizando proteína recombinante.
Sh28GST em fase mais avançada de estudos:
BILHVAX (proteína recombinante) diminuição de fecundidade fase II de testes clínicos
SM14
FABP (fatty acid-binding protein). Aquisição e utilização de ácidos
graxos por diferentes organismos. Vacina bivalente anti-helmíntica.
(TENDLER et al., 1996)
Vacina de DNA com Sm14. (NASCIMENTO
et al., 2002)
OBJETIVO GERAL
Desenvolver e avaliar a eficácia de uma nova estratégia de imunização contra a esquistossomose experimental.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Transformar a linhagem atenuada SL3261 de Salmonella typhimurium com o plasmídeo vacinal.
Digestão e sequenciamento de pCI-Sm14. Ensaios de imunização oral de camundongos
SWISS. Avaliar produção de anticorpos. Avaliar proteção conferida aos
camundongos contra a esquistossomose experimental.
MATERIAIS E MÉTODOS
pC
MV
pC
MV
pCI-Sm14
pCI-neo
Amp
Amp
RESTRIÇÃO ENZIMÁTICA
SEQUENCIAMENTO
TRANSFORMAÇÃO
Salmonella typhimurium SL3261
CURVAS DE CRESCIMENTO
ENSAIOS DE IMUNIZAÇÃO ORAL
S. typhimurium SL3261 (pCI-neo)
00,20,40,6
0,81
1,21,4
02:20 03:40 04:40 05:40 06:40 07:40 08:40 09:40
Tempo (horas)
D.O
.60
0n
m
5,26 x 108
ENSAIOS DE IMUNIZAÇÃO ORAL
7 doses de 109 u.f.c foram administradas, no intervalo de 30 dias.
10-1 10-2 10-7
Meio + Antib. + Bactéria
O.N.
Diluição1\50
Fase estacionária Fase exponencial
4:30 hs depoisO.D. 0,8-0,9
...
(~10-8 a 10-9 UFC/ml)
Imunização com 100 µl
Meio da fase exponencial
Concentração (5 X 109 UFC/ml)
1 ANÁLISE DE RESPOSTA IMUNE HUMORAL
2 INFECÇÃO EXPERIMENTAL RECUPERAÇÃO DOS VERMES
3 ANÁLISES DE PROTEÇÃO
MATERIAIS E MÉTODOS
DIGESTÃO E SEQUENCIAMENTO DE pCI-Sm14
Foi confirmada a integridade estrutural do plasmídeo vacinal.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10PM
5000pb
2000pb
1000pb
400pbCANALETAS 8 E 9: Nhe I + Not I
CURVAS DE CRESCIMENTO
S. typhimurium SL3261 (pCI-neo)
00,20,40,6
0,81
1,21,4
02:20 03:40 04:40 05:40 06:40 07:40 08:40 09:40
Tempo (horas)
D.O
.600
nm
5,26 x 108
S. typhimurium SL3261 (pCI-Sm14)
00,20,40,60,8
11,21,41,6
02:20 03:40 04:40 05:40 06:40 07:40 08:40 09:40
Tempo (horas)
D.O
.60
0nm
S. typhimurium SL3261
00,20,40,60,8
11,21,4
02:20 03:40 04:40 05:40 06:40 07:40 08:40 09:40
Tempo (horas)
D.O
.60
0nm
5,54 x 108
2,36 x 109
1,6 x 105
4,75 x 105
6 x 108
8,3 x 108
8,9 x 108
ANÁLISES DE PROTEÇÃO
Tratamento Nº Vermes recuperados
(X ± )
% Proteção Valor p
1º Ensaio de Imunização
PBS 6 16,5 ± 3,4 _ _
SL3261 6 14,3 ± 2,9 13,3 0,264
SL3261 (pCI-neo) 6 13,5 ± 2,7 18,2 0,122
SL3261 (pCI-Sm14) 5 12,2 ± 1,8 26,0 0,032*
2º Ensaio de Imunização
PBS 7 20,6 ± 8,3 _ _
SL3261 6 22,3 ± 10 _ _
SL3261 (pCI-neo) 7 16,7 ± 7,8 18,9 0,388
SL3261 (pCI-Sm14) 8 21,5 ± 6,9 _ _
Número de fêmeas de S. mansoni recuperadas por camundongo experimental
0
2
4
6
8
10
12
nº f
êmea
s re
cupe
rada
s/ca
mun
dong
o
PBS SL3261 pCI-neo pCI-Sm14 0
2
4
6
8
10
12
14
16
nº f
êmea
s re
cupe
rada
s/ca
mun
dong
oPBS SL3261 pCI-neo pCI-Sm14
1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO
2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO
Contagens de ovos maduros e imaturos de S. mansoni/ grama de fragmento intestinal dos camundongos.Estágio dos ovos PBS SL3261 SL3261 (pCI-neo) SL3261 (pCI-Sm14)
1º Ensaio
Ovos imaturos/nº de fêmeas recuperadas
751,45 ± 512,21 698,55 ± 566,76 630,75 ± 292,64 573,93 ± 448,13
Ovos maduros/nº de fêmeas recuperadas
201,90 ± 101,46 441,17 ± 497,26 239,20 ± 89,24 325,5 ± 139,01
2º Ensaio
Ovos imaturos/nº de fêmeas recuperadas
611,83 ± 381,15 993,61 ± 811,77 969,43 ± 556,60 660,77 ± 235,98
Ovos maduros/nº de fêmeas recuperadas
200,64 ± 138,49 470,09 ± 571,76 398,71 ± 187,59 303,97 ± 191,21
Contagens totais de ovos de S. mansoni/ grama de fragmento intestinal dos camundongos
0
2000
4000
6000
8000
10000
nº to
tal d
e ov
os/g
de
frag
men
to
inte
stin
al
PBS pCI-Sm14
0,0
5000,0
10000,0
15000,0
20000,0
25000,0
nº to
tal d
e ov
os/g
de
frag
men
to in
test
inal
PBS pCI-Sm14
1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO
2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO
ANÁLISE DE RESPOSTA IMUNE HUMORALPRODUÇÃO DE IgG anti-Sm14
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
D.O
. 492
nmPBS
SL3261
SL3261(pCI-neo)
SL3261(pCI-Sm14)
15 30 45 60 75 90
-0,02
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
D.O
.492
nm
PBS
SL3261
SL3261(pCI-neo)
SL3261(pCI-Sm14)
*
15 30 45 60 75 90
1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO
2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO
CONCLUSÕES
Não é possível afirmar que a imunização oral com a linhagem vacinal confere proteção a camundongos SWISS, após a infecção experimental com cercárias de S. mansoni.
A administração da linhagem de S. typhimurium carreadora de vacina de DNA induz produção de anticorpos IgG anti-Sm14 nos camundongos.
AGRADECIMENTOS
Pai, mãe e irmãos. Amigos de BH (Pterodactilo’s Corporation);
Amigos de Sete Lagoas; Carol. Professores Vasco Azevedo e Alan de Melo. Colegas do LGCM, do LTBI e do GIDE. Pessoal do LIDI e do Lab.
Imunoparasitologia. Pessoal da Biologia e da Genética.
Candidatos vacinais contra a esquistossomose
Antígeno Estágio expresso
Propriedade particular
Proteção conferida (%)
Cam. Rato Outros
(GST 28) Todos estágios Enzima 30-60 40-60 40 (primata)
(Sm97) Esquistossômuloverme adulto
Proteína muscular
30
(IrV-5) Todos estágios Proteína muscular
50-70 95 25 (primata)
(MAP-4) Todos estágios Enzima 30-40
Sm23(MAP-3)
Todos estágios Proteína integrada à membrana
40-50
Sm14 Esquistossômulo verme adulto
Antígeno de membrana
65 90-100 (coelho)
VACINA DE DNA
VIAS DE ADMINISTRAÇÃO
MECANISMOS DE TRANSFERÊNCIA DE PLASMÍDEOS VACINAIS POR BACTÉRIAS
CARREADORAS
WEISS & CHAKRABORTY, 2001.
ALGUMAS VACINAS DE DNA CARREADAS POR SALMONELLA
Linhagem Antígeno Doença Resposta imunológ
ica
S. typhimurium aro -
Listeriolisina (Listeria monocytogenes)
Infecção instesti
nal
Humoral e celular
S. typhimurium aro -
Antígeno de superfície do vírus da hepatite B
Hepatite B Humoral e celular
S. typhimurium aro -
Glicoproteína D do vírus da herpes
Herpes Humoral e celular
S. typhimurium aro -
ESAT-6 (Mycobacterium tuberculosis)
Tuberculose
-
S. typhimurium aro -
Peptídeo NS3 do vírus da hepatite C
Hepatite C Celular
S. typhimurium aro -
HIV-1 Env AIDS Celular
1798
Varíola
1981
Hepatite B
1992
VACINAS DE 1ª GERAÇÃO 2ª GERAÇÃO VACINAS DE DNA