in vitro untersuchungen zur toxikologischen und … 06-03-201… · 5 zusammenfassung der arbeit...
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In vitro Untersuchungen zur toxikologischen und immunmodulatorischen Wirkung nanoskaliger Wolframcarbidpartikel
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
Dr.med.
an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig
eingereicht von
Ulrike Trahorsch geboren am 29.09.1981 in Belzig angefertigt am
Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung GmbH (UFZ) Leipzig in Kooperation mit dem Institut für Klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig betreut von
Prof. Dr. U. Sack, Frau Dr. I. Lehmann Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom 23.02.2011
We have to remember that what we see is not nature herself, but nature exposed to our
method of questioning
(Werner Karl Heisenberg, 1958)
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Bibliographische Beschreibung
In vitro Untersuchungen zur toxikologischen und immunmodulatorischen Wirkung
nanoskaliger Wolframcarbidpartikel
Trahorsch, Ulrike
Universität Leipzig, Dissertation
97 S., 156 Lit., 37Abb., 4 Tab., 3 Anlagen
Referat:
Inhalative Partikel können gesundheitsschädigende Wirkungen im Respirationstrakt
ausüben. Für Hartmetallstäube aus Wolframcarbidcobaltpartikeln wurden in epi-
demiologischen Studien Zusammenhänge mit dem Auftreten einer chronisch fibro-
tischen Lungenerkrankung aufgezeigt, der Hard Metal Lung Disease (HMLD). Zur Auf-
klärung ihrer Pathogenese wurden die biologischen Effekte mikroskaliger Wolfram-
carbidpartikel erforscht. Seit einigen Jahren werden zunehmend Pulver zur Her-
stellung von Hartmetall verwendet, deren Partikel Durchmesser im Nanometerbereich
aufweisen. In der vorliegenden Arbeit wurden daher in vitro die Effekte nanoskaliger
Wolframcarbidpartikel an humanen Zellen untersucht. Dabei wurden Partikelsuspen-
sionen mit unterschiedlichen Partikelgrößen und –zusammensetzungen verglichen.
Beurteilt wurden die Aufnahme der Partikel in die Zellen, ihre toxikologische Wirkung
und inflammatorische Mediatoren, die die exponierten Zellen als Reaktion auf die
Partikel sezernierten. In Bezug zur Exposition durch Inhalation wurden eine Lungen-
epithelzelllinie, eine Monozytenzelllinie und primäre mononukleäre Zellen aus dem
Blut untersucht. Es zeigte sich, dass die beobachteten Effekte sowohl partikelspezifisch
als auch zelltypspezifisch variierten. Dabei wurden die Partikel in alle Zelltypen
aufgenommen mit den stärksten Internalisierungsraten in humanen primären Mono-
zyten. Die Wolframcarbidcobalt-Partikel wirkten im Allgemeinen am stärksten
vitalitätsmindernd. Alle Partikelarten bewirkten in primären Monozyten eine stark
erhöhte Produktion von Zytokinen und Chemokinen. Untersuchungen zum
Mechanismus der Partikeleffekte wiesen auf die Beteiligung reaktiver
Sauerstoffspezies hin. Es konnten in der vorliegenden Arbeit bestehende Erkenntnisse
zur Toxizität von Wolframcarbidcobaltpartikeln bestätigt werden und Hinweise auf
die Beeinflussung biologischer Effekte durch verschiedene Partikelgrößen und
Oberflächeneigenschaften von Nanopartikeln gefunden werden.
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Abkürzungsverzeichnis
# Signifikante Hemmung * Signifikante Stimulation °C Grad Celsius µg Mikrogramm µl Mikroliter A549 humane Lungenepithelzelllinie ah anti human Ak Antikörper ca. Circa CB Kohlenstoff (engl. Carbon Black) CD Klassifizierung von Oberflächen-Antigenen (engl. cluster of differentiation) CO2 Kohlendioxid DMF N,N’-Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzym-Immunassay (engl. enzyme-linked mmunosorbent assay) FiTC Fluoresceinisocyanat FKS Fetales Kälberserum HMLD Hartmetall-Lunge (engl. Hard Metal Lung Disease) IFN Interferon IL Interleukin LPS Lipopolysaccharid M Molar MCP engl. monocyte chemoattractant protein mg Milligramm min Minute NAC N-Acetylcystein ng Nanogramm NHMP Natriumhexametaphosphat PBMC Periphere mononukleäre Zellen im Blut (engl. peripheral blood mononuclear cells) PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (engl. phophate buffered saline) PMA Phorbol-12-Myristat-13-Acetat ROS Reaktive Sauertsoffspezies (engl. reactive oxygen species) RPMI Zellkulturmedium (Roswell Park Memorial Insitute) RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat (engl. sodium dodecyl sulfate)
THP-1 Humane Makrophagenzelllinie
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TMB 3,3‘,5,5‘-Tetramethylbenzidin TNF Tumornekrosefaktor u.a. unter anderem
WC Wolframcarbid WC-Co Wolframcarbid-Cobalt
UFP Ultrafeine Partikel
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Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ____________________________________________________ VII
INHALTSVERZEICHNIS __________________________________________________________ IX
1 EINLEITUNG ________________________________________________________________ 1
1.1 WOLFRAMCARBIDE AM ARBEITSPLATZ UND IM LABOR ________________________________ 1 1.1.1 Herstellung und Anwendung _______________________________________________ 1 1.1.2 Gesundheitsrisiken durch Hartmetallaerosole __________________________________ 1 1.1.3 Untersuchungen zur Pathogenese der Hartmetall-Lunge _________________________ 2
1.2 NANOPARTIKEL, NANOPRODUKTE UND NANOTOXIKOLOGIE ____________________________ 3 1.2.1 Die besonderen Eigenschaften der Nanopartikel ________________________________ 3 1.2.2 Die Nanotoxikologie fußt auf der Toxikologie der Ultrafeinpartikel _________________ 6
1.3 DIE LUNGE ALS BARRIERE GEGENÜBER INHALATIVEN NANOPARTIKELN __________________ 7 1.3.1 Alveolarmakrophagen ____________________________________________________ 8 1.3.2 Zur Rolle des Alveolarepithels und den Wechselwirkungen mit anderen Zellen ________ 9
1.4 MECHANISMEN PARTIKELINDUZIERTER BIOLOGISCHER EFFEKTE _______________________ 12 1.4.1 Reaktive Sauerstoffspezies und Oxidativer Stress ______________________________ 12 1.4.2 Redoxsensitive Signalwege _______________________________________________ 13
1.5 ZIELSETZUNG DER ARBEIT _____________________________________________________ 14
2 MATERIAL UND METHODEN ________________________________________________ 16
2.1 ZELLKULTURARBEITEN _______________________________________________________ 16 2.1.1 Kultivierung der humanen Lungenepithel-Zellinie A549 _________________________ 16 2.1.2 Kultivierung und Differenzierung der humanen Monozytenlinie THP-1 _____________ 17 2.1.3 Präparation peripherer mononukleärer Zellen aus Spenderblut ___________________ 17 2.1.4 Verwendete Wolframcarbidpartikelsuspensionen ______________________________ 18 2.1.5 Exposition der Zellen ____________________________________________________ 19
2.2 MIKROSKOPISCHE AUFNAHMEN UND ENERGIEDISPERSIVE RÖNTGENSPEKTROSKOPIE _______ 21 2.2.1 Lichtmikroskopische Aufnahmen ___________________________________________ 21 2.2.2 Elektronenmikroskopische Aufnahmen und Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX, Röntgenspektralanalyse) ________________________________________________________ 21
2.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE _____________________________________________________ 22 2.4 DER MTT-TEST _____________________________________________________________ 24 2.5 DER ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY ______________________________________ 25 2.6 STATISTISCHE AUSWERTUNG ___________________________________________________ 28
3 ERGEBNISSE _______________________________________________________________ 29
3.1 DIE LOKALISATION DER PARTIKEL IN DEN UNTERSUCHTEN ZELLEN _____________________ 29 3.1.1 Lichtmikroskopische Aufnahmen ___________________________________________ 29 3.1.2 Rasterelektronische Aufnahmen und Röntgenspektralanalysen ____________________ 32
3.2 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR FRAGE DER AUFNAHME IN BZW. ANLAGERUNG DER PARTIKEL AN DIE ZELLEN ___________________________________________ 35 3.2.1 Veränderungen der Granularität durch Partikelexposition _______________________ 35 3.2.2 Untersuchungen zu verschiedenen Einflussfaktoren auf die Partikeleffekte __________ 39
3.3 EINFLUSS DER PARTIKEL AUF DIE ZELLVITALITÄT ___________________________________ 42 3.3.1 Partikeleffekte auf die A549-Zellen _________________________________________ 42 3.3.2 Partikeleffekte auf die THP-1-Zellen ________________________________________ 43 3.3.3 Partikeleffekte auf die PBMC _____________________________________________ 44
3.4 IMMUNMODULATORISCHE EFFEKTE DER WOLFRAMCARBIDPARTIKEL ____________________ 45 3.4.1 Reaktionen der A549-Zellen _______________________________________________ 46 3.4.2 Reaktionen der THP-1-Zellen _____________________________________________ 47
x
3.4.3 Reaktionen der PBMC ____________________________________________________ 48 3.4.4 Untersuchungen zum Mechanismus der Partikeleffekte __________________________ 50
3.4.4.1 Reaktion von PBMC auf inerte Latexpartikel ________________________________________ 50 3.4.4.2 Einfluss einer Vorstimulation mit LPS _____________________________________________ 50 3.4.4.3 Einfluss von Cobaltionen auf den Effekt der WC-Co-Partikel ___________________________ 51 3.4.4.4 Beteiligung von reaktiven Sauerstoffradikalen an den Partikeleffekten ____________________ 52 3.4.4.5 Der CD14-Rezeptor ____________________________________________________________ 54
4 DISKUSSION ________________________________________________________________ 57
4.1 ALLGEMEINE METHODOLOGISCHE ASPEKTE ________________________________________ 57 4.1.1 Zu den Partikelsuspensionen _______________________________________________ 57 4.1.2 Zu den in vitro Zellkulturmodellen __________________________________________ 59
4.2 PARTIKELAUFNAHME _________________________________________________________ 60 4.2.1 Lungenepithelzelllinie ____________________________________________________ 61 4.2.2 Aufnahmeverhalten der THP-1-Zellen und der primären Monozyten aus dem peripheren Blut 62 4.2.3 Einfluss spezieller Partikeleigenschaften auf die zelluläre Aufnahme. _______________ 63
4.3 PARTIKELEFFEKTE AUF DIE VITALITÄT ____________________________________________ 64 4.3.1 Toxische Effekte der Partikel auf A549-Zellen _________________________________ 64 4.3.2 Toxizität der Partikel gegenüber den THP-1-Zellen _____________________________ 65 4.3.3 Partikelspezifische toxische Effekte auf die PBMC ______________________________ 66
4.4 EINFLUSS DER WOLFRAMCARBIDPARTIKEL AUF DIE PRODUKTION VON IMMUNMODULATORISCHEN STOFFEN ________________________________________________________________________ 67 4.4.1 Partikeleinfluss auf die Zytokinproduktion von A549-Zellen ______________________ 68 4.4.2 Partikelspezifische Immunreaktionen der THP-1-Zellen _________________________ 69 4.4.3 Partikelinduzierte Stimulation der Zytokin- und Chemokinproduktion an PBMC ______ 70
4.5 MECHANISMEN DER PARTIKELWIRKUNG ___________________________________________ 72 4.5.1 Einfluss der Partikelgröße und -zusammensetzung ______________________________ 72 4.5.2 Reaktive Sauerstoffspezies und N-Acetylcystein ________________________________ 73 4.5.3 LPS-Wirkungen und der CD14-Rezeptor _____________________________________ 74
4.6 SCHLUSSFOLGERUNGEN UND AUSBLICK ___________________________________________ 76
5 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT ___________________________________________ 78
6 LITERATURVERZEICHNIS ___________________________________________________ 83
ANHÄNGE _______________________________________________________________________ 96
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Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abbildungen
1.1 Darstellung Größenordnung der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Nanopartikel
1.2 Vorhergesagte partielle Ablagerung inhalierter Partikel in den Atemwegen in Abhängigkeit von der Partikelgröße
1.3 Schematische Darstellung der Partikeleffekte im Respirationstrakt 1.4 Schematische Darstellung der oxidativen Hierarchie der Partikeleffekte 2.1 Schematische Darstellung des Messprinzips eines Durchflusszytometers 2.2 Prinzip des Sandwich-ELISA 2.3 Schema der Durchführung des ELISA unter Verwendung von OptEIA™-Kits 3.1 Lichtmikroskopische Abbildung der untersuchten Zellarten in Medium und
aqua dest. bzw. NHMP nach 24 Stunden Inkubation 3.2 Lichtmikroskopische Darstellung aller Zellarten nach 24stündiger Exposition
mit 30 µg/ml WC 100 3.3 Konzentrationsreihe der WC 100-Partikel auf THP-1-Zellen im
Lichtmikroskop nach 24stündiger Inkubation (Vergrößerung 100x) 3.4 Lichtmikroskopische Details der THP-1-Zellen nach 24stündiger Inkubation
mit Partikelsuspensionen 3.5 Lichtmikroskopische Darstellung von PBMC, für 24 Stunden exponiert mit
WC 100, Cytochalasin D und LPS (Vergr. 50x) 3.6 Rasterelektronenmikroskopische und röntgenspektralanalytische Darstellung
von PBMC nach 24stündiger Inkubation mit WC 100- und WC 10-Partikeln 3.7 Rasterelektronenmikroskopische und röntgenspektralanalytische Darstellung
von THP-1 nach 24stündiger Inkubation mit WC 100 bzw. WC 10 3.8 Veränderung der Granularität aller Zelltypen nach 20stündiger
Partikelexposition 3.9 Granularitätsänderungen in Abhängigkeit von unterschiedlichen
Partikelgrößen und Zelltypen sowie deren Beeinflussbarkeit durch Cytochalasin D
3.10 Granularität der PBMC nach 1, 3 bzw. 20 Stunden Inkubationszeit mit den Partikeln und verschiedenen Konzentrationen Cytochalasin D
3.11 Granularitätsänderungen durch unterschiedliche Partikelkonzentrationen 3.12 Veränderungen der Granularität von PBMC in Abhängigkeit von
unterschiedlichen Inkubationszeiten 3.13 Granularitätsveränderungen an unstimulieren und mit LPS vorstimulierten
PBMC eines Spenders nach Exposition mit 30 µg/ml WC 100 3.14 Ergebnisse des MTT-Tests an unstimulierten A549-Zellen 3.15 Partikeleffekte auf die Vitalität der THP-1-Zellen 3.16 Ergebnisse des MTT-Tests nach Exposition unstimulierter PBMC mit
Partikeln und CoCl2 3.17 Untersuchung der Partikeleffekte auf die Zytokinkonzentrationen im ELISA 3.18 Beeinflussung der Produktion von MCP-1 in A549-Zellen durch die Partikel 3.19 Partikeleffekte von WC 100 und WC-Co auf die Konzentrationen von MCP-1
und TNF-α im Kulturüberstand von THP-1-Zellen
xii
3.20 Zytokinkonzentrationen (IL-6, MCP-1, TNF-α) nach Partikelexposition auf PBMC
3.21 Vergleich der Partikeleffekte auf die IL-6-Konzentration an zwei Spendern 3.22 Partikeleffekte auf vorstimulierten PBMC 3.23 Vergleich der Wirkung von CoCl2 und WC-Co-Partikeln auf unstimulierte
PBMC 3.24 Auswirkung verschiedener NAC-Konzentrationen auf die MCP-1-Sekretion
partikelexponierter PBMC 3.25 Einfluss des Radikalfängers N-Acetylcystein auf die Partikeleffekte an
unstimulierten und stimulierten Zellen 3.26 Einfluss des Ausmaßes der Vorstimulation von PBMC auf die Wirkung von
N-Acetylcystein 3.27 LPS-Konzentrationsreihe und die Effekte eines monoklonalen anti-CD14-
Antikörpers Tabellen
2.1 Angabe der Konzentration und Größe der Partikel in den Suspensionen
2.2 Partikelcharakteristika, berechnet aus den nach verschiedenen Methoden ermittelten Durchmessern der Partikel bei einer Massenkonzentration von 0,1 mg/ml
2.3 Verwendete Konzentrationsreihe der Partikelsuspensionen als Massen-konzentration und Oberflächenkonzentration
3.1 Wirkung des anti-CD14-Antikörpers auf die Zytokinproduktion nach Partikelexposition
1
1 EINLEITUNG
Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des Projektes „Identifizierung und
Bewertung von Gesundheits- und Umweltauswirkungen von technischen
nanoskaligen Partikeln (INOS)“ durchgeführt, das vom Bundesministerium für
Bildung und Forschung gefördert wurde. Untersucht wurden die Effekte
verschiedener nanoskaliger Wolframcarbidpartikel auf humane Zellen.
1.1 Wolframcarbide am Arbeitsplatz und im Labor
1.1.1 Herstellung und Anwendung
Als Wolframcarbid (WC) wird eine nichtoxidische Keramik bezeichnet, die unter
anderem zur Werkzeugfertigung in der Hartmetallindustrie verwendet wird. Zur
Herstellung von Wolframcarbid wird Wolframoxid reduziert. Das entstandene
Wolfram-Metallpulver reagiert dann unter Hitze mit Kohlenstoff (carbon black, CB) zu
Wolframcarbid. Für den Einsatz als Hartmetall werden Wolframcarbid ca. 6
Massenprozent Cobalt als Bindephase zugegeben. Das Produkt, Wolframcarbid-Cobalt
(WC-Co), wird gepresst, hitzebehandelt und schließlich, beispielsweise durch
Schleifen, in seine endgültige Form gebracht. Hartmetalle sind gekennzeichnet durch
ihre außergewöhnliche Korrosionsbeständigkeit und ihre Härte, die im Gegensatz zu
anderen Metallen bei steigender Temperatur zunimmt. Dabei gilt: je feiner das Pulver
ist, aus dem der Werkstoff gefertigt ist, umso härter wird dieser (Fang et al. 2009).
Daher werden zunehmend Pulver mit nanoskaligen Partikeln verwendet,
beispielsweise zur Herstellung von hitzebeständigen Beschichtungen (Mohan und
Strutt 1996). Aus nanoskaligen Pudern gefertigte Hartmetallstücke zeichnen sich
insgesamt durch bessere Formbarkeit und mechanische Eigenschaften bei einer
homogenen Mikrostruktur aus (Dagani 1992).
1.1.2 Gesundheitsrisiken durch Hartmetallaerosole
Bei der Herstellung von Werkzeugen aus Hartmetall besteht die Möglichkeit, dass die
Partikel der verarbeiteten Pulver eingeatmet werden. Hinweise auf eine Gesundheits-
gefährdung durch Hartmetallstäube gibt es bereits seit vielen Jahren (Bech et al. 1962).
Im Jahresbericht der Deutschen Forschungsgemeinschaft (2004) wurden
2
wolframcarbid- und cobalthaltige Hartmetalle auf der Basis von epidemiologischen
Daten beim Menschen als Krebs erzeugend bewertet. Die Karzinogenität von Cobalt ist
bereits länger anerkannt (International Agency for Research of Cancer 1991). Diese
Bewertungen haben eine hohe Relevanz hinsichtlich der notwendigen Maßnahmen,
die zu ergreifen sind, um das Risiko für exponierte Arbeiter zu minimieren (Bochmann
et al. 2008). Das Einatmen von Stäuben während der Produktion von Hartmetallen
wird mit der Entstehung von berufsbezogenem Asthma, der sogenannten Hartmetall-
Pneumopathie (Hard Metal Lung Disease, HMLD) und Lungenkrebs in Verbindung
gebracht (Lasfargues et al. 1994). Die HMLD ist eine entschädigungspflichtige,
anerkannte Berufskrankheit, bei der die Patienten unter den Symptomen einer
restriktiven Lungenkrankheit mit reduzierter Diffusionskapazität leiden. Klinisch
äußert sich dies meist als chronischer Husten und Luftnot, häufig im Zusammenhang
mit Schwäche und Gewichtsverlust. Dabei zeigen manche Patienten eine subakute
Symptomatik, die nur während der Arbeit auftritt, während die Krankheit in anderen
Fällen schnell bis zur Lungenfibrose fortschreitet. Die HMLD kann bereits nach einer
sehr kurzen Expositionszeit autreten. Daher wird vermutet, dass die individuelle
Anfälligkeit eine größere Rolle spielt als die kumulative Belastung mit Hartmetall-
partikeln (Nemery et al. 2001). Umso bedeutsamer ist es, Grenzwerte für die
Staubbelastung der exponierten Arbeiter festzulegen und einzuhalten.
1.1.3 Untersuchungen zur Pathogenese der Hartmetall-Lunge
Das pathohistologische Bild der HMLD ist einzigartig. Als pathognomonisch gilt die
Anwesenheit ‚kannibalistischer’ vielkerniger Riesenzellen im Alveolarraum bzw. in
der bronchoalveolären Spülflüssigkeit Betroffener, weshalb die Erkrankung auch als
Giant Cell Interstitial Pneumonia bezeichnet wird (Nemery et al. 2001). Moriyama et al.
(2007) beschrieben, dass Wolfram im Lungengewebe von HMLD-Patienten stets in Ko-
Lokalisation mit Monozyten bzw. Makrophagen auftrat, die sich zu Riesenzellen
entwickelt hatten.
Die genaue Pathogenese der HMLD ist allerdings noch nicht bekannt. Die einzelnen
Bestandteile des Hartmetalls, Cobalt und WC-Partikel, kommen als pathogenetische
Faktoren in Frage (Bech et al. 1962, Lison et al. 1996). Es wird vermutet, dass u.a.
reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) die pathologischen Effekte
vermitteln. Dafür spricht, dass Cobaltionen die Bildung von ROS induzieren (Lewis et
3
al. 1991). In Anwesenheit von WC-Partikeln ist dieser Effekt deutlich verstärkt (Lison
et al. 1995). Durch WC-Co-induzierte ROS zeigten Effekte auf die Regulation von
Genen, die in apoptotische Prozesse und die Immunantwort invoviert sind (Lombaert
et al. 2004, 2008). Aus den Untersuchungen zu ROS im Zusammenhang mit der HMLD
wurde gefolgert, dass die individuelle Ausprägung antioxidativer Mechanismen die
Pathogenese der HMLD beeinflussen könnte (Nemery und Abraham 2007). Viele
Patienten mit HMLD beklagen zusätzlich zu den respiratorischen Symptomen einen
unverhältnismäßig starken Gewichtsverlust. Daher liegt die Vermutung nahe, dass
inflammatorische Mediatoren, wie der Tumornekrose-Faktor-α (TNF-α), ebenfalls eine
Rolle in der Pathogenese der HMLD spielen (Rolfe et al. 1992).
Die HMLD ist also eine Erkrankung, die aufgrund der bekannten epidemiologischen
Zusammenhänge eine wichtige Rolle bei der Erforschung möglicher pathogenetischer
Effekte inhalierbarer Partikel spielt. Die bisherigen experimentellen Untersuchungen
wurden vorwiegend an Partikeln mit Durchmessern im Mikrometerbereich durch-
geführt. Durch die zunehmende Exposition gegenüber Wolframcarbidpartikeln mit
Partikeldurchmessern im Nanometerbereich wächst der Bedarf an der Erforschung
ihrer biologischen Effekte.
Die Erzeugung nanoskaliger Wolframcarbidpartikel kann der Nanotechnologie
zugeordnet werden, die schon heute zu den Schlüsseltechnologien des 21. Jahr-
hunderts zählt. Es handelt sich hierbei nicht um eine spezifische Technik, sondern ein
breites Feld unterschiedlichster Anwendungen. Ihr gemeinsames Merkmal ist die
„Manipulation, die präzise Einbringung, Messung, Modellierung und Erzeugung von
Materialien kleiner als 100 nm“ (Meyer et al. 2001, S. 7). Unter dem Oberbegriff der
Nanotechnologie werden also neue Technologiebereiche zusammengefasst, die Nano-
partikel und Nanomaterialien produzieren und verwenden.
1.2 Nanopartikel, Nanoprodukte und Nanotoxikologie
1.2.1 Die besonderen Eigenschaften der Nanopartikel
Die American Society for Testing and Materials, eine internationale Standardisierungs-
organisation, definiert Nanopartikel als eine Untergruppe der ultrafeinen Partikel
(UFP), deren Längen in zwei oder drei Dimensionen mehr als 1 nm, aber weniger als
100 nm betragen. (ASTM International 2006). Die metrische Vorsilbe ‚nano’ kommt aus
4
dem Griechischen und bedeutet ‚Zwerg’. Zur Veranschaulichung der Größen-
verhältnisse kann folgender Vergleich dienen: Atome haben einen Durchmesser von
etwa 0,15 - 0,5 nm, Moleküle sind einige Nanometer und Makromoleküle einige 10 nm
groß. Ein Blatt Papier hingegen ist 100 000 nm dick. In Abbildung 1.1 sind die
Größenverhältnisse in Bezug zu den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Partikeln
dargestellt.
Nanopartikel können Eigenschaften aufweisen, die sich von denen makroskaliger
Partikel deutlich unterscheiden. Die Hauptursachen hierfür sind die erhöhte relative
Oberfläche pro Masseeinheit und das Auftreten von Quanteneffekten. Erstere führt zu
einer erhöhten chemischen Reaktivität, da bei linearer Abnahme des Partikeldurch-
messers exponentiell mehr Atome an der Oberfläche des Stoffgemisches liegen und so
mit der Umgebung reagieren können. Quanteneffekte können die optischen,
magnetischen und elektrischen Eigenschaften von Partikeln, die 30 nm und kleiner
sind, stark verändern (Borm et al. 2006; The Royal Society of Engineering 2004).
Viele Nanoprodukte haben bereits den Weg in unser tägliches Leben gefunden. Bereits
2006 gab es auf dem Markt mehr als 300 Produkte, die auf Nanotechnologie basieren.
Diese finden sich sowohl in der Automobilindustrie und der Elektronik, als auch in der
Biologie, der Umwelttechnik oder der Pharmazie. Ein wichtiges Gebiet der
Anwendung von Nanopartikeln umfasst die Entwicklung neuartiger Medikamente. So
Abb. 1.1: Größenordnung der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Nanopartikel Geändert nach „Nanoscience and nanotechnologies: opportunities and uncertainties.” The Royal Society and the Royal Academy of Engnieering (2004), d: Durchmesser, WC: Wolframcarbid
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sollen Nanopartikel als Transportvehikel die Blut-Hirn-Schranke überwinden (Kreuter
et al. 2002) oder mittels Hyperthermie Krebszellen zerstören (Jordan et al. 2006). Je
häufiger Nanopartikel im Alltag verwendet werden, umso dringender stellt sich die
Frage nach ihren Wechselwirkungen mit dem menschlichen Körper und daraus
eventuell erwachsenden Risiken. Obwohl die Nanotechnologie vielfältige
Möglichkeiten bietet, bleibt also die Frage zu klären, welche potentiellen Gefahren für
Gesundheit und Umwelt sich aus der weitreichenden Anwendung dieser Partikel
ergeben.
Menschen waren gegenüber kleinsten Partikeln bereits exponiert, lange bevor die
Technik sich diesen Raum eroberte. Während Sporen, Pollen, Pilze und Bakterien als
biogene Partikel auf den Menschen einwirken, verursachen Sandstürme oder Vulkan-
ausbrüche eine Exposition mit mineralischen Stäuben, deren Partikel ebenfalls Durch-
messer im Mikro- und Nanometerbereich aufweisen. Seitdem der Mensch das Feuer
beherrscht, ist er regelmäßig feinsten inhalativen Rußpartikeln ausgesetzt. Die
industrielle Revolution brachte eine enorme Zunahme dieser anthropogenen Partikel
durch die vielfältigen Verbrennungsprozesse von Motoren und Fabriken.
Im 20. Jahrhundert wurde man sich zunehmend möglicher Gesundheitsgefährdungen
durch feinste Partikel in der Atemluft bewusst. Die Partikeltoxikologie begann, diese
Risiken genauer zu erforschen. Im Zusammenhang mit den vielfältigen Anwendungen
von Nanopartikeln erschien 2004 eine Veröffentlichung von Donaldson, in der das
Arbeitsfeld der Nanotoxikologie als Unterkategorie der Toxikologie seine Namens-
gebung und breite wissenschaftliche Aufmerksamkeit erlangte (Donaldson et al. 2004).
Definiert wurde die Nanotoxikolgie kurz darauf als „Wissenschaft von hergestellten
Nanostrukturen und –Materialien, die sich mit deren Effekten im lebenden
Organismus beschäftigt“ (Oberdörster et al. 2005, S. 824). Im Jahr 2006 wurden dann
von führenden Wissenschaftlern fünf große Herausforderungen an die
Nanotoxikologie formuliert. Darunter fand sich die Exploration neuer Teststrategien,
die auf die Besonderheiten von Nanopartikeln abgestimmt sind. Dadurch sollen eine
Überprüfung neuer Nanomaterialien ermöglicht und Alternativen zu in vivo Tests
aufgezeigt werden. Das wichtigste Ziel der Nanotoxikologie sei es demnach,
Vorhersagen zu den Gefahrenpotentialen von Nanopartikeln auf die menschliche
Gesundheit zu treffen (Maynard et al. 2006). Dieses Ziel verfolgt auch das INOS-
Projekt.
6
1.2.2 Die Nanotoxikologie fußt auf der Toxikologie der Ultrafeinpartikel
Mit den Effekten von nanoskaligen Partikeln im Atmungstrakt beschäftigt sich die
Partikeltoxikologie schon seit geraumer Zeit. Dies geschieht im Rahmen der Forschung
zu Gesundheitseffekten anthropogener inhalativer Partikel, des Feinstaubs, zu dessen
Bestandteilen ultrafeine Partikel (UFP) zählen (Oberdörster et al. 1996). UFP sind nano-
partikuläre Luftverunreinigungen, die im Gegensatz zu industriell eingesetzten Nano-
partikeln nicht kontrolliert oder bewusst technologisch hergestellt wurden
(Oberdörster 2005). Sie stellen chemisch heterogene Gemische dar. Ihr toxikologisches
Potential könnte Hinweise auf Gesundheitsgefährdungen durch industriell hergestellte
Nanopartikel geben. Die Toxikologie der Ultrafeinpartikel beschäftigt sich vorwiegend
mit Effekten, die Partikel auf Zellen der Atemwege ausüben. Das Spektrum der
untersuchten Zellmodelle wurde erweitert, als sich Hinweise mehrten, dass inhalierte
feinste Partikel die Alveolar-Blut-Schranke überwinden können (Nemmar et al. 2002).
Die systematische Forschung zu inhalativen Partikeln im Größenbereich von 1-100 nm
und ihren Auswirkungen auf die Gesundheit begann in den 80er Jahren des 20.
Jahrhunderts (Oberdörster et al. 1990). In epidemiologischen Studien wurde nach-
gewiesen, dass eine erhöhte Feinstaubkonzentration in der Atemluft mit deutlichen
Mortilitäts- und Morbiditätsrisiken einherging (Dockery 1993). Auch im arbeits-
medizinischen Bereich wurden seit langem Zusammenhänge zwischen der Exposition
gegenüber Stäuben und pulmonalen Erkrankungen untersucht. Beispiele hierfür sind
die Pneumokoniosen bei Bergleuten im Kohlebau und die oben beschriebene HMLD
bei Industriearbeitern (Heppleston 1992, Sprince et al. 1984).
In vivo Studien an inhalierbaren Partikeln führten zu der Erkenntnis, dass im All-
gemeinen nicht die Gesamtdosis der Stäube, sondern vielmehr die Partikelgröße bzw.
ihre Struktur die biologischen Effekte bedingten (Oberdörster 2001). Dabei gilt zumeist:
je kleiner ein Partikel, desto toxischer wirkt es (Oberdörster et al. 2005). Dies ist eine
der grundlegenden Hypothesen der Nanotoxikologie. Da mit abnehmendem Durch-
messer der Partikel ihre Oberflächenausdehnung und damit die Wahrscheinlichkeit
von Interaktionen mit der biologischen Umgebung stark zunimmt, wird die Relation
der Oberfläche zur Masse als ein möglicher Prädiktor für die Toxizität von
Nanopartikeln angesehen (Oberdörster 2000).
7
1.3 Die Lunge als Barriere gegenüber inhalativen Nanopartikeln
Für Expositionsversuche mit Nanopartikeln werden üblicherweise Partikelkonzen-
trationen von 1-100 µg/ml auf 106 Zellen verwendet. Ein Literaturbeispiel zeigt, dass
diese Konzentrationen praxisrelevant sein könnten. Stefaniak et al. ermittelten die
Konzentration und Zusammensetzung von Stäuben in der Raumluft an verschiedenen
Arbeitsplätzen einer Hartmetallfabrik. Dabei fanden sie überwiegend 1-3 µm große W,
Co und WC-Co-Partikel in Konzentrationen zwischen 128 und 4.031 µg/m3 (Stefaniak
et al. 2007). Bei einem Hartmetallarbeiter dieser Fabrik könnten sich die inhalierten
Partikel innerhalb von 24 Stunden zu einer Gesamtmenge von 900µg bis zu mehreren
Gramm akkumulieren. Da die Epithelflüssigkeit der Lunge bei einem Erwachsenen ein
geschätztes Volumen von 40-50ml hat (Hofer et al. 2004), betrüge die akkumulierte
Partikelmasse ungefähr 90-400 µg/ml, was im Rahmen der experimentell eingesetzten
Massenkonzentrationen liegt.
Diese sehr hohen errechneten Partikelkonzentrationen ergeben sich aus der
Schwankungsbreite der ermittelten Partikelkonzentrationen des Literaturbeispiels und
der rechnerischen Annahme, dass alle eingeatmeten Partikel sich in der Lunge
ablagern. Dies entspricht jedoch nicht der physiologischen Realität. Bei der
Betrachtung der Ablagerung von Partikeln in der Lunge müssen mehrere
physikalische Prozesse unterschieden werden. Die Partikel unterliegen, je nach ihrem
Durchmesser, der Diffusion und/oder der Sedimentation (Oberdörster et al. 2005). Vor
diesem Hintergrund wurden mathematische Modelle entwickelt, die Voraussagen zum
Ort der Ablagerung von Partikeln im Respirationstrakt treffen (International Commission
on Radiological Protection 1994). Partikel, die größer sind als 10 µm, kommen laut der
Modellrechnungen kaum über die Verzweigungen der Bronchien hinaus. Dort
sedimentieren sie, werden durch das Flimmerepithel wieder in den oberen Atemtrakt
transportiert und zumeist verschluckt. In der Alveolarregion lagern sich vor allem
Partikel mit einem Durchmesser zwischen 10 nm und 2,5 µm ab (Asgharian und Price
2007, Oberdörster et al. 2005) (s. Abb. 1.2). Es konnte experimentell nachgewiesen
werden, dass die Partikelablagerung in der menschlichen Lunge mit sinkendem
Durchmesser der Partikel zunimmt (Jaques und Kim 2000). In der Alveole kommen die
Partikel unmittelbar mit dem proteinhaltigen Surfactant in Kontakt (Schürch et al.
1990). Dabei ist es möglich, dass sich die Proteine zusammen mit den inhalierten
8
Partikeln zu Komplexen verbinden. Dies kann die Translokation der Nanopartikel
durch die Alveolarwand hindurch beeinflussen (Borm et al. 2006). Außerdem können
Proteine durch die Interaktion mit den Partikeln ihre Funktionalität und ihre
Konformation verändern – bis hin zur Denaturierung (Lynch et al. 2006).
1.3.1 Alveolarmakrophagen
Der Respirationstrakt verfügt über verschiedene Mechanismen, um mit der Atemluft
aufgenommene Partikel zu eliminieren. In der Alveolarregion geschieht dies vorrangig
durch die Aufnahme von Partikeln in Alveolarmakrophagen. Nanopartikel werden im
Vergleich zu größeren Partikeln weniger effizient phagozytiert, können die Beweglich-
keit der Alveolarmakrophagen verringern und zusätzlich zur Schwächung nach-
folgender Phagozytoseprozesse führen (Lundborg et al. 2001, Möller et al. 2002).
Werden proteinumhüllte Partikel von Makrophagen aufgenommen, können die Zellen
als Reaktion darauf ROS und proinflammatorische Botenstoffe sezernieren (Park 2003,
Vanhee et al. 1995, Driscoll und Maurer 1991). Diese Mediatoren dienen beispielsweise
der Aktivierung weiterer Entzündungszellen und können somit eine lokale
inflammatorische Reaktion auslösen (Li et al. 1997, Brown et al. 2004). Die Aufnahme
von Partikeln kann des Weiteren aufgrund der Belastung mit ROS dazu führen, dass
die Makrophagen in Apoptose gehen (Li et al. 2003). Unter physiologischen
Umständen können diese apoptotischen Zellen durch vitale Makrophagen
phagozytiert werden, die daraufhin antiinflammatorische Mediatoren sezernieren und
damit die Entzündungsprozesse eindämmen (Savill 1997). Wenn allerdings die
Phagozytosefähigkeit der Makrophagen insgesamt zu stark beeinträchtigt ist, werden
Abb.1.2: Vorhergesagte partielle Ablagerung inhalierter Partikel in den Atemwegen in Abhängig-keit von der Partikelgröße Abhängigkeit der Ablagerung von Partikeln im Nasopharyngealtrakt (links), in der Luftröhre bzw. den Bronchien (Mitte) und in der Alveolarregion (rechts) von der Größe der Partikel. Basierend auf Daten der International Commission on Radiological Protection 1994 (nach Oberdörster 2005)
9
die apoptotischen Zellen nicht mehr aufgenommen und gehen sekundär in Nekrose.
Hierin kann eine Ursache für überschießende und lang anhaltende Entzündungs-
prozesse nach Partikelexposition liegen (Stern et al. 1996, Duffield 2003). Chronisch
inflammatorische Reaktionen können ihre Ursache auch darin haben, dass die
Makrophagen die Partikel nicht verdauen können. Die Partikel können bis zu 700
Tagen in den Makrophagen verbleiben (Oberdörster et al. 2005). Wenn diese dann in
Apoptose gehen, liegen die Partikel erneut frei in der Alveole vor, müssen wieder
aufgenommen werden und erhöhen so den oxidativen Stress in der Lunge.
Die Monozyten und Makrophagen besitzen auf der Zelloberfläche ein spezifisches
Membranprotein – den CD14-Rezeptor (cluster of differentiation). Dieser multi-
funktionelle Rezeptor dient u.a. der Bindung von Lipopolysaccharid (LPS), einem
Bestandteil der Zellwand gramnegativer Bakterien. Durch die Bindung des LPS
werden intrazelluläre Prozesse ausgelöst, die u.a. die Bildung entzündlicher
Botenstoffe bewirken (Ulevitch et al. 1995). Das CD14-Molekül besitzt außerdem eine
wichtige Funktion bei der Induktion der Apoptose und der Erkennung apoptotischer
Zellen durch monozytäre Zellen (Heidenreich 1999).
Wenn die inhalierte Partikelmenge so groß ist, dass die Alveolarmakrophagen nicht
alle Partikel aufnehmen können oder sich die Nanopartikel durch bestimmte Eigen-
schaften der Phagozytose entziehen, steigt die Wahrscheinlichkeit, dass sie mit den
Alveolarepithelzellen direkt in Kontakt kommen (Oberdörster et al. 2005, Brown et al.
2004).
1.3.2 Zur Rolle des Alveolarepithels und den Wechselwirkungen mit anderen Zellen
Dass das alveoläre Epithel keine rein passive Barriere für Partikel darstellt, wird
zunehmend anerkannt und seine Rolle in der Abwehr erforscht (Bals und Hiemstra
2004). In der Alveolarwand der menschlichen Lunge existieren verschiedene Zell-
populationen. Epithelzellen vom Typ-I bilden aufgrund ihrer flachen und lang-
gestreckten Struktur den Großteil der Alveolaroberfläche. Im Gegensatz dazu tragen
die kuboidalen Typ-II-Epithelzellen trotz ihrer höheren Gesamtzahl nur ca. 7 % zur
alveolären Oberfläche bei. Sie können jedoch zu Typ-I-Epithelzellen differenzieren.
Dadurch haben sie eine wichtige Rolle bei der Regeneration des Alveolarepithels und
können in vivo geschädigte Typ-I-Epithelzellen ersetzen.
10
Für die Aufnahme von Partikeln in Alveolarepithelzellen gibt es verschiedene
Erklärungsmodelle. Im Allgemeinen existieren in jeder Zelle unterschiedliche
Mechanismen, um Makromoleküle und kleinere Partikel aufzunehmen. Ein Vorgang,
der keine spezifischen Rezeptoren benötigt, ist die Pinozytose mit nachfolgender Endo-
und Lysosomenbildung. Andere Mechanismen setzen eine spezifische Erkennung
voraus, so zum Beispiel die Clathrin-abhängige Aufnahme von Substanzen oder
diejenige durch Caveolae, flaschenförmige Einstülpungen der Zellmembran. Diese
Vorgänge kommen abhängig von der Partikelgröße zum Einsatz (Rejman et al. 2004).
Geiser et al. (2005) beschreiben für kleine hydrophobe Partikel einen nichtphago-
zytischen Mechanismus durch adhäsive Prozesse oder absorptive Endozytose, wobei
die Partikel nach ihrer Aufnahme in direktem Kontakt zu Zellorganellen stehen und
diese schädigen können. Ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal verschiedener
Aufnahmeprozesse ist die Beteiligung zellulärer Aktinfilamente. Diese spielen nach
neueren Erkenntnissen sowohl bei der Phagozytose als auch bei der Endozytose eine
wichtige Rolle (Kaksonen et al. 2006), allerdings nicht bei Clathrin- oder Caveolae-
abhängigen Vorgängen. Aktin-abhängige Prozesse können durch den Einsatz eines
Pilzmetaboliten, des Cytochalasin D, gehemmt werden (Schliwa 1982). Der Einsatz
dieses Stoffes ermöglicht also eine grundlegende Aussage zu Aufnahmemechanismen
von Nanopartikeln in Zellen (Stringer et al. 1995).
Die Bindung und Aufnahme von Partikeln durch die Epithelzellen ist eine wichtige
Voraussetzung für deren biologische Wirkung und abhängig von verschiedenen
Partikeleigenschaften (Griese und Reinhardt 1998). Die zytotoxische und immun-
modulatorische Wirkung verschiedener Nanopartikel auf das Lungenepithel wurde
bereits verschiedentlich aufgezeigt (Renwick et al. 2004, Wottrich et al. 2004, Singh et
al. 2007). Internalisierte Partikel können eine dosis- und zeitabhängige Freisetzung
verschiedener immunregulatorischer Botenstoffe, wie Zytokine und Chemokine,
bewirken (Calcabrini et al. 2004), wobei die Zytokinproduktion in Abhängigkeit von
der Partikelgröße variieren kann (Hetland et al. 2004).
Die Produktion spezifischer Zytokine durch Epithelzellen bewirkt die Anlockung von
Granulozyten und Monozyten aus dem peripheren Blut in den Alveolarraum. Mit der
Rekrutierung dieser Entzündungszellen ist eine Freisetzung von reaktiven Sauerstoff-
spezies und lysosomalen Enzymen verbunden, die das Lungenepithel schädigen
können. Hierüber kann es bei chronischer Einwirkung zu Fibrosierung und Tumor-
11
genese kommen. Da die Anlockung der Granulozyten und Monozyten aus dem
peripheren Blut erfolgt und der Übertritt nanoskaliger Partikel in die Blutbahn
nachgewiesen wurde (Nemmar et al. 2002), ist auch die Interaktion von Nanopartikeln
mit Zellen des peripheren Blutes möglich.
Die Aufnahme nanoskaliger Partikel in primäre Monozyten des peripheren Blutes
wurde bereits mehrfach nachgewiesen (z.B. Thiele et al. 2001, Lombaert et al. 2004).
Außerdem wurde gezeigt, dass WC-Co-Partikel in mononukleären Zellen des
peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) einen apoptogenen Einfluss
ausüben, die Regulation von Genen (Lombaert et al. 2004, 2008) und die Produktion
von Zytokinen induzieren (Shin et al. 2007, Drumm et al. 2000). Abbildung 1.3 stellt die
Partikelwirkungen an der Luft-Blut-Schranke schematisch dar.
Abb. 1.3: Schematische Darstellung der Partikeleffekte im Respirationstrakt Abgebildet ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme der Alveolarwand (aus Gehr et al. 1978) mit einem Alveolarmakrophagen (Ma), der Filopodia (FP) und eine undulierende Membran (U) ausbildet. Zu sehen sind außerdem eine Epithelzelle Typ II (EPII) und mehrere Kapillaren (C). In den Schemata um das elektronenmikroskopische Bild herum sind die Partikeleffekte und mögliche Interaktionen der beteiligten Zellarten aufgeführt. ROS: reaktive Sauertstoffspezies
12
1.4 Mechanismen partikelinduzierter biologischer Effekte
1.4.1 Reaktive Sauerstoffspezies und Oxidativer Stress
Die Erzeugung von ROS durch Nanopartikel und den bei chronischer Exposition
damit einhergehenden oxidativen Stress beschrieben Nel et al. (2006) als best-
entwickeltes Paradigma für die Toxizität von Nanopartikeln. Die direkte Verbindung
zwischen reaktiven Sauerstoffradikalen und der Inflammation durch Zell-Partikel-
Interaktionen ist noch nicht vollständig erforscht. Von vielen nanoskaligen Partikeln
(z.B. Kohlenstoff, Cobalt und Nickel) ist jedoch bereits bekannt, dass sie ROS
generieren können (z.B. Stone et al. 1998). Bei vergleichenden Studien an Partikeln mit
unterschiedlichen Durchmessern zeigte sich, dass Nanopartikel im Vergleich zu
größeren Partikeln in zellfreiem Medium pro Masseeinheit mehr ROS erzeugten
(Brown et al. 2001, Stone et al. 1998). ROS entstehen auch, wenn Nanopartikel mit
Makrophagen und Epithelzellen interagieren. Vor allem Makrophagen geben nach
Aufnahme von Partikeln ROS in die Umgebung ab (Karnovsky und Sbarra 1960).
Der Begriff ‚Oxidativer Stress‘ bezeichnet eine Stoffwechsellage, bei der die Menge
gebildeter reaktiver Sauerstoffspezies die Kapazität antioxidativer Enzyme über-
schreitet. Ein typisches Merkmal der antioxidativen Abwehr der Lunge ist die hohe
Gluthationkonzentration im Flüssigkeitsfilm der Lungenepithelien, der etwa 140fach
höher ist als im peripheren Blut (Cantin et al. 1987). Gluthation ist ein nieder-
molekulares Thiol, das im Zellplasma, im Zellkern und in den Mitochondrien vieler
Zellen vorkommt. Reduziertes Gluthation ist ein Tripeptid mit einer freien Thiol-
Gruppe. Bei der Reduktion bestimmter reaktiver Sauerstoffspezies wird Glutathion zu
Gluthationdisulfid oxidiert. Als Marker für den oxidativen Stress gelten also die
Menge an ROS oder das zelluläre Gleichgewicht zwischen den Konzentrationen von
Glutathion und Glutathiondisulfid. Diese können direkt in speziellen Testsystemen
ermittelt werden. Eine indirekte Aussage über die Rolle von ROS in partikel-
induzierten Effekten kann über den Einsatz von N-Acetylcystein (NAC) erfolgen.
Dieser Radikalfänger verhindert unmittelbar die Bildung von ROS und dient zusätz-
lich als Vorläufer des Glutathions (Gosset et al. 1999). Ein hemmender Einfluss von
NAC auf partikelinduzierte biologische Effekte spricht dafür, dass reaktive Sauerstoff-
spezies an deren Zustandekommen beteiligt waren.
13
1.4.2 Redoxsensitive Signalwege
Es wird vermutet, dass durch partikelinduzierten oxidativen Stress redoxsensitive
Signalwege aktiviert werden und damit die Transkription von Genen proinflamma-
torischer Zytokine und Chemokine in der Zielzelle erzielt wird (Oberdörster et al.
2005). Xiao et al. (2003) erstellten hierzu eine Hypothese zur hierarchischen Ordnung
zellulärer Reaktionen auf oxidativen Stress, die in Abbildung 1.4 dargestellt ist.
Demnach werden zunächst antioxidative und detoxifizierende Enzyme vermehrt
gebildet. Die Gene, die diese Enzyme kodieren, stehen unter der Kontrolle des Trans-
kriptionsfaktors Nrf-2. Defekte oder Abweichungen in diesem protektiven Signalweg
können zu erhöhter Anfälligkeit gegenüber inhalierbaren Nanopartikeln führen. Bei
einem höheren Grad an oxidativem Stress wird die protektive Antwort durch
inflammatorische Reaktionen überlagert, die durch die Aktivierung bestimmter Signal-
kaskaden, z. B. über mitogen-aktivierte Proteinkinasen und den Nuklear-FaktorkB
initiiert werden. Der programmierte Zelltod bei weiter verstärktem oxidativem Stress
kann durch die Störung der mitochondrialen Integrität und die Freigabe pro-
apoptotischer Mediatoren ausgelöst werden (Xiao et al. 2003).
Abb. 1.4: Schematische Darstellung der oxidativen Hierarchie der Partikeleffekte (Nach Xiao 2003), GSH: Glutathion, GSSG: Glutathiondisulfid
14
Für die meisten Parameter der zellulären Reaktionen auf den verschiedenen Stufen des
hierarchischen Modells sind spezielle Messmethoden etabliert. So kann der oxidative
Stress durch die Messung der GSSG-Konzentration, inflammatorische Reaktionen
durch die Konzentration von Zytokinen und apoptotische Vorgänge durch Vitalitäts-
parameter quantifiziert werden. Zusammen mit der ausführlichen physiko-chemi-
kalischen Charakterisierung der untersuchten Nanopartikel bildet dies eine solide
Grundlage für die Beurteilung biologischer Partikeleffekte (Nel et al. 2006, Warheit et
al. 2008).
1.5 Zielsetzung der Arbeit
Die vorliegende Arbeit befasste sich mit Partikeln aus verschleißfesten Werkstoffen:
den Wolframcarbiden. In mikrokristalliner Form werden diese mit gesundheitlichen
Risiken in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit wurden in vitro die Effekte
nanoskaliger Wolframcarbidpartikel auf verschiedene Zelltypen untersucht, wobei
sowohl Vergleiche zwischen Partikeln verschiedener Zusammensetzung als auch
zwischen Partikeln unterschiedlicher Größenverteilungen gezogen wurden. Die
Auswirkung der Partikel auf die Zellen wurde anhand folgender Parameter analysiert:
- Verteilung der Partikel, Aufnahmemechanismen
Die Verteilung der Partikel in der Zellkultur und mögliche Aufnahme-
mechanismen wurden untersucht. Hierbei kamen verschiedene Techniken
(Lichtmikroskopie, Elektronenmikroskopie, Röntgenspektralanalyse,
Durchflusszytometrie) zum Einsatz.
- Zytotoxizität
Zur Untersuchung der toxischen Wirkung der Nanopartikel wurde die Vitalität
der Zellen nach Exposition mit den Partikeln beurteilt.
- Immunmodulation und Entzündung
Von Nanopartikeln können inflammatorische und immunmodulatorische
Effekte ausgehen. Zum Nachweis derartiger Effekte wurde die Freisetzung
inflammatorischer Botenstoffe (IL-6, MCP-1, IFN-γ, TNF-α) durch exponierte
Zellen analysiert.
Der relevante Aufnahmepfad für Wolframcarbidpartikel in den menschlichen
Organismus ist die Inhalation. Da Lungenepithelzellen und Alveolarmakrophagen mit
15
inhalierten Partikeln in Kontakt kommen, wurden in dieser Arbeit die Lungenepithel-
zelllinie A549 als Modell für Alveolarepithelzellen vom Typ II sowie die Monozyten-
Zelllinie THP-1 als Modellsystem für Alveolarmakrophagen verwendet. Da die Trans-
lokation von Partikeln in den Blutkreislauf nachgewiesen ist, wurden auch Partikel-
effekte auf periphere mononukleäre Blutzellen untersucht.
16
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Zellkulturarbeiten
Alle Zellkulturarbeiten wurden unter sterilen Bedingungen ausgeführt. Die
Auszählung der Zellen zur Einstellung der gewünschten Zellzahl in Kultur erfolgte bei
allen Zelltypen nach der Anfärbung der Zellkerne mit Türk’s Reagenz (Merck,
Darmstadt, Deutschland) in einer Neubauer Zählkammer.
2.1.1 Kultivierung der humanen Lungenepithel-Zellinie A549
Die A549-Zellen (American Type Culture Collection (ATCC) Nr. CCL-185, LGC,
Promochem, Wesel, Deutschland) wurden 1972 aus dem Lungenkarzinom eines
Mitteleuropäers gewonnen (Lieber et al. 1976) und ähneln Alveolarepithelzellen vom
Typ II. Die adhärent wachsenden Zellen wurden mit RPMI 1640 Medium (Biochrom
AG, Berlin, Deutschland) und 5 Vol.-% Fötales Kälberserum (FKS, Biochrom AG,
Berlin, Deutschland) kultiviert. Nach 2-3tägiger Inkubationszeit im Brutschrank
(Unitherm 190, Uni Equip Leipzig, Deutschland) bei 37,5°C, 5% v/v Kohlendioxid
(CO2) und wasserdampfgesättigter Atmosphäre wurde das Wachstum der Zellen unter
dem Lichtmikroskop (Inverses Mikroskop Axiovert 25, Carl Zeiss GmbH, Jena,
Deutschland) kontrolliert. Bei Vorliegen eines konfluenten Zellteppichs wurden die
Zellen passagiert. Hierfür wurde das Medium aus der 550ml Gewebekulturflasche mit
Filterdeckel (175 cm2 Wachstumsfläche, Greiner Bio-One, Solingen, Deutschland)
entfernt. Anschließend wurden die Zellen mit PBS (Dulbecco, Biochrom AG, Berlin,
Deutschland) gewaschen und mit 5 ml Trypsin/EDTA (0,05%/0,02%, PAN Biotech,
Aidenbach, Deutschland) abgelöst. Die Einwirkzeit wurde durch mikroskopische
Kontrolle des Ablösevorgangs optimiert und lag bei ca. 2 Minuten. Nach Aufnahme
der Zellen in RPMI / 5% FKS standen die Zellen für in vitro Experimente zur
Verfügung. Für die Weiterkultivierung wurden die Lungenepithelzellen in RPMI
1640/5% FKS in einer 550 ml Gewebekulturflasche ausgesät und wiederum 2-3 Tage
bei 37°C, 5% v/v CO2 und wasserdampfgesättigter Atmosphäre inkubiert. Für einzelne
Experimente wurden Zellen durch die Zugabe von 1 ng/ml Tumor-Nekrose-Faktor-
alpha (rh-TNF-a; ALImmunoTools, Friesoythe, Germany) vor der Partikelexposition
vorstimuliert.
17
2.1.2 Kultivierung und Differenzierung der humanen Monozytenlinie THP-1
Die THP-1 Zellen (ATCC; Rockville, MD, USA) wurden ursprünglich aus dem Blut
eines einjährigen Jungen mit akuter monozytischer Leukämie isoliert, besitzen in
vielerlei Hinsicht monozytischen Charakter (Tsuchiya et al. 1980) und können durch
die Stimulation mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA, 99% TLC, Sigma,
Deutschland) zu Makrophagen differenziert werden (Tsuchiya et al. 1982). Die
Kultivierung erfolgte in RPMI 1640 Medium mit 5% FKS. Adhärente Zellen wurden für
die Versuche mit Accutase (PAA Laboratories, Deutschland) aus den Zellkultur-
flaschen abgelöst. Die Differenzierung zu Makrophagen durch 10 ng/ml PMA erfolgte
für 72 Stunden bei 37°C, 5% v/v CO2 und wasserdampfgesättigter Atmosphäre. Das
Medium wurde vor der Aufbringung der Partikelsuspensionen durch frisches RPMI
1640/5% FKS ersetzt.
2.1.3 Präparation peripherer mononukleärer Zellen aus Spenderblut
Zu den peripheren mononukleären Zellen gehören Monozyten und Lymphozyten.
Diese können aufgrund ihrer spezifischen Dichte mit Hilfe eines Ficoll-Dichte-
Gradienten von den restlichen zellulären Blutbestandteilen getrennt werden. Ficoll ist
ein ungeladenes Polymer, dessen Dichte (1,077 g/ml) so eingestellt ist, dass rote
Blutkörperchen und tote Zellen höherer Dichte die Ficoll-Schicht beim Zentrifugieren
passieren können. Granulozyten sammeln sich in der Ficollphase, mononukleäre
Zellen in der Interphase an.
Die Isolierung der PBMC aus dem Buffy Coat (Leukozytenfilm) von gesunden
Blutspendern erfolgte unter sterilen Bedingungen. Dabei wurden 50 ml PBS und 50 ml
Spenderblut vermischt. In Zentrifugenröhrchen wurden je 12,5 ml Ficoll Paque®
(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala Schweden) vorgelegt und anschließend
mit ca. 25 ml der verdünnten Zellsuspension vorsichtig überschichtet. Es folgte eine
20minütige Zentrifugation (Rotanta 460R, Hettich Zentrifugen, Tuttlingen,
Deutschland) bei 670 g und Raumtemperatur (RT). Der entstandene Interphasering
(wurde mit einer sterilen Pasteurpipette abgesaugt und in neue Zentrifugenröhrchen
überführt. Nach zwei weiteren Waschschritten mit PBS (Zentrifugation jeweils für 10
min bei 340 g und RT) wurde die Zelldichte bestimmt. Nach der Einstellung auf die
gewünschte Zellzahl wurden die Zellen erneut zentrifugiert und das Pellet nach
18
Tab.2.1: Angabe der Konzentration und Größe der Partikel in den Suspensionen d: Durchmesser, dBET: Durchmesser berechnet nach der BET-Methode zur Berechnung der spezifischen Oberfläche poröser Stoffe. Dieser Wert bezieht sich auf die Primärpartikel; xPCS: Durchmesser ermittelt durch die Dynamische Lichtstreuung (DLS). Der hierbei ermittelte hydrodynamische Durchmesser stellt ein Maß für die Größe der Partikelagglomerate dar. NHMP: Natrium-Hexa-Metaphosphat bzw. Graham`s Salt.
Dekantieren des Überstandes in RPMI 1640/5% FKS aufgenommen, resuspendiert und
in die Zellkulturplatten verteilt. Für einige Versuche wurden die PBMC 1 Stunde vor
der Exposition mit den Partikelsuspensionen mit 100 pg/ml Lipopolysaccharid (LPS,
aus E.coli O55:B5, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland) stimuliert.
2.1.4 Verwendete Wolframcarbidpartikelsuspensionen
Die Partikelsuspensionen wurden vom Fraunhofer-Institut für keramische
Technologien und Systeme (IKTS) in Dresden charakterisiert und bereitgestellt. Für die
Versuche wurden folgende Partikelsuspensionen verwendet (s. Tabelle 2.1)
Neben der Massekonzentration können Partikelsuspensionen anhand anderer
Parameter verglichen werden. Hierfür kommen beispielsweise die Oberflächen-
konzentration oder die Partikelkonzentration in Frage. In Tabelle 2.2 ist dargestellt, wie
stark diese Parameter in Abhängigkeit von der gewählten Messmethode zur
Bestimmung der Partikelgröße variieren können.
Suspension Konz. der
Stammlösung
[mg/ml]
d=dBET
[nm]
d=xPCS
[nm]
Dispersionsmittel
Wolframcarbid 100 (WC 100) 0,3 56 145 aqua dest.
Wolframcarbid 10 (WC 10) 0,3 9 115
aqua dest.
Wolframcarbid-Cobalt (WC-Co) 0,33 62 145 NHMP
Im Rahmen des INOS-Projektes wurde vorwiegend die Massenkonzentration zur
Darstellung der Partikeleffekte verwendet. Die Partikel wurden als Suspension in aqua
dest. bzw. Natrium-Hexa-Metaphosphat (NHMP bzw. Graham`s Salt, Merck KGaA,
Darmstadt, Germany, CAS-No.: 10361-03-25) bereitgestellt. Nach Erhalt wurden sie
autoklaviert, eine Stunde im Ultraschallbad (USR 30H, Merck, Darmstadt,
Deutschland) resuspendiert und in Glasflaschen bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt.
19
d = xPCS d = dBET
Tab. 2.2: Partikelcharakteristika, berechnet aus den nach verschiedenen Methoden ermittelten Durchmessern der Partikel bei einer Massenkonzentration von 0,1 mg/ml dBET, xPCS: Durchmesser berechnet nach verschiedenen Methoden, s. Tab. 3.1 (Nach: Teeguarden 2007)
Nach dem Autoklavieren konnten die Partikelsuspensionen 3-4 Wochen lang unter
sterilen Bedingungen verwendet werden. Tabelle 2.3 zeigt die verwendeten
Konzentrationsreihen auf, bezogen auf die Masse und die Oberfläche der Partikel.
2.1.5 Exposition der Zellen
Vor der Aufbringung auf die Zellkultur wurden die Partikelsuspensionen
aufgeschüttelt und für 15 Minuten im Ultraschallbad behandelt. Innerhalb einer
Stunde nach dem Ultraschallbad wurden die Suspensionen mit dem jeweiligen Puffer
verdünnt und jeweils 100 µl auf die Zellkultur gegeben. Um die Wirkungen des Puffers
auf die Zellen von der Partikelwirkung zu unterscheiden, wurde jeweils eine Kontrolle
ohne Partikel, aber mit Puffer mitgeführt sowie eine Kontrolle nur mit RPMI 1640/ 5%
FKS.
Die A549-Zellen wurden in 24well-Kulturplatten mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen
ausgesät und in RPMI 1640/5% FKS über Nacht im Brutschrank inkubiert. Am
nächsten Tag wurde das Medium abgesaugt und frisches Medium sowie die Partikel-
suspensionen aufgetragen. Ähnlich behandelt wurden auch die THP-1-Zellen. Von
ihnen wurden 5 x 105 Zellen/ml in 24well-Kulturplatten ausgesät. Nach der
Differenzierungszeit wurden die Partikel aufgetragen. Die PBMC wurden nach der
Bestimmung der Zelldichte in RPMI 1640/ 5% FKS aufgenommen, zu je 1x106
Zellen/ml in Kulturplatten pipettiert und anschließend exponiert. Die Inkubation der
exponierten Zellen erfolgte im Brutschrank (bei 37°C, 5% CO2, wasserdampfgesättigte
Atmosphäre). Um die Wirkung von Cobaltionen auf die untersuchten Zellkultur-
Partikel-
Suspension
Oberflächenkonz.
[cm2/ml]
Partikelkonz.
[109/ml]
Oberflächenkonz.
[cm2/ml]
Partikelkonz.
[109/ml]
WC 100 6,8 69 2,6 7,9
WC 10 42,5 16700 3,3 3,9
WC-Co 6,6 55 2,8 4,2
20
modelle zu eruieren, wurden die Zellen mit einer Cobaltchloridlösung (Fluka Aldrich,
Deutschland) exponiert. Die Stammlösung (20 mM) wurde im Medium verdünnt
wobei 51 µM Cobaltchlorid der Cobaltkonzentration in 33 µg/ml WC-Co entsprach.
Um die Reaktion der phagozytierenden Zellen auf inerte Partikel zu testen, wurden
farblose Latexpartikel (Plano, W. Plannet GmbH, Wetzlar, Deutschland) mit einem
durchschnittlichen Durchmesser von 120 nm verwendet. Diese Partikel wurden bei 4°C
aufbewahrt und vor der Exposition in aqua dest. auf Partikelkonzentrationen von 107-
1010 Partikel/ml verdünnt. Es wurden jeweils 100 µl der Latexpartikelsuspension auf
die Zellkulturen gegeben.
Partikel-
suspension
Massekonzentration
[µg/ml]
Oberflächenkonzentration
[cm2/ml]
WC 100 0,3 0,0207
3,0 0,207
6,0 0,414
15 1,035
30 2,07
WC 10 0,3 0,1296
3,0 1,296
6,0 2,592
15 6,48
30 12,96
WC-Co 0,33 0,02178
3,3 0,2178
6,6 0,4356
16,5 1,089
33 2,178
Tab. 2.3: Verwendete Konzentrationsreihe der Partikelsuspensionen als Massenkonzentration und Oberflächenkonzentration (Umrechnung nach Teeguarden 2007)
21
Bei einigen Experimenten wurde vor der Partikelexposition der Radikalfänger N-
Acetylcystein (NAC, Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland) auf die Zellen gegeben.
Die Stammlösung (1M = 163,2 g/l) wurde in RPMI 1640 auf 800 mM eingestellt. Der
pH-Wert wurde mit Natrium-Hydroxid (NaOH) auf 7,4 titriert. Je nach verwendeter
Konzentration wurde die Lösung mit dem Kulturmedium verdünnt und eine Stunde
vor der Partikelexposition auf die Zellen gegeben.
2.2 Mikroskopische Aufnahmen und Energiedispersive Röntgenspektroskopie
2.2.1 Lichtmikroskopische Aufnahmen
Nach 24stündiger Inkubation mit den Partikelsuspensionen wurden licht-
mikroskopische Aufnahmen der Zellkulturen angefertigt. Hierzu wurden die Zell-
kulturplatten unter dem Mikroskop (Leica Microsystems, CMS, GmbH) betrachtet und
die Aufnahmen durch den Deckel der Zellkulturplatte hindurch angefertigt, um die
Proben nicht zu kontaminieren. Die Bearbeitung der Aufnahmen erfolgte mit Hilfe des
Programms Leica Application Suite (Leica, Microsystems, Jülich, Deutschland)
2.2.2 Elektronenmikroskopische Aufnahmen und Energiedispersive Röntgen-spektroskopie (EDX, Röntgenspektralanalyse)
Primäre chemische Fixierung (Aldehydfixierung)
In Vorbereitung auf die Elektronenmikroskopie bzw. die Röntgenspektralanalyse
wurden die Zellen nach Partikelexposition mit PBS (mit Ca2+und Mg2+, Dulbecco,
Biochrom AG, Berlin, Deutschland) von der Zellkulturplatte abgelöst, gewaschen und
in Eppendorf-Röhrchen überführt. Nach einem Zentrifugationsschritt (2000 rpm, 3-5
min) wurde der Überstand dekantiert und verdünntes Glutaraldehyd (2% in PBS,
Serva, Heidelberg, Deutschland) auf das Pellet gegeben. Die gut verschlossenen
Eppendorf-Gefäße wurden für 4-24 Stunden bei 4°C inkubiert. Nach dieser Zeit wurde
das Glutaraldehyd gewechselt und die Inkubation bei 4°C wiederholt. Anschließend
wurde das Glutaraldehyd abpipettiert und PBS auf das Pellet gegeben. Nach einer
Inkubationszeit von 2-4 Stunden bei 4°C wurde das PBS gewechselt und die
Inkubation für 24 Stunden fortgesetzt. Nach dieser Fixierung war das Pellet bei 4 °C
für mehrere Wochen haltbar und wurde an das Max-von-Bergmann-Zentrum für
22
Biomaterialien (MBZ) der Technischen Universität Dresden versandt, wo die folgenden
Arbeitsschritte erfolgten:
- sekundäre chemische Fixierung (komplementäre Schwermetallfixierung)
- Entwässerung (Dehydratation)
- Infiltration mit niederviskösem Epoxidharz nach Spurr (1969)
- Härtung (Polymerisation)
- Ultramikrotomie der polymerisierten Proben
- Zur Untersuchung mit dem Rasterelektronenmikroskop:
o Montierung auf REM-Träger
o Bedampfung mit Kohlenstoff
o Untersuchung im REM (Philips XL 30 FG-ESEM) unter Verwendung
geeigneter Detektoren
- Zur Röntgenspektralanalyse
o Die jeweiligen Bedingungen, die zur Identifizierung der Elemente
herangezogen wurden, sind den jeweiligen EDX-Spektren zu
entnehmen
2.3 Durchflusszytometrie
Prinzip der Methode
Mit Hilfe der Durchflusszytometrie können verschiedene Parameter gleichzeitig an
einer Zelle und an vielen tausenden Zellen innerhalb kurzer Zeit untersucht werden.
Zu diesen Parametern zählen morphologische Zelleigenschaften wie die Größe und die
Granularität der Zelle. Zusätzlich können Oberflächenantigene und intrazelluläre
Strukturen mittels fluorochrom-konjugierter Antikörper markiert und die
resultierende Fluoreszenz quantifiziert werden. Zur Untersuchung werden die Zellen
einer hydrodynamischen Fokussierung zugeführt und gleich einer Perlenkette an
einem Laserstrahl vorbeigeführt. Das in einem geringen Winkel (3-17°) zum Laser-
Strahl durch die Zelle abgelenkte Licht wird im Forward Scatter (FSC) dargestellt.
Dieser korreliert mit der Zellgröße. Die Streuung des Laserlichtes nach Einstrahlung im
rechten Winkel (90 +/- 26°) entspricht dem Sideward Scatter (SSC) und korreliert mit
der Granularität (s. Abb. 2.1).
23
Abb. 2.1: Schematische Darstellung des Messprinzips eines Durchflusszytometers
Bei der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen regt der Laserstrahl die Elektronen
der verwendeten Farbstoffe an und hebt sie auf höhere Energieniveaus. Wenn diese
Elektronen auf ihr energetisches Ausgangsniveau zurückfallen, geben sie Energie in
Form von Licht ab. Dessen Intensität wird gemessen und Schlussfolgerungen auf die
Menge an gebundenen Antikörpern je Zelle gezogen.
Vorbereitung und Durchführung der Durchflusszytometrie
Ablösen der Zellen
Nach Ablauf der Expositionszeit mit den Partikelsuspensionen wurden 750 µl des
Kulturmediums entnommen und zur späteren Verwendung bei -70°C in Masterblocks
(Greiner, Bio-One, Solingen, Deutschland) eingefroren. Mit dem restlichen Medium
wurden die Zellen in der Kulturplatte resuspendiert und in ein Zentrifugenröhrchen
aufgenommen. Anschließend wurde die Kavität mit 1 ml PBS gespült, um restliche
Zellen aufzunehmen. Bei den THP-1-Zellen war es zuweilen nötig, 100 µl Accutase
(Serva, Heidelberg, Deutschland) aufzutragen und die Platte 10 min im Brutschrank zu
inkubieren, bevor die Zellen sich mit PBS ablösen ließen. Nach Auffüllen des
Zentrifugenröhrchens mit PBS wurden die Zellen bei 1300 rpm und 4°C für 5 Minuten
abzentrifugiert. Anschließend wurde ein weiterer Waschschritt mit PBS durchgeführt.
Fixieren der Zellen
Nach einem erneuten Zentrifugationsschritt wurde der Überstand dekantiert und das
Zellpellet auf Eis für 10 Minuten mit 500 µl ICS Fixier Puffer (4% Paraformaldehyd in
PBS/1 % FKS, Serva, Heidelberg) inkubiert. Dann wurden die Ansätze noch zwei Mal
24
mit 3 ml des Waschpuffers (PBS Dulbecco (Ca2+, Mg2+-frei, pH 7,4) + 1% FKS)
gewaschen.
Permeabilisierung und Färbung
Die Zellen wurden in 2 ml des Permeabilisierungspuffers (50 g Saponin + 119 g
HEPES-Puffer in 500 ml aqua dest.) aufgenommen und nach zehnminütiger Inkubation
bei RT zentrifugiert (1200 U/min, 5 min). Anschließend wurden sie in
Permeabilisierungspuffer aufgenommen und in Durchflusszytometer-Röhrchen
überführt, in denen 2,5 µl der entsprechenden Antikörper vorgelegt waren. Die
Ansätze wurden nun für 30 min bei 4°C im Dunkeln inkubiert und es erfolgten zwei
weitere Waschvorgänge mit je 3 ml Permeabilisierungspuffer. Die Überstände wurden
dekantiert und die Zellen mit 300 µl PBS/ 1% Formol (Serva, Heidelberg, Deutschland)
fixiert.
Die verwendeten Antikörper wurden von den Firmen Coulter Immunotech und
Pharmingen bezogen. Sie waren an folgende Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt:
Fluoresceinisocyanat (FiTC, Emission: 520 nm), R-Phycoerythrin (PE, Emission: 578
nm) und R-Phycoerythrin-Cyanin (PE-CY 5, Emission: 668 nm). Die Anregung erfolgte
mit einem Argonlaser bei 488 nm.
Messung und Auswertung
Die Messung und Auswertung des FSC, des SSC sowie der Fluoreszenzsignale erfolgte
mit einem Calibur-Durchflusszytometer von Becton Dickinson und der Software
CellQuestTM. Pro Probe wurden 10 000 Zellen gemessen.
2.4 Der MTT-Test
Prinzip der Methode
Dieser Vitalitätstest, der nach dem Protokoll von Mosmann (1983) durchgeführt
wurde, trifft eine Aussage über die Stoffwechselaktivität der untersuchten Zellen.
Verschiedene zytoplasmatische und mitochondriale Dehydrogenasen (Berridge 1993,
Mosmann 1983, Benizot und Lang 1986) spalten den gelben Farbstoff 3-(4,5-
Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT) in einer irreversiblen
Reaktion in ein violett gefärbtes wasserlösliches Formazan. Die Färbung bleibt nach
dem Lysieren der Zellen erhalten und wird spektralphotometrisch vermessen. Die
25
Stärke der Absorption ist proportional zur Aktivität der Dehydrogenasen und damit
sowohl ein Maß für die Vitalität der Zellen als auch für die Zellzahl.
Durchführung
Nach Abnahme von 750 µl Kulturüberstand wurden zu den restlichen 250 µl Medium
25 µl der MTT-Lösung (5 mg/ml, Serva, Heidelberg, Deutschland) gegeben und die
Platte kurz geschwenkt, bevor sie für 4 h bei 37°C, 5% v/v CO2 und wasserdampf-
gesättigter Atmosphäre im Brutschrank inkubiert wurde. Danach wurden die
enzymatischen Vorgänge gestoppt und die Zellen lysiert, indem in jedes Well 300 µl
des MTT-Stopp-Reagenz (10% m/v Natriumdodecylsulfat, SDS, Serva, Heidelberg,
Deutschland) in 50%iger v/v wässriger N,N’-Dimethylformamid-Lösung (DMF, Serva,
Heidelberg, Deutschland) gegeben wurde. Nachdem die Platten über Nacht bei 37°C
inkubiert wurden, erfolgte die Messung der Absorption in den Zellkulturplatten (s.
Abb. 2.4). Dafür wurde die Extinktion am Photometer (Infinite F200, Tecan, Crailsheim,
Deutschland) unter Verwendung eines 570nm-Filters gemessen. Als Leerwert diente
eine zellfreie Probe mit dem Zellkulturmedium, die ebenfalls mit SDS und DMF
behandelt wurde. Die Ergebnisse wurden als Prozent der Vitalität/Proliferation im
Vergleich zur Kontrolle mit dem jeweiligen Lösungsmittel dargestellt [% Vitalität/-
Proliferation = 100% x Mittelwert-OD (optische Dichte) des Partikel-Ansatzes/-
Mittelwert-OD der Kontrolle].
2.5 Der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Prinzip der Methode
Der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) stellt ein immunologisches
Nachweisverfahren dar, das auf einer enzymatischen Farbreaktion basiert. Mit Hilfe
dieser Methode können Proteine und Viren, aber auch niedermolekulare Verbin-
dungen wie Hormone oder Toxine nachgewiesen werden. Da die Signalstärke eine
Funktion der Antigenkonzentration darstellt, kann der ELISA auch für quantitative
Analysen verwendet werden. Die Basis jedes ELISAs stellen drei chemisch-
physikalische Prozesse dar: die spezifische Interaktion eines Antigens mit Antikörpern,
die Bindung von Antikörper oder Antigen an eine spezielle Oberfläche (meist Plastik)
und die enzymatische Nachweisreaktion. Als Antigen dienten in der vorliegenden
Arbeit die von den Zellen produzierten Zytokine und Chemokine im Zellkultur-
medium. Die Messung der Zytokin- bzw. Chemokinkonzentration in den Zellkultur-
26
Abb. 2.2 Prinzip des Sandwich-ELISA (modizifizert nach: biosystemdevelopment.com)
überständen erfolgte mit einem sogenannten indirekten Sandwich-ELISA. Hierbei
werden zwei Antikörper verwandt, die beide an das Antigen binden (s. Abb. 2.5). Zur
Messung der Zytokinkonzentration wurden OptEIA™-ELISA-Kits von Pharmingen
für IL-6, MCP-1, TNF-α und IFN-γ verwendet. Als feste Phase zur Bindung der
Beschichtungsantikörper dienten 384er Nunc maxi Sorp-Immunoplatten.
Durchführung Die Beschichtung erfolgte mit einem Beschichtungsantikörper, der vorher mit PBS auf
die optimale Konzentration eingestellt wurde: 1:1500 für IL-6 und TNF-α, 1:1000 für
IFN-γ und MCP-1. Die ELISA-Platten wurden mit 50 µl der Beschichtungsantikörper-
lösung gefüllt und in einer feuchten Kammer über Nacht bei 4°C inkubiert. Um nicht
gebundene Beschichtungsantikörper zu entfernen, erfolgten Waschschritte mit 3 x 150
µl/ Kavität PBS/0,1% Tween®*20 (Merck, Darmstadt) mit dem ELISA-Platten-Washer
Columbus (Tecan, Crailsheim). Um Waschpufferreste vor dem nächsten Schritt zu
entfernen, wurden die Platten direkt nach dem Absaugen der Flüssigkeit kräftig auf
Zellstoff ausgeschlagen. Das Blocken freier Bindungsstellen für Proteine erfolgte durch
die Zugabe von 100 µl eines Assay-Puffers (5% FKS in PBS) in jede Kavität und die
Platten wurden anschließend für 1 Stunde in einer feuchten Kammer bei RT inkubiert.
Im Anschluss an die Blockung erfolgte erneut ein Waschvorgang mit PBS/0,1%
Tween®* 20 (3 x 150µl/ Kavität). Während der Inkubationszeit des Blockschrittes
wurde mit Zytokinstandards bekannter Konzentration eine 12-stufige Standard-
27
verdünnungsreihe für die einzelnen Zytokine durch eine serielle 1:2-Verdünnung
hergestellt. Deren Auftragung erfolgte in Duplikaten. Sofort nach dem Waschen
wurden 10 µl Assay-Puffer/Kavität vorgelegt, um Trocknungsartefakte durch
verzögerte Probenauftragung zu verhindern. Anschließend wurden die Standards und
die Proben mit je 100µl/Kavität aufgetragen. Nach einer erneuten Inkubationszeit von
mindestens 2 Stunden in der feuchten Kammer wurden weitere Waschschritte mit
PBS/0,1% Tween®*20 (5 x 150 µl/ Kavität) durchgeführt. Der biotinylierte Antikörper
und das Avidin-POD-Konjugat wurden in den jeweils erforderlichen Konzentrationen
durch Verdünnung mit Assay-Puffer hergestellt: 1:1750 für IL-6, 1:200 für MCP-1,
1:1000 für IFN-γ und 1: 1500 für TNF-α. Davon wurden je 50 µl pro Kavität in die Platte
gegeben und in der feuchten Kammer für 1 h bei RT inkubiert. Nach dem letzten
Waschschritt mit PBS/0,1% Tween®*20 (7 x 150 µl/Kavität) wurden 50 µl des
vorbereiteten Substrates (TMB, Becton Dickinson, Heidelberg)/Kavität zugegeben und
die Platte einige Minuten im Dunkeln inkubiert. Der Substratumsatz wurde dann
durch die Zugabe von 50 µl 1 M H2SO4 (Merck, Darmstadt)/Kavität abgestoppt. Zur
besseren Übersicht ist der Versuchsablauf in Abb. 2.6 noch einmal schematisch
dargestellt.
Messung und Auswertung
Das Messen der optischen Dichte zur Bestimmung der Zytokinkonzentration erfolgte
am ELISA-Reader (TECAN, Crailsheim) bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer
Referenzwellenlänge von 750 nm. Die Ergebnisse wurden als Prozent der Zytokin-/-
Chemokinfreisetzung im Vergleich zur Kontrolle mit dem jeweiligen Partikelpuffer
dargestellt [% Zytokin-/Chemokinfreisetzung = 100% x OD des Partikel-Ansatzes/
Mittelwert-OD der Kontrolle]. Die Auswertung der Daten erfolgte mittels EasyWin
Kinetics 32 (EasyWin-Software, Tecan, Crailsheim) und die Berechnung der auf die
Kontrolle normierten Proteinkonzentrationen mittels Excel XP (Microsoft Deutschland,
Unterschleißheim).
28
Abb. 2.5: Schema der Durchführung des ELISA unter Verwendung von OptEIA™-Kits (Pharmingen, Produktinformation)
2.6 Statistische Auswertung
Mit statistischen Methoden wurde überprüft, ob Unterschiede in den gemessenen
Werten als zufällig oder nichtzufällig anzusehen sind. Soweit nicht anders angegeben,
erfolgte die statistische Auswertung der Daten mit den Programmen Excel 2003
(Microsoft Deutschland, Unterschließheim) und Statistica 8 (StatSoft Inc., USA). Die
Daten wurden mit Hilfe des Student t-Tests für unabhängige Gruppen analysiert und
als Mittelwert und Standardfehler angegeben. Die Analyse der Versuchsergebnisse,
deren Ergebnisse nicht normalverteilt waren, erfolgte anhand des nicht-
parametrischen Mann-Whitney-U-Tests. Statistische Signifikanz, das heißt der
Grenzwert für die Entscheidung wo die zufallsbedingten Unterschiede aufhören,
wurde jeweils bei 5% (p < 0,05) angenommen.
29
3 ERGEBNISSE
Durch die Anwendung verschiedener Methoden konnte ein Einblick in die
Interaktionen nanoskaliger Wolframcarbidpartikel mit verschiedenen Zelltypen
humanen Ursprungs gewonnen werden. Dazu zählten die Lungenepithelzelllinie
A549, die Monozyten-Zelllinie THP-1 sowie PBMC. Die angewandten Techniken
ergänzten einander bei der Beurteilung der Lokalisation der Partikel in den Zellen, der
Aufnahmemechanismen, der Beeinflussung der Zellvitalität und schließlich der
immunologischen Reaktion der Zellen auf die Partikelexposition.
3.1 Die Lokalisation der Partikel in den untersuchten Zellen
3.1.1 Lichtmikroskopische Aufnahmen
Die Zellen wurden nach Exposition zunächst lichtmikroskopisch betrachtet. Beurteilt
wurden hierbei die Verteilung der Partikel in der Zellkulturplatte, die Darstellung von
Partikelagglomeraten in Relation zu den Zellen bei verschiedenen Partikel-
konzentrationen, Unterschiede zwischen den Partikelsuspensionen und eventuelle
Anzeichen für induzierte Zellschäden. Als solche wurden z.B. frei flottierende A549-
Zellen im Medium, Zellen mit defekter Zellmembran und die Anwesenheit von
Zelltrümmern angesehen.
Nicht exponierte A549-Zellen stellten sich dar als polygonale Zellen, die z.T. Ausläufer
besaßen und in Kultur einen konfluierenden Zellteppich ausbildeten. Die THP-1-Zellen
nahmen unterschiedliche Größen und Formen an und PBMC bildeten eine homogene
Zellmenge, in der nicht zwischen Lymphozyten und Monozyten unterschieden
werden konnte. Um zu untersuchen, ob die Applikation der Partikelpuffer bereits die
Morphologie der Zellen beeinflusst, wurde zunächst jeweils eine Gruppe der Zellen
nur mit Nährmedium behandelt und eine weitere zusätzlich mit den Puffern aqua
dest. bzw. NHMP ohne Partikel exponiert. Zwischen diesen Gruppen zeigten sich
lichtmikroskopisch keine Unterschiede in Zellform, Zelldichte und Konfluenz. In
Abbildung 3.1 sind die Zellen nach der Exposition mit dem Kulturmedium und dem
Partikelpuffer dargestellt.
30
Abb. 3.2: Lichtmikroskopische Darstellung aller Zellarten nach 24stündiger Exposition mit 30 µg/ml WC 100 (Vergrößerung 50x) A) A549-Zellen (Vergr. 100x), B) THP-1-Zellen (Vergr. 100x) , C) PBMC
A) C) B)
Anschließend wurden die Zellen mit den Partikelsuspensionen in unterschiedlichen
Konzentrationen exponiert und Aufnahmen nach einer Inkubationszeit von 24
Stunden angefertigt. Bei allen Zellarten zeigte sich eine inhomogene Verteilung von
Partikelagglomeraten in der Kulturplatte (s. Abb. 3.2). Das Auftreten der Partikel-
agglomerate war in seinem Ausmaß abhängig von der aufgebrachten Partikel-
konzentration, wie am Beispiel der THP-1-Zellen in Abbildung 3.3 gezeigt wird.
Es traten bei allen untersuchten Zellarten und Partikelsuspensionen sowohl Über-
lagerungen von Partikelagglomeraten und Zellkörpern als auch Agglomerate
unabhängig von den Zellen im Medium auf. Durch die Partikelexposition induzierte
Zellschäden zeigten sich anhand von defekten Zellmembranen, geschwollenen Zellen
und Zellfragmenten bei den A549-Zellen und der Monozyten-Zelllinie, v.a. nach der
Exposition mit WC-Co (s. Abb.3.4).
Abb. 3.1.: Lichtmikroskopische Abbildung der untersuchten Zellarten in Medium und aqua dest. bzw. NHMP nach 24 Stunden Inkubation
A) A549-Zellen (Vergr. 100x), B) THP-1-Zellen (Vergr. 100x) und C) PBMC (Vergr. 50x)
A) C)B)
31
Abb. 3.3: Konzentrationsreihe der WC 100-Partikel auf THP-1-Zellen im Lichtmikroskop nach 24stündiger Inkubation (Vergrößerung 100x) v.l.n.r. obere Reihe: Kontrolle mit aqua dest., 0,3 µg/ml, 3 µg/ml WC 100; untere Reihe: 6 µg/ml, 15 µg/ml, 30 µg/ml WC 100
Abb. 3.4: Lichtmikroskopische Details der THP-1-Zellen nach 24stündiger Inkubation mit Partikelsuspensionen THP-1-Zellen nach Exposition mit A) 30 µg/ml WC 10-Partikeln, B) 30 µg/ml WC 100-Partikel und C) 6,6 µg/ml WC-Co-Partikeln, Blockpfeile deuten auf Ko-Lokalisationen von Partikeln und Zellsomata, einfache Pfeile auf Anzeichen für Zellschäden/Zelluntergang
A) B) C)
Bei den PBMC erschien die Ko-Lokalisation der Partikel in Relation zu den Zellkörpern
ähnlich ausgeprägt wie bei der Monozyten-Zelllinie. Allerdings waren an den PBMC
keine morphologischen Veränderungen nach Partikeleinwirkung zu erkennen. Nur bei
32
Abb. 3.5: Lichtmikroskopische Darstellung von PBMC, exponiert mit WC 100, Cytochalasin D und LPS nach 24stündiger Inkubation (Vergrößerung 50x) PBMC nach Exposition mit A) 30 µg/ml WC 100, B) 30 µg WC 100 und Vorinkubation mit 2 µM Cytochalasin D sowie C) 30 µg/ml WC 100 und Vorinkubation mit 100 pg/ml LPS
A) B) C)
den stimulierten Zellen zeigten sich Zellkonglomerate, die häufig auch mit Partikel-
agglomeraten überlagert erschienen (s. Abb.3.5).
Lichtmikroskopisch konnte eine passive, schwerkraftbedingte Verteilung der Partikel
nicht von einer Anlagerung an bzw. einer Aufnahme in die Zellen unterschieden
werden. Um einen Anhaltspunkt dafür zu bekommen, ob die Partikel in die Zellen
aufgenommen werden, wurden weitergehende Versuche mit Cytochalasin D
durchgeführt. Dieser Phagozytosehemmer wurde in verschiedenen Konzentrationen
(5 µM bei A549, 2 µM bei PBMC und THP-1) eine Stunde vor der Partikelauftragung
auf die Zellen gegeben. Ein Effekt dieser Behandlung wurde nur bei den PBMC
deutlich. Hier erschienen die Partikel in den cytochalasin-behandelten Proben diffuser
verteilt, als in den Kontrollen (Abb. 3.5). Um weiterführende Erkenntnisse zur
Lokalisation der Partikel an bzw. in den Zellen zu erhalten, wurden elektronen-
mikroskopische und röntgenspektralanalytische Aufnahmen angefertigt.
3.1.2 Rasterelektronische Aufnahmen und Röntgenspektralanalysen
THP-1-Zellen und PBMC wurden nach 24stündiger Inkubation mit den Puffern bzw.
den Partikelsuspensionen WC 100 und WC 10 nach einem standardisierten Protokoll
aufbereitet (s. Kap. 2.2.2) und an das Max-von-Bergmann-Zentrum in Dresden
verschickt. Dort wurden elektronenmikroskopische und röntgenspektralanalytische
Aufnahmen angefertigt, um die genaue Lokalisation der Partikel in den Zellen zu
untersuchen. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Armin Springer können diese
33
Abbildungen hier vorgestellt werden.
In den rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen waren keine einzelnen Partikel,
sondern nur Partikelagglomerate detektierbar, die sich als helle Bereiche darstellten.
Bestätigt wurde die intrazelluläre Anwesenheit des Elementes Wolfram anhand eines
spezifischen Peaks in der Röntgenspektralanalyse über den untersuchten Zellen. Bei
den PBMC wurde anhand morphologischer Kriterien eine Unterscheidung zwischen
Monozyten und Lymphozyten getroffen. Beurteilt wurden die Form des Zellkerns und
die Kern-Plasma-Relation, die bei Lymphozyten größer ist als bei Monozyten. Es zeigte
sich in den untersuchten Proben eine Ansammlung der Partikel nur in den Monozyten.
Im Vergleich zu den Kontrollzellen fanden sich in den exponierten Zellen vergrößerte
Vesikel im Zellplasma. In den THP-1 konnten analog zu den PBMC Wolframpartikel
im Zellplasma nachgewiesen werden, während bei beiden Zellarten keine Partikel im
Zellkern lokalisiert waren. In den Abbildungen 3.6 und 3.7 sind diese Ergebnisse
zusammengefasst dargestellt.
B)
Rasterelektronenmikroskopie
A)
N
M
L
Röntgenspektralanalyse (EDX)
34
Abb. 3.6: Rasterelektronenmikroskopische und röntgenspektralanalytische Darstellung von PBMC nach 24stündiger Inkubation mit WC 100- und WC 10-Partikeln Linke Spalte: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen (Vergrößerung 2000x) der PBMC nach Exposition mit A) aqua dest., B) 30 µg/ml WC 100 und C) 30 µg/ml WC 10. Schwere Elemente (z.B. Wolfram) erscheinen als helle Areale. rechte Spalte: röntgenspektralanalytische Auswertungen der untersuchten Zellen (Vergrößerung 16.000x). Das Spektrum der Röntgenspektralanalyse zeigt über den hellen Punkten zwei prominente Röntgen-Peaks mit der charakteristischen Energie für Röntgenquanten der Wolfram-Mα (WM) und Wolfram-Lα (WL) Atomschalen. Andere Peaks repräsentieren weitere Elemente in der untersuchten Region und lassen sich auf das Einbettungsmedium (ClK, Chlorid Kα; OK, Sauerstoff Kα), die Umhüllung (CKα, Kohlenstoff Kα) oder die Färbung (OsM, osmium Mα und UM, Uranium Mα) zurückführen. N: Zellkern (Nukleus), M: Monozyt, L: Lymphozyt, dünne Pfeile: Wolframpartikelagglomerate, Ellipsen: Röntgen-Peaks der Wolframpartikel, Kasten: TiK: Titan-Peak (Abrieb von Ultraschallsonde bei Vorbereitung der WC 10- Suspensionen).
C)
N
B)
A)
Rasterelektronenmikroskopie Röntgenspektralanalyse (EDX)
35
3.2 Durchflusszytometrische Untersuchungen zur Frage der Aufnahme in bzw. Anlagerung der Partikel an die Zellen
Die Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchungen wurden hinsichtlich der
möglichen Aufnahme oder Anlagerung von Partikeln an die Zellen ergänzt durch
durchflusszytometrische Untersuchungen. Im Durchflusszytometer können zwei
morphologische Zellcharakteristika bestimmt werden: die Größe der Zellen stellt sich
anhand des Vorwärtsstreulichtes (Forwards scatter, FSC) dar und ihre Granularität
anhand des Seitwärtsstreulichtes (Sidewards Scatter, SSC). Darüber hinaus kann mit
Hilfe fluoreszenzmarkierter Antikörper die Identifikation einzelner Zellpopulationen
erfolgen. Dies war in der vorliegenden Arbeit wichtig zur Beurteilung der spezifischen
Partikeleffekte auf Lymphozyten bzw. Monozyten im peripheren Blut. Die Partikel-
effekte wurden an allen drei Zellreihen bei verschiedenen Partikelkonzentrationen und
verschiedenen Inkubationszeiten untersucht, und zusätzlich wurde der Einfluss eines
Phagozytosehemmers auf die Partikeleffekte beurteilt.
3.2.1 Veränderungen der Granularität durch Partikelexposition
Um zu beurteilen, ob sich die Granularität der Zellen allein aufgrund der Exposition
mit Partikeln veränderte, wurde jede Zellart für 20 Stunden mit farblosen Latex-
partikeln inkubiert. Wie in Abbildung 3.8 zu sehen ist, führte die Exposition mit Latex-
partikeln zu keiner deutlichen Änderung der Granularität. Nach der Exposition mit
den Wolframcarbidpartikeln wiesen hingegen alle untersuchten Zelltypen nach 20
Stunden eine Erhöhung ihrer Granularität auf.
Abb. 3.7: Rasterelektronenmikroskopische und röntgenspektralanalytische Darstellung von THP-1 nach 24stündiger Inkubation mit WC 100 bzw. WC 10 A) Puffer, B) 30 µg/ml WC 100 und C) 30 µg/ml WC 10 Erklärungen siehe Bildunterschrift zu Abb. 3.6, a: nähere Bezeichnung der Atomschale (in Bildunterschrift zu Abb. 3.6 als Alpha gekennzeichnet)
C)
36
In Abbildung 3.8 sind diese Veränderungen im SSC für alle Zellreihen aufgetragen.
Wie in dieser Abbildung ebenfalls zu erkennen ist, waren bei den PBMC von den
dargestellten Partikeleffekten ausschließlich die Monozyten/Makrophagen betroffen,
wobei die Ausmaße der Partikeleffekte interindividuell stark variierten. Die Granulari-
tätsänderungen der A549- und der THP-1-Zellen fielen im Vergleich zu den PBMC
geringer aus und betrafen eher diffus einen Großteil der untersuchten Zellen als eine
spezifische Zellgruppe.
Kontrolle 30 µg/ml WC 100 Latexpartikel
Abb. 3.8 : Veränderung der Granularität aller Zelltypen nach 20stündiger Partikelexposition Durchflusszytometrische Analyse der zellulären Granularität nach Exposition mit aqua dest. (Kontrolle, linke Spalte), 30 µg/ml WC 100-Partikeln (mittlere Spalte) bzw. 109 Latexpartikeln/ml (rechte Spalte). Die abgebildeten Ergebnisse stammen jeweils aus einem Experiment mit 10.000 Zellen/Probe
Monozytenzelllinie (THP-1)
Lungenepithelzellen (A549)
Monozyten Monozyten
Monozyten
Primäre Monozyten und Lymphozyten (PBMC) aus Spenderblut
37
Abb. 3.9 : Granularitätsänderungen in Abhängigkeit von unterschiedlichen Partikelgrößen und Zelltypen sowie deren Beeinflussbarkeit durch Cytochalasin D Veränderungen der zellulären Granularität (gemessen als SSC im Durchflusszytometer), dargestellt als Prozent der jeweiligen Kontrolle mit und ohne Cytochalasin D (2µM für PBMC und THP-1, 5 µM für A549) Die Messungen erfolgten nach einer 20stündigen Inkubationszeit mit 30µg/ml WC 100 bzw. WC 10. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus 4 unabhängigen Experimenten als Mittelwert und Standardfehler in Prozent der Kontrolle. * kennzeichnet den signifikanten Einfluss von Cytochalasin D (p<0,05) Die Daten zu dieser Abbildung wurden erhoben mit Unterstützung von Wibke Busch, UFZ Leipzig und dürfen mit ihrer freundlichen Genehmigung hier abgebildet werden.
A549 THP-1 PBMC
Sid
e Sc
atte
r Wer
t [%
Kon
trolle
]
0
200
400
600
800ohne Cytochalasin Dmit Cytochalasin DKontrolle
*
WC 100
A549 THP-1 PBMC
Side
Sca
tter W
ert [
% K
ontro
lle]
0
100
200
300
400ohne Cytochalasin Dmit Cytochalasin DKontrolle
*
*
WC 10
In Abbildung 3.9 werden die Granularitätsänderungen anhand der drei Zellarten noch
einmal quantitativ dargestellt. Die hier nicht dargestellten WC-Co-Partikel zeigten in
Bezug auf das Ausmaß ihrer Effekte ein sehr ähnliches Verhalten wie die WC 100-
Partikel. Bei den PBMC beispielsweise betrug der Mittelwert des SSC aus vier
unabhängigen Experimenten 595,90% vs. 573, 97% der Kontrolle für 30 µg/ml WC 100
bzw. 33 µg/ml WC-Co. Anhand der beiden Diagramme in Abb. 3.9 ist zu erkennen,
dass die relativen Änderungen der Granularität bei den WC 10-Partikeln deutlich
geringer ausfielen als bei den WC 100-Partikeln.
Der Einsatz des Phagozytosehemmers Cytochalasin D diente der Untersuchung von
zwei Aspekten der partikelspezifischen Effekte. Zum Einen ermöglicht er die Unter-
scheidung zwischen Granularitätsänderungen durch die extrazelluläre Bindung von
Partikeln an die Zellmembran und solchen, die durch Partikelaufnahme verursacht
werden. Zum Zweiten hemmt Cytochalasin D aktin-abhängige Aufnahmeprozesse
und lässt so einen Schluss auf mögliche partikel- oder zellspezifische Aufnahme-
mechanismen zu. Es zeigte sich, dass bereits Cytochalasin D allein zu leichten
Veränderungen der Granularität führte (Daten nicht gezeigt). Daher wurden in den
weiterführenden Versuchen die Zellen der Kontrollgruppen auch mit der
entsprechenden Konzentration Cytochalasin D im Nährmedium behandelt. Bei den
A549-Zellen wurden 5 µM Cytochalsin zugegeben, bei den PBMC und den THP-1-
Zellen 2 µM. Das Cytochalasin D führte nur bei den primären Monozyten zu einer
38
signifikanten Verminderung der partikelinduzierten Granularitätsänderungen. Die
Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Abbildung 3.9. dargestellt. Bei den PBMC
verringerten sich die Granularitätsänderungen signifikant, für WC 100 um 331,3% und
für WC 10 um 130,8 % auf 107,5% der Kontrolle. Bei den THP-1 verminderte das
Cytochalasin D die Granularitätsänderungen um 48,4% bzw. 14.2% bei WC 100 bzw.
WC 10. Am geringsten war der Effekt bei den Epithelzellen (Differenz von 24,9% bzw.
4,7% für WC 100 bzw. WC 10).
Um zu klären, inwiefern die Wirkungen des Cytochalasin D abhängig waren von der
eingesetzten Konzentration, wurde an den PBMC beispielhaft auch die Wirkung
höherer Cytochalasin D-Konzentrationen (5µM und 10µM) untersucht. Hierbei zeigte
sich, dass die Fähigkeit zur Phagozytosehemmung bei 2 µM Cytochalasin D noch nicht
voll ausgeschöpft war. In Abbildung 3.10 sind die Ergebnisse für die drei Partikel-
suspensionen dargestellt.
Abb. 3.10: Die Granularität der PBMC nach 1, 3 bzw. 20 Stunden Inkubationszeit mit den Partikeln und verschiedenen Konzentrationen Cytochalasin D PBMC wurden mit A) 30 µg/ml WC 100, B) 30 µg/ml WC 10 und C) 33 µg/ml WC-Co inkubiert. Variiert wurden die Inkubationszeiten, die Cytyochalasin-Konzentrationen und eine Gruppe wurde mit 100 pg/ml LPS vorstimuliert. Dargestellt sind die Daten aus einer Einzelmessung als Mediane des SSC
WC 100 WC 10 WC-Co
Konzentration Cytochalasin D [µM]2 5 10
Med
ian
SSC
0
50
100
150
200
250
300
350
Konzentration Cytochalasin D [µM]2 5 10
Med
ian
SSC
0
100
200
300
Konzentration Cytochalasin D [µM]2 5 10
Med
ian
SS
C
0
100
200
3001 h unstimuliert3 h unstimuliert20 h unstimuliert20 h stimuliert
WC 100 WC 10
Konzentration Cytochalasin D [µM]0 2 5 10
Med
ian
SSC
0
200
400
600
800
Konzentration Cytochalasin D [µM]0 2 5 10
Med
ian
SS
C
0
200
400
600
800
Konzentration Cytochalasin D [µM]0 2 5 10
Med
ian
SSC
0
200
400
600
800 1 h unstimuliert3 h unstimuliert20 h unstimuliert20 h stimuliert
WC-Co
39
Abb. 3.11: Granularitätsänderungen durch unterschiedliche Partikelkonzentrationen Für die A549- und THP-1-Zellen stammen die Daten aus einer Einzelmessung. Für die PBMC sind die zusammengefassten Ergebnisse aus drei unabhängigen Versuchen als Mittelwert und Standardabweichung dargestellt. Abgebildet sind die Mediane des SSC. Für die WC 100 bzw. die WC 10 Partikel gelten stets die erstgenannten, für die WC-Co-Partikel die zweitgenannten Konzentrationen.
WC 100 WC 10 WC-Co
Med
ian
SSC
0
200
400
600
800
Kontrolle15 bzw. 16,5 µg/ml30 bzw. 33 µg/ml
PBMC
WC 100 WC 10 WC-Co
Med
ian
SSC
0
50
100
150
200
250
Kontrolle6 bzw. 6,6 µg/ml30 bzw. 33 µg/ml
THP-1
WC 100 WC 10 WC-Co
Med
ian
SSC
0
50
100
150
200
250
Kontrolle7,5 bzw. 8,25 µg/ml15 bzw. 16,5 µg/ml30 bzw. 33 µg/ml
A549
3.2.2 Untersuchungen zu verschiedenen Einflussfaktoren auf die Partikeleffekte
Partikelkonzentration
Bei allen Zellen zeigten sich mit steigenden Partikelkonzentrationen zunehmende
Granularitätsveränderungen (s. Abb. 3.11).
Inkubationszeit
An den PBMC wurde weiterhin untersucht, inwiefern die Granularitätsänderungen
abhängig von der Inkubationszeit waren, wofür die Partikeleffekte nach Inkubations-
zeiten von 1, 3 und 20 Stunden untersucht wurden. Mit steigenden Inkubationszeiten
erhöhte sich der SSC zunehmend. In Abbildung 3.12 ist dieser Zusammenhang
graphisch dargestellt, wobei die PBMC auf CD14-positive Monozyten gegatet wurden,
so dass nur die Granularität für diese Zellfraktion dargestellt ist. Die Verschiebung der
Kurven nach rechts, also zu höheren SSC-Werten, zeigt, dass die Zellen stärker
granulär erschienen, je länger sie mit den Partikeln inkubiert wurden. Die Granularität
war bei Exposition mit 30 µg/ml WC 100 nach 1Stunde auf 193%, nach 3 Stunden auf
460% und nach 20 Stunden auf 792% angestiegen. 30 µg/ml WC 10 erhöhten die
Granularität nach 1 Stunde auf 114%, nach 3 Stunden auf 148% und nach 20 Stunden
auf 341% der jeweiligen Kontrolle. Die WC-Co-Partikel erhöhten die SSC-Mediane auf
236, 554 und 641% der jeweiligen Kontrollen nach einer Inkubationszeit von respektive
1, 3 und 20 Stunden. Es zeigte sich auch hier, dass die Effekte bei den WC 100-Partikeln
im Vergleich zu den WC 10-Partikeln wesentlich stärker ausfielen.
40
In Abb. 3.10 wurden die Ergebnisse der Experimente mit unterschiedlichen
Cytochalasin-Konzentrationen und verschiedenen Inkubationszeiten zusammen-
getragen. Es sind auch hier die bereits beschriebenen partikelspezifischen Effekte zu
erkennen. Die Granularitätsanderungen sind bei den WC 100 und den WC-Co-
Partikeln deutlicher ausgeprägt als bei den WC 10-Partikeln. Eine längere Inkubations-
zeit beeinflusste trotz des Einsatzes von Cytochalasin D die Ausprägung der
Granularitätsänderungen. Höhere Konzentrationen als die eingesetzten 2 µM Cyto-
chalasin D hatten einen additiv hemmenden Effekt. Die Unterschiede zwischen 2, 5
und 10 µM Cytochalasin D fielen bei den Suspensionen mit den größeren
Primärpartikeln (WC 100 und WC-Co) stärker aus als bei den WC 10-Partikeln.
Stimulation mit Endotoxin
Schließlich wurde der Einfluss einer Vorstimulation mit LPS auf die Granularität der
PBMC untersucht. Die erste Frage war, ob bereits eine unspezifische Stimulation der
Sekretion von Zytokinen, wie sie für LPS auf PBMC bekannt ist, zu einer signifikanten
Granularitätsänderung führt. Außerdem wurde beurteilt, inwiefern das LPS die Zell-
Partikel-Interaktionen beeinflusst und welchen Einfluss unterschiedliche Versuchs-
parameter auf stimulierte Zellen haben. Die PBMC wurden eine Stunde vor der
Partikelauftragung mit 100 pg/ml LPS stimuliert. Das LPS veränderte die Granulari-
tätswerte der Monozyten in der nicht partikelexponierten Kontrollgruppe nur
A) B) C)
Abb. 3.12: Veränderungen der Granularität von PBMC in Abhängigkeit von unterschiedlichen Partikeln und Inkubationszeiten Dargestellt sind die SSC-Werte einer durchflusszytometrischen Analyse der PBMC eines Spenders. Es sind nur die CD14-positiven Zellen dargestellt. Die untersuchten Inkubationszeiten mit A) 30 µg/ml WC 100, B) 30 µg/ml WC 10 und C) 33 µg/ml WC-Co betrugen 1 Stunde (hellgrau), 3 Stunden (mittelgrau) und 20 Stunden (dunkelgrau). Die Kontrolle ohne Partikel ist schwarz dargestellt (1 Stunde Inkubation)
41
Abb. 3.13 : Granularitätsveränderungen an unstimulieren und mit LPS vorstimulierten PBMC eines Spenders nach Exposition mit 30 µg/ml WC 100 Dargestellt sind die Ergebnisse der Durchflusszytometrie für mononukleäre Zellen, die entweder mit dem Puffer (linke Spalte) oder 30µg/ml WC 100 (rechte Spalte) für 20 Stunden inkubiert wurden. Eine Gruppe der PBMC wurde vor der Exposition für 1 Stunde mit 100 pg/ml LPS stimuliert (B)
Unstimulierte Zellen
A)
Ohne Partikel 30µg/ml WC 100
CD 14 FITC CD 14 FITC
CD 14 FITC CD 14 FITC
vorstimuliert mit 100 pg/ml LPS
B)
schwach. Bei drei Spendern stiegen die SSC-Werte im Mittel auf 142% der Kontrolle.
Nach Partikelexposition war auch in den stimulierten Zellen eine Änderung der
Granularität analog zu den unstimulierten Zellen zu erkennen, wie es in Abb. 3.13
exemplarisch anhand WC 100 dargestellt wurde. In Relation zu den unstimulierten
Zellen verringerte die Vorstimulation das Ausmaß der Granularitätsänderungen
deutlich: bei den WC 100-Partikeln von 645% auf 467% der Kontrolle, bei den WC 10-
Partikeln von 341% auf 210% der Kontrolle und bei den WC-CoPartikeln von 641% auf
326% der Kontrolle (Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten).
42
3.3 Einfluss der Partikel auf die Zellvitalität
Der Einfluss der Partikelsuspensionen auf die Vitalität der Zellen wurde mittels des
MTT-Tests untersucht. In Vorversuchen konnte nachgewiesen werden, dass die
Partikel im zellfreien Medium mit den MTT-Testsubstanzen die spektralphoto-
metrische Messung nicht beeinflussten (Daten nicht gezeigt). Die Darstellungen der
Resultate der Vitalitätsuntersuchungen beziehen sich auf die Vitalitätswerte der mit
dem Puffer exponierten Kontrollen. Die Inkubation mit unterschiedlichen Konzen-
trationen der Partikelsuspensionen erfolgte für 24 Stunden bzw. für die A549-Zellen
und die PBMC noch zusätzlich für 72 Stunden.
3.3.1 Partikeleffekte auf die A549-Zellen
Bei den Lungenepithelzellen zeigten die untersuchten Partikelarten deutlich konzen-
trationsabhängige, vitalitätsmindernde Effekte, die nach Exposition mit WC-Co-
Partikeln am stärksten ausfielen (s. Abb. 3.14). So senkten beispielsweise 0,33µg/ml
WC-Co die Vitalität von A549-Zellen auf 90% (p = 0,03). Bei WC 100 wirkte diese
Konzentration noch nicht toxisch (99,7%, p=0,94), bei WC 10 nur nach 72 Stunden
Inkubationszeit (89,1%, p=0,01). Eine Verlängerung der Expositionszeit von 24 auf 72
Stunden führte im Allgemeinen nicht zu einer Verstärkung der toxischen Effekte. Bei
den WC-Co-Partikeln war die toxische Wirkung nach der längeren Inkubation sogar
etwas geringer (bei 33 µg/ml 41% nach 24 Stunden vs. 54,2% nach 72 Stunden). Diese
Ergebnisse sind in Abbildung 3.14 dargestellt. Eine Stimulation der Zellen mit 1 ng/ml
TNF-α beeinflusste die Partikeleffekte nicht (Daten nicht gezeigt).
Bei den obigen Ausführungen wurde stets die Massekonzentration der Partikel
betrachtet, wonach die WC 10-Partikel einen stärkeren toxischen Effekt ausübten als
die WC 100-Partikel. Das änderte sich jedoch, wenn die Oberflächenkonzentrationen
als Bezugsparameter gewählt wurden (s. Abb. 3.14 untere Reihe). Dann zeigte sich
nach 24 Stunden Inkubationszeit eine leicht höhere Toxizität von WC 100 im Vergleich
zu WC 10 (s. Abb. 3.14B). Nach 72 Stunden war kein Unterschied zwischen den beiden
Partikelarten WC 100 und WC 10 mehr detektierbar (s. Abb. 3.14C). Unabhängig vom
Konzentrationsmaß beeinträchtigten die WC-Co-Partikel am stärksten die Vitalität.
43
Massekonzentration [µg/ml]0,33 3,3 6,6 16,5 33
Vita
lität
[% K
ontro
lle]
0
20
40
60
80
100
120
140 24 h72 h
###
#
##
### #
Massekonzentration [µg/ml]0,3 3 6 15 30
0
20
40
60
80
100
120
140 24 h72 h
##
#######
WC 10 WC-Co
Massekonzentration [µg/ml]0,3 3 6 15 30
Vita
lität
[% K
ontro
lle]
0
20
40
60
80
100
120
140 24 h72 h
#####
WC 100
Abb. 3.14 Ergebnisse des MTT-Tests an unstimulierten A549-Zellen Obere Zeile: Darstellung der Zellvitalität als % der mit dem jeweiligen Puffer exponierten Zellen nach Inkubation für 24 bzw. 72 h. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten als Mittelwerte und Standardfehler. Signifikante Verminderungen sind durch # gekennzeichnet (p<0,05) Untere Zeile: Vergleich der Darstellung der Vitalität in Bezug auf unterschiedliche Konzentrationsmaße A) Massenkonzentration B) und C) Oberflächenkonzentration mit unterschiedlicher Inkubationszeit. Aufgetragen sind die Messwerte als Mittelwerte aus 3 unabhängigen Experimenten.
nach 72 Stunden Inkubation
Oberflächenkonzentration [cm2/ml]
0,01 0,1 1 10 1000
20
40
60
80
100
120WC 100WC 10WC-Co
24 Stunden Inkubation
Oberflächenkonzentration [cm2/ml]0,01 0,1 1 10 100
0
20
40
60
80
100
120WC 100WC 10WC-Co
B) 24 Stunden Inkubation
Massekonzentration [µg/ml]0 5 10 15 20 25 30 35
Vita
lität
[% K
ontro
lle]
0
20
40
60
80
100
120WC 100WC 10WC-Co
A) C)
3.3.2 Partikeleffekte auf die THP-1-Zellen
Auf die Monozytenzelllinie bewirkten alle untersuchten Konzentrationen der drei
Partikelsuspensionen statistisch signifikante Vitalitätsminderungen. Am stärksten war
dieser Effekt, wie auch bei den A549-Zellen, nach Exposition mit der WC-Co-
Partikelsuspension. Während bei 33 µg/ml WC-Co-Partikelsuspension nur noch 28%
(p < 0,001) der Zellen vitale Reaktionen zeigten, waren es bei WC 100 noch 68% (p <
0,005) und bei WC 10 noch 74% (p < 0,001) der Zellen. Bei der Auftragung der
Oberflächenkonzentrationen der Partikel gegen die Vitalität änderten sich die relativen
Partikeleffekte nicht. WC-Co zeigte weiterhin die stärksten toxischen Effekte, während
WC 100 nur leicht und WC 10 noch weniger toxisch wirkte, wie in Abbildung 3.15
dargestellt.
44
3.3.3 Partikeleffekte auf die PBMC
Bei den PBMC zeigten die WC 10-Partikel die stärksten toxischen Effekte (s. Abb. 3.16).
Bereits die niedrigste eingesetzte Konzentration von 0,3 µg/ml verringerte die
Zellvitalität nach 24 Stunden auf 93% (p = 0,02). Bei der höchsten untersuchten
Massenkonzentration zeigten bei den WC 10-Partikeln noch 56% (p < 0,001) der Zellen
vitale Zeichen, bei WC-Co waren es 77% (p = 0,001) (s. Abb. 3.16A). Bei der Auftragung
der Vitalität gegen die Oberflächenkonzentrationen der Partikel zeigten die WC-Co-
Partikel dagegen eine stärkere toxische Wirkung als die WC 10-Partikel (s. Abb. 3.16B).
Die WC 100-Partikel bewirkten keine signifikanten Veränderungen in der Vitalität der
Zellen. Sie betrug nach 24stündiger Inkubation mit 30 µg/ml noch 95% (p = 0,5).
Bei einer Vorstimulation der PBMC mit 100 pg/ml LPS wirkten die WC 10-Partikel
ebenfalls vitalitätsmindernd, was für die anderen Partikelsuspensionen nicht der Fall
war (Daten nicht gezeigt). Analog zu den A549-Zellen war der toxische Effekt der WC-
Co-Partikel nach 72 Stunden weniger stark ausgeprägt als nach 24 Stunden. 33 µg/ml
der Partikelsuspension verringerten die Vitalität nach 24 Stunden auf 77% (p = 0,001)
und nach 72 Stunden auf 88,3% (p = 0,51). CoCl2 und WC-Co unterschieden sich nicht
signifikant in ihrer vitalitätsmindernden Wirkung (s. Abb. 3.16C). Beide Suspensionen
verringerten jedoch in den beiden höchsten Konzentrationen die Vitalität
unstimulierter und stimulierter PBMC im Vergleich zur Kontrolle signifikant.
Massenkonzentration [µg/ml]0 5 10 15 20 25 30 35
Vita
lität
[% K
ontro
lle]
0
20
40
60
80
100
120
WC 100WC 10WC-Co
A)
Oberflächenkonzentration [cm2/ml]0,01 0,1 1 10 100
Vita
lität
[% K
ontro
lle]
0
20
40
60
80
100
120
WC 100WC 10WC-Co
B)
Abb. 3.15: Partikeleffekte auf die Vitalität der THP-1-Zellen Die Zellen wurden für 24 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen der Partikelsuspensionen (WC 100, WC 10 und WC-Co) exponiert.. In A) sind Vitalitätswerte gegen die Massenkonzentration und in B) gegen die Oberflächenkonzentration aufgetragen. Dargestellt sind die Mittelwerte der zusammengefassten Ergebnisse aus einer Einzelmessung (n=6). In A) sind die Standardabweichungen aufgetragen. Alle Messpunkte waren statistisch signifikant zur Kontrolle (p< 0,05). Auf die Markierung der Signifikanz wurde der besseren Übersichtlichkeit wegen verzichtet.
45
Abb. 3.16: Ergebnisse des MTT-Tests nach Exposition unstimulierter PBMC mit Partikeln und CoCl2 obere Reihe: Einflüsse der Partikel auf die PBMC nach 24 bzw. 72 Stunden Inkubation. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus 5 unabhängigen Versuchen als Mittelwerte und Standardabweichungen, signifikante Verminderungen (p < 0,05) sind mit einem # gekennzeichnet; untere Reihe: In A und B sind die Messwerte für die 24stündige Inkubation mit allen drei Partikelarten zusammengefasst dargestellt. In A) erfolgte die Auftragung der Vitalität gegen die Massenkonzentration und in B) gegen die Oberflächenkonzentration. In C) sind vergleichend die Vitalitätswerte nach 24stündiger Exposition von WC-Co bzw. CoCl2 auf unstimulierte PBMC aufgezeigt. Dargestellt sind hier die zusammengefassten Ergebnisse aus 5 unabhängigen Versuchen als Mittelwert und Standardabweichung.
Massekonz. WC-Co [µg/ml] bzw. Kobaltäquivalent0,33 3,3 6,6 16,5 33
Vita
lität
[% K
ontro
lle]
40
60
80
100
120
140
WC-CoCoCl2
Massenkonzentration [µg/ml]0 5 10 15 20 25 30 35
Vita
lität
[% K
ontro
lle]
50
60
70
80
90
100
110
WC 100WC 10WC-Co
A)
Oberflächenkonzentration [cm2/ml]
0,01 0,1 1 10 100
Vita
lität
[% K
ontro
lle]
50
60
70
80
90
100
110
WC 100WC 10 WC-Co
B) C)
Massenkonzentration [µg/ml]0,3 3 6 15 30
Vita
lität
[% K
ontro
lle]
0
20
40
60
80
100
120
14024 h72 h
WC 100
Massenkonzentration [µg/ml]0,3 3 6 15 30
Vita
lität
[% K
ontro
lle]
0
20
40
60
80
100
120
14024 h72 h
# #
##
#
###
WC 10
Massenkonzentration [µg/ml]0,33 3,3 6,6 16,5 33
Vita
lität
[% K
ontro
lle]
0
20
40
60
80
100
120
14024 h72 h
# #
#
WC-Co
3.4 Immunmodulatorische Effekte der Wolframcarbidpartikel
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwiefern A549- und THP-1-
Zellen sowie PBMC auf die Exposition mit nanoskaligen Wolframcarbidpartikeln mit
der Bildung von Zytokinen bzw. Chemokinen reagierten. Im Rahmen vorbereitender
Versuche wurden unterschiedliche Partikelkonzentrationen für 24 Stunden mit
definierten Verdünnungsreihen von Zytokinen inkubiert und anschließend die
Zytokinkonzentrationen im ELISA gemessen. Die Ergebnisse sind beispielhaft für
MCP-1 in Abb. 3.17 aufgeführt. Die Partikel bewirkten durchgängig eine Verringerung
der gemessenen Zytokinkonzentration. Dieser Effekt war vor allem im Bereich höherer
Zytokinkonzentrationen zu erkennen. Es war keine Abhängigkeit der Partikeleffekte
von den eingesetzten Partikelkonzentrationen zu detektieren. Da die Zytokin-
konzentrationen gleichmäßig unterschätzt wurden, wurden die Partikel-Zytokin-
Interaktionen bei der Interpretation der Daten berücksichtigt.
46
Abb. 3.17: Untersuchung der Partikeleffekte auf die Zytokinkonzentrationen im ELISA Nach 24stündiger Inkubation verschiedener Partikelkonzentrationen von WC 100, WC 10 und WC-Co mit einer Standard-Verdünnungsreihe (jeweils 1:2 mit Medium verdünnt) wurden die Zytokinkonzen-trationen bestimmt. Dargestellt sind die Ergebnisse aus einer Einzelmessung in Triplikaten als Mittelwerte der Zytokinkonzentrationen in pg/ml.
Standard-Verdünnungen1 2 3 4 5 6
MC
P-1
[pg/
ml]
0
2x103
4x103
6x103
8x103
104
Standardreihe30 µg/ml WC 1006 µg/ml WC 1000,3 µg/ml WC 100
WC 100
Standard-Verdünnungen1 2 3 4 5 6
0
2x103
4x103
6x103
8x103
104
Standardreihe30 µg/ml WC 106 µg/ml WC 100,3 µg/ml WC 10
WC 10
Standard-Verdünnungen1 2 3 4 5 6
0
2x103
4x103
6x103
8x103
104
Standardreihe33 µg/ml WC-Co6,6 µg/ml WC-Co0,33 µg/ml WC-Co
WC-Co
3.4.1 Reaktionen der A549-Zellen
Es wurde untersucht, wie die Epithelzellen auf die Exposition mit unterschiedlichen
Konzentrationen der Partikelsuspensionen für 24 bzw. 72 Stunden reagierten.
Gemessen wurden die Konzentrationen von IL-6 und MCP-1 im Überstand der
Zellkultur. Am deutlichsten waren die Effekte des WC 10 zu beobachten, das eine
Erhöhung der MCP-1-Konzentration bewirkte (bei 15µg/ml auf 134% der Kontrolle,
p=0,03). Die Steigerung der MCP-1-Sekretion nach Exposition mit WC 100-Partikeln
fiel dagegen deutlich schwächer aus. 30 µg/ml der Partikelsuspension bewirkten
lediglich eine Steigerung der Zytokinkonzentration auf 112% der Kontrolle (p < 0,002)
(s. Abb. 3.18). Die Exposition mit WC-Co für 24 Stunden hingegen verringerte die
MCP-1-Konzentration bereits ab der niedrigsten Konzentration (0,33µg/ml, 94%, p <
0,05). Nach 72 Stunden war dieser hemmende Effekt nicht mehr nachweisbar (s. Abb.
3.18). Keines der Partikel führte zu signifikanten Beeinflussungen der IL-6-Produktion
(Daten nicht gezeigt). Die Stimulation der A549-Zellen mit 1 ng/ml TNF-α vor der
Partikelexposition hatte nur einen geringen Einfluss auf die Partikeleffekte. Lediglich
die Verminderung der MCP-1-Konzentration nach WC-Co-Exposition fiel stärker aus
als bei den unstimulierten Zellen. Nach 24 Stunden Inkubation mit 33 µg/ml WC-Co
betrug die MCP-1-Konzentration bei unstimulierten Zellen noch 79% und bei den
stimulierten nur noch 51% der Kontrolle (p < 0,001).
47
Massenkonzentration [µg/ml]0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33
MC
P-1
[% K
ontro
lle]
0
50
100
150
200WC 100WC-Co
##
#
#
MCP-1
Massenkonzentration [µg/ml]0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33
TNF-
α [%
Kon
trolle
]
0
50
100
150
200
250
300
350WC 100WC-Co
#####
*
*
TNF-α
Abb. 3.19: Partikeleffekte von WC 100 und WC-Co auf die Konzentrationen von MCP-1 und TNF-α im Kulturüberstand von THP-1-Zellen Zytokinkonzentrationen im ELISA nach Exposition von THP-1 für 24 Stunden. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus einer Einzelmessung (n=6). Sigifikante. Erhöhungen sind mit *, signifikante Verminderungen mit # gekennzeichnet (p<0,05)
3.4.2 Reaktionen der THP-1-Zellen
Bei den THP-1 Zellen wurde die Konzentration von MCP-1 und TNF-α nach
24stündiger Exposition mit den Partikelsuspensionen untersucht. Die Exposition mit
WC 10-Partikeln hatte keinen Einfluss auf die Sekretion der Zytokine (Daten nicht
gezeigt). WC 100-Partikel beeinflussten die MCP-1-Konzentration ebenfalls nicht.
Allerdings erhöhten sie die Produktion des TNF-α signifikant (bei 30 µg/ml auf 247%
der Kontrolle, p < 0,001). WC-Co hingegen verminderte die Bildung der untersuchten
Zytokine. Bei der MCP-1-Konzentration erreichte dieser inhibitorische Effekt
statistische Signifikanz bereits ab einer Partikelkonzentration von 3,3 µg/ml (71% der
Kontrolle, p = 0,001). Der Einfluss auf die TNF-α-Produktion fiel deutlich geringer aus
(bei 33µg/ml auf 81% der Kontrolle, p = 0,003). Die Ergebnisse sind in Abbildung 3.19
zusammengefasst.
Abb. 3.18: Beeinflussung der Produktion von MCP-1 in A549-Zellen durch die Partikel Darstellung der im ELISA gemessenen Zytokinproduktion. Die Zellen wurden für 24 bzw. 72 Stunden mit den Partikeln inkubiert. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus 3 unabhängigen Experimenten als Mittelwert und Standardfehler. Signifikant erhöhte Werte im Vergleich zur Kontrolle wurden mit *, signifikant verringerte Werte mit # gekennzeichnet (p < 0,05)
Massenkonzentration [µg/ml]0,3 3 6 15 30
0
20
40
60
80
100
120
140
160
18024 h72 h
* *
**
* *
WC 10
Massenkonzentration [µg/ml]0,3 3 6 15 30
MC
P-1
[% K
ontro
lle]
0
20
40
60
80
100
120
140
160
18024 h 72 h
* * * * *
WC 100
Massenkonzentration [µg/ml]0,33 3,3 6,6 16,5 33
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
24 h72 h
# # # #
WC-Co
48
3.4.3 Reaktionen der PBMC
Die Monozyten und Leukozyten, die aus dem venösen Blut anonymer Blutspender
isoliert wurden, zeigten zum Teil sehr starke Reaktionen auf die 24stündige bzw.
72stündige Exposition mit den Partikelsuspensionen. Es wurden die Partikeleffekte auf
die Sekretion der Zytokine und Chemokine IL-6, MCP-1, IFN-γ und TNF-α untersucht.
In Abbildung 3.20 sind die Auswirkungen der Partikelexposition auf IL-6, MCP-1 und
TNF-α zusammenfassend dargestellt. Da keine der Partikelsuspensionen einen
Einfluss auf die Konzentration des Zytokins IFN-γ ausübte, ist dieses Zytokin nicht
abgebildet. Insgesamt zeigten die WC 100-Partikel die stärksten Effekte, gefolgt von
WC-Co und WC 10. Die Partikelexposition erhöhte nach 24 Stunden die Freisetzung
von IL-6 und MCP-1 sehr stark und zunehmend mit steigender Partikelkonzentration.
Bei den höchsten WC-Co-Konzentrationen kam es bei MCP-1 wieder zu einem Abfall
der Zytokinkonzentration. Die TNF-α−Freisetzung wurde durch WC 100 und die WC-
Co deutlich, durch WC 10 jedoch nicht beeinflusst. Die Partikeleffekte auf IL-6 und
MCP-1 zeigten keine Abhängigkeit von den unterschiedlichen Inkubationszeiten.
Daher werden nur die Ergebnisse der Experimente dargestellt, bei denen die Zellen für
24 Stunden mit den Partikeln exponiert wurden. Bei TNF-α war nach 72stündiger
Exposition kein Partikeleffekt mehr nachweisbar. Das Ausmaß der Zytokinkonzentra-
tionsänderungen unterlag starken interindividuellen Schwankungen.
Einfluss der individuellen Disposition auf die Partikeleffekte
Zur Verdeutlichung der Abhängigkeit der Partikeleffekte von der individuellen
Disposition der Spender wurden die PBMC verschiedener Spender an einem Tag mit
allen Partikelsuspensionen exponiert. In Abbildung 3.21 sind exemplarisch die
Ergebnisse für zwei Spender und das Zytokin IL-6 aufgeführt. Die PBMC beider
Spender wurden am selben Tag präpariert und mit den gleichen Chargen der Partikel
exponiert. Während WC 10 bei Spender 125 mit Abstand die stärksten Effekte in Bezug
auf die IL-6-Konzentration auslöste (s. Abb. 3.21A), zeigten sich bei Spender 126 keine
signifikanten Unterschiede im Effekt der unterschiedlichen Partikelarten (s. Abb.
3.21B). Auch die Stärke der Zytokinproduktion unterschied sich stark im Vergleich der
beiden Spender. Bei Spender 125 erhöhten 30µg/ml WC 10 die IL-6-Konzentration
beispielsweise auf 4821% der Kontrolle. Dieselbe Partikelkonzentration bewirkte bei
49
Abb. 3.21 Vergleich der Partikeleffekte auf die IL-6-Konzentration an zwei Spendern Darstellung der IL-6-Konzentration im Überstand der Zellkultur. Die PBMC von A) Spender 125 und B) Spender 126 wurden jeweils für 24 Stunden mit den Partikelsuspensionen inkubiert. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus drei Bestimmungen als Mittelwerte und Standardabweichung
Massenkonzentration [µg/ml]0,3 / 0,33 3 / 3,3 6 / 6,6 15 / 16,5 30 / 33
IL-6
[% K
ontro
lle]
0
1000
2000
3000
4000WC 100WC 10WC-Co
A)
Massenkonzentration [µg/ml]0,3 / 0,33 3 / 3,3 6 / 6,6 15 / 16,5 30 / 33
IL-6
[% K
ontro
lle]
0
50
100
150
200
250
300
350WC 100WC 10WC-Co
B)
Spender 126 eine wesentlich geringere Erhöhung der IL-6-Konzentration auf 481% der
Kontrolle (s. Abb. 3.21).
Abb. 3.20: Zytokinkonzentrationen (IL-6, MCP-1, TNF-α) nach Partikelexposition auf PBMC Zytokinproduktion unstimulierter PBMC, die für 24 Stunden mit Partikelsuspensionen in verschiedenen Konzentrationen exponiert wurden. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus sechs unabhängigen Experimenten (jeweils in Triplikaten). Die Box-Plots repräsentieren den Median und den Interquartilabstand. Die Ergebnisse wurden dargestellt als Prozent der Kontrollen (100%), die y-Achse ist zur besseren Darstellung logarithmisch eingeteilt. * bezeichnet eine signifikante Erhöhung der Zytokinkonzentration (p<0,05).
0,3 3 6 15 30101
102
103
104
105
106
***
0,3 3 6 15 30101
102
103
104
105
106
WC 10
Massenkonzentration [µg/ml]
0,3 3 6 15 30101
102
103
104
105
0,3 3 6 15 30101
102
103
104
105
106
***
*
*
WC 100
MC
P-1
[% K
ontr
olle
] IL
-6
[% K
ontr
olle
]
Massenkonzentration [µg/ml]0,3 3 6 15 30
101
102
103
104
105
TNF-
α
[% K
ontr
olle
]
0,3 3 6 15 30101
102
103
104
105
106
****
*
0,33 3,3 6,6 16,5 33101
102
103
104
105
*
*
**
WC-Co
0,33 3,3 6,6 16,5 33100
101
102
103
104
Massenkonzentration [µg/ml]0,33 3,3 6,6 16,5 33
101
102
103
104
105
50
3.4.4 Untersuchungen zum Mechanismus der Partikeleffekte
3.4.4.1 Reaktion von PBMC auf inerte Latexpartikel
Es wurde untersucht, ob eine Exposition von PBMC mit Latexpartikeln die Zytokin-
sekretion der Zellen beeinflusst. Dafür wurden die gleichen Latexpartikel wie bei den
durchflusszytometrischen Untersuchungen verwendet. Die Partikeldichte betrug bei
der höchsten eingesetzten Massenkonzentration etwa 1- 2x109 Partikeln/ml. Ihre
Berechnung erfolgte nach Teeguarden et al. (2007), wobei die Partikeldurchmesser
berücksichtigt wurden, die die Größe der Partikelagglomerate beschreiben (s. Tab. 2.2).
Die Latexpartikel führten bei drei unabhängigen Experimenten zu keiner signifikanten
Erhöhung der Produktion von IL-6, MCP-1 oder TNF-α. Nach der Exposition mit
109Latexpartikeln/ml betrug die IL-6 Konzentration 104% der Kontrolle (p = 0,58), die
MCP-1-Konzentration 139% der Kontrolle (p = 0,19) und die TNF-α-Konzentration 97%
der Kontrolle (p = 0,58).
3.4.4.2 Einfluss einer Vorstimulation mit LPS
Das Ausgangsniveau der Zytokinkonzentration war im Vergleich zu unstimulierten
Zellen erwartungsgemäß stark erhöht, wenn die PBMC eine Stunde vor der Partikel-
exposition mit 100 pg/ml LPS stimuliert wurden (Daten nicht gezeigt). Nach
Exposition stimulierter Zellen mit WC 100- und WC 10-Partikeln zeigten sich die
Zytokinkonzentrationen nicht zusätzlich erhöht. Lediglich die WC-Co-Partikel führten
auch bei vorstimulierten Zellen zu einer vermehrten Produktion von IL-6 und TNF-
α. Eine 24stündige Inkubation stimulierter PBMC mit 16,5 µg/ml WC-Co erhöhte die
Konzentration von IL-6 auf 151 % (p = 0,02) und die des TNF-α auf 458% der Kontrolle
(p<0,01). Die MCP-1-Konzentration im Überstand mit 33 µg/ml WC-Co exponierter
stimulierter Zellen sank hingegen nach 24 Stunden auf 47% der Kontrolle (p = 0,005).
Diese Ergebnisse sind in Abbildung 3.22 dargestellt.
51
3.4.4.3 Einfluss von Cobaltionen auf den Effekt der WC-Co-Partikel
Um den Anteil der Cobaltionen an den Partikeleffekten des WC-Co auf die PBMC zu
untersuchen, wurden die Zellen von 5 Spendern für 24 Stunden mit WC-Co und CoCl2
inkubiert und die Zytokinkonzentration von IL-6, MCP-1 und TNF-α im Überstand
ermittelt. Die eingesetzten Konzentrationen an Cobaltchlorid entsprachen den Cobalt-
konzentrationen in den jeweiligen WC-Co-Suspensionen (z.B. 51µM Co bei 33µg/ml
WC-Co). Die Exposition der PBMC mit Cobaltchlorid führte im Vergleich zu WC-Co-
Partikeln nicht zu signifikanten Veränderungen der Zytokin-bzw. Chemokin-
konzentrationen (s. Abb. 3.23).
Abb. 3.23: Vergleich der Wirkung von CoCl2 und WC-Co-Partikeln auf unstimulierte PBMC Konzentration von IL-6, MCP-1 und TNF-α nach 24stündiger Inkubation mit WC-Co bzw. CoCl2 im Kulturüberstand der PBMC. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus 5 unabhängigen Experimenten als Median und Interquartilabstand. Signifikante Unterschiede zwischen den WC-Co und den CoCl2-Effekten sind mit einem * gekennzeichnet (p<0,05)
Massenkonzentration WC-Co [µg/ml] 0,33 3,3 6,6 16,5 33IL
-6 -K
onze
ntra
tion
[% K
ontro
lle]
101
102
103
104
105
WC-CoCoCl2
*
**
IL-6
Massenkonzentration WC-Co [µg/ml] 0,33 3,3 6,6 16,5 33M
CP-
1-K
onze
ntra
tion
[% K
ontro
lle]
101
102
103
104
105
WC-CoCoCl2
MCP-1
Massenkonzentration WC-Co [µg/ml] 0,33 3,3 6,6 16,5 33TN
F-α
-Kon
zent
ratio
n [%
Kon
trolle
]
101
102
103
104
105
WC-CoCoCl2
*
*
TNF-α
Abb. 3.22: Partikeleffekte an vorstimulierten PBMC Darstellung der Zytokinproduktion durch PBMC als Reaktion auf die 24stündige Exposition mit unter-schiedlichen Konzentrationen der Partikelsuspensionen. Die stimulierten PBMC wurden eine Stunde vor der Partikelzugabe mit 100 pg/ml LPS behandelt. Dargestellt sind die zusammen gefassten Ergebnisse aus 5 unabhängigen Experimenten als Median
Massenkonzentration [µg/ml]0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33
IL-6
-Kon
zent
ratio
n [%
Kon
trolle
]
90
100
110
120
130
140
150
160WC 100WC 10WC-Co
Massenkonzentration [µg/ml]0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33
MC
P-1
-Kon
zent
ratio
n [%
Kon
trolle
]
20
40
60
80
100
120
140
160
WC 100WC 10WC-Co
Massenkonzentration [µg/ml]0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33
TNF-
α-K
onze
ntra
tion
[% K
ontro
lle]
0
100
200
300
400
500
WC 100WC 10WC-Co
IL-6 MCP-1 TNF-α
52
Massenkonzentration WC 100 [µg/ml]0 5 10 15 20 25 30 35
MC
P-1
-Kon
zent
ratio
n [%
Kon
trolle
]
0
1000
2000
3000
4000
50005 mM NAC10 mM NAC15 mM NAC25 mM NAC
WC 100
Massenkonzentration WC-Co [µg/ml]0,33 3,3 6,6 16,5 33
MC
P-1
-Kon
zent
ratio
n [%
Kon
trolle
]
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
5 mM10 mM15 mM25 mM
WC-Co
Abb. 3.24 : Auswirkung verschiedener NAC-Konzentrationen auf die MCP-1-Sekretion partikelexponierter PBMC Jeweils ein Spender wurde für 24 Stunden mit WC 100- bzw. WC-Co-Partikeln und NAC-Konzentrationen von 5, 10 15 oder 25mM exponiert. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse als Mittelwert und Standardabweichung aus Triplikaten.
3.4.4.4 Beteiligung von reaktiven Sauerstoffradikalen an den Partikeleffekten
In vielen Studien zu Nanopartikeln wird auf den Zusammenhang zwischen Partikel-
effekten und reaktiven Sauerstoffspezies hingewiesen. Um indirekt deren Einfluss auf
die Partikeleffekte in der vorliegenden Arbeit zu untersuchen, wurden die PBMC vor
der Partikelexposition mit N-Acetylcystein (NAC) inkubiert. Dies ist ein Radikalfänger,
der auf unterschiedlichen Wegen die Bildung von ROS verhindern kann. Zum Einen
kann das NAC ROS direkt abfangen und zum Anderen fungiert es als Vorläufer von
Gluthation, einem physiologischen zellulären Antioxidans.
An jeweils einem Spender wurden zunächst verschiedene NAC-Konzentrationen und
ihre Auswirkungen auf die Zytokinbildung getestet. Das NAC wirkte in den
eingesetzten Konzentrationen nicht zelltoxisch auf die PBMC (Daten nicht gezeigt).
Wie in Abbildung 3.24 anhand des MCP-1 dargestellt ist, hemmten 25 mM NAC die
partikelinduzierte Zytokinproduktion fast vollständig. Diese Konzentration wurde im
Folgenden in 5 unabhängigen Experimenten an unstimulierten und stimulierten PBMC
verwendet, um die Wirkung von NAC auf die Partikeleffekte zu untersuchen. Einen
Überblick über die partikel- und zytokinspezifischen Wirkungen des NAC an
unstimulierten und stimulierten PBMC soll Abbildung 3.25 vermitteln.
In Abbildung 3.25 ist zu erkennen, dass die immunstimulatorische Wirkung der
Partikel durch 25 mM NAC im Allgemeinen gehemmt wurde. Die NAC-Wirkungen
stellten sich zytokinspezifisch dar – an unstimulierten Zellen zeigten sich die MCP-1-
53
Konzentrationen am stärksten beeinflusst, bei den stimulierten Zellen die TNF-α-
Konzentrationen. Auffallend war die starke stimulatorische Wirkung des NAC auf die
MCP-1-Sekretion nach Exposition mit den WC-Co-Partikeln (s. Abb. 3.25). Bei einem
Vergleich der absoluten Zytokinkonzentrationen zeigte sich eine an den unstimulierten
Zellen eine stimulatorische Wirkung des NAC, die mit steigender Partikelkonzen-
tration abnahm (Daten nicht gezeigt). Bei allen Versuchen mit dem N-Acetylcystein
traten große interindividuelle Schwankungen auf.
Im Folgenden sollte daher ermittelt werden, inwiefern eine variable Vorstimulation der
exponierten Zellen die NAC-Wirkung beeinflusst. Dafür wurden die PBMC jeweils
dreier Spender mit LPS-Konzentrationen zwischen 0,1 und 10000 pg/ml stimuliert und
mit 25mM NAC exponiert. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Abbildung
3.26 dargestellt und zeigen zum Einen, dass die Wirkung des NAC auf die Zytokin-
konzentration stark abhängig war vom Ausmaß der Vorstimulation der Zellen. Zum
Anderen schienen auch hier wieder, besonders beim MCP-1, interindividuelle Unter-
schiede in der Reaktion auf die Stimuli eine große Rolle zu spielen.
Abb. 3.25: Einfluss des Radikalfängers N-Acetylcystein auf die Partikeleffekte an unstimulierten und stimulierten Zellen Vor der 24stündigen Inkubation mit den Partikelsuspensionen wurden die Zellen mit 25 mM NAC inkubiert. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus 5 unabhängigen Experimenten an unstimulierten (obere Reihe) und stimulierten (untere Reihe) PBMC. Auf der y-Achse sind die Differenzen der Mediane abgetragen (% Kontrolle mit NAC - % Kontrolle ohne NAC).
stim
ulie
rt
unst
imul
iert
IL-6
Massenkonzentration WC-Co [µg/ml]
0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33
IL-6
[Diff
. % K
ontro
lle]
-400
-200
0
200
WC 100WC 10 WC-Co
Massenkonzentration WC-Co [µg/ml]
0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33
MC
P-1
[Diff
. % K
ontro
lle]
-2000
-1500
-1000
-500
0
500
WC 100WC 10 WC-Co
Massenkonzentration WC-Co [µg/ml]
0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33
TNF-
α[D
iff. %
Kon
trolle
]
-400
-200
0
200
WC 100WC 10 WC-Co
Massenkonzentration WC-Co [µg/ml]
0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33
IL-6
[Diff
. % K
ontro
lle]
-100
-50
0
50
100
150
200WC 100WC 10 WC-Co
Massenkonzentration WC-Co [µg/ml]
0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33
MC
P-1
[Diff
. % K
ontro
lle]
-100
-50
0
50
100
150
200WC 100WC 10 WC-Co
Massenkonzentration WC-Co [µg/ml]
0,3/ 0,33 3/ 3,3 6/ 6,6 15/ 16,5 30/ 33
TNF-
α [D
iff. %
Kon
trolle
]
-300
-200
-100
0
100
200
300WC 100WC 10 WC-Co
MCP-1 TNF-α
54
Abb. 3.27: LPS-Konzentrationsreihe und die Effekte eines monoklonalen anti-CD14-Antikörpers PBMC wurden für 24 Stunden mit steigenden Konzentrationen von LPS und 1 µg/ml eines anti-CD14-Antikörpers inkubiert. Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus 3 unabhängigen Versuchen als Mittelwerte und Standardabweichungen
LPS-Konzentration [pg/ml]0,1 1 10 100 1000 10000
Zyto
kink
onze
ntra
tion
[% K
ontro
lle]
101
102
103
104
105
106
LPSLPS + CD14 Antikörper
IL-6
LPS-Konzentration [pg/ml]0,1 1 10 100 1000 10000
Zyto
kink
onze
ntra
tion
[% K
ontro
lle]
100
101
102
103
104
105
LPSLPS + CD14 Antikörper
MCP-1
LPS-Konzentration [pg/ml]0,1 1 10 100 1000 10000
Zyto
kink
onze
ntra
tion
[% K
ontro
lle]
101
102
103
104
105
106
LPSLPS + CD14 Antikörper
TNF-a
3.4.4.5 Der CD14-Rezeptor
Abschließend wurde die Rolle des Oberflächenmoleküls CD14 bei der Vermittlung der
Partikeleffekte untersucht. Bei der Exposition der PBMC mit einer Konzentrationsreihe
LPS (0,1-10.000 pg/ml) hemmte ein eingesetzter ani-CD14-Antikörper die Produktion
aller untersuchten Zytokine (s. Abb. 3.27).
Während diese Hemmung bei IL-6 und TNF-α mit steigenden LPS-Konzentrationen
geringer wurde, blieb sie in Bezug zum MCP-1 über die gesamte Konzentrationsreihe
relativ konstant. Es wurde zudem deutlich, dass die in den Versuchen zur
Vorstimulation eingesetzte LPS-Konzentration von 100 pg/ml in dem Bereich lag, in
dem die LPS-Wirkung auf die Zytokinproduktion zu einem großen Teil durch den
CD14- Rezeptor vermittelt und daher auch durch den Antikörper gehemmt wurde. Die
LPS-Konzentrationen
0,1 1 10 100 1000 10000
% Z
ytok
ine
rela
tiv z
u P
robe
ohn
e N
AC
0
100
200
300
400
500
Spender 30 Spender 31Spender 32
IL-6
LPS-Konzentrationen
0,1 1 10 100 1000 10000
% Z
ytok
inko
nz. r
elat
iv z
u P
robe
ohn
e N
AC
0
20
40
60
80
100
120
Spender 30Spender 31Spender 32
TNF-a
LPS-Konzentrationen
0,1 1 10 100 1000 10000
% Z
ytok
ine
rela
tiv z
u P
robe
ohn
e N
AC
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
Spender 30Spender 31Spender 32
MCP-1
Abb. 3.26: Einfluss des Ausmaßes der Vorstimulation von PBMC auf die Wirkung von N-Acetylcystein Abgebildet sind die relativen Änderungen in den Zytokinkonzentrationen der NAC-exponierten Proben im Vergleich zu den Kontrollen ohne NAC. Die Versuche wurden in Triplikaten durchgeführt und sind als Mittelwerte aufgetragen.
55
IL-6 Konzentration nach Antikörper-Exposition betrug in Bezug auf den Effekt von 100
pg/ml LPS nur noch 2%, die des MCP-1 noch 19% und die des TNF-α 3%.
Der eingesetzte monoklonale anti-CD14-Antikörper schwächte die immunmodulato-
rischen Partikeleffekte an den PBMC deutlich, jedoch nicht vollständig. Die Effekte des
Antikörpers waren abhängig von der eingesetzten Partikelkonzentration. In Tab. 3.1
sind die ermittelten Zytokinkonzentrationen nach Antikörpereinsatz für zwei Partikel-
konzentrationen dargestellt.
Tab. 3.1: Wirkung des anti-CD14-Antikörpers auf die Zytokinproduktion nach Partikelexposition Dargestellt sind die zusammengefassten Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten als Mittelwerte in % Kontrolle
WC 100 WC 10 WC-Co
antiCD14Ak 30 µg/ml 15 µg/ml 30 µg/ml 15 µg/ml 30 µg/ml 15 µg/ml
IL-6 - 4617 1668 2941 1056 335 185
+ 717 270 665 329 181 173
MCP-1 - 23023 12320 14711 5738 85 225
+ 322 350 298 281 52 107
TNF-α - 1124 520 1133 534 418 202
+ 471 324 493 317 287 157
56
57
4 DISKUSSION
In der vorliegenden Arbeit wurden die Wirkungen verschiedener nanoskaliger
Wolframcarbid-Suspensionen auf drei Zellkulturmodelle untersucht. Deren Auswahl
erfolgte anhand des wahrscheinlichsten Expositionswegs der Wolframcarbidpartikel –
der Inhalation. Untersucht wurden A549-Zellen, die phänotypisch Alveolarepithel-
zellen vom Typ II ähneln, differenzierte THP-1 Zellen stellten ein Modell für die
Alveolarmakrophagen dar, und die Partikeleffekte auf primäre Immunzellen wurden
anhand mononukleärer Zellen aus Spenderblut beobachtet. In den verschiedenen
Monokultursystemen wurde untersucht, inwiefern die Partikel in die Zellen
aufgenommen wurden oder sich an die Zellen anlagerten. Des Weiteren wurde der
Partikeleinfluss auf die Zellvitalität und auf die Produktion immunmodulatorischer
Stoffe gemessen. Mögliche Interaktionen zwischen den verwendeten Testsystemen und
Nanopartikeln (Stone et al. 2009, Jones and Grainger 2009) werden in den
entsprechenden Abschnitten diskutiert. Zunächst sollen jedoch einige wichtige
Aspekte im Hinblick auf die verwendeten Wolframcarbid-Suspensionen und die Zell-
kultursysteme erwähnt werden, die die Interpretation aller biologischen Endpunkte
der vorliegenden Arbeit beeinflussten.
4.1 Allgemeine methodologische Aspekte
4.1.1 Zu den Partikelsuspensionen
Die Wolframcarbidpartikel wurden im Rahmen des INOS-Projektes ausführlich
charakterisiert (Bastian et al. 2009, Meissner et al. 2010), wie es in den letzten Jahren
von vielen Autoren ausdrücklich gefordert wurde (z.B. Teeguarden et al. 2007, Warheit
et al. 2008). WC 100 und WC-Co unterschieden sich kaum im Hinblick auf ihr
Verhalten in physiologischen Medien. Bei dem Vergleich von WC 100- und WC 10-
Partikeln sind in Bezug auf die vorliegende Arbeit folgende Aspekte von Bedeutung:
- Die kristalline Phase von WC 100-Partikeln besteht aus Wolframcarbid-
kristallen, WC 10 hingegen aus W2C-Kristallen mit einem deutlich erhöhten
Anteil an Kohlenstoff, der als Carbon Black (CB) vorliegt (Meissner et al. 2010).
Es ist möglich, dass die Partikeleffekte der WC 10-Partikel durch den erhöhten
Kohlenstoffanteil beeinflusst wurden (Sydlik et al. 2006, Drumm et al. 2000).
58
- Nach der Ultraschallbehandlung lagen die WC 10-Partikel im Gegensatz zu den
WC 100-Partikeln hochgradig aggregiert vor. Als Aggregate werden Partikel
bezeichnet, die durch sehr starke Kräfte, wie z.B. kovalente Bindungen,
miteinander verbunden sind. Für die Wechselwirkungen mit biologischen
Systemen steht daher unter Umständen eine kleinere reaktive Oberfläche zur
Verfügung als die Summe der Oberflächen der Einzelpartikel (BSI 2007). Diese
Eigenschaft der WC 10-Partikel kann dazu führen, dass sich trotz der kleineren
Primärpartikel ihre biologisch aktive Oberfläche nicht deutlich von der der
größeren Partikel unterscheidet.
- Sowohl die WC 100- als auch die WC 10-Partikel zeigten in RPMI-Medium eine
starke Neigung zur Agglomeration (Meissner et al. 2010). Agglomerate sind
lose verbundene Partikel oder Aggregate, bei denen die resultierende Ober-
fläche ungefähr so groß ist, wie die Summe der Einzeloberflächen (BSI 2007).
Durch Zugabe von Serum zum Medium konnte die Agglomerationsneigung
der Partikel deutlich vermindert werden. Dennoch entstanden Partikel-
agglomerate, die bei beiden Partikelarten ähnliche Durchmesser aufwiesen. Für
die Stabilisierung der WC-10-Partikelsuspension wurde allerdings weniger
Serum benötigt. Verantwortlich dafür könnten die geringere Porengröße oder
der erhöhte Anteil an CB der WC 10-Partikel sein (Meissner et al. 2010). Die
Stabilisierung von Nanopartikeln durch Serum wird mit einer Umhüllung der
Partikel durch Serumproteine erklärt (Cedervall et al. 2007, Lynch et al. 2006).
Die Anzahl und die Art der umhüllenden Proteine können die zelluläre
Aufnahme und die biologische Aktivität von Nanopartikeln beeinflussen
(Dutta et al. 2007). Da sich die Proteinumhüllung der WC 100- von der der WC
10-Partikel unterschied, liegt hierin eine mögliche Ursache für unterschiedlich
ausgeprägte Effekte der Partikelarten. In der vorliegenden Arbeit wurden die
beiden Partikelsuspensionen allerdings mit einheitlichen Serumkonzen-
trationen im Zellmedium verwendet, da Bestandteile des Serums einen
partikelunabhängigen Einfluss auf die Zellkulturen ausüben können.
Wie aus diesen Ausführungen zu ersehen ist, gibt es trotz der gemeinsamen Grund-
struktur relevante Unterschiede zwischen den WC 100- und den WC 10-Partikeln. Ihre
biologischen Effekte müssen daher in diesem Kontext interpretiert werden.
59
Bei der Verwendung von Partikelsuspensionen in in vitro Versuchen gibt es viele
Möglichkeiten, die Konzentration anzugeben. Zu den nominalen Konzentrations-
maßen gehören beispielsweise die Masse pro Volumen (Massenkonzentration), die
Partikelanzahl pro Volumen (Partikeldichte) sowie die Oberfläche pro Volumen (Ober-
flächenkonzentration). Im Gegensatz zu effektiven Konzentrationsmaßen (Teeguarden
et al. 2007), wie z.B. der Partikelanzahl pro exponierter Zelle, setzt die Verwendung der
nominalen Konzentrationsmaße voraus, dass der Großteil der aufgebrachten Partikel
mit den exponierten Zellen in Kontakt kommt. In der vorliegenden Arbeit wurde mit
submersen Zellkulturen gearbeitet und die Partikel wurden als Suspensionen
aufgetragen. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass der größte Teil der
Partikel durch konvektive Vorgänge in der Suspension die exponierten Zellen erreichte
(Lison et al. 2008). Zum Vergleich der Partikeleffekte wurde in der vorliegenden Arbeit
vorrangig die Massenkonzentration in µg/ml eingesetzt, da dies eine etablierte Vor-
gehensweise darstellt. Für den Vergleich von Partikeln unterschiedlicher Primär-
partikelgröße wird allerdings von einigen Autoren die Verwendung der Oberflächen-
konzentration als Bezugsmaß empfohlen (Oberdörster 2005, Stoeger et al. 2006). In
Bezug auf die WC 100- und WC 10-Partikel wurde daher in der vorliegenden Arbeit
zusätzlich betrachtet, inwiefern die Verwendung unterschiedlicher Konzentrations-
maße die Interpretation der Partikeleffekte beeinflusste.
4.1.2 Zu den in vitro Zellkulturmodellen
Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Zelltypen sollten dazu beitragen, die
biologische Wirkung der untersuchten Nanopartikel nach Inhalation und Trans-
lokation in die Blutbahn zu bewerten. Sowohl die A549- als auch die THP-1-Zellen
wurden ursprünglich aus Tumoren gewonnen. Sie dienen als Modell primärer Zellen,
unterscheiden sich von diesen aber aufgrund ihrer Herkunft im Hinblick auf die
zelluläre Differenzierung und die Immortalisation. Diese Aspekte haben eine
besondere Bedeutung bei der Reaktivität auf Noxen, wie beispielsweise reaktive
Sauerstoffspezies (ROS) (Stone et al. 2009) und müssen bei der Bewertung der
toxikologischen Daten berücksichtigt werden.
Die Sensitivität von Zellen in Zellkultur gegenüber Mikroorganismen und anderen
externen Stimuli kann durch Antibiotikazusätze im Kulturmedium verändert werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde daher auf den Einsatz von Antibiotika verzichtet,
60
was die Vergleichbarkeit mit Studien, bei denen Antibiotika verwendet wurden,
einschränkt. Die Effekte von Nanopartikeln können außerdem durch geringfügige
Unterschiede in der Handhabung der Zellkulturen beeinflusst werden (Veranth et al.
2008). In der vorliegenden Arbeit wurden die Kulturarbeiten stets nach einem
einheitlichen Protokoll von derselben Person durchgeführt, um interindividuelle
Variabilitäten möglichst zu vermeiden.
4.2 Partikelaufnahme
Die direkten Partikel-Zell-Interaktionen wurden in der vorliegenden Arbeit anhand
licht- und elektronenmikroskopischer Aufnahmen, Röntgenspektralanalyse und
Durchflusszytometrie beurteilt. Bereits in den lichtmikroskopischen Aufnahmen
zeigten sich bei allen Zelltypen Überlagerungen von Partikelagglomeraten mit den
Zellkörpern. Elektronenmikroskopisch wurde die Aufnahme der Partikel in das
Zytoplasma der A549-Zellen, der THP-1-Zellen und der monozytären Zellen der
PBMC nachgewiesen. Die Partikel lagen in Agglomeraten teils membrangebunden,
teils frei im Zytoplasma vor. Die primären Monozyten bildeten nach der Partikel-
exposition große zytoplasmatische Vesikel aus. Durch die Röntgenspektralanalyse
konnte die intrazelluläre Anwesenheit der Partikel zusätzlich bestätigt werden.
Die Durchflusszytometrie bot neben den mikroskopischen Methoden eine weitere
Möglichkeit zur Beurteilung der zellulären Partikelaufnahme. Die Granularität von
Zellen wird im Durchflusszytometer bestimmt durch die Streuung des Seitwärtslichtes
(SSC) an intrazellulären Organellen oder Partikeln. Wenn Partikel in Zellen aufge-
nommen werden, erhöhen sie daher deren Granularität. Die Quantifizierung des SSC
als Parameter der zellulären Partikelaufnahme wurde von Stringer et al. (1995) etabliert
und in weiteren Studien angewendet und ausgebaut (Palecanda und Kobzik 2000,
Haberzettl et al. 2007). In der vorliegenden Arbeit erhöhten alle Partikel die Granu-
larität der exponierten Zellen. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede zwischen
den Zelltypen und den Partikelarten. Die Exposition mit farblosen Latexpartikeln
verursachte keine Granularitätsänderung, ebenso wenig wie eine Vorstimulation der
PBMC mit Lipopolysaccharid (LPS).
Um Aussagen zum möglichen Aufnahmemechanismus der Partikel in die Zellen zu
treffen, wurde in der vorliegenden Arbeit der Pilzmetabolit Cytochalasin D verwendet.
61
Da dieser an Aktinfilamente bindet und deren Polymerisation inhibiert (Schliwa 1982),
ermöglicht er eine Unterscheidung zwischen aktinabhängigen und aktinunabhängigen
Partikel-Zell-Interaktionen.
4.2.1 Lungenepithelzelllinie
Dass A549-Zellen im Allgemeinen zur Aufnahme von Nanopartikeln fähig sind, wurde
bereits in verschiedenen Studien nachgewiesen (Stearns et al. 2001, Geiser et al.2005,
Wottrich et al. 2004). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der vorliegenden
Arbeit und der INOS-Studie (Bastian et al. 2009) wurden keine einzelnen, sondern
agglomerierte Partikel (Stearns et al. 2001, Singh et al. 2007, Wottrich et al. 2004) in
membrangebundenen Strukturen (Stearns et al. 2001, Kato et al. 2003, Wottrich et al.
2004) sowie in den Lysosomen der Zellen (Singh et al. 2007, Kim et al. 2006) detektiert.
In der vorliegenden Arbeit erhöhte sich nach Partikelexposition die Granularität der
A549-Zellen. Dies steht in Übereinstimmung mit den Experimenten von Stringer et al.
(1995) an epithelialen Zellen. Neben der Partikelaufnahme, die in der vorliegenden
Arbeit durch die elektronenmikroskopischen Aufnahmen nachgewiesen wurde, kann
diese Granularitätserhöhung seine Ursache auch in einer Anlagerung von Partikeln an
die Zellmembran haben. Mikroskopisch wurde eine solche Anlagerung an A549-Zellen
in mehreren Studien nachgewiesen (Stearns et al. 2001, Jordan et al. 2009). Für eine
Anlagerung von Partikeln in der vorliegenden Arbeit spricht, dass die Anwendung des
Cytochalasin D kaum einen hemmenden Effekt auf die Granularitätsänderungen
ausübte (Stringer et al. 1995).
Zum Aufnahmemechanismus der Partikel in die Lungenepithelzellen konnten im
Rahmen der vorliegenden Arbeit und des INOS-Projektes nur bedingt Aussagen
getroffen werden. Die Ko-Lokalisation der Wolframcarbidpartikel mit Lysosomen der
A549-Zellen (Busch et al., in Vorbereitung) sowie ihr Vorkommen membrangebunden
im Zellplasma (Bastian et al. 2009) können als Hinweise auf einen endozytotischen
Aufnahmevorgang gedeutet werden. Dieser wird im Zusammenhang von Partikeln
und A549-Zellen von mehreren Autoren vorgeschlagen (Kim et al. 2006, Huang et al.
2002, Stearns et al. 2001). Dafür spricht, dass die endozytotische Aufnahme von
Partikeln in Lysosomen nur bei anionischen Partikeln auftritt (Harush-Frenkel et al.
2008), zu denen auch die untersuchten Wolframcarbide gehören. Dagegen spricht
allerdings, dass das Cytochalasin D nur einen sehr geringen hemmenden Effekt auf die
62
Granularitätsänderungen der A549-Zellen hatte und die Endozytose aktin-abhängig
verläuft (Kaksonen et al. 2006) Dies wiederum deutet auf ein mögliches passives
Einsinken der Partikel in die A549-Zellen hin (Geiser et al.2005).
4.2.2 Aufnahmeverhalten der THP-1-Zellen und der primären Monozyten aus dem peripheren Blut
Die THP-1-Zellen gehören, genauso wie die primären Monozyten, zur Gruppe der
professionellen Phagozyten (Rabinovitch 1995). Dass beide Zelltypen, wie in der vor-
liegenden Arbeit gezeigt, nanoskalige Partikel aufnehmen können, steht daher in Über-
einstimmung mit zahlreichen Studien (z. B. Wottrich et al. 2004, Thiele et al. 2001, Kato
et al. 2003, Lison und Lauwerys 1990). Die Exposition der Zellen mit farblosen Latex-
partikeln hingegen führte nicht zu Granularitätsänderungen, obwohl bekannt ist, dass
Leukozyten aus dem peripheren Blut Latexpartikel phagozytieren können (Kawaguchi
et al. 1986). Dies spricht dafür, dass die in der vorliegenden Arbeit beobachteten
Granularitätsänderungen auch durch optische Eigenschaften der Partikel, wie
beispielsweise deren Farbe, beeinflusst sein könnten (Johnsen und Widder 1999).
Auffällig war in der vorliegenden Arbeit, dass die Granularitätsänderungen der THP-
1-Zellen wesentlich geringer ausfielen als die der primären Monozyten. Zum Einen
muss hierfür die unterschiedliche Herkunft der Zellen in Betracht gezogen werden.
Das Verhalten einer Tumorzelllinie kann von dem primärer Zellen in vieler Hinsicht
abweichen (Stone et al. 2009). Auf der anderen Seite kann allein die Präparation der
primären Monozyten und ihre Kultivierung unter nicht-physiologischen Umständen
apoptotische Vorgänge auslösen (Hodge et al. 2000), die sich in einem erhöhten SSC
widerspiegeln können (Vermes et al. 2000). Auch die Aufnahme apoptotischer Zellen
durch vitale Phagozyten kann mit einer Erhöhung der zellulären Granularität einher-
gehen (Savill 1998). Also können die starken Granularitätserhöhungen sowohl auf die
Partikelaufnahme als auch auf apoptotische und phagozytotische Vorgänge zurück-
zuführen sein. Dafür spricht die in der vorliegenden Arbeit elektronenmikroskopisch
nachgewiesene Ausbildung von Vesikeln in den primären Monozyten nach Partikel-
exposition. Solche Vesikel werden auch in Monozyten nach der Phagozytose
apoptotischer Zellen beobachtet (Savill 1998).
Die unterschiedlich ausgeprägte Wirkung von Cytochalasin D auf die Granularitäts-
veränderungen der beiden Zellarten lässt vermuten, dass es bei den THP-1-Zellen
63
neben der Aufnahme auch zu einer Anlagerung von Partikeln an die extrazelluläre
Membran gekommen sein kann. Dafür spricht, dass das Cytochalasin D hier nur einen
schwachen Einfluss auf die Granularitätsänderungen hatte. Eine solche Anlagerung
wurde in verschiedenen Studien beschrieben (z.B. Stringer et al. 1995, Pulskamp et al.
2007). Bei den PBMC hingegen verringerte die Anwendung von Cytochalasin D die
Granularitätsveränderungen stark, was einen Hinweis auf eine aktin-abhängige
Aufnahme von Partikeln in die primären Monozyten darstellt (Stringer et al. 1995).
4.2.3 Einfluss spezieller Partikeleigenschaften auf die zelluläre Aufnahme.
Die WC 10-Partikel bewirkten in der vorliegenden Arbeit unabhängig vom Zelltyp
deutlich schwächere Granularitätserhöhungen als die größeren Partikel WC 100 und
WC-Co. Entweder bedingten die WC10-Partikel allein durch ihre geringere Primär-
partikelgröße eine geringere Streuung des Laserlichtes oder sie wurden weniger gut
von den Zellen aufgenommen. Zum genauen Einfluss der Partikelgröße auf die
Aufnahme in A549-Zellen finden sich in der Literatur widersprüchliche Aussagen.
Während im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit bei Foster et al. (2001) kleinere
Partikel verstärkt einer zellulären Aufnahme unterlagen, konstatierten Singh et al.
(2007), dass die Primärpartikelgröße keinen Einfluss habe. An Monozyten und Makro-
phagen wurde im Einklang mit der vorliegenden Arbeit in verschiedenen Studien
beobachtet, dass kleinere Partikel weniger gut phagozytiert wurden (z.B. Oberdörster
2001).
Einschränkend muss in diesem Zusammenhang jedoch beachtet werden, dass laut
Stringer et al. (1995) anhand des SSC ein direkter Vergleich zwischen zwei unter-
schiedlichen Partikelarten nicht möglich ist, da weitere Partikeleigenschaften die
Aufnahme der Partikel zusätzlich beeinflussen können. So bewirkte in verschiedenen
Studien eine erhöhte Konzentration an Kohlenstoffpartikeln eine Inhibition der Phago-
zytose durch Makrophagen (Lundborg et al. 2001). Wie bereits erläutert wurde, ist der
Kohlenstoffanteil der WC 10-Partikel wesentlich höher als bei den anderen Partikel-
arten (Meissner et al. 2010). Die Ursache der beobachteten partikelspezifischen Effekte
könnte also neben der unterschiedlichen Primärpartikelgröße auch durch den erhöhten
CB-Gehalt der WC 10-Partikel bedingt sein.
64
4.3 Partikeleffekte auf die Vitalität
Der MTT-Test wird in der Nanotoxikologie häufig zur Erfassung vitalitätsmindernder
Partikeleffekte verwendet (Stone et al. 1998, Lanone et al. 2009). Beim Vergleich
verschiedener Studien gilt es jedoch zu beachten, dass das ursprünglich von Mosmann
(1983) erstellte Protokoll zur Durchführung des MTT häufig variiert und angepasst
wurde, was die Vergleichbarkeit verschiedener Studien einschränkt. Bei der
Beurteilung der Ergebnisse des MTT-Tests mussten in der vorliegenden Arbeit
folgende Aspekte berücksichtigt werden:
Zum Ersten wird im MTT die Aktivität zellulärer Dehydrogenasen anhand einer Farb-
reaktion dargestellt, die sowohl mit der metabolischen Aktivität der Zellen als auch mit
der Zellzahl korreliert. Da die Zellzahl in der vorliegenden Arbeit präparationsbedingt
schwanken konnte, wurden die Experimente in Triplikaten durchgeführt, um diesen
systematischen Fehler zu verringern. Zweitens können viele Nanopartikel im MTT
eine Veränderung der Absorption verursachen, indem sie mit den Testsubstanzen oder
dem Zellmedium interagieren (Stone et al. 2009). Für die in der vorliegenden Arbeit
verwendeten Partikel konnte dieser Effekt ausgeschlossen werden. Es ist allerdings
bekannt, dass Partikel mit einer großen reaktiven Oberfläche das Formazan, welches
durch die Wirkung der Dehydrogenasen entsteht, adsorbieren und damit zu einer
Unterschätzung der Vitalität führen können. Dies wurde für kohlenstoffhaltige Nano-
partikel nachgewiesen (Wörle-Knirsch et al. 2006, Monteiro-Riviere et al. 2009). Es
könnte also in Bezug auf die Effekte des WC 10 eine Rolle spielen und konnte in der
vorliegenden Arbeit nicht ausgeschlossen werden. Drittens ist der MTT-Test ein redox-
sensitives System. Nanopartikel können sowohl unmittelbar im Zellmedium als auch
durch die Wechselwirkung mit Lungenzellen oder Makrophagen ROS erzeugen (Nel et
al. 2006). Die dadurch veränderte oxidative Umgebung kann im MTT zu einer
Überschätzung der Vitalität führen (Stone et al. 2009).
4.3.1 Toxische Effekte der Partikel auf A549-Zellen
Bei den Lungenepithelien verringerten alle Partikelsuspensionen die Vitalität leicht.
Bei der vergleichenden Betrachtung der vitalitätsmindernden Effekte der WC 100- und
WC 10-Partikel fiel auf, dass das verwendete Konzentrationsmaß (Massen- oder
Oberflächenkonzentration) beeinflusste, welche Partikelart als toxischer angesehen
65
wurde. Dies deutet daraufhin, dass die Oberfläche eine wichtige Rolle bei der
Vermittlung der toxischen Effekte der WC-Partikel spielte (Duffin et al. 2007). Nach
72stündiger Inkubation wirkten die WC 10-Partikel jedoch unabhängig vom Konzen-
trationsmaß toxischer als die WC 100-Partikel. Die Ursache hierfür liegt möglicher-
weise im erhöhten CB-Anteil der WC 10-Partikel, denn Kohlenstoffpartikel können
einen späten, aber prolongierten inhibitorischen Effekt auf die metabolische Aktivität
von A549-Zellen ausüben (Stone et al. 1998).
Unabhängig vom Testsystem und vom Konzentrationsmaß zeigten die WC-Co-Partikel
die stärksten vitalitätsmindernden Effekte auf die A549-Zellen. Diese toxische Wirkung
war nach 72 Stunden Inkubationszeit im Vergleich zur 24stündigen Inkubation
verringert. Das könnte dadurch bedingt sein, dass nanoskaliges WC-Co neben den
akut toxischen Effekten auch proliferative Wirkungen besitzt (Ding et al. 2009). Im
Gegensatz zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit konnten Bastian et al. (2009) im
Rahmen der INOS-Studie mit denselben Partikelsuspensionen an A549-Zellen weder
für WC 100 noch für WC-Co eine signifikant toxische Wirkung zeigen. Diese Dis-
krepanz kann seine Ursache zum Einen in unterschiedlichen Testsystemen und zum
Anderen in unterschiedlichen Kulturbedingungen der Zellen haben (Veranth et al.
2008).
4.3.2 Toxizität der Partikel gegenüber den THP-1-Zellen
In der vorliegenden Arbeit erschienen die THP-1-Zellen im Vergleich zu den Alveolar-
epithelzellen stärker anfällig gegenüber den Nanopartikeln. Diese Beobachtung findet
sich in mehreren Studien bestätigt (Lanone et al. 2009, Roesems et al. 1997, Wottrich et
al. 2004). Eine mögliche Erklärung hierfür liegt in der unterschiedlichen Proliferations-
fähigkeit der Zellarten. Die THP-1 wurden durch die PMA-induzierte Differenzierung
in ihrer Proliferationsfähigkeit gehemmt (Traore et al. 2005), was die Empfindlichkeit
gegenüber pathogenen Noxen erhöhen kann. Die Differenzierung der THP-1-Zellen
durch PMA wird über ROS vermittelt, die in diesem Zusammenhang zu einer
Verringerung des Zellmetabolismus führen (Traore et al. 2005). Wenn nun durch die
Exposition mit Partikeln zusätzlich ROS entstehen (Nel et al. 2006) wird die
inhibierende PMA-Wirkung gesteigert und kann sich in den Vitalitätswerten der
vorliegenden Arbeit widerspiegeln. Dafür spricht, dass WC-Co den stärksten Effekt
zeigt und von diesen Partikeln bekannt ist, dass sie mehr ROS generieren als WC-
66
Partikel (Lison et al. 1995). Soto et al. (2007) stellten im Gegensatz dazu die relative
Sensitivität zwischen Epithelzellen und Makrophagen genau andersherum dar. In
dieser Studie wurden die THP-1 allerdings nicht differenziert, was die Vergleichbarkeit
der Ergebnisse zur vorliegenden Studie einschränkt und wie oben erläutert, die
Partikeleffekte beeinflussen kann.
4.3.3 Partikelspezifische toxische Effekte auf die PBMC
Im MTT erschienen die PBMC von allen untersuchten Zelltypen am wenigsten anfällig
für zytotoxische Partikeleffekte. Hier bewirkten allein die WC 10-Partikel eine konzen-
trationsabhängige Vitalitätsminderung. Cobaltchlorid zeigte ähnlich starke toxische
Effekte wie WC-Co. Die Stimulation der PBMC mit LPS hatte im MTT-Test keinen
Einfluss auf die Vitalität. Diese toxikologischen Ergebnisse müssen im Zusammenhang
mit den weiter oben besprochenen Einschränkungen des MTT-Tests betrachtet werden.
Vor allem seine Redoxsensitivität kann die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit beein-
flusst haben, da die primären Monozyten nach Partikelaufnahme in hohem Ausmaß
ROS produzieren (Vanhee et al. 1995). Die toxische Wirkung der WC 10-Partikel kann
zum Einen durch Ergebnisse erklärt werden, laut denen Partikel mit einer geringeren
Primärpartikelgröße eine stärkere oxidative Belastung der exponierten Zellen auslösen
können (Monteiller 2007). Zum Anderen kann jedoch auch der erhöhte Anteil an CB zu
einer Unterschätzung der Vitalität im MTT-Test geführt haben (Monteiro-Riviere et al.
2009).
Die Ergebnisse des MTT-Tests der vorliegenden Arbeit stehen im Widerspruch zu
vorliegenden Arbeiten, in denen WC-Co-Partikel toxischer auf Monozyten wirkten als
WC-Partikel (Lombaert et al. 2004, 2008). Auch Erkenntnisse von Ashwood et al.
(2007), die Konjugaten aus LPS und Partikeln eine sehr starke apoptogene Wirkung
zuschreiben, konnten durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt
werden. Um näher auf diese Widersprüche einzugehen, hätte es des Einsatzes eines
weiteren Testsystems zur Einschätzung von nanopartiklären Effekten in den in vitro
Systemen bedurft (Stone et al. 2009). Dies war im Rahmen der vorliegenden Arbeit
leider nicht möglich.
67
4.4 Einfluss der Wolframcarbidpartikel auf die Produktion von immun-modulatorischen Stoffen
Laut Driscoll et al. (1997) basiert der Mechanismus der partikelinduzierten pulmonalen
Inflammation auf Zell-Zell- und Zell-Zytokin-Interaktionen. In der vorliegenden Arbeit
wurden daher die Konzentrationen von Zytokinen und Chemokinen ermittelt, die für
die Interaktionen der untersuchten Zelltypen bedeutsam sind. Der Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay (ELISA) ist eine etablierte, sensitive Methode zur Quantifizierung
von Proteinkonzentrationen. Bei der Interpretation der ELISA-Ergebnisse muss im
Rahmen von Untersuchungen an Nanopartikeln jedoch beachtet werden, dass die
Zytokine und Chemokine sich an die Oberfläche der Partikel binden können (Lynch et
al. 2007). Die Anlagerung von Serumproteinen wurde für die in der vorliegenden
Arbeit verwandten Partikel nachgewiesen (Meißner et al. 2010). Dies ließ vermuten,
dass es auch zu einer Interaktion mit den Zytokinen kommen könnte. In Vorversuchen
konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass im zellfreien Medium die
Zytokinkonzentration in Anwesenheit von Partikeln unterschätzt wurde, was die
Beobachtungen anderer Autoren bestätigt (Kocbach et al. 2008). Da die Zytokinkonzen-
trationen jedoch durchgängig unterschätzt wurden, unabhängig von den Partikelarten
und –konzentrationen, wurde diese Methode trotz der Interaktion angewendet und die
Partikeleinflüsse bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt.
Eine weitere wichtige Fragestellung bei der Einschätzung immunologischer Effekte
von Nanopartikeln ist die Möglichkeit einer Verunreinigung der Partikel mit Bakterien
oder bakteriellen Zellbestandteilen, wie dem LPS (Gorbet und Sefton 2005). Dies ist
von Bedeutung, da sowohl A549-Zellen als auch Makrophagen auf Endotoxine mit der
Bildung immunmodulatorischer Stoffe auf LPS reagieren (Stone et al. 2009). In der
vorliegenden Arbeit wurden die Partikel vor ihrer Verwendung autoklaviert, um
Mikroorganismen abzutöten (Schulze et al. 2008). Das LPS ist jedoch nicht hitzesensitiv
und konnte daher durch die Autoklavierung nicht unschädlich gemacht werden. Zur
Testung von Partikelsuspensionen auf eine Endotoxinkontamination existieren
verschiedene Testsysteme, wie beispielsweise der weit verbreitete Limulus Amebocyte
Lysate Test. Allerdings sind auch hier Partikel-Interaktionen mit dem Testsystem
bekannt (Schulze et al. 2008) und es steht generell in Frage, ob dieser Test partikel-
gebundenes Endotoxin nachweisen kann oder nur solches in Lösung (Jones und
68
Grainger 2009). In der vorliegenden Arbeit wurde daher auf die direkte Testung auf
Endotoxin verzichtet. Dafür wurde, beispielsweise durch den Einsatz eines CD14-
Antikörpers, versucht, partikelinduzierte Effekte von LPS-induzierten Wirkungen zu
differenzieren
4.4.1 Partikeleinfluss auf die Zytokinproduktion von A549-Zellen
An den A549-Zellen bewirkten die Wolframcarbidpartikel leichte, partikelspezifische
Effekte auf die Produktion des MCP-1. Die WC 10 Partikel wirkten hierbei stärker
stimulatorisch als die WC 100-Partikel, während die WC-Co-Partikel die Sekretion von
MCP-1 verminderten. Das MCP-1 spielt im Zusammenspiel zwischen Epithelzellen
und Immunzellen eine wichtige Rolle, da es Monozyten an den Ort der Pathogen-
wirkung rekrutiert (Driscoll et al. 1997). Die Reaktion der A549-Zellen könnte also im
physiologischen Rahmen eine Entzündungsreaktion initiieren. Dass Alveolarepithel-
zellen auf die Exposition mit Nanopartikeln oder Fasern mit der Produktion von
Chemokinen reagieren, wurde bereits häufig nachgewiesen (z.B. Wottrich et al. 2004,
Monteiller et al. 2007).
In der vorliegenden Arbeit bewirkten die WC 10-Partikel eine stärkere Induktion der
Zytokinproduktion als die WC 100-Partikel. Von niedrig-toxischen, schlecht-löslichen
Nanopartikeln, zu denen auch die WC-Partikel gezählt werden können, wird
vermutet, dass sie in der Lunge allein über ihre große Oberfläche inflammatorische
Reaktionen auslösen können (Stöger 2006). Da bei Partikeln mit abnehmendem
Durchmesser die Oberfläche stark zunimmt, würde diese Hypothese die Ergebnisse
der vorliegenden Arbeit unterstützen. Ebenso wurde in weiteren Studien aufgezeigt,
dass kleinere Partikel an Epithelzellen stärkere inflammatorische Reaktionen auslösten
(Oberdörster 2000, Monteiller 2007, Ding et al. 2009). Zusätzlich muss jedoch in der
vorliegenden Arbeit in Betracht gezogen werden, dass der erhöhte Anteil an Carbon
Black in den WC 10 Partikeln einen Einfluss auf die Induktion der MCP-1-Produktion
ausgeübt haben könnte, wie es in verschiedenen Studien beschrieben wurde (Stone et
al. 1998).
Der inhibierende Effekt der WC-Co-Partikel allerdings steht im Widerspruch zu in
vivo-Studien, in denen WC-Co-Partikel eine wesentlich stärkere pulmonale Entzün-
dung auslösten als WC-Partikel (Lison et al. 1995). In der vorliegenden Arbeit müssen
die Ergebnisse in Bezug zu den Toxizitätsdaten interpretiert werden. Im MTT-Test
69
zeigte WC-Co die stärksten vitalitätsmindernden Effekte. Allerdings besitzen die A549-
Zellen regenerative Fähigkeiten. Die Vitalität der Zellen zeigte sich nach 72 Stunden
schwächer beeinträchtigt, und nach dieser Zeit unterscheidet sich die MCP-1-
Produktion der partikelexponierten Zellen nicht mehr von der der Kontrollen. Es kann
also vermutet werden, dass die akuten Effekte der WC-Co-Partikel durch die Zell-
toxizität des Cobalt bestimmt wurden, während der Partikeleinfluss des WC nach
längerer Inkubationszeit möglicherweise auch die MCP-1-Produktion induziert hätte.
Für die im Allgemeinen schwachen immunmodulatorischen Reaktionen der Epithel-
zellen gibt es mehrere mögliche Erklärungen. Zum Einen muss die bereits erwähnte
Partikel-Zytokin-Wechselwirkung in Betracht gezogen werden. Dies spielt bei den
Alveolarepithelzellen umso mehr eine Rolle, als aufgrund der geringen Partikelauf-
nahme noch viele Partikel im Zellmedium oder an der Membran der Zellen vorliegen
können und so mit den Zytokinen in Kontakt kommen. Zum Anderen wurden die in
der vorliegenden Arbeit verwendeten Partikel durch Zugabe von Serum zum Kultur-
medium stabilisiert. Das Serum erhöhte die Ruhezytokinproduktion der A549-Zellen
stark, was geringfügige Immunreaktionen auf die Partikel verdeckt haben könnte.
Allerdings waren die Zellen trotz des Serums noch fähig zur Steigerung der Zytokin-
produktion durch die Positivkontrolle TNF-α.
4.4.2 Partikelspezifische Immunreaktionen der THP-1-Zellen
Die WC 10-Partikel zeigten, im Gegensatz zu den A549-Zellen, an den THP-1 keinen
Effekt auf die Produktion der untersuchten Zytokine. Die WC 100-Partikel stimulierten
die TNF-α-Produktion, während WC-Co-Partikel sowohl die Konzentration des TNF-α
als auch die des MCP-1 verminderten.
Der in der vorliegenden Arbeit beobachtete stimulatorische Effekt der WC 100-Partikel
auf die Sekretion von TNF-α bestätigt Ergebnisse einer Studie an Makrophagen, die
u.a. mit nanoskaligen Kohlenstoffpartikeln exponiert wurden (Van Eeden et al. 2001).
TNF-α ist ein proinflammatorisches Zytokin, das vorrangig von monozytären Zellen
gebildet wird. Es besitzt eine wichtige Funktion bei der Vermittlung von Partikel-
effekten in der Lunge, indem es epitheliale Zellen, endotheliale Zellen und weitere
Monozyten zur Freisetzung von Chemokinen stimuliert (Driscoll et al. 1997). Die
erhöhte Freisetzung nach Partikelkontakt spricht also dafür, dass die WC 100-Partikel
in physiologischer Umgebung eine akute inflammatorische Reaktion auslösen könnten.
70
Die WC-Co-Partikel hingegen verringerten in THP-1-Zellen, ähnlich wie bei den
Lungenepithelzellen, die Konzentrationen der untersuchten Zytokine. Wie bei den
A549-Zellen kann zur Erklärung die toxische Wirkung der Partikel in Erwägung
gezogen werden. Allerdings wurden in der vorliegenden Arbeit keine Messungen nach
72 Stunden vorgenommen. Somit konnte der Effekt der längeren Inkubationszeit nicht
beurteilt werden. In physiologischer Umgebung werden apoptotische Zellen von
vitalen Makrophagen aufgenommen, um sekundär nekrotische Reaktionen zu
verhindern (Fadok et al. 1998). Dieser Mechanismus wird beispielsweise durch die
Sekretion von MCP-1 durch Monozyten gesteuert (Martin und Frevert 2005). Von
diesem Chemokin ist außerdem bekannt, dass THP-1-Zellen es in Reaktion auf die
Phagozytose von Bakterien oder Partikeln verstärkt sezernieren (Friedland et al. 1993).
In der vorliegenden Arbeit konnte eine Stimulation der MCP-1-Produktion bei keiner
Partikelart nachgewiesen werden. Dies könnte sowohl der Zytokin-Partikel-Bindung
geschuldet sein, als auch den vitalitätsmindernden Effekten der Partikel. Sie könnte
allerdings ebenfalls ein Hinweis darauf sein, dass die Partikel in den Experimenten
nicht mit größeren Mengen Endotoxin kontaminiert waren, da die THP-1-Zellen auf
eine LPS-Stimulation stark mit der Bildung von MCP-1 reagieren (Matsushima et al.
1989). Um differenziertere Aussagen zu den Partikeleffekten auf den THP-1-Zellen zu
machen müssten jedoch zusätzliche Versuche durchgeführt werden, da die aus-
gewertete Probenzahl nur gering war.
4.4.3 Partikelinduzierte Stimulation der Zytokin- und Chemokinproduktion an PBMC
Im Gegensatz zur THP-1-Zelllinie reagierten die primären Monozyten auf die Partikel-
exposition im Allgemeinen sehr stark mit der Produktion von IL-6, MCP-1 und TNF-α.
Unabhängig von der Partikelart wurde die Zytokinsekretion in Abhängigkeit von der
Partikelkonzentration stimuliert. Die WC 100- und WC-Co-Partikel zeigten einen
deutlicheren Effekt als die WC-10-Partikel. Die Interferon-γ-Produktion wurde
hingegen durch keine der Partikelsuspensionen beeinflusst, was gegen eine
Beteiligung der Lymphozyten an der Immunreaktion spricht. Auffallend war bei den
primären Zellen die große interindividuelle Schwankungsbreite der immun-
modulatorischen Partikeleffekte, die nicht nur das Ausmaß der Reaktion betraf,
sondern auch die Grundniveaus der Zytokinproduktion und die Partikelspezifität der
71
Effekte. Diese interindividuellen Unterschiede sind ein bekannter Aspekt in der
Verwendung von Primärzellen in in vitro-Untersuchungen und wurden u.a. auch in
einer anderen Studie an Wolframcarbidpartikeln beobachtet (De Boeck et al. 2003).
Dass die monozytären Zellen des peripheren Blutes, wie in der vorliegenden Arbeit,
als Reaktion auf Wolframcarbidpartikel vermehrt Zytokine und Chemokine produ-
zieren, bestätigt die Ergebnisse anderer Studien an PBMC (z.B. Shin et al. 2007, Monn
und Becker 1999). Untersuchungen zum Mechanismus der Immunreaktion nach
Partikelexposition durch Lombaert et al. (2008) deuten darauf hin, dass durch
mikroskalige WC-Co-Partikel Gene beeinflusst werden, die in der der Immun- und
Stressantwort eine wichtige Rolle spielen. Da eines der herrunterregulierten Gene,
TNFAIP6, eine Rolle in anti-inflammatorischen Prozessen spielt und entzündliche
Reaktionen begrenzen soll (Park et al. 2006), wurden die Partikeleffekte als Hinweis
auf die Induktion einer starken Inflammation durch WC-Co interpretiert (Lombaert et
al. 2008).
Diese Vermutung wird durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigt. IL-6
und TNF-α sind potente proinflammatorische Mediatoren mit Auswirkungen auf den
gesamten Organismus. Ihre Ausschüttung könnte erklären, warum inhalierte Partikel
sowohl lokale pulmonale, als auch systemische Effekte bewirken (Nemmar et al. 2004).
Das Chemokin MCP-1 wurde ebenfalls von den partikelexponierten Monozyten im
hohen Maß sezerniert. Es wird im physiologischen Rahmen sowohl nach Partikel-
exposition von Epithelzellen der Lunge gebildet, als auch von Alveolarmakrophagen
als Reaktion auf phagozytierte Pathogene (Friedland et al. 1993). Seine Funktion
besteht vorrangig darin, Monozyten an den Ort der Pathogenwirkung zu locken. Dabei
bewirkt das MCP-1 allein zwar keine inflammatorischen Reaktion der Leukozyten, die
angelockten Zellen exprimieren jedoch verstärkt CD14-Rezeptoren und sezernieren
TNF-α. Daher sind sie zum Einen anfällig für starke Reaktionen gegenüber anderen
inflammatorischen Stimuli (Maus et al. 2001, Gunn et al. 1997). zum Anderen führt
TNF-α auf parakrinen Wegen zur weiteren Bildung von MCP-1 durch Monozyten
(Driscoll et al. 1997).
In Bezug auf das MCP-1 existieren wichtige Unterschiede zwischen primären
Monozyten und den THP-1-Makrophagen Die Differenzierung der THP-1-Zellen führt
zu einer verminderten Expression von MCP-1 (Gruss et al. 1994) bzw. zu einer
Herunterregulation der Rezeptoren für das MCP-1 (Tangirala et al. 1997), wodurch
72
diese Zellen schwächer als primäre Monozyten auf MCP-1 reagieren können (Vaddi et
al. 1994). Diese komplexen Wechselwirkungen zwischen den Zytokinen und Chemo-
kinen könnten also die vergleichsweise starke Reaktion der primären Zellen gegenüber
den THP-1-Makrophagen verursacht haben.
4.5 Mechanismen der Partikelwirkung
4.5.1 Einfluss der Partikelgröße und -zusammensetzung
In der vorliegenden Arbeit wurden biologische Effekte von Partikeln miteinander
verglichen, die sich sowohl in der Größe ihrer Primärpartikel (WC 10 vs. WC 100) als
auch in ihrer Zusammensetzung (WC 100 vs. WC-Co) unterschieden. Dabei war es
durch das in den WC 10-Partikeln vorhandene CB nur bedingt möglich, den Einfluss
der Partikelgröße auf die Partikelwirkungen zu beurteilen.
Auffällig war in der vorliegenden Arbeit, dass von allen untersuchten biologischen
Parametern die Granularitätsänderungen am deutlichsten unabhängig von der
untersuchten Zellart durch die Partikelgröße beeinflusst schienen. Im INOS-Projekt
bestätigte sich dieser Zusammenhang auch an weiteren Zelltypen (Busch et al.in
Vorbereitung). Im Hinblick auf die immunologischen Reaktionen der PBMC ähnelten
sich die WC 100 und WC-Co-Effekte ebenfalls deutlich im Vergleich zu den geringeren
Effekten der WC 10-Partikel. Dieser Zusammenhang könnte darauf schließen lassen,
dass bei den primären Monozyten die zelluläre Partikelaufnahme mit der immuno-
logischen Reaktion darauf korreliert. Dafür spricht, dass die Phagozytose von Partikeln
die ROS-Bildung durch Monozyten/Makrophagen induzieren kann und die
Produktion der untersuchten Zytokine auf redoxsensitiven Signalwegen beruht. Die in
der vorliegenden Arbeit erhobenen Beobachtungen zur Abhängigkeit der
Inflammation von der Partikelgröße werden in vielen Studien unterstützt, wobei
jedoch beim Vergleich von mikro- mit nanoskaligen Partikeln im Allgemeinen bei den
kleineren Partikeln die stärkeren inflammatorischen Reaktionen beobachtet werden
(Madl und Pinkerton 2009).
Die Wolframcarbidpartikel wurden in der vorliegenden Arbeit vor dem Hintergrund
ihrer arbeitsmedizinischen Bedeutung untersucht. Daher lag ein Hauptaugenmerk auf
den Partikeleffekten der WC-Co- im Vergleich mit den WC 100-Partikeln. In einigen
Studien wurden die Wechselwirkungen zwischen den Wolframcarbidpartikeln und
73
dem Cobaltanteil untersucht und verschiedene mögliche Mechanismen beschrieben
(z.B. Lison et al. 1995, Bastian et al. 2009). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit
bestätigten bei allen Zelltypen Erkenntnisse zur erhöhten Toxizität von WC-Co im
Vergleich zu WC-Partikeln (Lison und Lauwerys 1990, Roesems et al. 1997). Bei der
Untersuchung der Aufnahme der Partikel unterschieden sich WC 100- Partikel nicht
von den WC-Co-Partikeln. Die inflammatorische Reaktion der primären Monozyten
auf WC 100 fiel sogar stärker aus als die auf die WC-Co-Partikel. Allerdings muss bei
diesem Vergleich der toxische Einfluss der WC-Co-Partikel mit in Betracht gezogen
werden. Ein Hinweis darauf, dass beide Bestandteile des WC-Co für die inflamma-
torische Reaktion nötig sind, zeigte sich in der geringen Immunreaktion der primären
Monozyten auf die Exposition mit Cobaltchlorid, was die Ergebnisse anderer Studien
zu WC-Co-Partikeln bestätigt (Lasfargues et al. 1992). Dass die primären Monozyten
allerdings nicht per se auf eine Exposition mit partikulären Stimuli mit der erhöhten
Sekretion von Immunstoffen reagierten, zeigte sich in der fehlenden Reaktion auf
Latexpartikel in äquivalenten Partikelkonzentrationen.
4.5.2 Reaktive Sauerstoffspezies und N-Acetylcystein
Eine der vorherrschenden Theorien zur Wirkung von Nanopartikeln in zellulären
Systemen beschäftigt sich mit der Rolle von reaktiven Sauerstoffspezies (Nel et al. 2006,
Li et al. 2008). Als Reaktion auf eine Belastung mit ROS reagieren biologische Systeme
im Sinne einer oxidativen Hierarchie (Xiao et al. 2003) zunächst mit antioxidativen
Abwehrmechanismen. Wird die Fähigkeit der exponierten Zellen zur antioxidativen
Abwehr überlastet, können inflammatorische Mediatoren gebildet werden (Nel et al.
2006). Schließlich kann oxidativer Stress zur Apoptose von Leukozyten (Splettstoesser
und Schuff-Werner 2002) und zu Gewebsschäden der Lunge führen (Nakashima et al.
1991).
In Bezug zu den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Partikeln ist bekannt, dass
Wechselwirkungen zwischen Cobalt und den Wolframcarbidpartikeln im Zellkultur-
medium direkt die Bildung von ROS induzieren können (Lison et al. 1995). Es ist aber
allein aufgrund der geringen Partikelgröße wahrscheinlich, dass auch WC 100- und
WC 10-Partikel die Bildung von ROS in zellfreier Umgebung induzieren können (Li et
al. 2008). Eine größere reaktive Oberfläche von Nanopartikeln wird in diesem
Zusammenhang häufig mit einer erhöhten Fähigkeit zur Erzeugung von ROS
74
assoziiert (Nel et al. 2006, Li et al. 2003). Diese Erkenntnisse ließen sich in der
vorliegenden Arbeit nicht bestätigen, da die WC 10-Partikel sowohl weniger toxisch als
auch weniger inflammatorisch wirksam waren als die größeren Partikel. Eventuell
kann dies im Zusammenhang mit einer geringeren zellulären Aufnahme der WC 10-
Partikel erklärt werden. Denn die Aufnahme von Partikeln führt zur Bildung von ROS
durch die phagozytierenden Zellen (Karnovsky und Sbarra 1960), wobei das Ausmaß
der Partikelaufnahme mit der ROS-Induktion korreliert (Nkamgueu et al. 2000). Die
geringere Aufnahme der WC 10-Partikel könnte also die weiteren biologischen Effekte
beeinflusst haben.
In der vorliegenden Arbeit sollten die Effekte der reaktiven Sauerstoffspezies indirekt
beurteilen werden. Dafür wurde N-Acetylcystein (NAC) eingesetzt und seine Wirkung
auf die Zytokinproduktion der Zellen untersucht. Dieser Radikalfänger kann ROS
direkt neutralisieren, dient aber auch als Vorläufer von Glutathion, das die Zelle zur
Regulation des Oxidantienhaushaltes benötigt (van Zandwijk 1995). In der
vorliegenden Arbeit hemmte die Anwendung von NAC die partikelinduzierte
Produktion beinahe aller untersuchten Zytokine an den unstimulierten Monozyten.
Dies bestätigt die Erkenntnisse von Ding et al. (2009) an epidermalen Zellen. In
weiterführenden Versuchen zeigte sich, dass das Ausmaß der Vorstimulation der
PBMC einen deutlichen Einfluss auf die NAC-Effekte hatte. Sowohl eine Exposition
der PBMC mit gramnegativen Bakterien als auch partikelgebundenes Endotoxin
könnte also die Wirkung des NAC beeinflusst haben. Zur weiteren Untersuchung des
Einflusses von ROS auf Effekte von Nanopartikeln wäre es nützlich, Tests
durchzuführen, mit denen die ROS quantitativ bestimmt werden können.
4.5.3 LPS-Wirkungen und der CD14-Rezeptor
Das Lipopolysaccharid (LPS) aus der Zellwand gramnegativer Bakterien ist ein
bekannter Auslöser inflammatorischer Reaktionen. Es wirkt an Monozyten und
Makrophagen vorrangig über die Bindung an den Oberflächenrezeptor CD14. Nach
dieser Bindung werden in den Zellen Prozesse in Gang gesetzt, die sowohl zur Akti-
vierung inflammatorischer als auch apoptotischer Signalwege führen können
(Heidenreich et al. 1997). Das LPS wirkt an Monozyten dabei über die Erzeugung von
Superoxid, einer reaktiven Sauerstoffspezies (Landmann et al. 1995). In der vor-
liegenden Arbeit wurde es als Positivkontrolle für die Zytokinproduktion der
75
primären Monozyten und der THP-1-Zellen verwendet. Beide Zellarten reagierten auf
die Stimulation mit 100 pg/ml LPS erwartungsgemäß mit deutlich erhöhten Grund-
spiegeln der untersuchten Zytokine. Wurden die vorstimulierten PBMC allerdings
zusätzlich mit Partikeln exponiert, zeigten sich bei den WC 100- und den WC 10-
Partikeln keine immunologischen Partikeleffekte. Die Vorstimulation schien also die
Aufnahme der Partikel, gemessen als Granularitätsänderung in der Durchfluss-
zytometrie, kaum beeinträchtigt zu haben, wohl aber die Reaktion darauf.
Dieser fehlende Partikeleffekt an vorstimulierten Zellen könnte dadurch bedingt sein,
dass die Zytokinproduktion der PBMC durch die Vorstimulation bereits vor der
Exposition mit den Partikeln erschöpft war. Um dies zu überprüfen, wurden die PBMC
steigenden LPS-Konzentrationen (1 pg/ml – 100 ng/ml) ausgesetzt. Die Ergebnisse
dieser Versuche zeigten, dass LPS-Konzentrationen höher als 100 pg/ml die Zytokin-
bildung weiter verstärken konnten. Bei der Beurteilung der Partikeleffekte an
vorstimulierten Zellen muss des Weiteren bedacht werden, dass das LPS u.a. über die
Erzeugung von ROS auf die Zellen wirkt. Zusammen mit den ROS, die die Partikel
selbst verursachen, könnte die oxidative Abwehr der Zellen überfordert gewesen sein
und die toxische Wirkung der Partikel die Bildung zusätzlicher Zytokine verhindert
haben. Dagegen spricht der Fakt, dass die WC-Co-Partikel auch an vorstimulierten
Zellen die Produktion von IL-6 und TNF-α steigerten. Die Ursachen der Partikeleffekte
an vorstimulierten Zellen konnten in der vorliegenden Arbeit nicht abschließend
geklärt werden. Die Unterschiede in der Wirkung der verschiedenen Partikel konnten
nicht auf einzelne Partikeleigenschaften zurückgeführt werden. Wahrscheinlich
spielten neben den komplexen Zell-Partikel-Interaktionen auch die Wirkung der
Cobaltionen und die Art der gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies eine wichtige
Rolle.
Das CD14-Ober-flächenmolekül wird spezifisch auf Monozyten und Makrophagen
exprimiert und besitzt, wie bereits in der Einleitung beschreiben, viele unterschiedliche
Funktionen bei der Vermittlung LPS-spezifischer Reaktionen, bei der Induktion
apoptotischer Prozesse und der Phagozytose apoptotischer Zellen. Wahrscheinlich ist
das CD14-Molekül überdies ein wichtiger Rezeptor zur Erkennung spezifischer Muster
im Rahmen der angeborenen Immunabwehr (Pugin et al. 1994). Zur Untersuchung der
Rolle des CD14-Rezeptors an den Partikeleffekten wurde in der vorliegenden Arbeit
ein monoklonaler Antikörper verwendet. Dieser bindet sich an die Aminosäuren des
76
CD14, die für die LPS-vermittelte Wirkung mitverantwortlich sind (Stelter et al. 1997)
und sollte LPS-induzierte Effekte somit unterdrücken.
In Vorversuchen ohne Partikel konnte eine LPS-induzierte Zytokinproduktion
gehemmt werden, wobei die LPS-Wirkung bei sehr hohen Konzentrationen nicht mehr
über den CD14-Rezeptor vermittelt wurde. An unstimulierten partikelexponierten
PBMC verminderte der eingesetzte anti-CD14-Antikörper die partikelinduzierte
Zytokinproduktion. Diese Hemmung trat bei allen untersuchten Partikeln und
Zytokinen auf, war aber bei weitem nicht vollständig. Auch nach der Antikörper-
Anwendung war noch ein konzentrationsabhängiger Partikeleffekt messbar. Eine
Mitbeteiligung von LPS an den gemessenen Partikeleffekten konnte also durch diese
Versuche nicht vollständig ausgeschlossen werden. Die inkomplette Hemmung der
Zytokinproduktion durch den anti-CD14-Antikörper spricht allerdings gegen einen
alleinigen LPS-induzierten Effekt. Aufgrund der vielfältigen Funktion des CD14-
Rezeptors im Rahmen von Inflammation, Apoptose und Phagozytose bedürfte es zu
einer umfassenden Beurteilung der Partikeleffekte weiterführender Untersuchungen.
4.6 Schlussfolgerungen und Ausblick
In der vorliegenden Arbeit wurden die Interaktionen zwischen verschiedenen
nanoskaligen Wolframcarbidpartikeln und humanen Zellen untersucht. Die
beobachteten Effekte stellten sich sowohl partikelspezifisch als auch zelltypspezifisch
dar. Neben der Erfassung der Partikeleffekte wurden auch Überlegungen zu verant-
wortlichen Partikeleigenschaften und Mechanismen der Partikel-Zell-Interaktionen
angestellt. Im Hinblick auf die Aufnahme der Partikel in die verschiedenen Zelltypen,
die Zytotoxizität und die inflammatorische Reaktion schienen unterschiedliche Primär-
partikelgrößen, die besonderen Oberflächeneigenschaften der WC 10-Partikel und die
Cobaltionen in den WC-Co-Partikeln eine wichtige Rolle zu spielen. Da Nanopartikel
mit verschiedenen Testsystemen interagieren können, wurden Vorversuche zur
Erfassung dieser Interaktionen durchgeführt. Eine wichtige Fragestellung bei der
Arbeit mit Nanopartikeln ist die Möglichkeit ihrer Kontamination mit Bakterien oder
bakteriellen Zellbestandteilen, wie dem LPS, da sie aufgrund der geringen Partikel-
durchmesser eine große Oberfläche aufweisen, an die sich vermehrt Proteine binden
können (Ashwood et al. 2007). Diese Möglichkeit konnte in der vorliegenden Arbeit
77
nicht ausgeschlossen werden, Untersuchungen mit einem monoklonalen anti-CD14-
Antikörper sprachen jedoch für partikelspezifisch induzierte biologische Effekte.
In weiterführenden Versuchen wäre es möglich, die untersuchten Zelltypen in
Kokulturen mit den Wolframcarbidsuspensionen zu exponieren, um eine bessere
Annäherung an die biologische Realität schaffen zu können. Des Weiteren wäre es
wünschenswert, die nach Partikelexposition gebildeten ROS direkt zu messen, um ihre
Rolle im Rahmen der Partikeleffekte besser beurteilen zu können. Zur Aufklärung von
partikelinduzierten Signalwegen könnten in weiteren Untersuchungen die beteiligten
Transkriptionsfaktoren und regulierte Gene untersucht werden, womit im Rahmen des
INOS-Projektes bereits begonnen wurde (Busch et al. 2010).
Das Ziel des INOS-Projektes war eine Untersuchung des toxikologischen Potentials
von Nanopartikeln, um Vorhersagen zu schädigenden Wirkungen auf Mensch und
Umwelt treffen zu können. Die vorliegende Arbeit bestätigte an nanoskaligen Partikeln
viele bestehende Erkenntnisse zur toxischen und immunmodulatorischen Wirkung
mikroskaliger Hartmetallpartikel, deren Assoziation mit fibrotischen und allergischen
Atemwegserkrankungen als gesichert gilt (Nemery und Abraham 2007). Damit wird
die Vermutung bekräftigt, dass die Verwendung nanoskaliger Pulver bei der
Herstellung von Hartmetall und die damit mögliche Inhalation nanoskaliger Partikel
eine Ursache für inflammatorische pulmonale Erkrankungen sein könnte.
Erkenntnisse, die an in vitro-Zellkultursystemen gewonnen wurden, können nur
eingeschränkt auf physiologische Verhältnisse übertragen werden. Die Ergebnisse der
vorliegenden Arbeit lassen jedoch vermuten, dass es ungeachtet der Partikelgröße
wichtig ist, Vorkehrungen zu treffen, um Arbeiter der Hartmetallindustrie vor der
Inhalation von Wolframcarbidpartikeln zu schützen.
78
5 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. In vitro Untersuchungen zur toxikologischen und immunmodulatorischen Wirkung nanoskaliger Woframcarbidverbindungen eingereicht von Ulrike Trahorsch Geboren am 29.09.1981 in Belzig angefertigt am Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung (UFZ) Leipzig im Rahmen des vom BMBF geförderten INOS-Projektes in Kooperation mit dem Institut für Klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig betreut von Prof. Dr. U. Sack und Frau Dr. I. Lehmann eingereicht im Juli 2010
Die hier vorgestellte Arbeit wurde im Rahmen des Projektes „Identifizierung und
Bewertung von Gesundheits- und Umweltauswirkungen von technischen
nanoskaligen Partikeln (INOS)“ durchgeführt, das vom Bundesministerium für
Bildung und Forschung gefördert wurde. Untersucht wurden in der vorliegenden
Arbeit konkret die Effekte verschiedener nanoskaliger Wolframcarbidpartikel auf
humane Zellen. Wolframcarbide sind Mischkristalle aus Wolfram und Kohlenstoff,
denen zur Herstellung des sogenannten Hartmetalls noch Cobalt als Bindephase
zugegeben wird. Hartmetall zeichnet sich durch eine außergewöhnliche Korrosions-
beständigkeit und eine hohe Härte aus. Daher wird es vor allem in der Werkzeug-
fertigung verwendet, kommt aber auch in den Kugeln von Kugelschreibern und in
Bohrwerkzeugen vor. Die einzelnen Bestandteile des Hartmetalls werden als Pulver
verarbeitet, wobei gilt: je feiner das verarbeitete Pulver, umso härter ist das
Endprodukt. Eine Freisetzung der Pulverteilchen und damit eine mögliche Exposition
von Mensch und Umwelt ist prinzipiell in der gesamten Fertigungskette des
Hartmetalls möglich.
Seit Beginn der Hartmetallerzeugung Anfang des 20. Jahrhunderts wurden wiederholt
Fälle von Arbeitern in Hartmetallfabriken beschrieben, die an respiratorischen
Erkrankungen litten. Im Rahmen epidemiologischer Studien wurde ein Zusammen-
hang zwischen der Hartmetallexposition und einer fibrotischen Lungenerkrankung
79
konstatiert, die aus diesem Grund die Bezeichnung Hartmetall-Pneumopathie erhielt
(Hard Metal Lung Disease, HMLD). Es handelt sich hierbei um eine chronisch restriktive
Erkrankung, bei der im Lungengewebe der Betroffenen charakteristische ‚kanni-
balistische’ Riesenzellen nachgewiesen werden können, die jedoch nur einen geringen
Teil der exponierten Arbeiter betrifft. Im 20. Jahrhundert wurden viele Studien zur
biologischen Wirkung mikroskaliger Wolframcarbidpartikel durchgeführt, ohne dass
die genaue Pathogenese der HMLD geklärt werden konnte.
Seit einigen Jahren werden in der Hartmetallindustrie Pulver hergestellt und
verwendet, die Partikel enthalten, deren Durchmesser weniger als 100 nm beträgt –
also Nanopartikel. Somit kann diese Industrie zur Nanotechnologie gezählt werden,
deren Merkmal eben u.a. die Erzeugung von Materialien kleiner als 100 nm ist (Meyer
et al. 2001). Die Nanotechnologie gilt allgemein als eine der Schlüsseltechnologien des
21. Jahrhunderts. Es handelt sich hierbei nicht um eine spezifische Technik, sondern
ein breites Feld unterschiedlichster Anwendungen. Die Besonderheit der Nanotechno-
logie besteht darin, dass Nanopartikel sich in vielen Eigenschaften von den gleichen
Partikeln mit mikroskaligem Durchmesser unterscheiden können. Somit eröffnen sich
viele Anwendungsgebiete in allen Lebensbereichen. Allerdings verbinden sich mit der
Nanotechnologie nicht nur Hoffnungen, sondern auch Befürchtungen bezüglich
gesundheitlicher Risiken. Daher beschäftigt sich das rapide wachsende Forschungs-
gebiet der Nanotoxikologie mit den Effekten von Nanopartikeln im lebenden
Organismus. Um diese biologischen Effekte zu erforschen werden häufig in vitro
Untersuchungen an kultivierten Zellen eingesetzt. Diese bieten den Vorteil definierter
Versuchsbedingungen mit gut charakterisierten Zellarten, können jedoch die
physiologische Umgebung nur ungenau abbilden.
In der vorliegenden Arbeit wurden nanoskalige Wolframcarbidpartikel verschiedener
Größen (WC 10 und WC 100) sowie Wolframcarbid-Cobalt-Partikel (WC(100)-Co) auf
ihre Effekte untersucht. Da der wahrscheinlichste Expositionsweg dieser Partikel die
Inhalation darstellt, wurden Zellkulturmodelle gewählt, die mögliche Zielzellen
repräsentieren: A549-Lungenepithelzellen als Modell für Alveolarepithelzellen vom
Typ II, differenzierte THP-1-Zellen als Modell für Alveolarmakrophagen und
mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (PBMC) als primäre Immunzellen.
Untersucht wurde, ob die Partikel in die Zellen aufgenommen wurden oder sich
80
extrazellulär an die Zellen anlagerten, ob sie die Vitalität der Zellen beeinträchtigten
und ob die Zellen als Reaktion auf die Partikelexposition immunmodulatorische Stoffe
bildeten. Die eingesetzten Methoden umfassten Lichtmikroskopie, Rastelelektronen-
mikroskopie, Röntgenspektralanalyse, Durchflusszytometrie, den MTT-Vitalitätstest
und den Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Mit den Fortschritten in der
nanotoxikologischen Forschung wurden in den letzten Jahren zunehmend Inter-
aktionen zwischen etablierten Testsystemen und Nanopartikeln aufgedeckt. Diese
wurden in der vorliegenden Arbeit teilweise bestätigt und bei der Interpretation der
Ergebnisse berücksichtigt.
Es zeigte sich, dass alle untersuchten Zellarten die Partikel aufnahmen. Die intra-
zelluläre Aufnahme konnte durch röntgenspektralanalytische Verfahren nachgewiesen
werden. In den Zellen stellten sich die Partikel als Agglomerate dar und kamen
zumeist membrangebunden vor. Die primären Monozyten zeigten zudem die Bildung
großer intrazellulärer Vesikel nach Partikelexposition. In der Durchflusszytometrie
stellte sich die Partikelaufnahme als eine Zunahme der Granularität bei allen
untersuchten Zelltypen dar. Hierbei fiel auf, dass die kleineren Partikel durchgängig
einen geringeren Effekt auf die Granularität zeigten, was auf eine Abhängigkeit der
Aufnahme von der Partikelgröße hindeuten könnte.
Der Aufnahmemechanismus der Partikel wurde untersucht, indem der Phagozytose-
hemmer Cytochalasin D eingesetzt wurde. Dieser hemmte nur bei den primären
Monozyten die Partikelaufnahme deutlich. Dies spricht dafür, dass die primären
Monozyten die Partikel über einen aktinabhängigen Prozess aufnahmen, während bei
den anderen Zellarten wahrscheinlich viele Partikel an der extrazellulären Membran
angelagert oder über aktin-unabhängige Prozesse aufgenommen wurden.
Die Vitalität war bei allen Zellen nach Partikelexposition beeinträchtigt. Im
Allgemeinen zeigten die WC-Co-Partikel die stärksten vitalitätsmindernden
Wirkungen.
Die Bildung immunmodulatorischer Mediatoren (Zytokine und Chemokine) war bei
den Lungenepithelzellen und den THP-1-Zellen nur schwach beeinflusst. Vor allem die
Exposition mit WC-Partikeln führte aber bei diesen beiden Zelltypen zu einer
vermehrten Sekretion von MCP-1 und TNF-α, was auf eine mögliche Induktion
inflammatorischer Vorgänge hindeutete. Die PBMC reagierten mit Abstand am
deutlichsten auf die Partikelexposition mit einer erhöhten Zytokinsekretion, wobei
81
diese Reaktion starken interindividuellen Schwankungen unterlegen war. Hier
wiederum zeigten die Partikeleffekte eine starke Abhängigkeit von der Partikelgröße,
denn die Wirkungen der WC 10-Partikel fielen bei allen Zytokinen schwächer aus als
die der größeren Partikel. Untersuchungen zum Wirkmechanismus der Partikel mit
dem Radikalfänger N-Acetylcystein deuteten auf eine Beteiligung reaktiver Sauerstoff-
spezies an den Partikeleffekten hin. Allerdings konnte auch eine Bindung von Lipo-
polysaccharid, einem Zellwandbestandteil gramnegativer Bakterien, an die Partikel
und eine damit verbundene Mitbeteiligung an den Effekten nicht endgültig aus-
geschlossen werden.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen in vieler Hinsicht vorliegende
Erkenntnisse zur erhöhten Toxizität von WC-Co-Partikeln im Vergleich mit WC-
Partikeln. Außerdem zeigte sich, dass die biologischen Effekte der untersuchten
Partikel abhängig von der Primärpartikelgröße und von der Oberflächenbeschaffenheit
waren, wobei die Einflüsse dieser beiden Partikeleigenschaften nicht konkret unter-
schieden werden konnten. Im arbeitsmedizinischen Kontext der HMLD spricht vieles
dafür, dass auch die Exposition mit nanoskaligen Wolframcarbidpartikeln zu
Entzündungsprozessen in der Lunge führen kann. Daher müssen die notwendigen
Vorkehrungen getroffen werden, um die gefährdeten Arbeiter vor der Inhalation
dieser Partikel zu schützen.
82
83
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ANHÄNGE
DANKSAGUNG
Ich möchte an dieser Stelle den Menschen danken, die auf ganz unterschiedliche Art
und Weise dazu beigetragen haben, dass diese Arbeit durchgeführt und zu Papier
gebracht werden konnte.
Das wäre nicht möglich gewesen, hätten mir Frau Dr. Irina Lehmann und Prof. Dr.
Ulrich Sack nicht das Thema zur Promotion angeboten.
Viele Mitstreiter im INOS-Projekt haben mir bereitwillig meine zahlreichen Fragen
beantwortet, mir Mut gemacht oder die Arbeit anderweitig unterstützt. Dazu gehörten
Dr. Dana Kühnel und Dr. Wibke Busch vom UFZ sowie Tobias Meißner vom IKTS und
Dr. Armin Springer vom MBZ.
Der Alltag im Labor wurde mir sehr erleichtert durch die Mitarbeit und den Humor
von Anne Hain, Denise Hinze und Pierre Kruber.
Hier zuletzt erwähnt, aber auch enorm wichtig war, dass meine Familie und meine
Freunde mich auch in den schwierigen Phasen der Promotion begleitet haben, wofür
ich beispielhaft besonders Dr. Oliver Arendt und Anne-Sophie Trahorsch danken
möchte. Diejenigen, die hier unerwähnt bleiben, hören das Dankeschön persönlich von
mir.
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ERKLÄRUNG
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige
Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. ich
versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte
Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der
vorgelegten Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch
im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde zum
Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt wurde. Alles
aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene Material, das in der
Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches
kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die direkt an der
Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.
(Ort, Datum) (Unterschrift)
98
LEBENSLAUF Persönliche Daten
Name: Ulrike Trahorsch
Geburtsdatum: 29.09.1981
Geburtsort: Belzig
Schulbildung:
1994-1998 Musikgymnasium „Schloss Belvedere“, Weimar
1998-1999 Preston High School, Preston, Idaho, USA
1999-2002 Hermann-von-Helmholtz-Gymnasium Postdam
Studium
2002-2009 Studium der Humanmedizin, Universität Leipzig
2002-2009 Stipendiatin der Studienstiftung des deutschen Volkes
08/2004 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
08-12/2005 Auslandsaufenthalt Kampala, Uganda
01-04/2006 ERASMUS-Semester Lissabon, Portugal
11/2009 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
PJ
08/2008-12/2008 Innere Medizin, Hämatologie/Onkologie (Vogtland-Klinikum
Plauen)
12/2008-04/2009 Traumatologie, Thoraxchirurgie (Klinikum St. Georg, Leipzig)
04/2009-07/2009 HNO (Universitätsklinikum Leipzig)
Promotion
07/2007-08/2008 wissenschaftliche Tätigkeit am Helmholtz-Zentrum für
Umweltforschung (UFZ) Leipzig
Berufliche Tätigkeit
Seit 05/2010 Ärztin in Weiterbildung Allgemeinmedizin, Krankenhaus St.
Elisabeth und St. Barbara, Halle
Veröffentlichung
Bold A, Wurth R, Keller T, Trahorsch U, Voigt P, Schubert S, Sack U: Low-cost
enumeration of CD4+ T cells using a density-based negative selection method
(RosetteSep) for the monitoring of HIV-infected individuals in non-OECD countries.
Cytometry A. 2008 Jan;73(1):28-35
Leipzig, den 30.06.2010 Ulrike Trahorsch