imunologia prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2...
TRANSCRIPT
![Page 1: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/1.jpg)
Imunologia Prática30 % da nota final
É necessário aprovação para ir a exame teórico
2 trabalhos (Entregar final de Novembro):-Trabalho escrito (Grupos de 3 alunos max)-Apresentação oral (Método laboratorial)Teste prático (Dezembro)
![Page 2: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/2.jpg)
Trabalhos teóricosCancroAutoimunidadeTransplantaçãoHipersensibilidadeImunodeficiências PrimáriasVacinaçãoDefesas às infecçõesImunodeficiências SecundáriasDiversidade de AnticorposAnticorpos e AlergiasVacinas do cancroTerapia com anticorpos
![Page 3: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/3.jpg)
Apresentações de métodos laboratoriais
• Reacções de precipitação• Reacções de aglutinação• Reacções do complemento• ELISAs• Radioimunoensaios• Imunofluorescência• Separação de populações celulares• Citometria de fluxo• Estimulação celular e citotoxicidade• Estudos de funcionalidade celular
![Page 4: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/4.jpg)
Ag-Ab reactionsTests for Ag-Ab reactions
![Page 5: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/5.jpg)
Nature of Ag/Ab Reactions
• Lock and Key Concept
• Non-covalent Bonds– Hydrogen bonds– Electrostatic bonds– Van der Waal forces– Hydrophobic bonds
• Reversible
• Multiple Bonds
Source: Li, Y., Li, H., Smith-Gill, S. J.,
Mariuzza, R. A., Biochemistry 39, 6296, 2000
http://www.med.sc.edu:85/chime2/lyso-abfr.htm
![Page 6: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/6.jpg)
Affinity = attractive and repulsive forces
Ab
Ag
High Affinity
Ab
Ag
Low Affinity
Affinity
• Strength of the reaction between a single antigenic determinant and a single Ab combining site
![Page 7: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/7.jpg)
Calculation of Affinity
Ag + Ab Ag-Ab
Keq = [Ag-Ab]
[Ag] x [Ab]
Applying the Law of Mass Action:
![Page 8: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/8.jpg)
Avidity• The overall strength of binding between an Ag
with many determinants and multivalent Abs
Keq = 104
Affinity106
Avidity1010
Avidity
![Page 9: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/9.jpg)
Specificity
• The ability of an individual antibody combining site to react with only one antigenic determinant.
• The ability of a population of antibody molecules to react with only one antigen.
![Page 10: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/10.jpg)
Cross Reactivity• The ability of an individual Ab combining site to
react with more than one antigenic determinant.• The ability of a population of Ab molecules to
react with more than one Ag
Anti-A Ab
Ag A
Anti-A Ab
Ag B
Shared epitope
Anti-A Ab
Ag C
Similar epitope
Cross reactions
![Page 11: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/11.jpg)
Factors Affecting Measurement of Ag/Ab Reactions
• Affinity
• Avidity
• Ag:Ab ratio
• Physical form of Ag
Ab excess Ag excess
Equivalence – Lattice formation
![Page 12: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/12.jpg)
Tests Based on Ag/Ab Reactions
• All tests based on Ag/Ab reactions will have to depend on lattice formation or they will have to utilize ways to detect small immune complexes
• All tests based on Ag/Ab reactions can be used to detect either Ag or Ab
![Page 13: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/13.jpg)
Precipitation Tests
Lattice Formation
![Page 14: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/14.jpg)
Precipitation Reactions
• Involve soluble antigens with antibodies
Figure 18.3
![Page 15: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/15.jpg)
Radial Immunodiffusion (Mancini)
• Interpretation– Diameter of ring is
proportional to the concentration
• Quantitative– Ig levels
• Method– Ab in gel– Ag in a well
Ag Concentration
Dia
met
er2
AgAgAgAg
Ab in gel
![Page 16: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/16.jpg)
Factors Affecting precipitation Reactions
• pH variation
• Proportion Ag and Ab
• Ionic strength
• Temperature
Ab excess Ag excess
Equivalence – Lattice formation
![Page 17: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/17.jpg)
Curve of precipitation
![Page 18: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/18.jpg)
![Page 19: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/19.jpg)
Immunoelectrophoresis• Method
– Ags are separated by electrophoresis
• Interpretation– Precipitin arc represent individual antigens
Ag-+
Ag
Ab
Ag
Ab
– Ab is placed in trough cut in the agar
![Page 20: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/20.jpg)
Agglutination Tests
Lattice Formation
![Page 21: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/21.jpg)
Agglutination Reactions
• Involve particulate antigens and antibodies
• Antigens may be:
• On a cell (direct agglutination)
• Attached to latex spheres (indirect or passive agglutination)
Figure 18.4
![Page 22: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/22.jpg)
Hemagglutination
• Hemagglutination involves agglutination of RBCs.
• Viral hemagglutination inhibition tests for antibodies by the antibodies' ability to prevent viruses from agglutinating RBCs.
Figure 18.7
![Page 23: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/23.jpg)
Agglutination/Hemagglutination
• Definition - tests that have as their endpoint the agglutination of a particulate antigen– Agglutinin/hemagglutinin
+
• Qualitative agglutination test– Ag or Ab
![Page 24: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/24.jpg)
Antibody Titer
• Is the concentration of antibodies against a particular antigen
Figure 18.5
![Page 25: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/25.jpg)
Agglutination/Hemagglutination• Quantitative agglutination test
– Titer– Prozone
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
1/25
6
1/51
2
1/10
24
Pos
.
Neg
.
Titer
64
8
512
<2
32
128
32
4
Patient
1
2
3
4
5
6
7
8
![Page 26: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/26.jpg)
Agglutination/Hemagglutination
• Definition
• Qualitative test
• Quantitative test• Applications
– Blood typing– Bacterial infections
–Fourfold rise in titer
• Practical considerations– Easy– Semi-quantitative
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
8
1/25
6
1/51
2
![Page 27: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/27.jpg)
Passive Agglutination/Hemagglutination
• Definition - agglutination test done with a soluble antigen coated onto a particle
+
• Applications– Measurement of antibodies to soluble antigens
![Page 28: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/28.jpg)
Neutralization Reactions
• Eliminate the harmful effect of a virus or exotoxin
Figure 18.8b
![Page 29: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/29.jpg)
Coombs (Antiglobulin)Tests
• Incomplete Ab• Direct Coombs Test
– Detects antibodies on erythrocytes
+
Patient’s RBCs Coombs Reagent(Antiglobulin)
![Page 30: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/30.jpg)
Coombs (Antiglobulin)Tests
• Indirect Coombs Test– Detects anti-erythrocyte antibodies in serum
Patient’s Serum
TargetRBCs
+ Step 1
+
Coombs Reagent(Antiglobulin)
Step 2
![Page 31: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/31.jpg)
Coombs (Antiglobulin)Tests
• Applications– Detection of anti-Rh Ab– Autoimmune hemolytic anemia
![Page 32: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/32.jpg)
Agglutination/Hemagglutination Inhibition
• Definition - test based on the inhibition of agglutination due to competition with a soluble Ag
+
Prior to Test
+ +
Test
Patient’s sample
![Page 33: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/33.jpg)
Agglutination/Hemagglutination Inhibition
• Applications– Measurement of soluble Ag
• Practical considerations– Same as agglutination test
• Definition
![Page 34: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/34.jpg)
Immunoelectrophoresis
• Method
• Interpretation
• Qualitative– Relative concentration
![Page 35: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/35.jpg)
Countercurrent electrophoresis• Method
– Ag and Ab migrate toward each other by electrophoresis
– Used only when Ag and Ab have opposite charges
• Qualitative–Rapid
Ag Ab- +
![Page 36: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/36.jpg)
Radioimmuoassays (RIA)Enzyme-Linked Immunosorbent
Assays (ELISA)
Lattice formation not required
![Page 37: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/37.jpg)
Competitive RIA/ELISA for Ag
• Method– Determine amount
of Ab needed to bind to a known amount of labeled Ag
+
Prior to Test
Labeled Ag
+
Test
+Patient’ssample
LabeledAg
+
– Use predetermined amounts of labeled Ag and Ab and add a sample containing unlabeled Ag as a competitor
![Page 38: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/38.jpg)
Competitive RIA/ELISA for Ag • Method cont.
– Determine amount of labeled Ag bound to Ab NH4SO4
anti-Ig • Immobilize the Ab
• Quantitative– Most sensitive test
+ Test
+Patient’ssample
LabeledAg
+
– Concentration determined from a standard curve using known amounts of unlabeled Ag
SolidPhase
SolidPhase
![Page 39: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/39.jpg)
Solid Phase Non-Competitive RIA/ELISA
• Ab detection– Immobilize Ag– Incubate with sample– Add labeled anti-Ig– Amount of labeled Ab
bound is proportional to amount of Ab in the sample
• Quantitative
SolidPhase
AgImmobilized
Ab in Patient’s
sample
LabeledAnti-Ig
![Page 40: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/40.jpg)
Solid Phase Non-Competitive RIA/ELISA
• Ag detection– Immobilize Ab– Incubate with sample– Add labeled antibody– Amount of labeled Ab
bound is proportional to the amount of Ag in the sample
• Quantitative
SolidPhase
Ag
Immobilized
Ag in Patient’s
sample
LabeledAb
![Page 41: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/41.jpg)
Tests for Cell Associated Antigens
Lattice formation not required
![Page 42: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/42.jpg)
Immunofluorescence
• Direct– Ab to tissue Ag is labeled with fluorochrome
Ag
FluorochromeLabeled Ab
Tissue Section
![Page 43: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/43.jpg)
Immunofluorescence
• Indirect– Ab to tissue Ag is
unlabeled– Fluorochrome-labeled anti-
Ig is used to detect binding of the first Ab.
Ag
FluorochromeLabeled Anti-Ig
Tissue Section
UnlabeledAb
• Qualitative to Semi-Quantitative
![Page 44: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/44.jpg)
Immunofluorescence
• Flow Cytometry– Cells in suspension are labeld with fluorescent tag
• Direct or Indirect Fluorescence– Cells analyzed on a flow cytometer
FlowTip
Laser
FLDetector
LightScatter
Detector
![Page 45: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/45.jpg)
Immunofluorescence
• Flow Cytometry cont.– Data displayed
Green Fluorescence Intensity
Nu
mb
er o
f C
ells
Unstained cells
FITC-labeled cells
One Parameter Histogram
Red Fluorescence Intensity
Gre
en F
luor
esce
nce
In
ten
sity
Two Parameter Histogram
![Page 46: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/46.jpg)
Assays Based on Complement
Lattice formation not required
![Page 47: Imunologia Prática 30 % da nota final É necessário aprovação para ir a exame teórico 2 trabalhos (Entregar final de Novembro): -Trabalho escrito (Grupos](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062519/5697c02e1a28abf838cda0ae/html5/thumbnails/47.jpg)
Complement Fixation
– Ag mixed with test serum to be assayed for Ab– Standard amount of complement is added– Erythrocytes coated with Abs is added– Amount of erythrocyte lysis is determined
Ag
Patient’sserum
Ag No Ag
Ag
• Methodology