imunoprecipitaÇÃo e aglutinaÇÃo - … imunoprecipitação.pdf · •imunologia clínica na...
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Reações de Aglutinação e Precipitação
Pesquisa e quantificação de antígeno (Ag) e anticorpo (Ac)
• Dosagem de hormônios (T3, T4, TSH, etc.) e drogas
• Diagnóstico e acompanhamento de doenças infecciosas (pesquisa de Ag ou Ac)
• Entre outras aplicações.....
Perfil de anticorpos na rubéola
Hepatite por HBV
Diagnóstico e acompanhamento: pesquisa de Ags
virais e de Ac contra o vírus
Sensibilidade analítica
• É a menor quantidade do elemento em análise que o teste é capaz de detectar
• PSA Ultrassensível Sensibilidade – 0,003 ng/mL
• PSA: antígeno prostático específico: diagnóstico precoce e acompanhamento de alterações prostáticas
Especificidade Analítica
• Capacidade do teste de detectar apenas o analito em questão, sem reações cruzadas
• Fatores que levam a resultado falso-positivo:
–Presença de anticorpos naturais
–Poli infecções
o Anticorpos naturais
o Presentes em indivíduos sadios
o IgM que reage com polissacarídeos e lipídeos
Reação Cruzada
capacidade de um Ac produzido contra um Ag de se ligar a outros Ag estruturalmente semelhantes
• Ex: soro de pacientes com leishmaniose pode apresentar reação com Ag de Trypanosoma cruzi
Reação de Aglutinação
• Feita em: lâmina, tubo ou placa de microtitulação
• Reação com partículas insolúveis
• Fatores interferentes: classe de Ac, tempo, temperatura, presença de macromoléculas (ex.: albumina)
1 – Reação de aglutinação direta
• Pesquisa de Ag que faz parte naturalmente da célula (ou hemácia)
• Exemplos:
• Determinação de Ag de grupo sanguíneo dos sistemas ABO e Rh nas hemácias
Pesquisa de Ag na superfície das hemácias
• Pesquisa de Ag do sistema ABO e Rh
1 – Reação de aglutinação direta
• Pesquisa de Ac contra bactérias em amostras de soro
• Exemplos: Ac contre Leptospira, Brucela
2 – Reação de aglutinação indireta ou passiva
• Ag ou Ac não faz parte da partícula
• Exemplo:
• partículas de látex com Ac ou Ag adsorvido
• hemácias de aves com Ag de microrganismos (hemoaglutinação)
Reação de aglutinação de partículas de látex
• Exemplo: látex para Proteína C reativa (PCR), fator reumatoide ou para Ac anti-estreptolisina O (ASO, AEO)
• Kit de látex-PCR: usa partículas de látex com anticorpo anti PCR
• Kit de látex-ASO: usa partículas de látex com um Ag: estreptolisina O (obtida do Streptococcus)
Aglutinação de látex
Aglutinação passiva usando hemácias (hemo aglutinação)
• Hemácias sensibilizadas com Ag do micróbio
• Classe de Ac detectados (detecta todas as classes de Ac)
• Aplicações: sorologia para Ac anti-Toxoplasma gondii
• Usa hemácias sensibilizadas com Ag de Toxoplasma gondii
Reação de hemoaglutinação
3- Reação de Floculação
• VDRL (Venereal Disease Research Laboratory): • Triagem e controle de tratamento da sífilis
• Antígeno usado: cristais de colesterol, cardiolipina e lecitina
• Pesquisa Ac anti cardiolipina
Placa de Kline
VDRL
Síndrome do anticorpo anti fosfolipídio
• Organismo produz anticorpos que levam à formação de trombos
• Causa importante de abortos repetidos
Reação de Precipitação
•Ag e Ac são inicialmente solúveis
•Detecta precipitados
Pesquisa de crio globulinas (precipitação simples)
- crio globulinas em paciente com hepatite C
*** Crio globulinas: Ac que precipitam em temperaturas baixas
1 - Imunodifusão
• A precipitação ocorre em meio gelificado (gel de ágar ou agarose)
• Classificação: simples e dupla
Imunodifusão radial simples
• Anticorpo específico é incorporado à solução de ágar ou agarose antes da gelificação
• Aplicações: classes e subclasses de Ig, proteínas do complemento, proteína C reativa – PCR
Determinação da concentração de Ag por imunodifusão radial simples
Nos orifícios 1 a 12 acrescentar amostra de pacientes onde
se pesquisa Ag (ou Ac) ou padrão em diferentes concentrações
Como determinar a concentração do analito??
• Fazer curva com pelo menos 3 concentrações conhecidas do padrão para determinação da concentração do analito
Pesquisa de imunoglobulinas
• Diagnóstico de infecção
Diagnóstico de infecções intrauterinas (rubéola):
• pesquisar IgM no feto ou recém nascido
• Diagnóstico de câncer de células do sistema imune: mieloma múltiplo (↑ de IgG em grande parte de casos)
• Diagnóstico de alergia (pesquisa de IgE)
• Diagnóstico de imunodeficiências
IgM para diagnóstico de rubéola congênita (pré-natal)
Imunoglobulinas e idade
- Caracterizada por eczema, púrpura trombocitopênica e susceptibilidade a
infecções, frequentemente ocorre aumento de IgA e IgE
Eczema generalizado e infecção
secundária da pele
Imunodifusão radial dupla
• Antissoro e amostra são adicionados a orifícios
diferentes do gel de ágar (não são incorporados no ágar)
Imunoeletroforese (eletroforese seguida de imunodifusão)
Etapas:
1º Eletroforese de proteínas
• Separação das proteínas do soro do paciente de acordo com a carga em gel de agar ou agarose
Proteínas presentes no plasma sanguíneo
Frações
--------------globulinas----------------
Alterações no nível de algumas proteínas podem não provocar
alteração na eletroforese
Eletroforese de Proteínas
Imunoeletroforese
Imunofixação • Mais sensível e rápida que a imuno eletroforese
• Amostra é aplicada em 6 posições diferentes no gel de agarose e proteínas da amostra são fracionadas
• Soros mono-específicos (anti-IgG, anti-IgA) impregnados em fita de papel são aplicados em cada posição e difundem no gel
• Adicionar solução fixadora de proteínas
Detecção de Ag e Ac em reações de aglutinação e precipitação
• Vários fatores físico químicos e imunológicos interferem na ocorrência e visualização da reação Ag-Ac
• O máximo de precipitação (ou aglutinação) ocorre quando as quantidades de Ag e Ac são equivalentes
Curva de Precipitação
Pós zona Pró zona
• A concentração de Ac foi mantida fixa e adicionou-se concentrações crescente de Ag
Curva de Precipitação
• Se aplica também para os testes de aglutinação
A quantidade de Ac usada na técnica para detecção de um Ag interfere na sensibilidade da técnica?
Fenômeno (efeito) de pró-zona
• Ausência de reação detectável quando a quantidade de anticorpo presente numa amostra de soro é alta em relação à quantidade de antígeno usada no teste, gerando resultados falso-negativos
• Ex: altos títulos de Ac anti cardiolipina em paciente com sífilis
Onde estudar
• Imunoensaios – Fundamentos e Aplicações. VAZ, TAKEI, BUENO, 1ª edição, 2007
• Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Autoimunes – FERREIRA & MORAES, 3a edição, 2013
• Imunologia Clínica na Prática Médica – VOLTARELLI, DONADI, CARVALHO, ARRUDA, LOUZADA JR, SARTI, 1ª edição, 2008