in vİtro Şfile.toraks.org.tr/toraksfd23njkl4nj4h3bg3jh/mse11-ppt-pdf/h_bayram.pdf · normal...
TRANSCRIPT
IN VIN VİİTROTRO ARAARAŞŞTIRMA TIRMA YYÖÖNTEMLERNTEMLERİİ
Prof. Dr. Hasan BayramGaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi
Göğüs Hastalıkları ADE-posta: [email protected]
Toraks 11.Yıllık Kongresi, Antalya Nisan 2008
Amaç• Deneysel araştırmada in vitro yöntemler ve
kullanım alanları konusunda genel bilgi sahibi olma
• Solunum yolunun hücre dizileri ile primer hücre kültürlerinin elde ediliş yöntemleri hakkında bilgi sahibi olma
• Bu kültürlerin araştırmalarda sunduğu olanaklar ile kullanılan yöntemler hakkında bilgi sahibi olma
• Katılımcıları bu yöntemleri öğrenme ve kullanmaları konusunda teşvik etme
Sunu Akışı• Giriş;
– Araştırma laboratuarı– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri• Hücre dizilerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı• Özet
Sunu Akışı• Giriş;
– Araştırma laboratuarı– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri• Hücre dizilerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı• Özet
İn Vitro Araştırma Laboratuarı
• Nasıl kurulur?• Kaynak; DPT, Üniversite fonları, TÜBİTAK• Profesyonel destek• Personel; biyolog, teknisyen, asistan
İn vitro yöntemler nerede kullanılır?
• İn vivo koşullarda alınan bir örneğin incelemesi;– Periferik kan, idrar, dışkı, BOS vs.– Ekspirasyon havası, balgam, biyopsi, BAL– Deney hayvanlarından alınan örnekler; kan, hava
yolu-akciğer sıvıları, akciğer dokusu• İn vitro koşullarda doku ve hücre kültürü elde
edilmesi ve incelenmesi– Periferik kan kültürleri; mono nükleer hücreler,
eozinofil vs– Hava yolu hücre kültürleri; Hücre dizileri, primer hücre
kültürleri vs
İn Vitro Yöntemler Niçin Kullanılır?
• Bir enzim, elementin direkt ölçümü; ALT, AST, Na, K vs• Hücre fonksiyon/bütünlüğünün araştırılması; silya
titreşimi, elektriksel direnç, permabilite• Hücrenin canlılığı; MTT (tetrazolium tuzu), trypan blue• Anahtar bir proteinin belirlenmesi; ELISA, Western Blot• Gen düzeyindeki bozukluk/aktivasyonunun incelenmesi:
PCR, RT-PCR• Bir protein/antijenin ekspresyonu; immüno-sito kimya• Hücrelerin (büyüklük/eksprese ettiği belirtece göre)
ayrılması/belirlenmesi; akım sitometri (‘flow cytometry’)
Sunu Akışı• Giriş;
– Araştırma laboratuarı– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri• Hücre dizilerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı• Özet
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)/Enzyme
ImmunoAssay (EIA)
(‘capture ab’)(Nümune)
(‘detecting ab’)
(‘enzime bağlısecondary ab’)
(Substrat)
ELİSA
ImmunoSito/Histokimya
Enzimatik Yöntem Floresan Yöntemi
‘Blotting’ (leke)• Southern blot; DNA dizisi
(sequence,sekans)• Western blot; protein antibody ile • Northern blot; gen ekspresyonu RNA ile• Southwestern blot: DNA bağlı protein• Far-western blot: Protein, non-antibody
protein ile
http://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot
Western Blot (Immunoblot)
•Doku homojenat•Spesifik proteini, düzeyini belirlemek
ı/ekstraktı, hücre
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Microarray (Mikrodizi)
• DNA microarray’leri; cDNA microarray, oligonucleotide microarrays
• Protein mikroarray• Tissue mikroarray• Transfection mikroarray (hücre microarray) • Kimyasal bileşik mikroarray• Antibody mikroarray• Gene Chip Analizleri
DNA Mikroarray
•Gen/genom chip, DNA chip, gen array•Tek bir geni temsil eden mikroskobik DNA spotlarının bir kolleksiyonu•Diğer arraylar’dan farkı ya DNA’yı ölçer, ya da ölçüm sistemlerinin bir parçası olarak DNA’yıkullanırlar.
Genomic
•Bir organizmanın bütün genomunun araştırılması•Organizmaların bütün DNA dizilerinin(sekans)tespitine dayalı çalışmalar
Proteomic
•‘Genomic’ ılır• Genel olarak protein çal(yap
• ‘Proteome’; ‘•Bir organizma taraf
ile analoji yaratmak amacıyla kullanışmaları
ı ve fonksiyonları)protein’ ve ‘genome’ dan oluşur.
ından üretilen tüm proteinler
Small Interfering RNA (siRNA)
•‘short interfering RNA’• Sçift-sarmal RNA moleküllerinden olu
• sSpesifik geni etkisizlekullan
veya ‘silencing RNA’pesifik rolleri olan 20-25 nükleotid uzunluğunda
şur.iRNA transfeksiyon yoluyla hücreye verilerek
ştirme de (knock down)ılabilir
Flow Cytometry
• DNA (hücre siklüsü, proliferasyonu vs)• Apopitozis çalışmalarında• Hücre yüzey antijenlerinin belirlenmesinde
(CD markerları)• Hücre içi antijenler (sitokin, mediatör vs)• Kromozom analiz ve tespitinde• RNA çalışmalarında• Protein ekspresyon ve lokalizasyonunda
http://www.bdbiosciences.com/immunocytometry_systems/support/training/online/ITF/index.shtml
•Tek dalga ışın demeti(lazer) sıvı akımına yönlendirilir•Çevredeki detektörler ışığınkırılma yönü, yaydığıfloresan ışığının tespitiyle hücre/partiküllerin belirlenmesi esasına dayanır
Akım Sitometri (Flow Cytometry)
Hücre Siklüs Ölçümü
Sunu Akışı• Giriş;
– Araştırma laboratuarı– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri• Hücre dizilerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı• Özet
Hücre Kültürleri• İn vivo uygulamalarda etik, güvenlik
sorunları• Uygun çalışma modeli• Hücre fizyolojisi, biyokimyası vb• Patogenez; rinit, astım, KOAH, kanser• Toksikoloji; kimyasallar, zehirler, çevresel
irritanlar (hava kirliliği), biomas• Terapötik; Ca tedavisi, steroidler, β2-
agonist, teofilin, yeni ajanlar, vs
Hücre Dizileri (‘Cell line’)• Normal hücreler (ölümsüz) ‘immortal’ hale
getirilirler (viruslar, SMV40);– BEAS-2B (Bronş epitel hücreleri)– 16 HBE-14o- hücreleri (Bronş epitel hücreleri)
• Kanserleşmiş hücreler kullanılır– A549 hücreleri (akciğer karsinoma hücreleri)
NHLI Cell Culture Protocols, American Type Culture Collection
A549 (İnsan Alveolar Epitel Hücreleri)(Hoffman Modüle Kontrast Mikroskobu x400)
• DMEM, %10 FCS, 2mM L-glutamine• Tek katman (‘monolayer’) oluşturur
Dizel Egzoz Partikülleri DEP (medyan=0.4μm)
Hücre Canlılığı - MTT
SF 50 100 200 400FCS%10
5 10
Dizel Egzoz Partikülleri (μg/ml)
DEP’nin A549 hücre canlılığı üzerine etkisi
24 saat
***p<0.0001 - 0μg/ml DEP
FCS 0 5 10 50 100
200
400
1000
2000
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Dizel Egzoz Partikülleri (μg/ml)(%10)
* *
*
*
Opt
ik D
ansi
te
FCS 0 5 10 50 100
200
400
1000
2000
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Dizel Egzoz Partikülleri (μg/ml)
*
* * **
*
(%10)
Opt
ik D
ansi
te
FCS 0 5 10 50 100
200
400
1000
2000
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
(%10) Dizel Egzoz Partikülleri (μg/ml)
**
*O
ptik
Dan
site
72 saat48 saat
Serum 0 10 50 100
200
400
0
1000
2000
3000
4000
5000
*
Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/ml)
IL-8
(pg/
ml)
Serum 0 10 50 100
200
400
1000
0
5
10
15
*
Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/mG
M-C
SF (p
g/m
l)l)
DEP (10-1000μg/ml) ile 72s İnkübasyonunA549’dan Sitokin Salınımına Etkisi
DEP (10μg/ml)’nin A549 hücre proliferasyonuna etkisi
G0/1 S G2/M0
25
50
75
100Serum FreeDEP (10μg/ml)FCS (10%)***
***
*
**
*****
Cell cycle compartments
Perc
ent o
f cel
ls
Channels (FL2-H)0 50 100 150 200 250
Num
ber
020
040
060
080
010
00
G0G1G2MS-Phase
SF
Bayram H et al, Eur Respir J 2006
SF
LL(A-/P-) LR(A+/P-) UR(A+/P+) UL(A-/P+)0
10
20
30
40
70
100 **
*
FCS(10%)SFDEP (10μg/ml)
*
*
Kuadrantlar
Hüc
rele
rin %
'si
*P<0.05 and**P<0.005 vs SF
Bayram H et al, Eur Respir J 2006
DEP (10μg/ml)’nin A549 hücre apoptozisine etkisi
DEP’nin A549 hücre p21CIP1/WAF1 protein ekspresyonuna etkisi
0 1 100
50
100
150
p21
(% o
f βac
tin)
10% FCS
10%FCS0 1 10
DEP (μg/ml)
*** β-actin
p21CIP1/WAF1
*P<0.05 and**P<0.01 vs 0μg/ml DEP
0 1 100
100
200
300
400
DEP(μg/ml)
*
p21
mR
NA
(% G
APD
H)
*P<0.05 vs SF
DEP (10μg/ml) ile 48 saat inkübasyonun A549 hücre p21CIP1/WAF1 mRNA ekspresyonuna etkisi
Sunu Akışı• Giriş;
– Araştırma laboratuarı– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri• Hücre dizilerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı• Özet
Primer Hücreler-Avantajlar• İn vivo ortamdaki hücrelerle genotipik ve
fenotipik benzerlik• Çeşitli patolojilerde, hastalardan direkt
olarak elde edilebilirler
Primer Hücre Kültürü-Dezavantajlar
• Elde edilmeleri daha zor• Tekrar tekrar çoğaltılıp kullanılamazlar• Etik sorunlar
Doku - Hücre Kaynağı• Cerrahi eksplant
– Pnömonektomi, Lobektomi– Transplant akciğeri
• Biyopsi• Fırçalama (epitel hücreler)• Enzimatik digestion,• Disseksiyon• Hazır, ticari olarak
Akciğerin Primer Hücre Kültürleri
• Düz kas hücreleri• Fibroblast kültürleri• Alveolar epitel hücreleri• Bronş epitel hücreleri
Primer Bronş Epitel Hücre Kültürleri
• Fırçalama,• Enzimatik digestion,• Disseksiyon
Bronş Epitelyumunun Disseksiyonu
Kültür Vasatı• ‘Medium 199’
– Foetal bovine serum (2.5ml)– 1ml bovine pancreatic insulin (2.5 μg/ml)– 1ml human transferrin (2.5 μg/ml)– 1ml epidermal growth factor (20μg/ml)– 1ml hydrocortisone (0.36 μg/ml)– 1ml L-glutamine (0.02mg/ml)– 1ml antibiyotik/antimikotik solüsyon
• 100ml tamamlanır ve 0.2μm por çap filtreden geçirilir
Kültür Kapları
6cm çaplı, Falcon ‘Primaria®’’ plastikkültür kapı (Becton Dickinson,UK)
9mm çaplı 24 gözlü, 0.45μm porçaplı hücre kültür ‘insert’ diagramı
24-Kuyucuklu Plate
(Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)
1. Hafta 3. Hafta
Hücrelerin DEP ile İnkübasyon
Silya Titreşim Frekansının Ölçülmesi
Bayram H, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 1998.
DEP’nin bronş epitel hücre silya titreşim frekansına etkisi
0,01
0,1
1
10
100
1000
Normal kültür ortamında astmatik ve non-astmatik bronşepitel hücrelerinden inflamatuar mediatör salınımı
IL-8 GM-CSF RANTES sICAM-1
p<0.05
p<0.002
p<0.003
pg/μg selüler protein
YK
Non-ast. Ast.(log.)
Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998.
İn vitro Ozon –NO2 Maruziyet Düzeneği
%5 CO2İn Air
NO2
Kültürlerin Elektriksel Direncinin Ölçüm Düzeneği
Ozon ve NO2’e 2-6s maruziyetin atopik astmatik bronşepitel hücre kültürlerinin elektrik direncine etkisi
Bayram H, et al. Clin Exp Allergy 2002.
Sunu Akışı• Giriş;
– Araştırma laboratuarı– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri• Hücre dizilerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı• Özet
Özet• Bir araştırma laboratuarı kurmakla başlanmalı• İn vitro yöntemler çok çeşitli araştırmalarda
kullanılabilirler• Akciğer hücre dizi ve primer hücre kültürleri
yapılabilir• Solunum yolu hücrelerinin
– Fizyolojik– Biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi– Çeşitli patolojilerdeki rollerinin aydınlatılmasında
kullanılabilir
Yorum• Bütün dünyada yaygın olarak
kullanılan in vitro araştırma yöntemlerinden yararlanmalıyız
Sabrınız İçin Teşekkür Ederim