Voorbereidingsopdracht

In de ban van het griepvirus

Een voorbereidende opdracht behorende bij de masterclass ‘In de ban van het

griepvirus’.

Besteed ongeveer 4 uur aan deze voorbereidende opdracht.

© 2016 Universiteit Utrecht: U-talent

Auteur: Andrea van Bruggen- van der Lugt MEd, onderwijsontwikkelaar U-talent

scheikunde

Voorkennis Je bent net gestart in vwo 5 of 6. Er wordt dan verondersteld dat je al veel weet over de ruimtelijke

bouw van eiwitten. Je kent de primaire eiwitstructuur als ook de secundaire, tertiaire en quaternaire

structuur. Je weet globaal hoe eiwitten worden gevormd door transcriptie (vertalen van de DNA code

voor een bepaald eiwit naar een RNA code) en translatie (vertalen van een RNA code naar een

aminozuurvolgorde).

Overleg ook met je vakdocent als je in deze onderwerpen hiaten veronderstelt, en vraag dan welke

opdrachten je moet maken om deze kennis te verkrijgen. Je bent er dan dus meer dan 4 uur mee

bezig.

Oriëntatie op de masterclass

Tijdens de masterclass krijg je een college over virusziekten. Daarna doe je een praktisch onderzoek

aan patiëntmateriaal, waarbij je vaststelt of er sprake is van een besmetting met een griepvirus. Je

gebruikt hierbij de microscoop gecombineerd met moleculair biologische technieken. Je onderzoekt

welke medicijnen werken tegen het virus. Tenslotte gaan we aan de slag met een

computermodelleerprogramma, dat je inzicht geeft in de driedimensionale structuur van

viruseiwitten en mogelijke aangrijpingspunten om het virus onschadelijk te maken.

2

Oriëntatie op deze voorbereidingsopdracht

Deze voorbereidingsopdracht bestaat uit drie delen.

Je start met een basisdeel waarin je de voorkennis ophaalt over eiwitten en een eerste oriëntatie

over virussen.

Je verdiept de kennis over eiwitten door modellen van eiwitten te bestuderen. Zo leer je vast op een

driedimensionale manier naar eiwitten kijken.

Tenslotte bestudeer je in een keuzeopdracht alvast één van de technieken die je tijdens het

laboratoriumonderzoek toepast. Je kunt kiezen uit diverse moleculair biologische technieken nl.:

- (Reverse Transcriptase) Polymerase Chain Reaction (RT- PCR)

- Poly Acrylamide Gel Elektroforese (PAGE).

- Het gebruik van fluorescerende eiwitten als marker voor het Golgi- systeem in de cel en

het virus.

- Het gebruik van HeLa cellen voor celkweek.

3

Basisopdrachten

Ophalen voorkennis

Het onderwerp van de masterclass ligt op het raakvlak van scheikunde en biologie. Het kan zijn dat

je een aantal van onderstaande begrippen nog niet gehad hebt. Met onderstaande vragen zorg je

ervoor dat je de juiste voorkennis hebt voor de masterclass.

Opdracht 1. Aminozuren

a. Jouw lichaam bestaat voor een groot deel uit eiwitten. Aminozuren zijn de bouwstenen van

eiwitten. Teken de structuurformule van het aminozuur glycine.

b. Twee aminozuren kunnen aan elkaar binden met een peptidebinding. Zoek uit hoe deze binding

gevormd wordt en teken vervolgens twee glycinemoleculen na binding.

c. Welk molecuul komt er vrij bij de vorming van een peptidebinding.

Opdracht 2. Eiwitten

a. Zoek uit en beschrijf hoe een eiwit gemaakt wordt. Begin bij het gen dat codeert voor een eiwit.

In jouw uitleg moeten de begrippen transcriptie, translatie, aminozuur en ribosoom voorkomen.

b. Omschrijf de primaire, secundaire, tertiaire en quartaire structuur van een eiwit?

Tijdens de masterclass ga je zelf een medicijn ontwerpen tegen neuraminidase, een eiwit dat een rol

speelt bij het ontsnappen van het griepvirus uit de gastheercel. Om dit te kunnen doen, heb je kennis

nodig van interacties tussen eiwitten in een lichaam. Daarover gaan de volgende vragen.

Eiwitdefecten en medicijnen

In elke cel zijn eiwitten verantwoordelijk voor allerlei processen. Zo zijn eiwitten belangrijk bij de

synthese van DNA, ons erfelijk materiaal; ze zijn aanwezig in het cytoskelet, dat de cel vorm en

stevigheid geeft; ze kunnen zuurstof transporteren, maar ook hulp geven bij de omzetting van een

molecuul in een ander molecuul. Voor elke functie is steeds weer een ander eiwit aanwezig en zo zit

een cel vol met eiwitten in allerlei soorten en maten, met elk een eigen vorm.

Eiwitten zijn opgebouwd uit aminozuren die in een lange keten aan elkaar gekoppeld zijn (figuur 1).

Elk eiwit varieert in de volgorde waarin de aminozuren aan elkaar gekoppeld zijn en de lengte van

de keten.

afbeelding 1

4

Opdracht 3. Aminozuren en eiwitten

a. Wat betekenen de termen peptidebinding, N-terminus, C-terminus, polypeptide backbone?

b. Er bestaan 20 aminozuren met elk een andere zijgroep (BINAS tabel 67C; afbeelding 2). In deze

afbeelding staat per aminozuur het iso-elektrisch punt genoemd. Dit is de pH waarde waarbij de

zijgroep van het aminozuur neutraal geladen is. Zoek op wat er gebeurt met de zijgroep van

Asparaginezuur als de pH waarde gelijk is aan die van ons bloed.

afbeelding 2 Door de wisselende chemische samenstelling van elk aminozuur veranderen ook de chemische eigenschappen van elk aminozuur en daarmee ook elk eiwit.

5

Opdracht 4. Polaire zijgroepen

Bestudeer afbeelding 3. Sommige zijgroepen van aminozuren zijn in een cel negatief geladen, positief

geladen, ongeladen polair en niet polair.

a. Zoek eerst uit wat het begrip ‘polair’ betekent.

b. Beschrijf voor elk van deze 4 mogelijkheden hoe een zijgroep aan deze chemische eigenschap kan

komen.

Afbeelding 3 Hoe elk eiwit zich vouwt tot zijn driedimensionale structuur, wordt vooral bepaald door de volgorde van de aminozuren. Door het ontstaan van verschillende bindingen tussen verschillende zijgroepen vouwt het eiwit zich op een bepaalde manier op (afbeelding 4).

afbeelding 4

Opdracht 5. Bindingen in eiwitten

a. Beschrijf de verschillende bindingen en rangschik de bindingen in sterkte.

6

b. In een cel zal elk eiwit zich zo opvouwen dat de hydrofobe groepen zich naar de binnenkant keren en

de hydrofiele groepen naar de buitenkant (zie afbeelding 5). Waarom?

afbeelding 5 Er zijn twee structuren die veel voorkomen in eiwitten: In de α – helix is de N-H binding in elke peptidebinding gebonden via een waterstofbrug aan een C=O groep van een naburige peptidebinding vier aminozuren verderop (afbeelding 6)

afbeelding 6 In de β-sheet is de keten in een plaatstructuur opgevouwen waarbij de verschillende delen in de keten bij elkaar worden gehouden met waterstofbruggen tussen de peptidebindingen in de verschillende delen. De keten kan zich parallel of antiparallel opvouwen (afbeelding 7).

7

afbeelding 7

Opdracht 6. α- helix en β

sheets

Bekijk onderstaand model van een klein

eiwit (afbeelding 8). Tijdens de

masterclass ga je met een computerprogramma een medicijn ontwerpen dat een interactie zal

aangaan met een eiwit dat een rol speelt bij een ziekte. De eiwitten zullen dan ook op deze manier

worden weergegeven.

Geef in onderstaand eiwit aan waar het eiwit zich heeft opgevouwen in een α- helix en in een β-sheet.

Afbeelding 8

De eerder genoemde niet-covalente bindingen spelen niet alleen een rol bij het vouwen van eiwitten. Nog belangrijker voor het medicijn dat jullie gaan ontwerpen is het feit dat ze ook een belangrijke rol spelen bij eiwit-substraat interacties. Dit is bijvoorbeeld het geval bij veel enzymen. Het enzym zal een binding moeten aangaan met het molecuul dat omgezet moet worden (het substraat). De binding van het substraat aan het enzym vindt plaats in het actieve centrum (afbeelding 9 en 10).

8

afbeelding 9

Afbeelding 10 Na binding van het substraat zal het enzym helpen bij de omzetting van het substraat, bijvoorbeeld de splitsing van maltose in twee glucose eenheden

(afbeelding 11)

Afbeelding 11 Bij veel ziekten spelen eiwitten een belangrijke rol. Soms wordt een bepaald eiwit teveel gemaakt of spelen eiwitten een rol bij de groei (vermeerdering) van bepaalde ziekteverwekkers zoals bacteriën of virussen. Wanneer we tijdens de masterclass een medicijn ontwerpen, doen we dat door in het actieve centrum van het eiwit een molecuul te brengen dat stevig zal binden. Op die manier kan het medicijn het eiwit blokkeren zodat de werking wordt geremd. Daarom gaan we op zoek naar positief geladen aminozuren en negatief geladen aminozuren. In opdracht 4 heb je beschreven hoe bijvoorbeeld glutaminezuur negatief geladen kan worden en lysine positief geladen. Je kunt het ook goed zien in afbeelding 4.

9

a. Wanneer in het actieve centrum van het eiwit positief geladen aminozuren aanwezig zijn, welke

groepen moet het medicijn dan bevatten voor een sterke binding op die plaats

b. Wanneer in het actieve centrum van het eiwit negatief geladen aminozuren aanwezig zijn, welke

groepen moet het medicijn dan bevatten voor een sterke binding op die plaats?

Virussen

a. Zoek uit en beschrijf wat virussen zijn. Maak daarbij onderscheid tussen DNA virussen, RNA

virussen, retrovirussen

b. Bestudeer in het bijzonder het griepvirus, bespreek de verschillende eiwitten die voorkomen in

het virus en waarom er jaarlijks nieuwe medicijnen tegen griep worden ontwikkeld.

c. Bekijk en beschrijf globaal de ruimtelijke bouw van de viruseiwitten die je hebt benoemd bij vraag

b.

Opdracht 7. Het actieve centrum

Opdracht 8. Virussen

10

Verdiepende opdrachten

De bouw van eiwitten weergegeven in een model

Veel informatie over de verschillende eiwitten kun je vinden in de Wikipedia (zowel de Engelse als

de Nederlandse versie) en in de proteopedia (http://www.proteopedia.org/), een soort wikipedia

voor eiwitstructuren. Kijk in de ‘structure index’ voor informatie per eiwit-type.

Zeer veel eiwit structuren (meer dan 100.000!) zijn opgeslagen in een vrij toegankelijke database,

de Protein Data Bank (PDB, http://www.rcsb.org/pdb). Voor de voorbereidingsopdracht zullen we

een aantal van deze 3D structuren bekijken met de Protein Workshop viewer die vanuit de PDB

pagina's toegankelijk is.

Tips voor het gebruik van Protopedia

- Als je op de groene tekst in de beschrijvingen klikt, verandert het 3D plaatje ter illustratie.

- Je kunt in het plaatje klikken en de structuur bewegen om iets beter te zien - Eventueel kun je op popup klikken om het plaatje in een groter venster te zien - Je kunt een plaatje bewaren door in het vlak van het plaatje te rechts-klikken en bestand –

export te selecteren

Opstarten: Voor het runnen van de viewer moet Java op je computer geïnstalleerd zijn. Meestal is dit het geval; zo niet installeer Java dan eerst. In principe opent de viewer als je op de link in de PDB pagina klikt (door op ‘view in 3D’ te klikken), maar soms gebeurt dit niet automatisch en moet je eerst een link downloaden.

Vervolgens dubbelklik je op deze link en de viewer opent met de structuur geladen. In sommige versies van Internet Explorer 11 werkt de link niet. In Chrome werkt de link. Wel kan het nodig zijn om linksonder in het browservenster te klikken

op RCSB-ProteinWorkshop.jnlp In OSX kan het zijn dat de veiligheidsinstellingen het uitvoeren van bestanden die niet uit de

Applestore afkomstig zijn verbieden. Om Protein Workshop toch uit te voeren in Safari: Klik op het “Toon downloads” icon rechtsboven. Rechts-klik op het bestand RCSB-ProteinWorkshop… en

selecteer “Toon in Finder”. In Finder CTRL+click op het bestand en selecteer open. Als Protein workshop is opgestart Laadt een andere structuur door te klikken op: File: Open PDB ID. De eerder getoonde structuur

verdwijnt. Als je twee structuren wilt vergelijken open je een tweede viewer vanaf de PDB-pagina of dubbelklik je nog een keer op de link.

o Vaak moet je even je muis bewegen om de nieuw geladen structuur te zien. Muis-acties:

o Linkerknop = draaien o Rechterknop = verschuiven o Middelknop = zoomen (op een Apple Mac met een twee-knops muis: CTRL+ALT plus muis is zoomen)

Plaatjes opslaan kun je onder: Options: Save Image of File: Save Image (je kunt kiezen tussen TIFF - PNG - JPEG format).

o Voor plaatjes is een witte achtergrond waarschijnlijk mooier: Shortcuts : Change the Background Color.

Tips voor gebruik van de Protein Workshop Viewer

11

De weergave aanpassen. Je kan dingen (on)zichtbaar maken, kleuren, labelen etc door de stappen 1-2-3 (zie rechter menu) te volgen en vervolgens in het venster eronder (nr. 4) op het juiste aminozuur, eiwit of molecule te klikken.

1. Selecteer welke eigenschap je wilt veranderen: bijv. Colors.

2. Selecteer waarop je het wilt toepassen: Atoms & Bonds (geldt ook als je hele aminozuren wilt kleuren/zichtbaar maken) - Ribbons - Surfaces (dit heeft alleen effect als je het moleculaire oppervlak van het eiwit laat zien)

3. Kies uit verschillende opties - hangt af wat je onder 1 hebt gekozen. 4. Selecteer het doelwit bijv. het ligand - een ion - het eiwit-een specifiek aminozuur in het

eiwit. o Je kunt ook op de ribbon of op individuele atomen klikken om je selecties toe te passen.

BELANGRIJK!!!!! Voordat je in het plaatje klikt om het te bewegen etc., zorg dat je onder tools - re-centering selecteert. Anders kunnen er ongewenste/onverwachte dingen gebeuren, want je kunt de tools opties nl ook toepassen door op het eiwit te klikken.

Als je het huidige beeld wilt bewaren om later nog eens naar terug te keren, klik: Options- Capture current viewer state (eerst een toepasselijke naam in het vakje invullen). De bewaarde "state"' komt dan in het lijstje onder Import state - Je krijgt het weer terug door op de naam te klikken.

o Het is aan te raden dit regelmatig te doen. o Dit werkt alleen zolang de viewer draait en je geen nieuwe structuur laadt, als je

het permanent wilt bewaren moet je het saven onder options-save selected state.

Intro:

Opdracht 9. HIV-I protease

12

Voor deze opdracht kijken we naar het enzym HIV-I protease. Human Immunodeficiency Virus (HIV)

is de veroorzaker van de ziekte AIDS. Het virus maakt zogenaamde poly-eiwitten. Deze bestaan uit

een aantal individuele eiwitten die samen worden gesynthetiseerd als 1 lange eiwitketen. Voordat

deze eiwitten hun werk kunnen doen moet die lange keten in de individuele eiwitten uiteen worden

geknipt. HIV-1 protease is het enzym dat deze functie uitvoert en HIV-1 protease is daarom cruciaal

voor de vermeerdering van HIV en dus een doelwit van veel AIDS remmers.

Afbeelding 12 Knippen van een poly-eiwit door HIV-1 protease

Gebruik Protopedia (zie tips hierboven) en Wikipedia en PDB (http://pdb101.rcsb.org/motm/6) om

de volgende vragen te beantwoorden:

1. Welke reactie kan een protease versnellen?

2. Beschrijf de bijzondere ruimtelijke bouw van dit viruseiwit.

3. Het substraat van HIV-1 protease is een polyeiwit (zie afbeelding 12). Waar denk je dat HIV-

1 protease zal gaan binden? Wat moet er gebeuren met HIV-I protease zodat het polyeiwit

in kleinere eiwitten geknipt kan worden?

4. Op welke manier kan HIV-I protease geremd worden (en hierdoor dan ook de ziekte AIDS)?

Er is een flink aantal 3D structuren bepaald van HIV-I protease met verschillende substraten/

remmers (kijk op Protopedia voor een complete lijst). We zullen een tweetal iets beter bekijken en

zien wat we er van kunnen leren:

Ga naar de Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb). Typ in de zoekbalk bovenin: 1HXB (elke structuur heeft een unieke identifier = PDB ID). Je ziet nu een pagina met veel informatie over 1HXB waar je waarschijnlijk niet zoveel

mee kunt; negeer dit. In het kort: 1HXB is HIV- I protease met het medicijn Saquinavar, een AIDSremmer.

Aan de linkerkant van de pagina zie je een plaatje van de 3D structuur van HIV-I protease. Kijk daaronder bij "Standalone Viewers" en open de Protein Workshop viewer (zie evt. ook

de hierboven beschreven Tips voor gebruik van de Protein Workshop Viewer) Je ziet nu het eiwit HIV-I protease in ribbon (lint) weergave, waarbij de eiwitketen is gekleurd

van amino-terminus --> carboxy terminus = blauw --> rood (als je niet meer weet wat het aminoterminus en carboxyterminus van een eiwit is kun je

dat opzoeken in opgave 3a) In de witte box aan de rechterzijde zie je wat er in de structuur aanwezig is: Chain A en B zijn twee eiwitketens;

Klik op chain A:hiv-1 protease en je ziet welke van de twee ketens chain a is doordat de aminozuurzijketens zichtbaar worden. Klik op + voor chain A:hiv-1 protease en je vouwt de lijst open om de aminozuren te zien. Klik op één van de aminozuren in je ziet waar het betreffende aminozuur zich bevindt in de

keten. Watermoleculen - die zullen we negeren

Vraag: 5. Is het een monomeer of multimeer eiwit?

6. Bestaat het uit voornamelijk α-helices of juist β-sheets?

Aminozuren die belangrijk zijn voor de enzymatische reactie van HIV-I protease zijn: Asparaginezuur

25, Threonine 26 en Glycine 27

Lokaliseer deze in de structuur (Tools – visibility – Atoms&bonds – klik Asp25,

13

THR26 en GLY27 in chain A en B Maak het moleculaire oppervlak van HIV-1 protease zichtbaar door de schuifbalk ongeveer

tot halverwege transparant en opaque (ondoorzichtig) te verschuiven (je wilt de onderliggende structuur blijven zien). Klik en beweeg het plaatje om het beeld te verversen.

Vraag:

7. Welke van deze drie aminozuren zal de belangrijkste rol spelen bij het knippen van het

polyeiwit?

8. Als je kijkt naar de vorm van het moleculaire oppervlak (beweeg het plaatje) en de positie

van de katalytische aminozuren, kun je dan voorspellen hoe het substraat (het polyeiwit)

bindt aan het eiwit?

Je kunt het oppervlak ook kleuren naar de mate waarin het oppervlak hydrofoob dan wel hydrofiel

of geladen is (knop onder de schuifbalk (hydrophobicity); geel = hydrofoob, wit = hydrofiel, blauw

= geladen aminozuren)

Vraag:

9. Wat is de overheersende eigenschap van het oppervlak richting de substraat/ remmer

bindingsplaats?

Hiv-1 protease behoort tot de familie van de aspartyl proteases. Deze groep enzymen kenmerkt zich

door de aanwezigheid van de aminozuurvolgorde Asp-Thr-Gly. Vanwege het belang van HIV-1

protease voor de virulentie van HIV zijn er honderden 3D structuren van dit eiwit bekend, waarvan

vele met remmers. In oktober 2014 waren er al 471 structuren van HIV-1 protease beschikbaar in

de Protein Data Bank.

Vraag:

10. Verklaar waarom het moeilijk is om HIV-I protease te kristalliseren (de techniek die nodig is

om deze 3D modellen te kunnen construeren) met het poly-eiwit.

(Tip: kristalliseren van eiwitten duurt enkele uren tot weken, afhankelijk van het eiwit en de

condities).

14

Keuzeopdrachten

Analyse technieken

Hieronder staat een viertal opdrachten (10 t/m 13) over diverse analysetechnieken die worden

toegepast tijdens de masterclass. Lees de opdrachten door en kies vervolgens welke opdracht je wilt

maken. Het is de bedoeling dat je er minstens één maakt. Verdiep je in de techniek waarvoor je de

meeste interesse voelt. Bereid je zo voor dat je, tijdens het experiment waarin je de betreffende

techniek toepast, het principe van de techniek kunt uitleggen aan je begeleider en medestudenten.

(Reverse Transcriptase) Polymerase Chain Reaction (PCR en RT-PCR)

Opdracht 10. PCR en RT- PCR

Beschrijf de techniek PCR.

Veel informatie kun je vinden

- Op bioplek

http://www.bioplek.org/animaties/moleculaire_genetica/PCRx.html

- in de nlt module forensisch onderzoek blz 110 t/m 113

http://betavak-nlt.nl/les/modules_v/gecertificeerd/00015/

Beschrijf in eigen woorden de verschillende stappen die plaatsvinden tijdens de PCR.

Wanneer je op school al eerder had kennis gemaakt met de techniek PCR, of wanneer je je verder

wilt verdiepen, kun je nog informatie verzamelen over RT-PCR. Beschrijf de rol van het enzym

Reverse Transcriptase en waarom soms RT-PCR moet worden toegepast in plaats van PCR.

https://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction

Gelelektroforese

Opdracht 11. Gelelektroforese

Beschrijf de techniek gelelektroforese.

Veel informatie kun je vinden op de link

http://www.mlochemie.nl/index.php/21-elektroforese

waarbij je door kunt klikken naar andere websites waaronder bioplek.

Leg uit op basis waarvan de verschillende stukjes DNA worden gescheiden.

Fluorescerende markers

Opdracht 12. Red Fluorescent Protein (RFP) en Green Fluorescent Protein (GFP)

Bestudeer het filmpje over een nobelprijswinaar die het Green Fluorescent Protein ontdekte.

http://www.youtube.com/watch?v=90wpvSp4l_0&feature=related

Beschrijf over dit eiwit

- waar het in de natuur wordt gevonden

- de bijzondere eigenschappen

- de bijzondere ruimtelijke bouw

- de mogelijkheden die dit eiwit biedt in onderzoek. Beschrijf de manier waarop dit eiwit wordt

gebruikt in moleculair biologisch onderzoek.

Meer informatie kun je ook vinden op de Engelstalige website van Wikipedia over dit eiwit.

Celkweek

Lees het artikel Celkweek- het zwarte goud van de wetenschap

Opdracht 13. HeLa cellen

15

http://www.sciencepalooza.nl/2012/06/celkweek-het-zwarte-goud-van-de-medische-wetenschap/

Beschrijf hoe de cellen van Henrietta Lacks hebben geleid tot wetenschappelijke doorbraken

(sommigen zelfs bekroond met een Nobelprijs!) zoals een poliovaccin. Welke speciale eigenschap

maakt HeLa-cellen (maar ook veel andere cellijnen) zo geschikt voor het gebruik in onderzoek? Meer

informatie is te vinden op de wikipediapagina’s over

celcultuur

https://nl.wikipedia.org/wiki/Celcultuur

en HeLa-cellen

https://en.wikipedia.org/wiki/HeLa

De basisopdracht met opdracht 1 t/m 7 is overgenomen (en voor deze voorbereidingsopdracht bewerkt) uit de

U-talent vwo 4 module ‘Ontwikkeling van medicijnen’ .

De verdiepende opdracht met opdracht 9 is overgenomen (en voor deze voorbereidende opdracht bewerkt) uit

de U-talent vwo 6 module ‘Eiwitstructuur en enzymkinetiek’.

Colofon

Deze opdracht is gemaakt voor U-Talent (http://www.u-talent.nl/) met bijdragen van:

U-Talent: o A.W. van Bruggen- van der Lugt MEd (auteur) o Drs. C.C. Kleijer (curriculumcoördinator)

Universiteit Utrecht, Faculteit Bètawetenschappen, Departement scheikunde o Ir. P.T. van Bentum

Voor deze voorbereidende opdracht geldt een

Creative Commons Naamsvermelding-Niet-commercieel-Gelijk delen 3.0

Nederland Licentie

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/nl

Het auteursrecht op de voorbereidende opdracht berust bij de Universiteit Utrecht en U-Talent

16