indicadores microbiológicos da qualidade do solo · principais grupos microbianos do solo rupo...
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Indicadores Microbiológicos daIndicadores Microbiológicos daIndicadores Microbiológicos daIndicadores Microbiológicos da
Qualidade do SoloQualidade do Solo
Marco Antonio NogueiraMarco Antonio NogueiraMariangela HungriaMariangela Hungria
EMBRAPA EMBRAPA –– SojaSojaLaboratório de Biotecnologia do SoloLaboratório de Biotecnologia do Solo(tel. 43 3371 6081; [email protected])(tel. 43 3371 6081; [email protected])
Maio 2013Maio 2013
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O que veremos nesta manhã?O que veremos nesta manhã?
Solo e ambiente: sustentabilidade.Solo e ambiente: sustentabilidade.O ã bi i di d ?O ã bi i di d ?O que são bioindicadores?O que são bioindicadores?Para que servem?Para que servem?Indicadores físicos, químicos e microbiológicos.Indicadores físicos, químicos e microbiológicos.Relações entre os indicadoresRelações entre os indicadoresRelações entre os indicadores.Relações entre os indicadores.Bioindicadores baseados em métodos clássicos.Bioindicadores baseados em métodos clássicos.Bioindicadores baseados em técnicas moleculares: PCRBioindicadores baseados em técnicas moleculares: PCR--DGGE, metagenômica.DGGE, metagenômica.Como interpretar dados baseados em bioindicadores de Como interpretar dados baseados em bioindicadores de qualidade do solo de amostras ambientais?qualidade do solo de amostras ambientais?
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Origem dos metazoár ios
( + de 500 milhões de anos atrás)Pré Cambriano
Cambr ianoEvolução morfológica dos metazoár ios
Era dos dinossauros0
120 , %
MicrorgaMicrorga--nismos:nismos:D i m D i m
de a
nos
Or igem dos fototróficos
Ambiente oxigênico
Desenvolvimento da camada de ozônio
Endossimbiose
Or igem dos eucar iotosmodernos
Origem dos metazoár ios1
2
10
1
0,1 O2 n
a at
mos
fera
,Da origem Da origem da vida aos da vida aos dias atuaisdias atuais
Bilh
ões
Diversificaçãomicrobiana
Origem dos fototróficosoxigênicos (cianobactér ia)
Or igem da vida
Eubactér ia
Arqueobactér iaLinhanuclear3
,
g
Evolução química
Formação da ter ra(cerca de 4,5 bilhões de anos atrás)
Síntese fotoquímicade moléculas orgânicas4 Anóxica
Adaptado de Brock, 1997.
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OO solosolo nana visãovisão simplistasimplista“Parte“Parte superficial,superficial, nãonão consolidada,consolidada, dodomantomanto dodo intemperismo,intemperismo, aa qualqual encerraencerramatériamatéria orgânicaorgânica ee vidavida bacteriana,bacteriana, ee
ibilitibilit d l i td l i t dd l tl t ””possibilitapossibilita oo desenvolvimentodesenvolvimento dasdas plantasplantas..””
(Aurélio Buarque de Holanda Ferreira)(Aurélio Buarque de Holanda Ferreira)
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O solo na visão do microbiologistaO solo na visão do microbiologistaAmbiente microbiológico, um meio de Ambiente microbiológico, um meio de cultura complexo com as mais variadas cultura complexo com as mais variadas cultura complexo com as mais variadas cultura complexo com as mais variadas interações entre seus habitantes;interações entre seus habitantes;Cada organismo do solo funciona como um Cada organismo do solo funciona como um órgão em um animal, excretando, órgão em um animal, excretando, t f d d b tâ i d t f d d b tâ i d transformando e removendo substâncias do transformando e removendo substâncias do ambiente, modificandoambiente, modificando--o. A água faz o o. A água faz o papel do sangue. papel do sangue. (Quastel, 1946)(Quastel, 1946)
Local onde a biosfera interage com a Local onde a biosfera interage com a Local onde a biosfera interage com a Local onde a biosfera interage com a litosfera, hidrosfera, atmosfera e a litosfera, hidrosfera, atmosfera e a “detritosfera”“detritosfera”
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Funções do soloFunções do solo
Propiciar desenvolvimento Propiciar desenvolvimento vegetal e microbiano e vegetal e microbiano e animal;animal;Regulador do ciclo Regulador do ciclo Regulador do ciclo Regulador do ciclo hidrológico;hidrológico;Atuar como tampão e Atuar como tampão e depurador por imobilizar e depurador por imobilizar e degradar compostos degradar compostos
t i l t j di i i t i l t j di i i potencialmente prejudiciais potencialmente prejudiciais ao ambiente.ao ambiente.
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Solo: sistema deSolo: sistema detrês fasestrês fases
RecursoRecurso naturalnatural fundamentalfundamental;;S lS l s dá ls dá l xx s st nt bilid ds st nt bilid d ddSoloSolo saudávelsaudável xx sustentabilidadesustentabilidade dedeagroecossistemasagroecossistemas ee sistemassistemas naturaisnaturais;;VulnerávelVulnerável:: 100100--400400 anosanos parapara formarformar 11 cmcm;;“O“O solosolo éé umum sistemasistema vivo,vivo, dinâmicodinâmico ee complexo,complexo,vitalvital parapara oo funcionamentofuncionamento dosdos ecossistemasecossistemasvitalvital parapara oo funcionamentofuncionamento dosdos ecossistemasecossistemasterrestresterrestres..””
(Doran et al., 1996)(Doran et al., 1996)
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Microrganismos na formação do soloMicrorganismos na formação do solo
Mecanismos: Ácidos orgânicos; COMecanismos: Ácidos orgânicos; CO22..
Entrada de N e C (possibilita o estabelecimento de outras Entrada de N e C (possibilita o estabelecimento de outras formas de vida).formas de vida).
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Microrganismos na formação do soloMicrorganismos na formação do solo
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Solo: grande diversidade de habitatsSolo: grande diversidade de habitats
Prec
ipita
ção
(mm
)
Tem
pera
tura
(ºC
) Vegetação
Al2O3Fe2O3 + Al2O3
Ord
ens
de s
olo
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Solo: DiversidadeSolo: Diversidade
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Em 1 g de terra: número de microrganismos Em 1 g de terra: número de microrganismos equivalente à população do planeta: equivalente à população do planeta: atividade.atividade.
(D l 1996)(Doran et al., 1996)
http://picasaweb.google.com/lh/view?q=microorganism&psc=G&filter=1&hl=pt-BR#5748592490233185138
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A biota do soloA biota do solo
Representa o carbono “vivo” do solo, de 1 a 5% da matéria orgânica do Representa o carbono “vivo” do solo, de 1 a 5% da matéria orgânica do solo (coeficiente microbiano solo (coeficiente microbiano qqMic).Mic).
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A maior parte da biodiversidade não está ACIMA, A maior parte da biodiversidade não está ACIMA, mas DENTRO do solomas DENTRO do solo
arti
nês
Foto
: A.M
. Ma
O que os olhos não veem o coração não sente?O que os olhos não veem o coração não sente?
Nem a mente compreende? Nem a mente compreende? Elke J.B.N. CardosoElke J.B.N. Cardoso
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Só conhecemos a ponta do Iceberg…Só conhecemos a ponta do Iceberg…
CultiváveisCultiváveis
Não cultiváveisNão cultiváveis
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Um ecossistema sustentável depende do fluxo de Um ecossistema sustentável depende do fluxo de t i t l d í i t ófi di d t i t l d í i t ófi di d
Microrganismos e sustentabilidadeMicrorganismos e sustentabilidade
nutrientes ao longo dos níveis tróficos, mediado por nutrientes ao longo dos níveis tróficos, mediado por microrganismos que atuam na transformação e microrganismos que atuam na transformação e mineralização da matéria orgânica do solo.mineralização da matéria orgânica do solo.Chen et al. (2003) Chen et al. (2003)
maior flutuação da maior flutuação da
AutossustentávelAutossustentávelEquilíbrioEquilíbrio
maior flutuação da maior flutuação da temperatura e umidade temperatura e umidade
do solodo soloerosão eólica e hídricaerosão eólica e hídrica
compactaçãocompactação
teor de matéria teor de matéria
Vegetação Vegetação clímaxclímax
EquilíbrioEquilíbrio
DesmatamentoDesmatamento PerturbaçãoPerturbação
teor de matéria teor de matéria orgânica do solo orgânica do solo
atividade microbianaatividade microbiana
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Uso do solo e diminuição na diversidade e atividade Uso do solo e diminuição na diversidade e atividade microbianamicrobiana
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Microrganismos como patógenos...Microrganismos como patógenos...
MicrorganismoMicrorganismo DescriçãoDescrição EfeitoEfeito
Bacillus anthracisBacillus anthracis
Clostridium botulinumClostridium botulinum
Clostridium perfringensClostridium perfringens
G (+), aeróbico, bastonete esporulanteG (+), aeróbico, bastonete esporulante
G (+), anaeróbico, bastonete esporulanteG (+), anaeróbico, bastonete esporulante
G (+) anaeróbico bastonete esporulanteG (+) anaeróbico bastonete esporulante
AntrazAntraz
BotulismoBotulismo
GangrenaGangrena gasosagasosaClostridium perfringensClostridium perfringens
Clostridium tetaniClostridium tetani
Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa
Aspergillus fumigatusAspergillus fumigatus
Aspergillus flavusAspergillus flavus
G (+), anaeróbico, bastonete esporulanteG (+), anaeróbico, bastonete esporulante
G (+), anaeróbico, bastonete esporulanteG (+), anaeróbico, bastonete esporulante
G (G (--), aeróbico, bast. não), aeróbico, bast. não--esporulanteesporulante
Deuteromiceto, filamentoso, septadoDeuteromiceto, filamentoso, septado
Deuteromiceto filamentoso septadoDeuteromiceto filamentoso septado
GangrenaGangrena gasosagasosa
TétanoTétano
InfecçõesInfecções
Pulmões,Pulmões, micosesmicoses
AflatoxinaAflatoxinaAspergillus flavusAspergillus flavus Deuteromiceto, filamentoso, septadoDeuteromiceto, filamentoso, septado AflatoxinaAflatoxina
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... mas os efeitos benéficos são maiores!!... mas os efeitos benéficos são maiores!!
CiclosCiclos biogeoquímicosbiogeoquímicos (ciclagem(ciclagem dede CC ee nutrientesnutrientes::C closC clos b ogeoqu m cosb ogeoqu m cos (c clagem(c clagem dede CC ee nutr entesnutr entessustentabilidadesustentabilidade dada vidavida nana Terra)Terra);;SeqüestroSeqüestro dede carbonocarbono (imobilização(imobilização nono solo)solo);;DegradaçãoDegradação dede substânciassubstâncias xenobiontesxenobiontes;;ControleControle biológicobiológico;;ControleControle biológicobiológico;;FixaçãoFixação biológicabiológica dede nitrogênionitrogênio;;MicorrizasMicorrizas;;BiorremediaçãoBiorremediação;;F tF t dd h ih i étiétiFonteFonte dede recursosrecursos parapara aa engenhariaengenharia genéticagenética..
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GG E lE l NN 11 ll BiBi (k(k hh 11))
Principais grupos microbianos do soloPrincipais grupos microbianos do solo
GrupoGrupo ExemploExemplo NNoo gg--11 solosolo BiomassaBiomassa (kg(kg haha--11))
VírusVírus TMVTMV 10101010--10101111
BactériasBactérias PseudomonasPseudomonas 101088--101099 300300--30003000
A ti b té iA ti b té i St tSt t 101077 101088 300300 30003000ActinobactériasActinobactérias StreptomycesStreptomyces 101077--101088 300300--30003000
FungosFungos AspergillusAspergillus 101055--101066 500500--50005000
AlgasAlgas ChlorellaChlorella 101033--101066 1010--15001500
ProtozoáriosProtozoários EuglenaEuglena 101033 101055 55 200200ProtozoáriosProtozoários EuglenaEuglena 101033--101055 55--200200
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Indicadores microbiológicosIndicadores microbiológicos
Efeitos de práticas de uso e manejo do solo sobre a Efeitos de práticas de uso e manejo do solo sobre a comunidade microbiana: atividade e diversidade;comunidade microbiana: atividade e diversidade;Qualidade microbiológica do solo (“saúde” do solo);Qualidade microbiológica do solo (“saúde” do solo);Avaliações de impacto ambiental;Avaliações de impacto ambiental;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Estabelecer Estabelecer relações entre as propriedadesrelações entre as propriedades químicas e químicas e físicas do solo;físicas do solo;São mais “sensíveis”.São mais “sensíveis”.
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Indicadores de qualidade do solo: por Indicadores de qualidade do solo: por quê?quê?
Potencial de uso;Potencial de uso;Produtividade;Produtividade;Sustentabilidade;Sustentabilidade;Orientar manejo;Orientar manejo;Melhor uso do solo.Melhor uso do solo.
(Turco & Blume, 1999)(Turco & Blume, 1999)
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Características de um indicador Características de um indicador biológico:biológico:
Simples de obter e fácil de interpretar;Simples de obter e fácil de interpretar;Sensível a alterações impostas a um ambiente;Sensível a alterações impostas a um ambiente;Procedimentos semelhantes a análise química de Procedimentos semelhantes a análise química de Procedimentos semelhantes a análise química de Procedimentos semelhantes a análise química de solo para fins de fertilidade;solo para fins de fertilidade;Interpretação da análise química de solo: Baseadas Interpretação da análise química de solo: Baseadas em correlações e calibrações. O mesmo deve ser em correlações e calibrações. O mesmo deve ser feito para os indicadores biológicos... Trabalho!feito para os indicadores biológicos... Trabalho!Comparação com áreasComparação com áreas--referência?referência?
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O que significa um valor obtido de um O que significa um valor obtido de um indicador microbiológico?indicador microbiológico?
Alto, médio, baixo?Alto, médio, baixo?Interpretação da análise química de solo: Interpretação da análise química de solo: Baseadas em correlações e calibrações. O Baseadas em correlações e calibrações. O mesmo poderia ser feito para os mesmo poderia ser feito para os mesmo poderia ser feito para os mesmo poderia ser feito para os indicadores microbiológicos...? Trabalho!indicadores microbiológicos...? Trabalho!Comparação com áreasComparação com áreas--referência?referência?
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ã
ÁreasÁreas--referência para estudos com indicadoresreferência para estudos com indicadores
020406080
100Feijão 1 agr
Feijão 2 agr
Feijão 3 agr
F ijã 5S j
Tabaco con
Flor. Sec.
Glu
Asp
Ure
(B)
020406080
100Feijão 1 agr
Feijão 2 agr
Feijão 3 agr
Feijão 5 agrS oja con
Tabaco con
.F lor. S ec
Cel
Ami
(A)
FiguraFigura.. AtividadeAtividade enzimáticaenzimática relativarelativa ((%%)) considerandoconsiderando umauma áreaárea sobsob florestaflorestasecundáriasecundária ((FlorFlor.. SecSec..)) comocomo referênciareferência ((100100%%)).. (A)(A) EnzimasEnzimas relacionadasrelacionadas aoaociclociclo dodo CC ((CelCel == celulasecelulase;; AmiAmi == amilaseamilase));; (B)(B) EnzimasEnzimas relacionadasrelacionadas aoao ciclociclo dodo
Feijão 5 agr
Milho 3 agrMilho con
Soja conMilho 3 agrMilho con
ciclociclo dodo CC ((CelCel == celulasecelulase;; AmiAmi == amilaseamilase));; (B)(B) EnzimasEnzimas relacionadasrelacionadas aoao ciclociclo dodoNN ((GluGlu == glutaminaseglutaminase;; AspAsp == asparaginaseasparaginase;; UreUre == ureaseurease)).. (Lima,(Lima, 20082008))
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ÁreasÁreas--referência para estudos com indicadoresreferência para estudos com indicadores
Figura. Propriedades do solo sob preparo convencional (PC) e aveia/milho (A/M) e plantiodireto (PD) e aveia+vica/milho+caupi (A+V/M+C), em comparação ao solo em campo nativo(referência=100%). C. org= C orgânico, NMP= N potencialmente mineralizável, C>53= C namatéria orgânica particulada, C-Bio= C na biomassa microbiana, Ntotal=nitrogênio total,C-CO2=atividade microbiana, N>53= N na matéria orgânica particulada, e Quoc. Met.=quociente metabólico. (Conceição, 2002; modificado por Bayer, 2004).
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Indicadores biológicos: Grupos funcionaisIndicadores biológicos: Grupos funcionais
(Matsumoto, 2004)(Fagotti, 2007)
(Saridakis, 2001)
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Protozoários Protozoários
Importantes integrantes da comunidade Importantes integrantes da comunidade Importantes integrantes da comunidade Importantes integrantes da comunidade microbiana;microbiana;Regula a população de bactérias;Regula a população de bactérias;Indicadores da “saúde” do solo.Indicadores da “saúde” do solo.
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Indicador biológico x químicoIndicador biológico x químicoQuímicoQuímico
ÁreaÁrea P resinaP resina M.O.M.O. pHpH KK CaCa MgMg H+AlH+Al SBSB CTCCTC VV
mg/dmmg/dm33 g/kgg/kg CaClCaCl22 ------------------ ------------------ ------mmolmmolcc /dm/dm33-------- ------------------ ------------------ %%MataMata
Past20Past20Past25Past25algodãoalgodão
6677552121
4040404039393232
5,75,75,85,85,85,86,46,4
4,94,95,55,57,57,59,59,5
838393936868190190
2626262628282020
2828222222221313
114114125125104104220220
142142147147126126233233
8080858582829494
ÁreaÁrea C microbianoC microbiano CelulaseCelulase AmilaseAmilase
mg/kgmg/kg μμg AR/g solo/hg AR/g solo/h μμg AR/g solo/hg AR/g solo/hMataMata
Past20Past20428 a428 a363 a363 a
2,64 bc2,64 bc3,47 ab3,47 ab
31,87 a31,87 a20,40 b20,40 b
BiológicoBiológico
Past25Past25algodãoalgodão
402 a402 a143 b143 b
,,3,87 a3,87 a1,58 c1,58 c
,,28,48 ab28,48 ab
5,91 c5,91 c
Fonte: MarchioriFonte: Marchiori--Júnior & Melo (1999)Júnior & Melo (1999)
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Interrelações entre indicadoresInterrelações entre indicadores
Propriedades físicas x microrganismos. Ex.: Propriedades físicas x microrganismos. Ex.: microagregados x fungos filamentosos + gomas microagregados x fungos filamentosos + gomas bacterianas;bacterianas;
P i d d í i i id d i bi E P i d d í i i id d i bi E Propriedades químicas x atividade microbiana. Ex.: Propriedades químicas x atividade microbiana. Ex.: pH, elementos tóxicos, nutrientes;pH, elementos tóxicos, nutrientes;
Carbono orgânico (química): efeitos na biologia e na Carbono orgânico (química): efeitos na biologia e na física do solo.física do solo.
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Indicador físico x biológicoIndicador físico x biológico
raízes
hifas fúngicas
areiasilteargila
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Indicador biológico x químicoIndicador biológico x químico
Hifa
s, m
/g
60
70
80
Y = 37,76 + (17,14/x)R2= 0,82**
P disponível mg/kg
0 10 20 30 4030
40
50
P disponível, mg/kg
Nogueira et al. (não publicado)
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Indicador biológico x químicoIndicador biológico x químico
360
atas
e al
calin
a,
NF/
g/h
a 37
oC
240
280
320 Y = 213 + (42/x)R2= 0,64*
0 10 20 30 40
Fosf
aμ g
PN
160
200
240
P disponível, mg/kg
Nogueira et al. (não publicado)
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Matéria orgânica: papel chave entre Matéria orgânica: papel chave entre os indicadoresos indicadores
Agregação: física;Agregação: física;
Capacidade de retenção de água: física;Capacidade de retenção de água: física;
Fonte de nutrientes: química;Fonte de nutrientes: química;
Efeito tampão e CTC: química;Efeito tampão e CTC: química;
Fonte de energia para crescimento e diversidade Fonte de energia para crescimento e diversidade microbiana: biológica;microbiana: biológica;
Supressão de agentes patogênicos por diversidade Supressão de agentes patogênicos por diversidade e competição: biológica.e competição: biológica.
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Matéria orgânica: papel chave entre Matéria orgânica: papel chave entre os indicadoresos indicadores
Ácidos HúmicosÁcidos Húmicos
Ácidos FúlvicosÁcidos Fúlvicos
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Matéria orgânica x água no soloMatéria orgânica x água no solo
34
onte
nt, g
/kg
28
30
32
o)
Wat
er c
o
22
24
26Y = 17.60 + 4.58Xr ²=0.85
ra e
t al.
(não
pub
licad
o
Total organic C, %
1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.222
Nog
ueir
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Técnicas para estudos em Técnicas para estudos em microbiologia do solomicrobiologia do solo
A li ã d f it d áti d j d l b A li ã d f it d áti d j d l b Avaliação dos efeitos de práticas de uso e manejo do solo sobre a Avaliação dos efeitos de práticas de uso e manejo do solo sobre a comunidade microbiana;comunidade microbiana;Avaliação da qualidade microbiológica do solo (“saúde” do solo);Avaliação da qualidade microbiológica do solo (“saúde” do solo);Avaliações de impacto ambiental;Avaliações de impacto ambiental;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Estabelecer relações entre as propriedades biológicas, químicas e Estabelecer relações entre as propriedades biológicas, químicas e físicas do solo. físicas do solo. Ex.: microagregados x fungos filamentosos + gomas bacterianas; pH, Ex.: microagregados x fungos filamentosos + gomas bacterianas; pH, elementos tóxicos, nutrientes.elementos tóxicos, nutrientes.
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Nível de Nível de
DesidrogenaseDesidrogenase
RespirometriaRespirometria
Técnicas baseadas no metabolismoTécnicas baseadas no metabolismo
atividade atividade biológica biológica no solono solo
pp
Quociente metabólico (Quociente metabólico (qqCOCO22))
Biomassa MicrobianaBiomassa Microbiana
Ocorrência e atividadeOcorrência e atividademelhor melhor entendimento dos entendimento dos efeitos das ações efeitos das ações efeitos das ações efeitos das ações antrópicas sobre a antrópicas sobre a sustentabilidade do sustentabilidade do ambiente.ambiente.
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RespirometriaHCl 0 25NHCl 0,25N
NaOH 0,25N
100g 20mL
INCUBAÇÃO
fenoftaleína
BaCl2
Na2CO3 + H2O
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Biomassa de C e NBiomassa de C e N
Fumigação e extraçãoFumigação e extração
25g25g
24 h (escuro)24 h (escuro)
AmostraAmostra++
Solução extratoraSolução extratora
DuplicataDuplicata+Clorofórmio+Clorofórmio
30 min30 min
--ClorofórmioClorofórmio
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Digestão e titulaçãoDigestão e titulação
8 mL extrato8 mL extrato2 mL dicromato de potássio2 mL dicromato de potássio15 mL H15 mL H22SOSO44/H/H33POPO44
Sulfato ferrosoSulfato ferroso
100 100 °°C, 30 C, 30 minmin
AmostraAmostra+ + ferroínaferroína
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qqCOCO22 e relação C/N da biomassae relação C/N da biomassa
Baseados em índicesBaseados em índices
C/N biom. =C/N biom. = Biomassa CBiomassa CBiomassa NBiomassa N
qqCOCO22 == RespirometriaRespirometriaBiomassa CBiomassa C
Biomassa CBiomassa CqqMic =Mic = Biomassa CBiomassa CCC--orgânicoorgânico
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Atividades enzimáticasAtividades enzimáticas
DesidrogenaseDesidrogenase
5g5g
MetanolMetanol
IncubaçãoIncubação
485 485 nmnm
Cloreto de Cloreto de trifeniltrifenil tetrazóliotetrazólio (1%)(1%)
IncubaçãoIncubação24 h24 h
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Amilase e celulaseAmilase e celulase
5g5g Reagentes para Reagentes para Determinação de Determinação de açúcares redutoresaçúcares redutoresaçúcares redutoresaçúcares redutores
690 690 nmnm
( ) ( )
IncubaçãoIncubação24 h24 h
Tampão (pH 5,5)Tampão (pH 5,5)++
Substrato (CMC/Amido)Substrato (CMC/Amido)++
ToluenoTolueno
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Carboidratos solúveis em água quente
5g
50 mL H2O
16 h80°C
Filtragem100°C35 min
490 nm
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Baseadas em cultivoBaseadas em cultivo
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Fungos e bactérias heterotróficasFungos e bactérias heterotróficas
Baseadas em cultivoBaseadas em cultivo
1010--11
Fungos = MartinFungos = MartinBactérias = ANBactérias = AN
10 g solo em 10 g solo em Diluição em sérieDiluição em série90 mL salina90 mL salina
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Amilolíticos e celulolíticosAmilolíticos e celulolíticos
Baseadas em cultivoBaseadas em cultivo
1010--11
AmilolíticosAmilolíticos50 50 µLµL
10 g solo em 10 g solo em Diluição em sérieDiluição em sérieaté 10até 10--44
CelulolíticosCelulolíticos
90 mL salina90 mL salina até 10até 10--44
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49
Solo
Genes ribossomais: 16S, 18S
Independentes de cultivo: PCRIndependentes de cultivo: PCR--DGGEDGGE
Sistema de eletroforesevertical Bio-Rad
M 3 4 5 6 71 2 8 9M 3 4 5 6 71 2 8 9
1. Tanque e tampa.2. Núcleo central de refrigeração. 3. Câmara de gel montada sobre suporte e carcaça 4. Braçadeiras5. Cartão de alinhamento6. Pentes G
radiente d
16S rRNA
Jaccard (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE DGGEde desnaturação
DGGE
100
8060
DGGE
02
04
06
01
08
05
07
03
09
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50
Independentes de cultivo: MetagenomaIndependentes de cultivo: Metagenoma
Oliveira et al. (2006)
+
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51
•• Etapas:Etapas:Fragmentação do DNAFragmentação do DNA
Independentes de cultivo: MetagenomaIndependentes de cultivo: Metagenoma
-- Preparação da BibliotecaPreparação da Biblioteca
-- PCR de EmulsãoPCR de Emulsão
S i tS i t-- SequenciamentoSequenciamento
Ligação dos AdaptadoresLigação dos Adaptadores
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52
•• Etapas:Etapas:
Independentes de cultivo: MetagenomaIndependentes de cultivo: Metagenoma
-- Preparação da BibliotecaPreparação da Biblioteca
-- PCR de EmulsãoPCR de Emulsão
S i m tS i m t-- SequenciamentoSequenciamento
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53
•• Etapas:Etapas:
Independentes de cultivo: MetagenomaIndependentes de cultivo: Metagenoma
-- Preparação da BibliotecaPreparação da Biblioteca
-- PCR de EmulsãoPCR de Emulsão
SequenciamentoSequenciamento-- SequenciamentoSequenciamento
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54
•• Etapas:Etapas:
Independentes de cultivo: MetagenomaIndependentes de cultivo: Metagenoma
-- Preparação da BibliotecaPreparação da Biblioteca
-- PCR de EmulsãoPCR de Emulsão
SequenciamentoSequenciamento-- SequenciamentoSequenciamento
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MEGANMEGAN -- MEtaGenome AnalyzerMEtaGenome Analyzer
Independentes de cultivo: MetagenomaIndependentes de cultivo: Metagenoma
-- Baseado no resultado da comparação BLASTX Baseado no resultado da comparação BLASTX –– NRNR
-- Utiliza o algorítimo Utiliza o algorítimo Lowest Common Ancestor Lowest Common Ancestor (LCA) (LCA)
para atribuir táxons às sequências.para atribuir táxons às sequências.
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56
Como interpretar dados baseados em Como interpretar dados baseados em bioindicadores de qualidade do solo de bioindicadores de qualidade do solo de
amostras ambientais?amostras ambientais?amostras ambientais?amostras ambientais?
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57
Ferramentas para análise global dos dados: Ferramentas para análise global dos dados: visão sistêmicavisão sistêmica
•• Necessidade de validação estatística;Necessidade de validação estatística;•• Necessidade de validação estatística;Necessidade de validação estatística;•• Qual usar?Qual usar?
(Métodos univariados não são adequados);(Métodos univariados não são adequados);•• Métodos multivariados:Métodos multivariados:
Variáveis analisadas ao mesmo tempo;Variáveis analisadas ao mesmo tempo;Expressa um conjunto reduzido de 2 dimensões;Expressa um conjunto reduzido de 2 dimensões;Discrimina grupos de dados.Discrimina grupos de dados.
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Ferramentas para análise global Ferramentas para análise global dos dados: Análise multivariadados dados: Análise multivariada
PPPressupostos:Pressupostos:
Distribuição normal dos erros (DP +/Distribuição normal dos erros (DP +/--3);3);–– Linear <3, Unimodal >3Linear <3, Unimodal >3
Os erros devem ser independentes e ter a mesma Os erros devem ser independentes e ter a mesma variância, ou seja, homocedasticidade de variâncias;variância, ou seja, homocedasticidade de variâncias;–– Enviezamento de dados, reflexos na análise.Enviezamento de dados, reflexos na análise.
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As variáveis podem ser:As variáveis podem ser:
á R E ú d d íd á R E ú d d íd •• Variáveis Resposta. Ex.: número de indivíduos Variáveis Resposta. Ex.: número de indivíduos de diferentes espécies, parâmetros de diferentes espécies, parâmetros microbiológicos, bioquímicos, variáveis microbiológicos, bioquímicos, variáveis fisiológicas, presença/ausência de uma banda, fisiológicas, presença/ausência de uma banda, t S f f itt S f f itetc. Sofrem o efeito.etc. Sofrem o efeito.
•• VariáveisVariáveis explicativasexplicativas. Ex.: . Ex.: concentraçãoconcentração de de umaumasubstânciasubstância químicaquímica, , atributosatributos físicosfísicos//químicosquímicosdo solo. do solo. EstãoEstão relacionadosrelacionados à à causacausa. .
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Análise multivariada: métodos Análise multivariada: métodos disponíveisdisponíveis
R du m mpl xid d d s d d s s R du m mpl xid d d s d d s s •• Reduzem a complexidade dos dados e os Reduzem a complexidade dos dados e os representam em um sistema de novas variáveis representam em um sistema de novas variáveis ou novas dimensõesou novas dimensões––ordenação;ordenação;
•• Exemplos:Exemplos:pp• Análise discriminante (DA);• Análise discriminante (DA);• Análise de Componentes Principais (PCA);• Análise de Componentes Principais (PCA);• Análise de Coordenadas Principais (PCOA);• Análise de Coordenadas Principais (PCOA);• Análise de Correspondências (CA);• Análise de Correspondências (CA);• Ordenações Canônicas (CCA e RDA);• Ordenações Canônicas (CCA e RDA);• Multidimentional Scaling (MDS)• Multidimentional Scaling (MDS)
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Indicadores de qualidade em função do uso do solo Indicadores de qualidade em função do uso do solo em áreas de floresta nativa, reflorestamento e em áreas de floresta nativa, reflorestamento e agrícolas (Nogueira et al., 2006)agrícolas (Nogueira et al., 2006)
Variáveis físicas;Variáveis físicas;Variáveis químicas;Variáveis químicas;Variáveis microbiológicas;Variáveis microbiológicas;ggVariáveis bioquímicas;Variáveis bioquímicas;Diversidade genética de Diversidade genética de BacteriaBacteria (DGGE).(DGGE).
Total: 26 variáveis.Total: 26 variáveis.
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Bioindicadores e e análise de agrupamento Bioindicadores e e análise de agrupamento (todas as variáveis, exceto DGGE)(todas as variáveis, exceto DGGE)
Floresta NativaFloresta Nativa
3
8
4
6
2
1
Site
s
Reflorestamento IReflorestamento I
Reflorestamento IIReflorestamento IIReflorestamento IIIReflorestamento III
Floresta NativaFloresta Nativa
Regeneração 25 anosRegeneração 25 anosAgrícola Agrícola –– Trigo veg.Trigo veg.
2 3 4 5 6 7 8 9Linkage Distance
7
5
9
Agrícola Agrícola -- PousioPousioAgrícola Agrícola –– Trigo mat.Trigo mat.
Agrícola Agrícola Trigo veg.Trigo veg.EucaliptoEucalipto
Dendrograma baseado em análise de custer dos resultados das análises microbiológicas e químicas do solo das áreas em estudo. (Nogueira et al., 2006)
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63
100
8060
02
Diversidade genética e análise de Diversidade genética e análise de agrupamento com base no perfil de DGGEagrupamento com base no perfil de DGGE
Reflorestamento IReflorestamento I04060108
05
Reflorestamento IIReflorestamento IIReflorestamento IIIReflorestamento IIIFloresta NativaFloresta NativaRegeneração 25 anosRegeneração 25 anosAgrícola Agrícola -- PousioPousio05
070309
Dendrograma (esquerda) baseado em análise de Dendrograma (esquerda) baseado em análise de
Agrícola Agrícola -- PousioPousioAgrícola Agrícola –– Trigo mat.Trigo mat.Agrícola Agrícola –– Trigo veg.Trigo veg.EucaliptoEucalipto
custer dos produtos de PCRcuster dos produtos de PCR--DGGE de DNA de solo DGGE de DNA de solo após amplificação com primers para a região do após amplificação com primers para a região do rDNA 16S (Direita). (Nogueira et al., 2006)rDNA 16S (Direita). (Nogueira et al., 2006)
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64
Indicadores de qualidade em áreas sob área nativa, Indicadores de qualidade em áreas sob área nativa, reflorestamentos com Araucária e Pinus, e agrícola reflorestamentos com Araucária e Pinus, e agrícola (Miyauchi et al., submetido)(Miyauchi et al., submetido)
Nativa Reflorestamento Pinus
Reflorestamento Araucária Agrícola
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65
Estratégia de amostragemEstratégia de amostragem
25 x 5 m
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66
1.0
fung
C/N
PI13,6
%
PCA: relação entre áreas, variáveis resposta e PCA: relação entre áreas, variáveis resposta e explicativasexplicativas
amiloliceluloli
bact
fung
d-ase
celulaseamilase
BMC
ADA
UMI
PI
AGR
Revolvimento Revolvimento solosolo
Menor Menor cobertura cobertura vegetalvegetal
Aplicação de Aplicação de
Eixo
2: 1
-1.0 1.0
-1.0
d-ase
respqCO2
pHCOTNAT
AR
p çp çinsumosinsumos
Eixo1: 69 0%
Miyauchi (2007)
Eixo1: 69,0%
Figura. Plano fatorial da Análise de ComponentesPrincipais (ACP) baseada nas variáveis resposta evariáveis explicativas (COT, UMI e pH) nas áreas(NAT = floresta nativa; AR = A. angustifolia; PI =Pinus taeda; AGR = agrícola).
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1.0
fung
C/N
PI
PCA: relação entre áreas, variáveis resposta e PCA: relação entre áreas, variáveis resposta e explicativasexplicativas
Qualidade do Qualidade do resíduo vegetalresíduo vegetal
C/N solo C/N solo maior em PI, maior em PI, amiloli
celulolibact
f g
d-ase
celulaseamilase
BMC
ADA
UMI
AGR
o2: 1
3,6%
Limitação das Limitação das técnicas técnicas baseadas em baseadas em cultivocultivo
resinas resinas ligninalignina
Espécie exótica Espécie exótica altera propr. do altera propr. do -1.0 1.0
-1.0
respqCO2
pHCOTNAT
AR
Ei 1 69 0%
Eixo
Figura. Plano fatorial da Análise de ComponentesPrincipais (ACP) baseada nas variáveis resposta evariáveis explicativas (COT, UMI e pH) nas áreas(NAT = floresta nativa; AR = A. angustifolia; PI =Pinus taeda; AGR = agrícola).
altera propr. do altera propr. do solosolo
Eixo1: 69,0%
Miyauchi (2007)
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Variáveis do ciclo do NVariáveis do ciclo do N
agot
ti e
t al
. (20
12)
Fa
Figura. Plano fatorial da Análise de ComponentesPrincipais (ACP) baseada nas variáveis resposta do ciclodo N nas áreas (NAT = floresta nativa; AR = A.angustifolia; PI = Pinus taeda; AGR = agrícola).
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Conversão de cultivo convencional para Conversão de cultivo convencional para agroecológicoagroecológico
Lima (2008)
5/13/2013
70
PCA com atividade/biomassa microbianaPCA com atividade/biomassa microbiana
Figura. Plano Figura. Plano fatorial da Análise de Componentes Principais (ACP) baseada nas variáveis resposta e
Eixo
2: 1
3,2%
pváriaveis explicativas (pH, Ctot, umi) nas áreas.
Eixo1: 62,8%
Lima (2008)
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71
1.0
H
PCA com atividades enzimáticasPCA com atividades enzimáticas
Figura. Plano fatorial da
Glu
UreDesid
Falc
pH
Fj3 Fj1Fj5
fatorial da Análise de Componentes Principais (ACP) baseada nas variáveis resposta (enzimas) e
Asp
Umi
Ctot
Fj2
MilCSojC
TabC
Eixo
2: 2
4,1%
(enzimas) e váriaveis explicativas (pH, Ctot, umi) nas áreas.
-0.7 1.2
-0.8
CelAmil
FacidFloresta
MilA
Eixo1: 62,1% Lima (2008)
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72
Atividade e biomassa microbiana do solo podem Atividade e biomassa microbiana do solo podem explicar diferentes níveis de produtividade de explicar diferentes níveis de produtividade de grãos em áreas agrícolasgrãos em áreas agrícolas
rvan
tes
et a
l. (2
012)
Fazenda I Fazenda II
Cer
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73
Atividade e biomassa microbiana do solo podem Atividade e biomassa microbiana do solo podem explicar diferentes níveis de produtividade de grãos explicar diferentes níveis de produtividade de grãos em áreas agrícolasem áreas agrícolas
s et
al.
(201
2)Ce
rvan
tes
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74
Metagenômica de solo sob plantio direto e plantio Metagenômica de solo sob plantio direto e plantio convencional em rotação e sucessão de culturas no convencional em rotação e sucessão de culturas no norte do Paraná (Souza 2012)norte do Paraná (Souza 2012)
CurvaCurva de de RarefaçãoRarefaçãoSouza (2012)
5/13/2013
75
Souza (2012)
5/13/2013
76
•• DomínioDomínioBacteriaBacteria
Souza (2012)
5/13/2013
77
•• DomínioDomínio BacteriaBacteria
mbe
r of reads
Num
Taxon Souza (2012)
5/13/2013
78
•• DomínioDomínio Bacteria Bacteria FiloFilo ProteobacteriaProteobacteria
r of reads
Num
ber
TaxonSouza (2012)
5/13/2013
79
•• DomínioDomínio BacteriaBacteria•• FiloFilo ProteobacteriaProteobacteriaClasseClasse AlfaproteobacteriaAlfaproteobacteria
Souza (2012)
read
sNum
ber o
f
Taxon
5/13/2013
80
•• AnáliseAnálise estatísticaestatística
Souza (2012)
5/13/2013
81
•• DomínioDomínio BacteriaBacteriaFiloFilo ProteobacteriaProteobacteria
r of reads
Num
ber
TaxonSouza (2012)
5/13/2013
82
•• DomínioDomínio BacteriaBacteria•• FiloFilo ProteobacteriaProteobacteriaClasseClasse BetaproteobacteriaBetaproteobacteria
Souza (2012)
read
sNub
er o
f
Taxon
5/13/2013
83
• Análise estatística
Souza (2012)
5/13/2013
84
• Domínio ArchaeaSouza (2012)
• Domínio Archaea
5/13/2013
85
• Domínio Archaea
read
sNum
ber
of
Taxon Souza (2012)
5/13/2013
86
•• DomínioDomínioEukaryotaEukaryota
Souza (2012)
5/13/2013
87
•• DomínioDomínio EukaryotaEukaryotaSouza (2012)
er of reads
Num
be
Taxon
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AlimentosAlimentos (11%)(11%)
> > 1000 bilhões de U$1000 bilhões de U$CiclagemCiclagem do C (50%)do C (50%)
SaprofíticosSaprofíticos
Valor dos serviços ambientaisValor dos serviços ambientais
AlimentosAlimentos (11%)(11%)FungosFungosInvertebradosInvertebrados
Bi t lBi t l (10%)(10%)
PolinizaçãoPolinização(13%)(13%)InsetosInsetos
SaprofíticosSaprofíticosDecompositoresDecompositores
BiotecnologiaBiotecnologia (<1%)(<1%)
BiocontroleBiocontrole (10%)(10%)
PedogênesePedogênese (2%)(2%)BioturbaçãoBioturbaçãoAti id d Ati id d bi ló ibi ló i
Pimentel Pimentel et al.et al. (1997)(1997)
CiclagemCiclagem do N (6%)do N (6%)FixaçãoFixação do Ndo N22DenitrificaçãoDenitrificaçãoNitrificaçãoNitrificação
BioremediaçãoBioremediação (8%)(8%)DetoxificaçãoDetoxificação
Atividade Atividade biológicabiológica
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ConclusõesConclusõesBioindicadores baseados tanto em métodos Bioindicadores baseados tanto em métodos Bioindicadores baseados tanto em métodos Bioindicadores baseados tanto em métodos clássicos quanto em métodos mais avançados clássicos quanto em métodos mais avançados permitem distinguir efeitos do uso do solo;permitem distinguir efeitos do uso do solo;A comparação com áreas referência dá A comparação com áreas referência dá i di ã d s f it s d si ã i di ã d s f it s d si ã indicação dos efeitos da recomposição indicação dos efeitos da recomposição vegetal e do manejo em atributos biológicos vegetal e do manejo em atributos biológicos do solo;do solo;A análise deve ser global, interpretando o A análise deve ser global, interpretando o
l d d d d d d d l d d d d d d d papel de cada indicador nas propriedades do papel de cada indicador nas propriedades do solo.solo.
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90
@ b [email protected]@embrapa.br
Equipe:Adriana Pereira SilvaAndré S. NakataniBiana H KuwanoBiana H. KuwanoDáfila S. Lima FagottiLetícia C. BabujiaMarco A. NogueiraMariangela HungriaRafaela RuyR t C S
Ex-alunos:Cristiane A. SantosDaniel Bini
Renata C. SouzaVívian N. Marques Cervantes
Glaciela KaschuckMarina Yumi H. Miyauchi