In vitro evaluacija gljivičnih izolata i nutritivne izmjene truljenja jabuke

SAŽETAK

Primarno širenje crnih mjesta za askospore proizvedene od prezimljenog lišća jabuke. Da biste efikasno pronašli degradirana legla, in vitro postupak prikazan na 59 gljivičnih izolata sa sposobnosti da kolonizira sterilizirano lišće jabuke. Izolati Aureobasidium, Alternaria, Chaetomium, Coniothyrium, Epicoccum, Fusarium, Phoma, Trichoderma i Ulocladium spp su nastali iz lišća ili od voćaka usjeva. Bijela trulež bazidomiceta izolata su bili iz plodonosnih tijela na maternjom bukvom, topolom . 18 izolata od koloniziranih disk listova najbrže su bile dalje testirane, sa amandmanima listova pet nutrijenata, za svoje aktivnosti na biorazgradnju disk listova. Nakon inkubacije na 10 ° C za 9 sedmica, najefikasniji izolati Trametes versicolor, Phoma, Epicoccum i Chaetomium spp. Izazvali su 54, 39, 37 i 23% smanjenje težine, odnosno, dok su izmjene i dopuni list, urea i mješavinu Mycorrcin ™ i Digestor ™, izazvali smanjenje 29 i 20%, respektivno. Ovi tretmani su odabrane za evaluaciju na polju.

UVOD

Jabučne crne točke ili jabučne kraste kao što je poznato u nekim zemljama, najviše su ekonomski značajne bolesti u jabukama širom svijeta. Ciklus bolesti patogena, Venturia inaequalis (Cooke) Wint., uključuje primarnu, zimsku faza u zaraženom lišću, iz koje se askospore izbacuju u proljeće, i sekundarni, ponavljajući nesavršenu fazu, koja se javlja na voću i ostaje od proljeća do jeseni. Obje faze zahtijevaju vlažno vrijeme i mlada tkiva za uspješnu infekcije i to je najčešće uobičajeno u proljeće, kada se oslobađaju askospore. Iznos primarnog inokuluma dostupan u voćnjacima u proljeće je ključni faktor u razvoju bolesti tokom cijele sezone rasta (MacHardy 1996).

Kontrola jabučne crne tačkavosti u razvijenim zemljama je u velikoj mjeri napredovala od primjene fungicidnog prskanja, koje se primjenjuje kad god se prate vremenske prilike i prognoza jabučnih crnih mrljan (Beresford i Manktelow 1994). Međutim, u svijetu pritisak za više održive sisteme u biljnoj proizvodnji dovela je do većeg naglaska stavljenog na integrisano upravljanje štetočinama, koji koriste niz kontrolnih strategija koje ciljaju različitim fazama razvoja patogena. Kod crnih mrlja jabuke proizvodnja askospora može se spriječiti ako se ukloni svo prezimljeno lišće, ali pod komercijalnim uvjetima voćnjaka ovo nije praktično (MacHardy 1996). Još jedan način za postizanje ovog je da se osigura potpuna degradacija zaraženog lišća prije sljedećeg proljeća. Korištenje prirodnih saprofitskih gljive za poboljšanje degradacije lista i da antagoniziraju V. inaequalis je prikazano u kanadskom laboratoriju (Philion et al 1997;. Kvimet et al 1997. godine.) i terenske studije (Carrisse et al. 2000). Primjena uree u jesen je da se poboljša degradacija lišća jabuke (Burchill 1968) i da se smanji proizvodnju askospora (Beresford et al. 2000. godine; Carisse et al. 2000). Cilj ovog projekta je da se podloga iz Novo Zelanda izolira sa saprofitskim gljivama , u kombinaciji sa nekoliko tretmana nutrijenata, za njihovu sposobnost da se degradira jabučno lišće.

Materijal i metode

Priprema izolata i diskova lista

U 59 gljivičnih izolata koji su odabrani iz rodova / vrsta Aureobasidium, Alternaria, Chaetomium, Coniothyrium, Epicoccum, Fusarium, Phoma, Trichoderma, Ulocladium i basidiomicete bijele truleži. Izolati bijee truleži su nastali iz plodonosnih tijela na maternjoj bukvi, topoli i voćkama, a drugi su bili izolati iz lišća ili voćaka. Izolati su dobijeni iz kulture zbirke Rouke Bakker i biljne patologije Grupe na Lincoln University, i iz HortResearch, Lincoln. Svi gljivični izolati su odrasli na krompir dekstroznom agaru (Oxoid), na 20ºC uz 12 h dnevnog svjetla. Inokulacionom je svaki izolat bio pripremljeni sa pet utikača promjera 1,4 cm reznih iz aktivnog rast ispred 7 dana stare kulture. Ovi se homogeniziraju u sterilnu plastičnu vrećicu s 50 ml sterilizirane vode koja sadrži 50 uL Tween 20, koristeći Stomacher laboratorijsku mješalicu, kao što je opisano od strane Philion et al. (1997).

Uzorci lišća jabuke su prikupljeni iz prskanja Red Delicious bloka u istraživanju voćnjaka na Lincoln University. Lisni diskovi, 1.3 cm u promjeru, su smanjeni oko donjeg ruba krila lopatica da se izbjegnu velike rane , jer za ova područja je ranije utvrđeno da pružaju diskove relativno uniforme težine (znači disk težine 3,5 mg ± 0.38 mg (SD) od 10 uzoraka 10 diskova). Diskovi su čuvati na 4 ° C do 2 sedmice , a zatim su sterilizirani gama zračenjem na 27.8 kGy od Schering-Plough Zdravlja životinja Ltd, Wellington.

Screen 1

Sterilni lisni diskovi su smješteni na 2% vodenog agara s pet diskova po petrijevki i dvije petrijevke po izolatu. Diskovi su svaki inokulisani sa 50 uL kapi kulture suspenzije. Diskovi su potom inkubirani za 7 dana na 20ºC 12 h na dnevnom svjetlu , na tacnama obloženim vlažnim papirom , ručnici i labavo umotani u nove plastične vrećice. Prečnici kolonija u razvoju su snimani svakodnevno za 4 dana, a zatim na dan 7. Kolonije srednjeg promjera su korištene kao osnova za izbor izolata za daljnje skeniranje , i što više moguće rodova da se predstavi.

Screen 2

Za osamnaest gljivičnih izolata (Tabela 1) i pet amandmana lišća prikaana je njihova efikasnost u ponižavajući senesced diskova listova jabuke, na dvije inkubacione temperature, 10 i 20 ° C, u 18 x 5 x 2 faktorijela eksperimenta. Sve izmjene i dopune su testirane na njihove preporučene koncentracije, ostvarene u steriliziranoj vodi koja sadrži 0,025% Citowett ™ (BASF Novi Zeland Limited, Auckland). Izmjene i dopune liste su bile:

1. Bio-Start ™, mješavinu dvije formulacije koje proizvodi Bio-Start Ltd, Auckland. Mycorrcin ™ i Digestor ™ su dodati 270 uL i 85 ml, odnosno, u 100 ml vode. Oba su opisani kao proizvodi bakterijske fermentacije na bazi prirodnih hranjivih podloga.

2. Jednostavno Organic ™, organski se bazira na ribi folijarno hranjivih proizvoda Folio Feed Gnojiva Ltd. Dunedin, po 5 ml / 100 ml vode. Ona sadrži azot (0.81% w / v = 5% proteina) i riblje ulje (4,1% w / w, 3.9% w / v), kao i druge hranjivih tvari i elemente u tragovima. Koncentracija ovih, prikazan kao mg / litru zagrade, bili Zn (5), Cu (0,6), Fe (0,7), Mn (0,7), Ca (1215), P (828), Cl (934),

S (324), Na (384), Mg (93), K (1430), Pb (3), Hg (<1), Cd (<1) i As (<1).

3. Vertex ™, a folijarno hranjive tvari koje proizvodi Headland Agrichemicals, Cambridge, Novi Zeland, na 200 uL / 100 ml vode. Ona sadrži N (12%), P (8%), K (2%), S (1,5%) i Mg (0,8%), a elementi u tragovima Bo (80 ppm), Zn (60 ppm), Ni (50 ppm) i Mb (10 ppm).

4. Urea na 5 g / 100 ml vode.

5. voda (koja sadrži 0,025% Citowett)

Za svaku kombinaciju faktora, bile su četiripetrijevke , svaka sadrži četiri lisna diska. Svaka treba da zadrži vlagu tokom dugog perioda inkubacije, 25 mm Deep Dish je ispunjen 25 ml sterilisane vode iz slavine i 50 ml prvorazrednog (2-3 mm) vermikulita, koji je dva puta autoklaviran za 30 minuta na 121ºC, sa jednom intervencijom u 24 h na sobnoj temperaturi.

Lisni diskovi su natopljeni za 5 min u svoje nutrijentnim rješenjima, koristeći topla sterilizirana, cjedila od nehrđajućeg čelika, a zatim se prazne i stavlja na vrh vermikulit sa ujednaĉenim rasporedom . Nakon inokulacije 50 uL po disku od micelija suspenzije, petrijevke su inkubirane na sobnoj temperaturi za 1 sedmicu . Posude su naslagane u slučajnom bloku i inkubirane na 10ºC i 20 ° C temperature u prostoriji. U 20ºC tretmana, posude su zabilježene da bude isušivane nakon 4 sedmice i još 25 ml alikvota sterilisanog vodom iz slavine.

Nakon 8 nedelja inkubacije, lisni diskovi su očišćena od čestica i vermikulit gljivičnih micelija, i sušena na 50 ° C za 48 h, originalni grupe od četiri diska iz svake posude se drže skupa. Grupe sastavljene od četiri diska analizirane varijance i značaja poređenja između tretmana su napravljene pomoću Fisher-a LSD testa (P = 0,05).

Rezultati

Screen 1

Stopa po kojoj gljivični izolati rastu na krilo diskova razlikuju se unutar i između rodova, uz neke izolate koji ne rastu, čak i kada se inokulacija ponovlja na svježe lisne diskove. Za one izolate koji nisu dobro rasli, 3 dana inkubacije je bilo dovoljno da razlikuju uzolati brzog i sporog rasta. 18 najbržih rastućih izolata izabrani su na drugi zaslon.

Screen 2

Nakon 9 sedmica inkubacije, gubitci težine diskova lista bili su znatno veći na 10ºC nego na 20ºC (P = 0,001). Postoje značajne razlike između gljiva (P = 0,001), i interakcije između gljivičnih izolata i temperature (P = 0,001) i između gljivičnih izolata i hranjivih tvari dopune (P = 0.045). Izolati koji su izazvai najveće smanjenje težine su Trametes, Phoma i Epicoccum spp. (Tabela 1).

Diskovi sa Trametes spp. su najteže kolonizovani, koji su prekriveni debelim prostirkama , koje su rasle izvan list diskova na vermikulitu . Lisni diskovi su također vrlo degradirani i pojavljuju se kao blijedo žuti i gotovo transparentni. Lisni diskovi tretirana Epicoccum i Ulocladium izolata također su pokazali upadljive micelije, uglavnom na rubovima diska.

Izmjene i dopune značajno se razlikuje u svojim ukupnim efektima (P = 0,001) (Tablica

1), s ureom je znatno veći gubitak težine (P <0.05) od ostalih nutrijenata izmjene i dopune. Gubici srednje težine za urea, Bio-Start ™, Vertex ™, Simply Organic ™ i vode, bili su 29, 20, 20, 20 i 17%, respektivno. Interakcija efekta nutrijenata izmjene i gljivičnih izolata je uglavnom zbog uree i poboljšanja učinka nekih izolata, posebno onih iz rodova Phoma, Epicoccum, Trichoderma, Fusarium, Ulocladium i Alternaria.

DISKUSIJA

Prvi zaslon izabran za izolat koji je u mogućnosti da brzo kolonizira lisne diskove, jedan važan atribut na terenu, gdje oni mogu da se takmiče sa primarnim kolonizatorima, koji koriste lako degradirane komponente u roku od nekoliko dana. Međutim, ovi primarni kolonizatori su u stanju da degradiraju složenije lisne komponenti, kao što su celuloza, hemicelulozai lignin, nanoseći ih da se zamijeniti sa drugim gljivama uzastopno (Frankland 1992). Drugi zaslon istražuje sposobnost najviših efektivnih primarni kolonizatora koji koriste složenije lisne komponente u dužem vremenski period. Na 10 ° C, temperature koja je omogućila veće truljenje i obezbedila najprikladniji odnos temperature zimi na zemljišta u Novom Zelandu, inkubacija za 9 sedmica rezultirala je najefikasnijim izolatom Trametes versicolor, Phoma, Epicoccum i Chaetomium spp. uzrokujući 54, 39, 37 i 23% smanjenje težine, respektivno. Od nutrijenata amandmana, samo urea je efikasniji od vode uzrokujući 29% smanjenje ukupne težine i 43% u kombinaciji sa Trametes versicolor.

Tabela 1: Srednja masa (mg) lisnih diskova nakon inokulacije sa gljivičnim izolatom i 9 sedmica inkubacije na 10 i 20 ° C (sredstva svih lisnih amandmana) i pet amandmana lisnih tretmana (sredstvo obje temperature). LSD (P <0,05) vrijednosti su izolati = 0.25, 0.42 i temperatura = hranjivih tvari = 0,29.

Rodovima koji su obavljeni o ovoj studiji je također utvrđeno da je efikasna i slična studija Philion et al. (1997). U svojoj studiji, izolati od Phoma, Epicoccum, Fusarium, Trichoderma i Chaetomium, bili su efikasni na smanjenje snage lisnih diskovi za 42, 41, 29, 18 i 21%, respektivno, a također inhibira proizvodnju askospora V. inaequalis za 41, 38, 26, 19 i 13%, respektivno. U dvostrukom agaru, studije i istraživanja pomoću kulture filtrata, Kvimet et al. (1997) također su utvrdili da izolati istih rodova imaju antagonistička svojstva, sprečavaju rast micelija V. inaequalis. Iako Chaetomium izolati nisu obavljali, kao drugi izolati laboratorijska istraživanja, u drugim studijama polju C. globosum je utvrđeno da dosljedno i učinkovito smanuju i broj askospora (Cullen et al. 1985). Gljive, koje uključuju Trametes spp., su zajednički saprofiti u mnogim vrstama legala i vrlo brzo razgrađuju celulozu, hemicelulozu i lignin (Rihani et al. 1995), iako nema izvještaja njihove upotrebe u kontroli V. inaequalis, možda zbog njihovih potencijalnih karakteristika. Međutim, njihova efikasnost u ovom procesu pokazuju da proces treba voditi da potvrdi svoju djelatnost pod uvjetima na terenu, prije nego što se proces patogenosti sa vodom koristi za sigurnost izolata.

Ovi rezultati pokazuju da su neki Novo Zelandski izolati saprofitskih gljiva su vjerojatno bili efikasni u jačanju degradacije lista. Budući pokusi će ocijeniti izolate Trametes versicolor od (HR131), Phoma (R236), Epicoccum (E062) i Chaetomium (CG1), a izmjene i dopune lista, urea i smijesa Bio-Start ™ proizvoda, kao prezimljavanje tretmani na lišću za smanjenje broja askospora u proljeće.