TECNICHE E NIETODOLOGIE

Indagini elettroforetiche sui cereali. I. Riconoscimento e dosaggio dell'orzo nelle farine e nelle paste alimentari

V I'ITO RIO SILANO (•), ANNA M A HIA D'ERRICO ( • •), F RANCESCO :\IUNTONI e F RANCESCO POCCHIAR I

l.t1boratori di Chimica e Labomtori di Chimica Biologiw

• Riassunto. - Protcin t' di farine di grano t' di paste a limen tari con te­

nenti farina d 'orzo in proporzioni decrescenti da l 20 al 2 % sono s tate estratte con acqua-etanolo (10 : 90) . G li estratti p rotcici così ottenuti sono s tati analizzati con elettro foresi discontinua su gel ùi poliacrilammidc.

L' identificazion e e la J cterminazione dcnsitometrica di bande protciche caratteristiche han no permesso il riconoscimento cd il dosaggio dell'o rzo

aggiun~o.

Summary (Gel electrophoresis of cere(tl proteins - l. Qunlitative nml quantitative nnalysis of barley in wheltt Jlours and macaronis). - Protein cxtracts of wheat flours and macaronis mixcd with differcnt amounts of barley flour (20 to 2 %) ha ve been obtained by extraction with water-ethanol (lO: 90 v/ v) solution. These cxtracts ha ve bcen analyzed by disc-clectropho­rcsis on polyacrylamidc gel. Identification a nd dcnsitometric measuremen ts of barley proteins allowcd to evaluate qualitativcly an d tpianti tatively the added ba rlcy.

INTRODUZIONE

Va ri tentati vi sono s tati fatti (STnrLCIUC, 1932; GIUJ. rANO & STEIN, 1955) pl'r difft·rcnziare i cereali a mezzo dell'esa me microscopico c di colo ra­zioni specifiche dei granuli eli amido. Tali metodi, par ti colarmente per il binomio g rano-orzo, non sono molto soddis fact·n ti.

D'altra parte il fa tto che questi cercali abbiano un contenuto proteicu quali tativatm~nte dive rso risulta da r lcmentari cognizioni genetiche, confer­mate da numerose ricerche spt>rimcntali (Cour.soN & SIM, L964 ; ELTON & EwAnT, L964; MrKOLA, 1965; CouLSON & SrM, J965).

(•) Borsista del Consiglio Nazionale ùelle Hicerche presso l'f.tituto ùi (.;ene tica per la Ccrealiculturu " N. Strampelli " - Roma.

(• •) Ospite dei Laboratori di Chimica Biologica.

Amt. l si . Su1•cr. Sa ttilà ( 1Vll7) 3 , 7 .J3·iU7.

75 1 TEt:"\;I CIIE J:; METOilU LOGI E

L'dt·tlrofon·si diseont inua di 0H NESTEJN (1964) t' DAvrs ( 1964) i· una LPcnica di gt'l-t' lt·llrofon·si i cu i vantaggi ri spetto a l t'CII iclw an a lo­ght· sono ·tali ampianlt'nlc trattati. ln particu la n t'SSa è stata appli cata anclw a llo studio di protrint· vcgctHli estratte da l grano ( ARAYAN, VOG EL & LAWilENCE, J 965 ; StLA I'i O, D E CJLLIS t\ PocCIIJAHJ , 1967) 1· dall'orzo (MIKOLA, ) 96.1).

Consideran do le IIUL<' Voli possibil ità quallli la t i\ t ' di quPsla l l'CIIica (HANSL, 1964) , si è riten uta util e una ricer ca su es tratti prot cici di pasl t· a limentari e farin t· tend ent1· ad accert an· la prr senza d i sfarinati d 'orzo evcn tualnwntc aggi unti l' d i proet'dcrc al loro dosaggio.

PAHTE SI'EH IM E TA L E

Materiali .

I cerea li usati furo no :

a) Grano : 1'riticum durum, varit'là B. 52 , Ciclope, Ciprucamar ; Triticum aestiv um, varietà Bianchctta, O vest , P asmicolum 5.

b) Orzo : H ordeum disticrun , varietà Wisa, Joanna Mari s Ot tl!r.

Dei cereali dcn cati sono stati anali?.zati il gra nello, la farina c lP pas te ap positam1·ntt• preparate nei nostri Laboratori .

M etodi .

Estraz ioni' d1'1le protrinl'. - Le protein e suno s la l t• es tra tte con due di­vcrl:S I procedimen ti :

a) d ue parti di campione, macinato con m acincllo Buh lt·r a g rada­zione 3, furono agita te dolccm en te per tre ore con tre parti ùi una soluzione acquosa di NaCl 0 ,85% (pesoj , ·oluuw) ;

b) una parte di ca mpione fu agitala per cinque ore con una parll' di solu zione a cqua-e tanolo '-"0:90 voi/ voi).

La sospensione che si ottenne alla fin p ddl' agi taziou c fu centrifuga ta co11 un a centrifuga lntcrnational modello HH-lpt'r 20 minuti a 14.000 r.p.m.

Nel caso del procedinwntu a) il supcrna tantc· limpido fu usato come talt· ; per il procedimento b) dopo dimin azione dell 'a lcool per evaporazione sottovuoto a 2SoC.

Determ i11azr:01w delle protl'ine . - La determinazione dellt· protein e to­tali negli estratti fu fa tta con il m etodo di LowRY el al. (1951).

E lettroforesi. I gels di poli ncril ammiJe furono preparati 111 tuui­cmr di ve tro di d iamC'tro ùi 0,5 cm e di altezza 6,5 cu1 con una solu -

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SILANO, o'ERRICO, llUNTONI E POCCIIIAll l 755

zione acquosa di acrilammide al 7,5 %, usando le st>guenti soluzioni !'ltandard :

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Ammonio Persolfato 0,14 g Ribofla vi n a 0,004 <T o Acqua a 100,0 mi Acqua a 100,0 mi

TI gel inferiore fu preparato con l mi della so luzione ottenuta mesco­lando : l parte di l a, 2 parti di 2 a, 4 parti di 3 a, l parte di H10 ; qut·llo superiore utilizzando 0,2 mi della ·oluzione ottenuta mf'scolando : l pa rte di l b, 2 parti rli 2 b, l parte di 3 b, 4 parti ili HtO.

La carica del campione fu fatta in saccarosio acl una concentrazione finale del 12 %· 0,02 ml dell'estra tto a) e 0,06 ml dell'estratto b) fu rono raricuti per ogni gel. Ad ogni tubicino fu applicata una corrente di 2,5 mA per 75 min. Dopo la corsa, e ffettuata in un tampone glicina-tris (0,38 M in gli cin a e 0,04 M in tris a pfl 9,5) in un sistema verticale della Canal Industriai Corporation, Rockville, Maryla nd (U .S.A.), i gd furono posti per la colorazione in una so luzione di anilina blue-black 5 °/00 in soluzione acquosa di acido acetico 7,5 % (voi/ vol.) per 2 ore circa. La decolora­zione fu effettuata a mezzo di ulteriore elettroforesi in soluzione acquosa a l 7,5% di acido acetico, per circa l ora applica ndo una corrente di 12,5 mA per gel. Dopo la decolorazione la registrazioni' del gel umidi fu fatta con microtlcnsitome tro '' Canalco Moùl'llo E "• dt•lla Canal Indus triai Corpora­lion, Hoekvi llt·, Maryland (U.S.A.) .

l:USULTATI E DISCUSS !O t E

l) Quadri I'Lettrof oretici degli estratti proteici ottenuti con l'estrazione .m lina.

In f ig . l sono mostrati i quadri proteici ottenuti con una estrazior.e mt·dia nte NaCI 0,85 % di sfarinato integra le .ti grano c di orzo . Evidenti tlifff•rpnzr sono visibili tra i quadri prot1•ici di Tritiwm (A, B , C, D) cd 1-fnr­,[,.um (E, F) attribuibili alla d iversità di gc nne fra i due C<" reali .

. f uu. h<l. Stt)J('T. Sllniloi ( 1967) 3. 7.i~·ìG7.

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S ILANO, O'ERIIICO, ~fUNTONI E POCCHIAR! 757

Differenze meno marca te, ma pure appreuabili, sono visibili tra i qua­dri proteici di Triticwn durum (A, B) e Triticum aPstivum (C, D). (SILANO

et al., 1967) .

Tale metodo di estra:t.ione a causa del no tevole numero di proteine estratte, non permette di eviden:t.ia re la presenza contemporanea dei due cereali; infatti mescolando gli es tratti ùi Triticum e di Hordeum nel rap­porto l / l non si ottenne una risolm;ion e soddisfacente (G, H) .

2) Quadri elettroforetici degli estratti proteici nttenuti con estrazione idro­etunolica.

a) Aspetti qualitativi .

In Fig. 2 sono riportati i quadri proteici ottenuti estraen do con acqua­etanolo (lO: 90 vol/vol.) le proteine dal chicco di tre varietà di Triticum durum (A, B, C), tre di Triticum aestivum (D, E , F) e tre di flordeum distiwm (G, H, 1).

Nessuna differenza qualitativa n elle composizioni elettroforetiche at­tribuibili a Ua var ietà o a lla specie si è evidenziata in questo caso ; infatti per i sei campioni di Triticwn queste sono praticam ente identiche fra loro, come a nch e per i tre di Hordeum. Notevolissime sono, invece, le differenze attribuibili a l genere ; infa tti, com e si vede daUa figura, le bande proteichc del Triticum si trovano in una zona del gel che è completamente diversa da quella in cui sono localizzate le bande ùell'Hordeum ed in nessun caso per l' flordeum si è potuto evidenziare la comparsa in quantità signifi­cativa delle bande caratteristiche del Triticum e viceversa. Come appare chiaramente dalla F ig. 3 non vi è alcuna differenza sostanziale tra i quadri elettroforetici di estratti proteici idro-etanolici usando co me prodo tto ini­zia le sia il chicco che la farina o la pasta.

P ertanto questa estrazione si presta a rilevare in ogni circostanza la pr<•senza contemporanea dci due cert·ali. Infatti daUc Figg. 4 e 5 risulta che si riescono a m ettere in eviden za le bande caratteris tiche dell'orzo sia n f• llc fa rine che nelle paste di grauo contl'nenti or;-.o.

Alcune differenze si notano, come era prevcdibile, tra i quadri elettro· foretici di estra tti pro tcici di miscele di crucco dei due cereali (Fig. 4, G) c quelli di miscele degli estratti proteici ottenuti da grano e da orzo separa­tamentc (Fig. 4, H). Infatti si nota che le bande corrispondenti a lle proteine del gra no sono più inten se nel primo caso che nel secondo, mentre il con­trario avviene per le bande caratteristiche dell'orzo . Ciò fornisce l'evidenza di una maggiore so lubili tà df' lle proteinf' d<·l gra no rispetto a ((Ut'llc dell 'orzo.

.11111. !.•t. Super. Sanità ( I!Jil7 ) 3, 7&3·7117.

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762 1'ECNICIIE E M J::TOVOLOG JJo.

b) A spmi quantitatiL·i .

Sart•bb t• sta lo prcfc·rihilt- Tt'alizzart· la determinaziont· qua n ti la t i va dc· l­l' orzo ndk farint · (' ncllt · pastt · misurand o la dcn sitù oltica della Landa 5, essendo quc•sla la pii:t intensa tra Il' Landt' carattt·risticlw ddl'orz(l. Dato per ù cht' l' intensità di questa banda risulta intermedia ai due· intt'na lli

ottimali per lt• dtH' F;C'n sibilità di cui è dotato il microdt'nsito metro Canalco, modc·llo E, si è o pt'rato sulla banda 7, anclw se qut•s ta è nolt'volm cntt· n~t·no

inten sa della 5.

In Fig. 6 sono s tat e riportai <" lt• r egistrazio ni tld lt · esplora zioni mino­dcnsitom('triclw dl'lla banda 7 JWr f'Stratti di past <" a varit' pert't'lllu;di di orzo .

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o Fig. 6. - Hegistruzionc de!Jn esvloruzion<' mic rodensitometrica della ltanda pro t ei<'u ad

H1 = 0,6 (Fig. 5), caratteristica dell'orzo, iu paste di grano duro a vurio <·un­tenuto di orzo.

P11Ml1t di g t·anu dut·o con con ten uto tli o r1.o d ol 20 " o (.\ ), d<'l l o":, (11). dd 10"., (C'l. elci ;, 0 u (Il). <1<'1 2°., (E). dl'llo o• .. (F).

In Tab. l sono riportate le aret' (A,, A,) definitc· dai pi cchi o ttenuti mediante registrazione della esp lorazione microdc·nsitometrica dei gel , t•or· rispondenti alle bande l c 4, ca ratteristich e· del grano, c• quc•lla (A,) corri­spondente alla banda 7 caratteristica dcll 'or:w. Inoltre sono riportati i va­lori A 1/A, Nl A 1 + A,. Comt· si vede l' area corrispondente a lla Landa 7 a u­m enta con la percentuale di orzo. Il fatto che il rapporto A 1/A, sia pratica ­mente costante è indict• cbt• la separazione elettroforetica è riproducibile.

Considerando che le bande l (Rt = 0,23) e 4 (H( = 0,38), ca rat­t eristicbt' del grano, sono molto piit in tensc di quelle 5 (Rr = 0,51) t• 7 (Hr = 0,60), caratteristiche d eli" orzo, an che quando questo è pres<"n lt• nella p c ree n t uak del 20 % ~elle paste e nelle farine (Fig. 5) si può ri te­nere che il valore A1 + A, s ia rapprPscnta ti vo dt'l contc•nuto protPi co totale dcll't>stra tto .

A nn. 1•1. Su}lcr. Srmii!Ì ( t !IG7) 3, 753 -7G7.

S I LANO, D'ERRI CO, \IUNTONI E POCCIIIARI 763

TABELLA l.

Dosaggio dell'orzo aggiunto alle paste di grano duro mediante valutazione densltometrlca di bande protelche caratteristiche .

l'crcentunlo di orzo

nello pasto

. t ree clc tlnlte li ~ti ' picchi corrispondenti alle l _ bnnclo cnrntteristlohe del grano ( l ,4) e dell'orzo (7) (Fig.~ _

A 1 (Rr - 0,23)l:_(Rf - 0,38) l A,(Tir - 0,60) l .\tfA, l .\, + .\. l ~--

O%

2 %

5%

10 %

15%

20%

2.860

3. ·HO

3.300

2.960

3A60

3.710

-, ---,--1 l. 950 28 l , ~6 1 L 81 O

2. 730 33 1, 25 6.710

2.700

2.310

2.610

2. 160

·W

50

60

85

1, 22

1, 28

1,32

1, n

6.000

5.270

6.070

5.330

(Le aree sono espresse in mmZ).

In Tab. 2 sono riportati i valori delle con centrazioni proteiche drgli estratti idroetanolici dopo eliminazione lle ll'a leool.

TABELLA 2.

Contenuto delle proteine in estra tti acquo-etanollci di paste dl grano duro contenenti orzo In varie percentuali

------- --

l l'e~·contuale di orzo nelle pUBte Contenuto protolco dell 'estratto fJ.g{ml

O% l 1. 560

2%

l 2.150

5% l . 910

lO % l L. 7:>0

15%

l 2. 050

20 % 1.670

-l l

l ----

media ± s.e. m . l. 848 J: 93 J - - --

Pt·r confrontare i risultati ottenuti con 'lut:ste due ll•eni ehe in Tab. 3 suno infine, riportati i rapporti (A,+ A4)/Q tQ= quantità di proteine es pressa in (J.g presente in nn , ·o lume l'gua le a quello usato per l'elettroforesi) ; ta li

. l nn. / st. S rtper. Sanità ( IU67 ) 3, 753-Hi7 .

7(ol TECI\' ICII E l·. ~n;T!li >OI . t>t;n

va lori rappresen ta no i mrn2 di area cht· IH.:lla rcgistrazi01w corriHpouuou o

ad l (J.g di proteina sottoposta ad rlettrofon·Ri. li fatto cht· yut·s ti ul ti m i , ·a fori

sian o praticamf•nte cos tanti per i \'ari tip i di pas lt• anal izzatt·, c i eonst•nlt·, almt•no ncllt· condj zioni ado t tatt·, di afl't·rman· la proporzionali ti! t ra la

quantitù di proteine pn·st•nti e l'area definita dal pieco di ogni prolt•ina.

Le aret· delimitati· dai pic:cbi , ancht· in consideraziou e della ()ostam:a del rapporto A, jA,, so11o con sirleralt• rappn·st·nt a ti' ,. de lla qua11titù di prote int·

'l'A llELI •. \ 3.

Rapporto (Ad AJ)/ Q e relativo fattore di correzione f.

J 'm·cl·nt.unlu ù i orr.o

ttellu pas ta

O% 2 0 '

/ o

5% lO %

15 %

20 % \_

( .\t l A , )/()

IIIUt . / Jl J;

51, 4

47,!1

52,2

50,2

'1·9, 3

53 , 3

.\' l () IIH.'cl iu

·l A,) () S (IOI'Ìtt ll• ttlalc

0,981i

l , OOG

0, 9i l

J ,009

J ,028

0, 95 1

( l va lori A1 + A4 sono s tuti ri('ava ti dallo 'l'ah. l : i valori Q, calcolabili da ll a Tab. 2, rappresentano la q uantit à di proteine iu p.g pre~cntc iu tlll volume eguak a qucllu u sato p er l 'elettroforesi.

corrispondt·nti a l picco. Piccult· \'a riazio ni dt·l rapporto (A, -j A.)/Q Mlllu

indicativt• di inevitabili imperfe1.ioni sperimentali nella carica del cam piolll' e nella regi strazione delle ban de . L'incid!'llZ(I di qut'Slt· imperfezioni sull' an·a

<lt>l pi cco dell (l Lanùa caratteris tica d ell 'o rzo , può essere ridotta uote ,·ol ·

mente moltipli cando il Yalon• A 1 per un fattorl' di correziotle {f) rappresen· tativo della deviazione dalla media dd rapporto predetto :

f medio

sperimentale

.. l un. l st. SttJ)er. Sat~ilrì ( I HH7 ) 3 , i ..J3·7Gi.

S I LANO, O'ERRICO, \I UNTONI E POCCII I Alll 765

Dalla Fig. 7 si vede che tra le aree del picco corrispondente alla banda 7

e la percentua le di o rzo presente n ella pasta vi è una relazione lineare almeno nell' intervallo con siderato ; dalla stessa risultano i vantaggi di usare

100

C'li

E E

50

o 5 10 20 % d1 orzo

Fig. 7. - Contenu to d'orzo nelle paste di grano duro. Utilità d el fa ttore tli correzione f. (Lo 11ree definito dal (liceo corrispondc nto ulln bnnd t\ n . 7 ( Ili - 0,6) (b' Jg. 5) sono ripo r. tato contro lo (JoroontULLli d i o rzo aggiunte. 0,06 rnltH cstmtto protoico 11nr i<'•~to por gel ;

e ' ' "ÌOri s pcr imon tl\U. Tempo d i doco\Ori\ZÌOne: 90 Ill iri c ircl\. 0 Vo.\ori HJ)Ot'irnontall cor·

rotti por Il rnttoro f ('l'a b . 3). Tempo tll tlooolora zlonc: !lO miJt. circa. 0 Vl\lo l'i s perime n· tull corret ti por Il fu t tot·o r. Te mpo di tloco lomzlonu: IliO m in circa).

il fa ttore di correzion e f propos to. La prc·senza di un assorbimen to in cor­rispondenza della banda caratteris tica dell 'orzo anche in pas te di solo grano è dovuto in parte ad un a aspecifica colorazione di fo ndo che si può el iminare a umen tando il tempo di decolorazione. No n si può infine cscludt•rf' che, la handa 7 sia prcst'ntc a nche nel grano sia pure in <'Oll el'ntrazionf' ridottissima . Con decolorazioni ad un tempo doppio è s ta to possibi le ridurre notevolmente l'asso rbimento aspecifico ( f ig. 7), anche se per l' limin a rc completa mente •(Uf'S to assorbimento bisogna ili mrzzarc la fJUa ntità di pro teiJ>t• ca rica te sul gel (Fig. 8).

In conclusione i da ti oggetto di ques ta puhblicazionc mostra no da una parte la va lidità del metodo proposto c dali 'alt ra interessa nti prospetti ve di sviluppo per anali si di questo t ipo. Alcune modifiche come la sgrassatura delle pastr ,. la ca rica in un gel, in v1•ce ehc in una soluzione di saccarosio, pot rebbt•ro a umt•ntarne la precisione sia pure a da nno della rapidità dcll'csf' -

. 11111, f .,[. Snpcr. Sani/{& O DU7) 3, 753· 767 .

7(o(o TEC~ICll F: E M El'Oil OJ.OGII :

eu7.iUII\'. j.: multo importante · s tandardi7.7.an · tutte· h- condizioni operati\··:

la macinazi01w, l'agitazioni' f' la ccutrifugazione· infltu·n1.ano la quantità

di proteine c•strallc (FEll.LE1\ l 9o7). J~ O\'\ io che· la pulizia dei tuLiein i,

... E E

50

40

30

20

10

5 10 15 20 % di orzo

Fig. Il. - Hiproduciltilità dell e dctcrminazion~ elc i cuutenuto d' orzo nelle pas te di grano duro.

( l,c nrco definite dal pie<·o <·OI'd~pondt · ut<- ulho handa n . 7 ( Hr ~ U,H) (l< i~ . ;,) •ono riportnt t' contJ·o le JJt·t·ccntuali di orzo aggiunto. l'or OA'nl gol SODO stuti c uo·ical.i 0.0:1 noi ùl estmtto proteico. Tutti i valori sporimoutnli suno stati COI'l'ct ti pco· il fuLLOt'L' r. \ 'ulori uoodi ili :J cspcricuzo con devinzionu stnud1.u·d).

Ja CUra neUa preparazione dei gel , Ja COllSI' r VaZIOll(' rho) g1·J, la tt'cnica di Ca­

rica di'l campion(•, 1\·tà d1'1le soluzioui usati', l!' variazioui di t emperatura

e soprattullo la durata della dPcoloraziont· sono fa t tori clw hanno una uote­voh: influenza sulla riproducibil ità dl'i dati. l)uest\' num1·rost· cause di Pr­

ron· po sono esseri' cvitlll\' analizzantlo il campioni' in esame insirml' ad una SPrie· di past1• nott>, in modo da avcrr una retta di taratura otten u ta

nel l t· idt•ntichc condizioni spcrimcn tali ado t la te · n cii" analisi del campiuue· incognito .

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